專利名稱：1型登革熱快速金標診斷試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疾病診斷的抗原，具體說是一種用于I型登革熱血清學(xué)診斷的重組抗原及其快速金標診斷試紙條。
背景技術(shù)：
登革熱是一種由伊蚊傳播的病毒性傳染病，主要流行于東南亞、美州等熱帶、亞熱帶國家和地區(qū)，一百多個國家有地方性登革熱傳播，每年均出現(xiàn)幾百萬病例，是全球性公共衛(wèi)生問題。近年來，我國東南沿海省份常年有輸入性病例報告，且由此造成的本地擴散及暴發(fā)流行越來越頻繁。由于登革熱主要的傳播媒介-白蚊伊蚊在國內(nèi)分布廣泛，因此其傳播速度快，容易造成不良的社會影響，同時對當?shù)氐慕?jīng)濟發(fā)展，特別是旅游業(yè)的發(fā)展造成沖擊，我國已將登革熱列為重點控制的傳染病之一。由于缺乏有效的登革疫苗，加強登革熱實驗室準確快速的檢測，及時發(fā)現(xiàn)、控制傳染源，對于控制疫情起著至關(guān)重要的作用。 目前登革熱的實驗室診斷主要包括病毒分離、基因診斷技術(shù)和血清學(xué)檢測。由于登革熱的病毒血癥期很短，通常在發(fā)熱前2-3天到發(fā)熱開始4-5天內(nèi)，因此病毒分離和基因診斷受到標本采集時間的限制，同時對設(shè)備、實驗室條件及人員素質(zhì)要求很高，不利于推廣。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法主要包括血凝抑制實驗、補體結(jié)合實驗、中和實驗和免疫熒光法。但這些方法大多敏感性和特異性不高，且操作繁煩，有的需要特殊檢測設(shè)備，目前已較少應(yīng)用。而ELISA法、免疫層析法具有較高的敏感性和特異性，且操作簡便快速，是目前大多數(shù)實驗室采用的主要方法。國外已有多個國家生產(chǎn)銷售此類試劑盒，但大多數(shù)質(zhì)量不盡人意，僅以澳大利亞Panbio公司生產(chǎn)的檢測試劑盒質(zhì)量最好，該試劑也是目前國內(nèi)實驗室采用的主要試劑。但其價格昂貴，一般實驗室難以承受，且運送時間長，難以應(yīng)對突發(fā)事件。而國內(nèi)尚沒有商業(yè)化的試劑盒面市。登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，可分為四種血清型。早期的診斷試劑盒主要采用全病毒或病毒裂解液作為捕獲抗原，檢測血清中的登革病毒抗體，但由于與其它蟲媒病毒存在交叉反應(yīng)，特異性差，已逐漸被重組抗原所替代。外膜蛋白(E蛋白)是登革病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，全長500個氨基酸左右，E蛋白能和宿主細胞表面受體相互作用從而在病毒入侵過程中起至關(guān)重要的作用，還能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護性的中和抗體。E蛋白可分為三個結(jié)構(gòu)區(qū)(DI、DII、DII I)，DIII區(qū)包括殘基300 400，由唯一的一個二硫鍵穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，含有多個中和表位和宿主細胞受體識別位點，能誘導(dǎo)病毒中和抗體和血凝抑制抗體的產(chǎn)生。該多肽區(qū)不僅含有群特異性表位，還含有登革病毒型特異性表位，可用于病毒血清型的鑒別。膠體金是一種處于半還原狀態(tài)的懸浮顆粒，能迅速吸附蛋白質(zhì)等大分子而不影響其活性，膠體金具有易分辨的紅至紫紅色，在與大分子結(jié)合后，易于用肉眼識別，不需二級放大即可直接觀察結(jié)果，膠體金診斷產(chǎn)品因而可直接進入沒有復(fù)雜檢測設(shè)備的診所甚至家庭里。近年來，以早孕檢測試紙為代表的膠體金免疫診斷試劑已進入千家萬戶，給人們的生活帶來很大的方便。從包括中國專利等有關(guān)資料檢索表明，目如尚未有利用基因工程方法獲得聞表達、高活性的外膜蛋白DIII區(qū)重組抗原用于同時檢測登革病毒感染者血清中IgM、IgG抗體的金標快速診斷試紙條的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是要提出一種用于I型登革熱診斷的外膜蛋白DIII區(qū)重組抗原及可同時檢測I型登革病毒感染者血清中IgM、IgG抗體的快速金標診斷試紙條。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一 .溶液配方(I)重組抗原溶解液SDS0. 1%甘氨酸 250mmol/L Tris. Cl 2Smmol /I,(2)膠體金溶液0. 03 0.05%的四氯金酸，加I 2%檸檬酸三鈉制備成膠體金顆粒；(3) 二抗羊抗人IgG單抗、羊抗人y鏈單抗，羊抗鼠IgG單抗由廈門波生生物技術(shù)有限公司研制；(4)包被緩沖液含I 3%蔗糖的磷酸鹽緩沖液；(5)基礎(chǔ)緩沖液由廈門波生生物技術(shù)有限公司研制，主要含牛血清白蛋白的緩沖液；(6)反應(yīng)緩沖液含0. 