專利名稱：一種γ-醇溶蛋白基因的核酸序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種Y-醇溶蛋白基因的核酸序列及其用途，提供了分析不同SDS沉降值水平的分子標記方法，屬于分子遺傳育種領(lǐng)域，專用于小麥優(yōu)質(zhì)專用品種的選育和種植資源的評價利用
背景技術(shù)：
小麥成熟籽粒蛋白質(zhì)主要由醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，兩者能形成一種具有彈性和韌性的復(fù)合物，稱作面筋。麥谷蛋白主要決定面筋的彈性，醇溶蛋白則賦予面筋延展性。醇溶蛋白在酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)中分為α (最快)、β、Y、ω (最慢)4個區(qū)。大多數(shù)Y-醇溶蛋白和ω-醇溶蛋白分別由I號染色體短臂上的Gli-I和Gli-3位點編碼，與LMW-GS編碼位點Glu-3緊密連鎖；α -醇溶蛋白一般由6號染色體短臂上的Gli_2位點編碼。一般認為3個貯藏蛋白位點與小麥加工品質(zhì)關(guān)系重要性依次為Glu-l > Gli-I> Gli-2。目前已鑒定出一些與小麥品質(zhì)相關(guān)的醇溶蛋白帶或等位基因。多肽一級結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的性質(zhì)。Y-醇溶蛋白的一級結(jié)構(gòu)重復(fù)區(qū)中高密度的谷氨酰胺區(qū)意味著有兩兩可形成氫鍵的-0H，很大程度上決定蛋白質(zhì)的彈性。但醇溶蛋白組分復(fù)雜不易純化，不同類型的醇溶蛋白具體影響面粉品質(zhì)哪些方面還存在爭議，對其一級結(jié)構(gòu)功能區(qū)的研究還不夠透徹。因此很有必要在分子水平上進一步研究醇溶蛋白的分子機理。SDS沉降值與面筋質(zhì)量密切相關(guān)。是衡量小麥面筋數(shù)量和質(zhì)量以及面團流變學(xué)特性的綜合間接指標，同時SDS沉降值基因型間遺傳差異顯著，具有較高遺傳力，國內(nèi)外許多育種者傾向于利用SDS沉降值作為小麥加工品質(zhì)的綜合評價指標。采用SDS沉降值評價小麥加工品質(zhì)的局限是必須等到種子收獲后才能進行選擇和篩選，在育種過程中易造成資源的浪費。因此在小麥育種過程開發(fā)針對SDS沉降值水平的分子標記有非常重要的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以鑒定普通小麥SDS-沉降值水平高低的分子標記。通過對目標帶型的分析，發(fā)現(xiàn)Y-醇溶蛋白谷氨酰胺富集區(qū)對小麥SDS-沉降值水平有正向作用，可用于評價和利用種植資源，加快品質(zhì)育種的進度。為達到本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下本發(fā)明以普通低面筋小麥總DNA為模板，根據(jù)文獻報道的Y-醇溶蛋白基因引物(P3 :5’ TATTAGTTAACGCAAATCCACTATG3’，P4 :5’ GATGAATCAGCTAAGCAACGATG3’)，利用 PCR 和分子克隆技術(shù)分離Y-醇溶蛋白基因，將獲得的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的Y-醇溶蛋白基因序列進行多重比對并分析其在一級結(jié)構(gòu)上的異同，結(jié)果表明我們克隆得到一個新型Y-醇溶蛋白基因，其編碼的Y-醇溶蛋白缺失了大片段的IV谷氨酰胺富集區(qū)，其核酸序列如下
I TATTAGTTAA CGCAAATCCA CTATGAAGAC CTTCCTCATC41 CTAACGATCC TTGCGATGGC AACTACCATC GCCACCGCCA81 ATATGCAGGT CGGCTCCAGC GGCCAAGTAC AATGGCCACA121 ACATCAACAG CTCCCCCAGC CCCAACAACC ACTCTACCAT161 CAACCACAAC AAATATTTCC CCAACCCCGA CAAACATTCC201 CCCATCTACC ACAACAAACA TTTCCCCAAC CCCAACAAAC241 AATCCCCCAT