專利名稱：一種水稻干旱誘導(dǎo)蛋白及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻干旱誘導(dǎo)表達(dá)蛋白及其編碼基因，以及這種基因的調(diào)控元件在水稻抗旱中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是最主要的三大糧食作物之一，其播種面積占糧食播種面積的1/5，全世界二分之一以上的人口以水稻為主食，同時(shí)也是我國最主要的栽培作物之一。并且，水稻被列為模式作物，有著很豐富和深入的基因組研究基礎(chǔ)。但是水稻的種植對淡水資源的需求量很大，干旱等非生物逆境一直是限制作物生長和產(chǎn)量的重要因素。且隨著全球環(huán)境惡化、氣候 異常等變化將會造成一些水稻主要產(chǎn)區(qū)的水資源的短缺，對水稻的產(chǎn)量影響很大，日益危害著我國的糧食生產(chǎn)安全。所以在全國范圍內(nèi)對于耐旱品種的研究和推廣就很有必要。由于水稻全基因測序工作的完成，針對水稻組織的如基因芯片、蛋白質(zhì)組分析等全基因組表達(dá)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，使得我們分析克隆水稻干旱脅迫下的響應(yīng)基因，進(jìn)而從中發(fā)現(xiàn)新的抗旱基因及其調(diào)控元件成為可能。本發(fā)明所提供的可應(yīng)答干旱的基因，是通過對處于花期的水稻進(jìn)行干旱脅迫處理，利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄譜分析，經(jīng)篩選所得。名稱為L0C_ 0s06g0498800，來源于水稻sativa L ssp. Japonica0 0s06g0498800是一個(gè)脫水素蛋白，在抗旱過程中起到重要作用能穩(wěn)定細(xì)胞膜和許多大分子的結(jié)構(gòu)以避免脫水對細(xì)胞造成的傷害。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，0s06g0498800基因的表達(dá)圖譜具有很高的專一性，且該基因的啟動子為誘導(dǎo)型啟動子，因此能夠在干旱脅迫下在水稻花穗中特異性表達(dá)，從而發(fā)揮抵御干旱逆境的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)來源于水稻的可以準(zhǔn)確應(yīng)答干旱的蛋白及其編碼基因，及這種基因的調(diào)控元件在水稻抗旱中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的可應(yīng)答干旱的蛋白，名稱為L0C_ 0s06g0498800，來源于水稻Oryza sativa L ssp. Japonica。是下述氨基酸殘基序列之一
(1)序列表中的SEQID No: I;
(2)將序列SEQID No: I的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至二十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對植物的生長發(fā)育具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID No: I由176個(gè)氨基酸殘基組成。編碼上述蛋白的基因LOC_ 0s06g0498800,是下述核苷酸序列之一
(1)序列SEQID No:2的核苷酸序列；
(2)編碼序列SEQID No: I蛋白質(zhì)序列的DNA ；
(3)與序列SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；
(4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列SEQID No:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為用0. I X SSPE (或0. I X SSC), 0. 1%SDS的溶液，在65°C下雜交
并洗月吳。序列表中的SEQ ID No:2由 531個(gè)堿基組成，其編碼框?yàn)樽?’端第I位堿基到第531位堿基，編碼具有序列表中的SEQ ID No: I的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的可應(yīng)答干旱的基因的調(diào)控元件為該基因的啟動子區(qū)域，是下述核苷酸序列之一
(1)序列SEQID No:3的核苷酸序列；
(2)與序列SEQID No:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；
(3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列SEQID No:3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為用0. I X SSPEO^O. I X SSC), 0. 1%SDS的溶液，在65°C下雜交
并洗月吳。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和工程菌以及擴(kuò)增該基因中任一片段的引物對，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述水稻花期干旱脅迫應(yīng)答基因或其調(diào)控元件在植物生長發(fā)育中的應(yīng)用，即有效檢測植物所受干旱脅迫程度的方法。具體是將所述水稻花期干旱脅迫應(yīng)答基因的調(diào)控元件啟動子區(qū)域與報(bào)告基因GUS融合后轉(zhuǎn)化水稻，在受過干旱處理的轉(zhuǎn)基因水稻植株里，其報(bào)告基因呈現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)。在實(shí)際應(yīng)用中，將0s06g0498800的啟動子與報(bào)告基因GUS融合，將該構(gòu)建L0C_ 轉(zhuǎn)化水稻，當(dāng)植物受到干旱逆境脅迫時(shí)，報(bào)告基因便開始表達(dá)，因而經(jīng)過一種便捷有效的染色方法即可估量植物水分的缺失，以便及時(shí)補(bǔ)救，從而減少甚至避免損失。