專利名稱：合成肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及合成多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從抗生素發(fā)明以來，人類在控制和治療微生物感染中取得了較大的成就，但隨著抗生素的持續(xù)使用，目前微生物抗藥性已成為感染控制的重大問題，以至于某些微生物細菌已沒有控制殺滅的一線藥物。如在臨床藥物治療中，萬古霉素抗性的葡萄球菌。腸球菌以及其他革蘭氏陰性菌感染疾病目前均是世界范圍內(nèi)的臨床治療難題?？咕氖且环N小分子的多肽類物質(zhì)，具有廣譜抗菌活性，對原核生物有作用，對真核生物無害?？咕氖巧锓烙到y(tǒng)中產(chǎn)生的一類對抗外源性病原體的肽類物質(zhì)，是生物 天生的、非特異性防御系統(tǒng)的重要組成部分?？咕目膳c革蘭陰性菌外膜的脂多糖或革蘭陽性菌表面的肽聚糖結(jié)合，使其被破壞而形成穿膜通道，胞內(nèi)離子大量流出，細胞因高滲破裂而死亡，不易產(chǎn)生耐藥性。另外，它還具有免疫調(diào)節(jié)、促進損傷皮膚修復(fù)、中和內(nèi)毒素及對抗膿毒性休克的作用。因此，抗菌肽在抗感染等方面具有極廣泛的應(yīng)用價值。但天然抗菌肽在含量、活性、活性依賴于結(jié)構(gòu)、生產(chǎn)成本等方面存在諸多缺陷，成為制約抗菌肽進入實際應(yīng)用的最大障礙。因此，開發(fā)結(jié)構(gòu)簡單、抗菌活性高、具有多種活性的抗菌成為當前抗菌肽開發(fā)的迫切需要。治療糖尿病人創(chuàng)傷等遷延不愈的創(chuàng)面愈合仍然是臨床存在的一大難題。創(chuàng)面愈合是一個有序的細胞調(diào)節(jié)過程，成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，構(gòu)成肉芽組織的重要成份，并借助裂隙連接及橋粒產(chǎn)生同步收縮，牽拉基質(zhì)使膠原重新排列和沉積，通過傷口的收縮活動加速創(chuàng)面閉合。而糖尿病患者自身修復(fù)能力減弱，創(chuàng)面常表現(xiàn)為壞死組織不易脫落，肉芽生長遲緩或異常，上皮化速度減慢甚至抑制，基底組織失去生機。不易脫落的壞死組織在愈合中后期形成厚厚的結(jié)痂，阻止了外用藥物對壞死組織與正常組織界面的有效殺滅作用。因而，增強自身修復(fù)能力，加快肉芽組織生長，是促進糖尿病患者創(chuàng)面愈合的重要環(huán)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種合成肽，該合成肽是在天然LfcinB4_9基礎(chǔ)上，采用保守替換和組合化學方法設(shè)計而成。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為合成肽，所述合成肽含有如SEQ ID NO : I所示的氨基酸序列。進一步，所述合成肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。進一步，在所述N末端和/或C末端的修飾、環(huán)化、替換、L-型氨基酸變D-型氨基酸。優(yōu)選的，所述合成肽的濃度大于等于4 μ g/mL。本發(fā)明的目的之二在于提供所述合成肽的兩種應(yīng)用，該應(yīng)用為抗感染和傷口愈合治療提供了新的思路。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為所述的合成肽在制備抗感染藥物中的應(yīng)用。其中，所述合成肽在制備抗革蘭氏陰性菌感染藥物中的應(yīng)用。其中，所述合成肽在制備抗革蘭氏陽性菌感染藥物中的應(yīng)用。所述的合成肽在制備傷口愈合劑中的應(yīng)用。其中，所述的合成妝在制備糖尿病人創(chuàng)傷愈合劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于1)本發(fā)明所述合成肽是只有6個氨基酸組成的六肽，采用化學方法合成，其生產(chǎn)成本相應(yīng)降低。2)本發(fā)明所述合成肽是由L型氨基酸組成的六肽，結(jié)構(gòu)簡單，突破了構(gòu)象對活性的限制，適合于在原核表達系統(tǒng)中高效表達以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。因此，相對于其他結(jié)構(gòu)復(fù)雜的抗菌肽或生長因子等肽類制劑，更易實現(xiàn)生產(chǎn)，適宜在臨 床上廣泛應(yīng)用。3)本發(fā)明所述合成肽具有多種活性，除了有高抗菌活性，還有顯著的促創(chuàng)傷愈合作用，使用劑量低，每天涂抹一次即可，療效顯著。