01 0. 05% NaN3的磷酸鹽緩沖液；(7)磷酸鹽緩沖液(PBS):為在800ml蒸餾水中溶解8g NaCUO. 2g KCl、1.44gNa2HPO4和0. 24g KH2PO4，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 2 7. 6，加水定容至1L。二 .本發(fā)明重組抗原的工藝流程(I)本研究所用的I型登革病毒株為Hawaii株；(2)以I型登革病毒基因組為模板，以F1/R1為PCR擴增引物，用一步法RT-PCR擴增得到E基因全長片段，其大小為2065bp，用TA克隆技術(shù)將此大片段克隆入TA載體pMD18-T中，獲得重組質(zhì)粒T-DENlE ；(3)以該重組質(zhì)粒T-DENlE為模板，以FID、RlD為引物(FlD為正向引物，添加了BamHI酶切位點；R1D為反向引物，添加了 Xho I酶切位點)，從中擴增出長度約378bp的E蛋白DIII區(qū)片段(DEN1EDIII)，將此片段定向插入原核表達載體pET-30a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達；Western blot證實該重組抗原pro-DENlEDIII能被I型登革病毒感染者陽性血清所識別，以上所用引物見表I ;表I I型登革病毒E蛋白DIII區(qū)克隆、表達所應(yīng)用的引物引物序列方向定位
Fl 5’-TTGAGACACCCAGGATTCACGG-3'M(+) 818-839
Rl 5’ -CTTCCCAAATGTTCCACGCTC-3’M(-) 2862-2882
FlD 5'- GTGGATCC ACGACAAAAATTTTCG
權(quán)利要求
1.一組I型登革熱快速金標診斷試紙條的溶液組分，其特征是 (1)重組抗原溶解液SDS0. 1% 甘氛酸 250mmol/L Tris. Cl 25mmol/L 其中，重組抗原為重組抗原pro-DENlEDIII，其核苷酸序列為 gacaaactga ccttaaaagg gatgtcatat gtgatgtgca caggctcatt caagttagag 60 aaagaagtgg ctgagaccca gcatggaact gttctagtgc aggttaaata cgaaggaaca 120 gatgcaccat gcaagatccc cttttcgacc caagatgaga aaggagtaac ccagaatggg 180 agattgataa cagccaaccc catagtcact gacaaagaaa aaccagtcaa cattgaggca 240 gaaccacctt ttggtgagag ttacatcgtg gtaggagcag gtgaaaaagc tctgaaacta 300 agctggttca agaaaggaag cagcataggg aaaatgcttg aagcaactgc ccgaggagca 360 cgaaggatgg ccatccta378 其所編碼的氨基酸序列為Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser151015Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu202530Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys He Pro Phe354045 Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu He Thr 505560Ala Asn Pro He Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn He Glu Ala65707580Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr He Val Val Gly Ala Gly Glu Lys 859095Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser He Gly Lys Met100105110Leu Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala He Leu115120125 (2)膠體金溶液0.03 0. 05%的四氯金酸，加I 2%檸檬酸三鈉制備成膠體金顆粒; (3)二抗羊抗人IgG單抗、羊抗人y鏈單抗，羊抗鼠IgG單抗； (4)包被緩沖液含I 3%蔗糖的磷酸鹽緩沖液； (5)基礎(chǔ)緩沖液由廈門波生生物技術(shù)有限公司研制，主要含牛血清白蛋白的緩沖液； (6)反應(yīng)緩沖液0.01 -0. 05% NaN3的磷酸鹽緩沖液； (7)磷酸鹽緩沖液為在800ml蒸餾水中溶解8gNaCUO. 2g KC1、1. 44g Na2HPO4和0.24gKH2P04，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 2 7. 6，加水定容至1L。
