專利名稱：p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制備方法及其在損傷中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及P75NTR-ED-FC融合蛋白的制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system, CNS)損傷與修復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)及大量移植修復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)成年哺乳動(dòng)物CNS損傷后不僅可再生而且由神經(jīng)元固有的特性(Intrinsic properties)和其所處的微環(huán)境(Environment cues)決定，與周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的成功再生相比，CNS再生失敗的主要原因是由于損傷微環(huán)境中多種再生抑制分子，如Nogo-A、MAG (Myelin-associated glycoprotein)和 OMgp (Oligodendrocytenyelin glycoprotein)的存在。它們均能獨(dú)立通過 Nogo-66 受體(Nogo-66 receptor,NgR)及其下游可能的信號(hào)通路參與神經(jīng)再生的抑制作用。NgR是ー 種GPI (Glycosyl phosphatidyl inositol)錨定膜蛋白，本身無信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，其下游分子的活化需要其協(xié)同受體(Co-receptor)的參與。研究表明中樞神經(jīng)神經(jīng)元p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體(p75 neurotrophin receptor, p75NTR)作為NgR的一個(gè)協(xié)同受體，可通過其細(xì)胞外域(Extracellular domain, ED)與NgR碳末端結(jié)合介導(dǎo)髓磷脂抑制物對(duì)軸突再生的抑制作用。目前雖然P75NTR抑制劑在體外可增強(qiáng)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)，但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)卻仍未證實(shí)其能夠促進(jìn)損傷中樞神經(jīng)元的軸突再生及功能恢復(fù)。研究表明，體外移植p75NTR高表達(dá)的雪旺細(xì)胞(Schwann cells, SCs)，嗅鞘細(xì)胞 (Olfactory enshenthing cells, OECs),神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells, NSCs)等均可促進(jìn)損傷脊髄的軸突再生和功能改善。盡管其作用機(jī)制目前尚不清楚，但它們有ー個(gè)共同特點(diǎn)，即均高表達(dá)P75NTR。這些細(xì)胞表面高表達(dá)的P75NTR在移植于損傷脊髓后可能與再生環(huán)境中神經(jīng)元的NgR-配體復(fù)合物發(fā)生相互作用，拮抗神經(jīng)元的NgR信號(hào)通路，減少再生抑制分子的抑制效應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)軸突的再生。但靠細(xì)胞培養(yǎng)移植治療脊髓損傷，過程相對(duì)復(fù)雜，培養(yǎng)成本較高，可操作性不強(qiáng)，很難形成大規(guī)模生產(chǎn)。目前重組蛋白的表達(dá)體系主要有真核表達(dá)體系和原核表達(dá)體系。真核表達(dá)體系最常用的為酵母表達(dá)體系和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系。盡管真核表達(dá)體系可產(chǎn)生具有天然立體結(jié)構(gòu)的分泌型蛋白，但真核表達(dá)體系也有其致命的缺點(diǎn)。如酵母表達(dá)體系糖鏈與哺乳動(dòng)物加工不一致，培養(yǎng)上清中糖濃度較高，部分蛋白產(chǎn)物易降解，表達(dá)量不可控；再如哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量通常較低，穩(wěn)定細(xì)胞系建立技術(shù)難度大，生產(chǎn)成本高，遠(yuǎn)不能滿足未來藥物開發(fā)的需要。原核表達(dá)體系中最常用的為大腸桿菌coh)，其遺傳背景清楚，基因工程操作簡(jiǎn)便，商品化表達(dá)載體種類齊全，表達(dá)效率高，更重要的是其生產(chǎn)成本低、周期短，適合大規(guī)模生產(chǎn)。盡管其表達(dá)的蛋白很難進(jìn)行正確折疊，生物活性較低，但PET 原核表達(dá)系統(tǒng)通過對(duì)載體及宿主的改進(jìn)，該狀況已有較大改觀