CAACCACAAC AACAATTTCC CCAGACCCAA281 CAACCACTAC AACCATTTCC TCAGCCCCAA CAAACATTCC321 CCCAACAACC ACAACAACCA TTACCCCAAC CTCAACAACC361 CCAACAACCA TTTCCCCAGT CACAACAACC ACAACAACCA401 CAACAACCAT TTCCTCAGCC CCAACAACAA TTCCCGCAGC441 CCCAACAACC CCAACAATCA ATCCCCCAGC AACAACAACC481 ATTGATTCGG TCATCTCTAC AACAACAGAT GAACCCATGC521 AAGAATTTTC TCTTGCAGCA ATGCAACCCT GTGTCGTTGG561 TGTCATCCCT TGTGTCATTG ATCTTTCCTC GAAGTGATTG601 CCAGGTGATG CAGCTACAAT GTTGCCAACA ACTAGCACAG641 ATTCCACAGC AGCTGCAGTG TGCAGCCATC CATAGCGTCG681 TGCATTCCAT CATGATGCAG CAAGAACAAC AACAACCTCA721 ACAACTAGCT CACTTAGAGG TGATTAGGTC ATTGGTGTTG761 AAAACTCTTC AAACCATGTG CAATGTGTAT GTTCGACCTG801 ACTGCTCCAA CATCAGGACA CCATTTGCCA GCACAGTCGC841 CGGCATTGGC GGCCAATGAA AAAAGTTGGT GTTATGCTAA881 TAGGTAGATG GATCA以上序列為本發(fā)明人克隆得到的新型Y-醇溶蛋白的編碼基因，根據(jù)通用密碼子信息，得到其推導(dǎo)的氨基酸序列如下I MKTFLILTIL AMATTIATAN MQVGSSGQVQ WPQHQQLPQP41 QQPLYHQPQQ IFPQPRQTFP HLPQQTFPQP QQTIPHQPQQ81 QFPQTQQPLQ PFPQPQQTFP QQPQQPLPQP QQPQQPFPQS121 QQPQQPQQPF PQPQQQFPQP QQPQQSIPQQ QQPLIRSSLQ161 QQMNPCKNFL LQQCNPVSLV SSLVSLIFPR SDCQVMQLQC201 CQQLAQIPQQ LQCAAIHSVV HSIMMQQEQQ QPQQLAHLEV 241 IRSLVLKTLQ TMCNVYVRPD CSNIRTPFAS TVAGIGGQ該蛋白序列與已公布的具有潛在功能的Y-醇溶蛋白序列多從比對發(fā)現(xiàn)，缺失大片段的谷氨酰胺富集區(qū)(圖I)。本發(fā)明的特異引物正是依據(jù)缺失區(qū)域前后保守序列設(shè)計的編碼框內(nèi)引物P1、P2，目的是通過擴增片段的大小，判斷小麥籽粒中Y-醇溶蛋白是否缺失谷氨酰胺富集區(qū)。本發(fā)明還提供一種擴增Y-醇溶蛋白谷氨酰胺富集區(qū)在內(nèi)的編碼框內(nèi)引物標記小麥SDS-沉降值水平的方法，包括基因組DNA提取、引物設(shè)計(該引物為Pl 5’ TCGTTGGTGTCATCCCTT3’，P2 :5’ GATGGTGGAGCAGTCAGG3’)、基因擴增、特異片段的驗證，其特征在于，以上述新型Y-醇溶蛋白基因的核酸序列進行引物設(shè)計，開發(fā)特異分子標記。所述引物是上述Y-醇溶蛋白基因的核酸序列為模板，擴增的目標片段為261bp，而且以該引物Pl，P2擴增SDS沉降值水平不同的小麥基因組DNA，通過目標帶型分析判斷小麥粉SDS沉降值高低水平。在以低筋小麥材料(川麥32) DNA為模板的擴增條件下，引物P1、P2能擴增出不同長度的片段(圖2)，且以260bp為主要帶型。PCR 反應(yīng)組成DNA100-150 ngdNTPs100 μ M
引物 Pl5 pmol
引物 P25 pmolTaq 聚合酶0.7 U10*PCR 緩沖液2.5 μ LMg2+1.5 mMDdH20加至終體積25 μ L(I ) 94 °C5 min(2)94°C45 s(3 ) 56°C25 sPCR反應(yīng)程序
(4)72°C25 s 重復(fù)(2)——(4) 32次