2.制備I型登革熱快速金標診斷試紙條重組抗原pro-DENlEDIII的工藝流程，其特征是(1)以I型登革病毒株為Hawaii株基因組為模板，以F1/R1為PCR擴增引物，用用一步法RT-PCR擴增得到外膜蛋白基因全長片段，其大小為2065bp，用TA克隆技術(shù)將此片段克隆A TA載體pMD 18-T中，獲得重組質(zhì)粒T-DENlE ； (2)以該重組質(zhì)粒T-DENlE為模板，以FlD、RlD為引物，從中擴增出長度約378bp的E基因DIII區(qū)片段，將片段定向插入原核表達載體pET-30a，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET30a-DENlEDIII，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達；蛋白免疫印跡實驗證實該重組抗原pro-DENIEDIII能被I型登革病毒感染者血清所識別； E基因DIII區(qū)片段DEN1EDIII表達的重組抗原pro-DENlEDIII的核苷酸序列為 gacaaactga ccttaaaagg gatgtcatat gtgatgtgca caggctcatt caagttagag 60 aaagaagtgg ctgagaccca gcatggaact gttctagtgc aggttaaata cgaaggaaca 120 gatgcaccat gcaagatccc cttttcgacc caagatgaga aaggagtaac ccagaatggg 180 agattgataa cagccaaccc catagtcact gacaaagaaa aaccagtcaa cattgaggca 240 gaaccacctt ttggtgagag ttacatcgtg gtaggagcag gtgaaaaagc tctgaaacta 300 agctggttca agaaaggaag cagcataggg aaaatgcttg aagcaactgc ccgaggagca 360 cgaaggatgg ccatccta378 其所編碼的氨基酸序列為Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser151015Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu202530Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys He Pro Phe354045Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu He Thr505560Ala Asn Pro He Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn He Glu Ala65707580 Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr He Val Val Gly Ala Gly Glu Lys 859095Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser He Gly Lys Met100105110Leu Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala He Leu115120125 (3)采用電洗脫方法純化重組蛋白對大量誘導(dǎo)時收集的菌體進行超聲粉碎后，離心后分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE凝膠電泳，沉淀用2M、4M、8M尿素依次進行洗滌，尿素溶解的重組蛋白用電洗脫法進行純化，純化蛋白進行SDS-PAGE，確定純度并進行蛋白定量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一步法RT-PCR反應(yīng)體系，其特征是 ·50 u I反應(yīng)體系包含以下成份
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的I型登革病毒克隆、表達所應(yīng)用的引物，F(xiàn)lR為正向引物，添加了 BamHI酶切位點；R1D為反向引物，添加了 Xho I酶切位點，其特征是