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種p75NTR-ED_Fc融合蛋白的制備方法，以提高 p75NTR-ED-Fc融合蛋白的表達(dá)效率和生物活性。本發(fā)明的另一目的是提供p75NTR-ED-Fc融合蛋白的新用途，具體講是提供 p75NTR-ED-Fc融合蛋白在損傷中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)中的應(yīng)用，以促進(jìn)損傷中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)。本發(fā)明所述p75NTR-ED_Fc融合蛋白的制備方法由以下步驟實(shí)現(xiàn)
(1)p75NTR-ED-Fc原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
以真核表達(dá)載體pcDNA-p75NTR-ED-Fc質(zhì)粒為模板，根據(jù)Genebank中編號(hào)為 NM_002507. I的p75NTR核苷酸序列及編號(hào)為XM_002348257. I的IgG的Fe段核苷酸序列分別設(shè)計(jì)特異的P75NTR正向引物和半特異的p75NTR/Fc反向引物，并在引物兩端分別弓I入 Kpn I, Xho I酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的保護(hù)堿基，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到p75NTR-ED-Fc片段，引物序列如下
Forward primer: 5' CGGGGTACCATGGGGGCAGGTGCCACC 3'
Kpn I酶切位點(diǎn)
Reverse primer: 5’ CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3’
Xho I酶切位點(diǎn)
PCR擴(kuò)增獲得的p75NTR-ED-Fc片段，經(jīng)Kpn I和Xho I雙酶切后回收純化并將其克隆于同樣雙酶切的pET32a+表達(dá)載體中，最終獲得含硫氧還蛋白及His標(biāo)簽的 pET-p75NTR-ED-Fc原核表達(dá)載體，對(duì)獲得的pET-p75NTR-ED_Fc重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切和測(cè)序鑒定驗(yàn)證其插入序列的準(zhǔn)確性；
(2)Trx-p75NTR-ED-Fc融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-p75NTR-ED-Fc轉(zhuǎn)化至萬.coB BL-21 pLys感受態(tài)細(xì)胞中， 挑選白色克隆于LB培養(yǎng)基中，35 39°C，220 280rpm振蕩培養(yǎng)約4 7小時(shí)，在OD6tltl達(dá)到0. 5 I. 0時(shí)加入IPTG至終濃度為0. 8 I. 2mmol/L,繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)12 20小時(shí)，高速冷凍離心機(jī)離心收集培養(yǎng)好的菌體后重懸于Tris-HCl緩沖液中，然后用超聲破菌，離心， SDS-PAGE電泳初歩檢測(cè)菌體上清及沉淀中蛋白的表達(dá)情況；
(3)Trx-p75NTR-ED-Fc融合蛋白的純化
取步驟(2)所得上清，利用His-tag親和層析柱純化破菌上清中的目標(biāo)融合蛋白 Trx-p75NTR-ED-Fc，將該純化后的目標(biāo)融合蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc通過脫鹽柱除去溶液中的咪唑和NaCl ；
(4)酶切除去Trx
在純化后的融合蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc溶液中加入重組牛腸激酶，酶切除去Trx，獲得p75NTR-ED-Fc融合蛋白；
(5)p75NTR-ED-Fc融合蛋白的純化
利用Hi s-tag親和層析柱對(duì)酶切后的融合蛋白p75NTR-ED-Fc進(jìn)行純化，得到含有切去融合標(biāo)簽Trx的融合蛋白p75NTR-ED-Fc，利用陰離子交換層析柱對(duì)所得融合蛋白 p75NTR-ED-Fc進(jìn)ー步純化，并進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western blot鑒定，將純化后的融合蛋白采用透析緩沖液透析到保存緩沖液中，獲得最終蛋白產(chǎn)品。本發(fā)明所述制備方法利用大腸桿菌pET32a+表達(dá)體系采用基因工程方法構(gòu)建外源融合蛋白p75NTR-ED-Fc與原核多肽硫氧還蛋白(Trx)及His標(biāo)簽(Tag)的融合蛋白， 不僅具有上述原核表達(dá)體系的優(yōu)點(diǎn)，而且易于純化，大大提高了表達(dá)蛋白的生物活性。另外，本發(fā)明利用人p75NTR-ED-Fc融合蛋白拮抗NgR信號(hào)達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)損傷后再生的目的具有明顯優(yōu)勢(shì)受體-Fe (Fragmentcristallizable)融合蛋白已被證實(shí)是除了抗體藥物外，清除體內(nèi)多余配體分子的又一有效手段，且與抗體藥物相比，不必進(jìn)行繁瑣的抗體篩選和人源化過程；受體結(jié)構(gòu)域在融合蛋白中執(zhí)行結(jié)合配體的功能，而Fe部分可有多種作用， 如可使用通用的標(biāo)記ニ抗進(jìn)行檢測(cè)，可通過與protein A的結(jié)合而使用親和層析方便地純化，更重要的是可大大延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期。