(5)72 °C8 minPCR擴增產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠上分離，100V恒壓電泳60分鐘。由于經(jīng)典的Y-醇溶蛋白含有谷氨酰胺富集區(qū)，而本發(fā)明從普通小麥中克隆的新型Y-醇溶蛋白編碼序列缺失該區(qū)域。根據(jù)此特征，設(shè)計特異性引物，擴增SDS沉降值水平差異較大的材料，其擴增帶型存在明顯差異(圖3)。在高沉降值材料中，以約400bp的帶型為主(圖4);而在低沉降值的材料中，目標條帶(約260bp)清晰(圖5)。從而根據(jù)帶型特征，能很好地判斷供試材料SDS沉降值的水平。推斷此類Y-醇溶蛋白在普通小麥中存在的規(guī)律，說明Y-醇溶蛋白谷氨酰胺富集區(qū)對小麥品質(zhì)有重要影響。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明是首次從分子水平檢測小麥籽粒SDS沉降值高低水平，種子用量少，并且有利于在育種中快速有目的地選擇優(yōu)質(zhì)專用種植資源，縮短育種年限。效果快捷明顯，有良好的應(yīng)用前景。


圖I是本發(fā)明Y-醇溶蛋白序列與已知Y-醇溶蛋白序列多重比較結(jié)果，缺失大片段的IV谷氨酰胺富集區(qū)富集區(qū)；
圖2是引物對P1、P2在低筋小麥川麥32中的擴增片段，其中M為Marker DM500 ；圖3是引物對P1、P2在不同SDS沉降值水平不同的兩個材料中擴增結(jié)果。其中I、2為低沉降值小麥，3、4為高沉降值小麥，其中M為Marker DM500 ；圖4是引物對P1、P2在高SDS沉降值小麥材料中的擴增結(jié)果。約400bp的擴增帶為亮帶，其中M為Marker DM500 ；圖5是引物對P1、P2在低SDS沉降值小麥材料中的擴增結(jié)果。260bp條帶為亮帶，其中 M 為 Marker DM500。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例詳細地說明本發(fā)明。實施方案為便于更好的理解本發(fā)明，但并非對本發(fā)明的限制。實施例I :I、基因組DNA的提取采取CTAB法提取低筋小麥川麥32的基因組DNA，提取步驟如下(I)取I克新鮮又嫩葉片，液氮研磨成粉后加2*CTAB提取液Iml混勻；(2) 65 °C水浴30-60分鐘，期間輕搖混勻。室溫加入等體積的氯仿異戊醇(24 I)，輕搖混勻10分鐘，IOOOOrpm離心10分鐘； (3)取上清液，加入等體積的異丙醇,冰浴30分鐘，沉淀DNA ；(4) IOOOOrpm離心10分鐘，棄上清，70%乙醇離心洗滌沉淀2次，室溫風(fēng)干DNA沉淀，溶于適量滅菌蒸餾水中；(5) 120V恒壓，I %瓊脂糖凝膠電泳20分鐘，檢測DNA濃度及質(zhì)量。2、根據(jù)已報道的引物序列(P3 :TATTAGTTAACGCAAATCCACTATG，P4 :GATGAATCAGCTAAGCAACGATG)進行PCR擴增，擴增體系如下DNA100-150 ng
dNTPs100 μ M
引物 Ρ35 pmol
引物 Ρ45 pmolPCR反應(yīng)組成
Taq聚合酶0.7 U
10*PCR緩沖液2.5 μL
Mg2+1.5 mM
DdH20加至終體積25 μ L(I ) 94 °C5 min
(2)94°C45 sPCR反應(yīng)程序
(3 ) 57°CI min (4 ) 72 °CI min
重復(fù)(2) - (4) 35次
(5)72 °C8 min3、PCR產(chǎn)物回收和純化使用Biomiga的膠回收試劑盒，操作均按照說明書進行。4、連接和轉(zhuǎn)化使用Takara的連接試劑盒將回收產(chǎn)物連接到PMD-19T載體，操作按說明書進行；將連接產(chǎn)物加入200 μ I感受態(tài)細胞DH5 α (購于天根生化科技有限公司)，充分混勻置于冰上30分鐘，42°C熱擊90秒，37°C振蕩(200rpm)培養(yǎng)45分鐘，IOOOOrpm離心3分鐘收集菌體，均勻涂于含氨芐青霉素(100μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C靜止培養(yǎng)16小時；5、陽性克隆的篩選(I)挑取培養(yǎng)板上生長良好的白色單菌落，在含氨芐青霉素(100μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，擴大培養(yǎng)(37°C培養(yǎng)12小時)；(2)挑取擴大培養(yǎng)后的菌進行PCR擴增，同步將擴大培養(yǎng)后的菌接種于Iml含氨節(jié)青霉素(100 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)6小時；(3)擴增產(chǎn)物在I %瓊脂糖凝膠上分離，100V恒壓30分鐘，檢測有無目的片段。