傳統(tǒng)基因工程中，通常利用組成型啟動子超量表達(dá)逆境應(yīng)答過程中的重要基因，以提高作物的抗逆性。本發(fā)明是利用誘導(dǎo)型啟動子，這樣一方面可以避免傳統(tǒng)方法的弊端，減輕了目標(biāo)蛋白對植株可能產(chǎn)生的負(fù)面效應(yīng)，另一方面可以驅(qū)動目標(biāo)基因在且只在植株受到誘導(dǎo)信號刺激后才表達(dá)，節(jié)約了植株細(xì)胞內(nèi)有限的資源，且更具目標(biāo)性和專一性。本發(fā)明的0s06g0498800是一個(gè)抗旱基因，可以在水稻受到干旱脅迫時(shí)大量表達(dá)，以抵御干旱逆境。而該基因的啟動子不僅可以通過驅(qū)動報(bào)告基因表達(dá)提供了一種檢測植物遭受干旱脅迫程度的手段，同時(shí)這個(gè)啟動子還可以驅(qū)動其他抗旱基因，使植物受到干旱脅迫時(shí)超量表達(dá)特定的抗旱蛋白，以抵御干旱的傷害。因而本發(fā)明涉及的這種可以有效應(yīng)答水稻干旱脅迫的蛋白及其編碼基因，以及這種基因的有效的專門響應(yīng)干旱刺激的啟動元件在水稻抗旱中應(yīng)用前景廣闊。


圖I為野生型水稻在干旱處理和未處理?xiàng)l件下，L0C_ 0s06g0498800基因熒光定量PCR檢測結(jié)果。圖2為野生型水稻和轉(zhuǎn)基因水稻在干旱和未處理?xiàng)l件下的⑶S染色圖。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。所用引物由英駿生物技術(shù)有限公司完成，測序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。實(shí)施例I.水稻抗旱基因0s06g049徹OO飽篩選。對水稻進(jìn)行正常培養(yǎng)，待到二級枝梗形成時(shí)，停止?jié)菜?，檢測土壤水分含量直至其含量達(dá)到約20%-30%左右，并保持該濕度約一周。取水稻花穗，抽取RNA，利用基因芯片比較分析對照未受干旱脅迫植物與被脅迫植物的基因表達(dá)譜，根據(jù)水稻基因芯片的結(jié)果，篩選到一些候選基因。0s06g0498800就是其中之一。以水稻未受干旱脅迫的花期、受到干旱脅迫的花期的總RNA為模板，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)合成cDNA (依據(jù)Plant RT — PCR Kit 2. 01 (TaKaRa)的用戶手冊進(jìn)行)，用熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)檢測對照植物與被脅迫植物中0s06g0498800的表達(dá)情況(依據(jù)TaKaRa的用戶手冊進(jìn)行)。所用5’和3’引物分別為5'-tcattgtactttgaacattgg-3' (SEQ ID No:4)和 5'-gtcgtcttaatatgaacacaa-S' (SEQ ID No:5)。反應(yīng)按照下列程序進(jìn)行預(yù)變性95°C 3分鐘，I個(gè)循環(huán)；變性95°C 10秒，退火與延伸60°C 30秒，40個(gè)循環(huán)。對比該基因在未受干旱脅迫的花期和受到干旱脅迫的花期的表達(dá)量，我們發(fā)現(xiàn)在受到干旱脅迫的花序中誘導(dǎo)表達(dá)(圖I)。實(shí)施例2.Gs伽辦視嫩^啟動子的克隆。通過網(wǎng)站查找并分析序列，并得到其啟動子部分序列。提取水稻總DNA，以水稻總DNA為模板，PCR擴(kuò)增0s06g0498800的啟動子部分。引物序列分別為5’-ggatcctctacaagatatccaagttga-3’ (SEQ ID No:6)和 5’- ccatggctagctagctagcttaagct -3' (SEQ ID No:7)0 50ul PCR反應(yīng)體系包含水稻基因組DNAlul,高保真酶 KOD plus (T0Y0B0) lul, IOX 緩沖液 5ul，2.5uM dNTP 4ul，25mMMg2+2ul, 20uM 的5’和3，引物各lul, 50%甘油5ul,水30ul。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性2分鐘；94°C變性30秒，55 °C退火30秒鐘，68 °C延伸4分鐘，共35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化約3500bp的擴(kuò)增片段。然后將該片段連至PMD19-T(TAKARA)
，經(jīng)桑尼公司測序正確再經(jīng)SaMl I和AfcoI酶切，大腸桿菌表達(dá)載體pCAMBIA1301桿菌表達(dá)質(zhì)粒 pCAMBIA1301_ 0s06g0498800u_-GUS。實(shí)施例3.重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-浴轉(zhuǎn)化水稻植株。將重組質(zhì)粒pCAMBIA1301- 0s06g0498800]2r⑶S轉(zhuǎn)化到水稻中。參照Hiei等(Plant Mol Biol, 1997,35 :205 — 218)的方法轉(zhuǎn)化水稻。將質(zhì)粒pCAMBIA1301-tts伽辦必6 優(yōu)浴通過電激法轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌EHA105中，經(jīng)篩選獲得陽性克隆。將攜帶質(zhì)粒pCAMBIA1301- 0s06g0498800n~GUS的農(nóng)桿菌EHA105接種到5ml含100mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中28°C搖菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期晚期，再I :100擴(kuò)大培養(yǎng)到0D600為0. I左右。收集農(nóng)桿菌菌體并重懸于轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中。