圖I為糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合情況，其中A為所述合成肽組，B為雙抗組，C為生理鹽水組；自上而下依次為I天、5天、10天、15天、20天、25天的創(chuàng)面愈合情況。圖2為病理切片，左圖為抗菌肽組，右圖為生理鹽水組。圖3為如SEQ ID NO :I所示的合成肽的高效液相色譜圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件進行或配置，未注明來源的產(chǎn)品均可通過市場途徑獲得。本發(fā)明所涉及的一種富含Trp/Arg六肽，是對在天然牛乳鐵蛋白肽LfcinB活性中心LfcinB4-9的基礎(chǔ)上，采用保守替換和組合化學方法設(shè)計而成，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司化學合成，所合成多肽HPLC純度大于98%，利用改良微量肉湯稀釋法(Hancock, 2000 ；Giacoetti等,2000)檢測多肽的抗菌活性，以預(yù)先采用化學合成法得到的天然抗菌肽LfcinB4-9為對照，進行抗菌活性檢測，結(jié)果本發(fā)明中的所述合成肽是殺菌活性明顯高于對照抗菌肽的抗菌活性。氨基酸縮寫簡稱如下谷氨酰胺gin Q ;甘氨酸gly G ;絲氨酸ser S ;丙氨酸ala A ;蘇氨酸t(yī)hr T ;繳氨酸val V;異亮氨酸ile I;亮氨酸leu L;酪氨酸t(yī)yr Y ;苯丙氨酸phe F ;組氨酸his H ;脯氨酸pro P;天冬酰胺asn N;甲硫氨酸met Μ;谷氨酸glu E ;色氨酸t(yī)rp W ;賴氨酸Iys K ；半胱氨酸cys C;精氨酸arg R ;天冬氨酸Asp D實施例I合成肽的制備與純度檢測本實施例中，涉及到的英文參數(shù)，為分析化學領(lǐng)域技術(shù)人員公知，可參照張玉奎主編的《分析化學手冊(六)液相色譜分析》。另，TFA指三氟乙酸，Acetonitrile指乙腈，HCOOH指甲酸；所涉及的流動相的濃度為體積濃度。一化學合成
所述合成肽由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司化學合成，經(jīng)HPLC純化和確認。二高效液相色譜分析所述高親和力結(jié)合多肽I色譜條件如下Measurement Peak Area ；Run Time 30min ；Calculation Type Percent ；Wavelength 220nm ；
Flow rate :1. Oml/min ；Inj. Vol 20μ L ；Buffer A 0. I % TFA in 100% Acetonitrile ；Buffer B 0. I % TFA in Water ；Column Kromasil 100-5C18,4. 6mmX250mm, 5micron ;
Gratiienl(丨 incar):AB
0.01 min 10%90%
25min 100%0%
25.01mm 100%0%
3 Ominstop2結(jié)果詳見下表或圖I :
Rank Time Cone. Area~I8.883 0.5009 48497
~29.100 0.3386 32780
~9.325 0.4257 41213
~9.708 0.5034 48736
~510.478 0.8357 80912
~610. 516 12.41 1201332
~10.819 63.94 6190606
~811.000 10. 53 1019669
~911. 165 2.821 273166~
權(quán)利要求
1.合成肽，其特征在于，所述合成肽含有如SEQID NO :1所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的合成肽，其特征在于，所述合成肽的氨基酸序列如SEQIDNO 1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的合成肽，其特征在于在所述N末端和/或C末端的修飾、環(huán)化、替換、L 一型氨基酸變D —型氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的合成肽，其特征在于，所述合成肽的濃度大于等于4μ g/mL。
5.權(quán)利要求1-4任一項所述的合成肽在制備抗感染藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述合成肽在制備抗革蘭氏陰性菌感染藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述合成肽在制備抗革蘭氏陽性菌感染藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1-4任一項所述的合成肽在制備傷口愈合劑中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的合成肽在制備糖尿病人創(chuàng)傷愈合劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及合成肽，所述合成肽含有如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列；所述的合成肽在制備抗感染藥物及傷口愈合藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明所述合成肽是只有6個氨基酸組成的六肽，采用化學方法合成，其生產(chǎn)成本相應(yīng)降低；相對于其他結(jié)構(gòu)復(fù)雜的抗菌肽或生長因子等肽類制劑，更易實現(xiàn)生產(chǎn)，適宜在臨床上廣泛應(yīng)用；本發(fā)明所述合成肽具有多種活性，除了有高抗菌活性，還有顯著的促創(chuàng)傷愈合作用，使用劑量低，每天涂抹一次即可，療效顯著。
文檔編號C07K7/06GK102816206SQ20121030805
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月27日
發(fā)明者沈克飛, 王孝友, 楊睿, 徐登峰, 谷山林, 付利芝, 李大軍, 葛良鵬 申請人:重慶市畜牧科學院