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組蛋白pro-DENlEDIII，其重組蛋白pro-DENlEDIII誘導(dǎo)表達 (1)挑取含重組表達質(zhì)粒pET30a_DENlEDIII的單菌落于5ml含Kanamycin,30 u g/ml的LB培養(yǎng)液中，37°C 250r/min過夜培養(yǎng)； (2)將過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒的表達菌以I: 100擴種；(3)表達菌生長到OD值約0.8時，加入IPTG使其終濃度為lmM，37°C誘導(dǎo)4h ； (4)菌液用4°C8000r/min,離心5min收集菌體,沉淀倒置扣干,備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用電洗脫方法純化重組抗原，其特征是 (I)用超聲波破碎法裂解細菌 ①將1500ml表達菌液于4°C,6000r/min,離心IOmin ；②BufferI 100ml懸浮沉淀，置冰浴上，350W超聲破碎20min, 2s超聲，5s間隔； Buffer I, pH 7. 2 5mM EDTA 20mM Tris. Cl150mM NaCl ③4°C，12000r/min,離心lOmin，取少量沉淀和 上清進行SDS-PAGE，確定目標蛋白位置及純度，重組蛋白存在于包涵體中； (2)包涵體的溶解 ①上述用BufferI懸起的沉淀加入等量4% Triton, 37 °C搖床振蕩30min,4°C,12000rpm/min 離心 lOmin,棄上清； ②沉淀用BufferI懸起，4°C, 12000rpm/min離心lOmin,棄上清； ③重復(fù)步驟1、2; ④沉淀用2mol/L尿素(溶于BufferI)懸起,37°C搖床振蕩30min, 4°C, 12000rpm/min離心lOmin,留上清； ⑤按照步驟4的操作方法,沉淀依次用4mol/L、8mol/L尿素(溶于BufferI)溶解，留上清； ⑥分別從2m0l/L、4m0l/L、8m0l/L尿素溶解的上清中取出10yl，加入等量2 X SDS凝膠加樣緩沖液，12% SDS-PAGE進行分析； (3)電洗脫法純化重組蛋白 ①固定膠板，用0.7%瓊脂糖凝膠封住膠板的底部及兩側(cè)； ②配制12% SDS-PAGE ； ③尿素溶解的包涵體加入5X SDS凝膠加樣緩沖液，每板上樣6ml ； ④IOOV電泳過夜； ⑤切膠根據(jù)折光效果，用小刀沿折光線劃出一條線(勿切斷)，在膠的中間縱向切出一條小膠，用0. 3mol/L CuC12染色，根據(jù)染色后蛋白帶的寬度，切下目的蛋白； ⑥電洗脫將切下的膠條置于透析袋中，加入IXSDS電泳緩沖液，置于水平電泳槽上電泳，110V電洗脫2h后，收集透析袋中的溶液，更換新的電泳緩沖液，繼續(xù)電洗脫2h，再次收集電洗脫液，收集的溶液即為純化的蛋白； ⑦純化的蛋白進行SDS-PAGE分析，鑒定其純度； ⑧蛋白定量參照DU530核酸蛋白分析儀說明書進行 ①在主菜單上選擇蛋白分析程序； ②選擇UV280方法測定蛋白濃度； ③以牛血清白蛋白(BSA)為參考蛋白，以溶解待測定蛋白的溶液配制一系列濃度的BSA溶液，測定其OD值，建立標準曲線； ④以溶解BSA的溶液調(diào)零。
7.I型登革熱金標快速診斷試紙條的制作工藝，其特征是 (1)取0.03%四氯金酸1000ml，加熱至沸騰，加入I %檸檬酸三鈉溶液25ml，繼續(xù)煮沸5min，待膠體金溶液顏色由有藍經(jīng)紫變紅后，自然冷卻后備用； (2)取膠體金溶液1ml，加入0.2M K2CO3IO U 1,50 u g根據(jù)權(quán)利要求2所述工藝制備的純化重組抗原pro-DENlEDIII，攪勻后靜置Ih ；(3) 加入20%牛血清白蛋白 25 u 1,20% PEG 20，00015 u 1,8, 000r/min，離心 8min，棄上清； (4)將沉淀懸浮于Iml基礎(chǔ)緩沖液中，即為金標抗原溶液；(5)同法標記鼠IgG； (6)兩種金標抗原溶液混合后充分浸潤玻璃纖維紙，置凍干機凍干； (7)羊抗鼠IgG單抗3.Omg/ml、羊抗人y鏈單抗2. Omg/ml、羊抗人IgG單抗2. Omg/ml,分別在NC膜的上、中、下位置包被NC膜，自然晾干； (8)在約IOcm寬的底板上，將吸水紙、NC膜、吸附了金標抗原的玻璃纖維和未 吸附抗原的玻璃纖維組裝成檢測IgM與IgG的試紙條。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于1型登革熱診斷的重組抗原及其快速金標診斷試紙條。其主要針對于1型登革熱診斷的外膜蛋白DIII區(qū)重組抗原及可同時檢測1型登革病毒感染者血清中IgM、IgG抗體的快速金標診斷試紙條。利用基因克隆技術(shù)獲得1型登革病毒的外膜蛋白DIII區(qū)重組抗原，純化后即可用于免疫學(xué)診斷?？焖俳饦嗽\斷試紙條可同時檢測1型登革病毒感染者血清中IgM、IgG抗體，可判斷患者的感染狀態(tài)，并對患者作出早期診斷，這對于控制傳染源，減少疾病的傳播起著重要的作用。此外，由于金標試紙條無需特殊儀器，無需訓(xùn)練有素的專業(yè)人員，可以滿足基層醫(yī)院、農(nóng)村衛(wèi)生院等臨床檢測的需要，而且大大的降低了成本，方便了患者，適用于大規(guī)模的血清流行病學(xué)調(diào)查。
文檔編號C07K1/26GK102778565SQ20121018655
公開日2012年11月14日 申請日期2012年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月2日
發(fā)明者嚴延生, 張志珊 申請人:嚴延生