按照常規(guī)方法浸染水稻日本晴的愈傷組織，經(jīng)共培養(yǎng)感染、抗性培養(yǎng)基篩選及分化培養(yǎng)基上分化得到潮霉素抗性的陽性苗。待小苗長至IOcm左右時(shí)，將小苗移至室外網(wǎng)室種植，收種即得Tl代種子。實(shí)施例4.質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因水稻植株報(bào)告干旱脅迫效果的檢測。將得到的轉(zhuǎn)基因水稻Tl代種子以及正常野生型植株正常種植，兩種植株都各分兩組實(shí)驗(yàn)，一組正常種植不做干旱處理；一組正常種植，待到二級枝梗形成時(shí)，停止?jié)菜?，檢測土壤水分含量直至其含量達(dá)到約20%-30%左右，并保持該濕度約一周。取下未受干旱脅迫與經(jīng)過干旱脅迫的兩種植物花序浸于⑶S染液中，于37°C放置24h，70%乙醇浸泡24h以洗脫雜色，觀察經(jīng)過干旱處理與對照組的花器染色程度。圖2即為轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻花序的⑶S染色結(jié)果?？梢?，未經(jīng)干旱處理的轉(zhuǎn)基因水稻植株，其 花序里報(bào)告基因GUS的表達(dá)水平很低，而經(jīng)過干旱處理的轉(zhuǎn)基因水稻植株，其報(bào)告基因的表達(dá)量很高，明顯高于未經(jīng)的對照組。而野生型植株經(jīng)處理與否都未見報(bào)告基因的表達(dá)。因而證明了的啟動子為一種干旱誘導(dǎo)型的啟動子，在植物受到干旱脅迫后在花器官中誘導(dǎo)表達(dá)。此外，我們的結(jié)果還提供了一種檢測植株水分缺失的方法，即通過一種簡單有效的染色即可估量植物水分缺失的程度，以便及時(shí)補(bǔ)救，有效減少甚至避免損失。
權(quán)利要求
1.水稻干旱脅迫應(yīng)答蛋白，其特征在于是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)(1)SEQ ID No: I ; (2)將SEQID No: I的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至二十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且對植物的生長發(fā)育具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述的干旱脅迫應(yīng)答蛋白的基因，其特征在于為下述核苷酸序列之一 (1)SEQID No:2核苷酸序列； (2)編碼SEQID No: I蛋白質(zhì)序列的DNA ； (3)與SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列； (4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQID No:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的干旱脅迫應(yīng)答蛋白的基因的調(diào)控元件，即該基因的啟動子，其特征在于為下述核苷酸序列之一 (1)SEQ ID No:3的核苷酸序列； (2)與SEQID No:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列； (3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQID No:3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.ー種含有權(quán)利要求2所述的水稻干旱脅迫應(yīng)答基因或其調(diào)控元件的表達(dá)載體。
5.ー種含有權(quán)利要求2所述的水稻干旱脅迫應(yīng)答基因或其調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6.ー種含有權(quán)利要求2所述的水稻干旱脅迫應(yīng)答基因或其調(diào)控元件的工程菌。
7.ー種擴(kuò)增權(quán)利要求2所述的水稻干旱脅迫應(yīng)答基因或其調(diào)控元件中任一片段的引物對。
8.如權(quán)利要求2所述的水稻花期干旱脅迫應(yīng)答基因或其調(diào)控元件在植物生長發(fā)育中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于將所述水稻花期干旱脅迫應(yīng)答基因的調(diào)控元件啟動子區(qū)域與報(bào)告基因GUS融合后轉(zhuǎn)化水稻，在受過干旱處理的轉(zhuǎn)基因水稻植株里，其報(bào)告基因呈現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種水稻干旱誘導(dǎo)蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No1所示；編碼花序中受干旱脅迫誘導(dǎo)后特異表達(dá)的蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；此外，本發(fā)明還提供一個(gè)水稻抗旱基因及建立于此基因調(diào)控元件基礎(chǔ)上的能夠有效檢測植物所受干旱脅迫程度的方法。經(jīng)檢測，該方法具有如下特點(diǎn)便捷、快速、能夠估量水稻植株所受干旱影響程度等。本發(fā)明為干旱育種提供了一個(gè)優(yōu)質(zhì)基因及基因調(diào)控元件，對于植物抗旱研究具有重要意義，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，且應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C07K14/415GK102659935SQ20121010555
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者俞瑜, 牟晨, 董愛武, 陳娜 申請人:復(fù)旦大學(xué)