6、序列測定與比對分析隨機選取陽性克隆進行測序，序列測定由華大基因完成。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，采用DNAMAN和MEGA軟件進行序列分析。 7、根據(jù)Y-醇溶蛋白谷氨酰胺富集區(qū)編碼序列前后保守區(qū)域，使用primerpremierf軟件設(shè)計特異引 物對P1、P2，以新克隆的Y -醇溶蛋白基因為模板，其目標片段為260bp左右。8、材料選擇及DNA的提取選擇本實驗室保存的材料100份，三年內(nèi)測定的微量SDS沉降值數(shù)據(jù)穩(wěn)定；材料包含不同SDS沉降值水平。采用CTAB提取所選材料的DNA。9、以引物對Pl，P2擴增所選材料100份，擴增帶型與材料的SDS沉降值水平完全相符(圖4、圖5)。因此推斷低沉降值小麥中Y-醇溶蛋白谷氨酰胺富集區(qū)缺失的類型較多，而高沉降值小麥中Y-醇溶蛋白的類型很少或幾乎不存在谷氨酰胺富集區(qū)的缺失。該分子標記能有效用于小麥材料SDS沉降值水平的篩選。
權(quán)利要求
1.一種Y-醇溶蛋白基因的核酸序列，其特征在于所述基因序列為序列表中SEQ IDNo. I所示的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的Y-醇溶蛋白基因的核酸序列，其特征在于該基因編碼產(chǎn)物缺失大片段的IV谷氨酰胺富集區(qū)。
3.—種Y-醇溶蛋白基因的氨基酸序列，其特征在于所述基因序列為序列表中SEQ IDNo. 2所示的氨基酸序列。
4.一種擴增Y-醇溶蛋白谷氨酰胺富集區(qū)在內(nèi)的編碼框內(nèi)引物標記小麥SDS-沉降值水平的方法，包括基因組DNA提取、引物設(shè)計、基因擴增、特異片段的驗證，其特征在于以權(quán)利要求I所述的Y-醇溶蛋白基因的核酸序列進行引物設(shè)計，開發(fā)特異分子標記。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的引物為Pl :5’ TCGTTGGTGTCATCCCTT3’，P2 :5， GATGGTGGAGCAGTCAGG3，。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述引物是根據(jù)權(quán)利要求I所述的Y-醇溶蛋白基因的核酸序列為模板，擴增的目標片段為261bp。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項所述的方法，其特征在于以引物Pl，P2擴增SDS沉降值水平不同的小麥基因組DNA，通過目標帶型分析判斷小麥粉SDS沉降值高低水平。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種γ-醇溶蛋白基因的核酸序列，其基因序列為序列表中SEQ ID No.1所示的核酸序列，該醇溶蛋白缺失大片段的谷氨酰胺富集區(qū)。本發(fā)明還公開了擴增γ-醇溶蛋白谷氨酰胺富集區(qū)在內(nèi)的編碼框內(nèi)引物標記小麥SDS-沉降值水平的方法，包括基因組DNA提取、引物設(shè)計、基因擴增、特異片段的驗證。該方法中設(shè)計了特征引物P1，P2，此特征引物可作為供試材料SDS沉降值水平高低的標記，便于優(yōu)質(zhì)種植資源的篩選，加快品質(zhì)育種的進程，提高育種效率。
文檔編號C07K14/415GK102618555SQ20121009087
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者吳瑜, 張靜, 李竹林, 李莉蓉, 李韻芳, 林旭群, 魯璐 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所