除上述優(yōu)勢(shì)外，P75NTR-ED與Fe結(jié)合還可提高P75NTR-ED的濃度并使其固定，從而模擬SCs、OECs等細(xì)胞的p75NTR定位，有利于充分提高其生物學(xué)功能。為觀察重組p75NTR-ED_Fc融合蛋白在中樞神經(jīng)損傷修復(fù)過程中對(duì)抗NgR信號(hào)對(duì)神經(jīng)再生及功能恢復(fù)的影響，分別采用體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該重組蛋白對(duì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的促進(jìn)效應(yīng)及對(duì)損傷脊髄的修復(fù)作用。


圖IA是重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果圖，其中M為DNA Marker DL 2000,1、2分別為克隆1、2 ；
圖IB是重組質(zhì)粒pET-p75NTR-ED-Fc酶切鑒定結(jié)果圖，其中I: pET_32a+ Kpn I+Xho I 雙酶切，2:重組 pET-p75NTR-ED-Fc Kpn I+Xho I 雙酶切，M: Wide Range DNA Marker (500-15000),3: pET-32a+ Xho I 單酶切，4:重組 pET-p75NTR-ED_Fc Xho I 單酶切;
圖2是重組p75NTR-ED-Fc融合蛋白的表達(dá)和純化的SDS-PAGE結(jié)果圖，其中M :蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，I :未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全菌裂解液，2 :經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的全菌裂解液，3 :經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的破菌上清，4 :經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體破菌沉淀，5 6 :破菌上清His-tag柱穿流樣(未結(jié)合到親和柱的部分)，7 :破菌上清His-tag柱洗脫樣(Trx-p75NTR-ED-Fc蛋白)，8 :酶切除去Trx純化的重組p75NTR-ED-Fc蛋白；
圖3是重組p75NTR-ED-Fc融合蛋白的Western Blot鑒定結(jié)果圖，其中1_2 :純化的目標(biāo)蛋白，3:未誘導(dǎo)的破菌上清；
圖4A是重組p75NTR-ED-Fc可中和MAG對(duì)神經(jīng)突起生長(zhǎng)的抑制作用，在預(yù)先用MAG 處理的培養(yǎng)液中培養(yǎng)大鼠新生鼠背根節(jié)神經(jīng)元(Dorsal root ganglia, DRG),加入 p75NTR-ED-Fc培養(yǎng)24h后與只加MAG組進(jìn)行比較，標(biāo)尺100_ ；
圖4B是重組p75NTR-ED-Fc可中和MAG對(duì)神經(jīng)突起生長(zhǎng)的抑制作用，統(tǒng)計(jì)分析各組神經(jīng)元平均突起長(zhǎng)度圖，其中數(shù)據(jù)表示為均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤(與MAG組相比，*#，p〈0. 001)；
圖5A是免疫熒光法檢測(cè)不同處理神經(jīng)元中NgR的表達(dá)，用兔抗NgR抗體免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示圖，標(biāo)尺50_ ；
圖5B是免疫熒光法檢測(cè)不同處理神經(jīng)元中NgR的表達(dá)，NgR表達(dá)強(qiáng)度的定量分析結(jié)果圖(與 MAG 組相比，#，p〈0. 001)。圖6A是脊髓半橫斷模型行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果，BBB評(píng)分結(jié)果圖(與單純損傷(SCI)組相比，*，p〈0. 05 ;**, p〈0. 01)；
圖6B是脊髓半橫斷模型行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果，足跡試驗(yàn)結(jié)果圖(紅色標(biāo)記大鼠前掌，藍(lán)色標(biāo)記后掌，d表示后掌中心垂直間距)；
圖6C是脊髓半橫斷模型行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果，足跡試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖(與SCI組相比，#， p〈0. 01)；
圖6D是脊髓半橫斷模型的神經(jīng)電生理學(xué)檢測(cè)結(jié)果；
圖7A是核黃(Nuclear yellow, NY)逆行示蹤標(biāo)記各組損傷部位頭側(cè)(距損傷部位中心上游約5mm處)脊髄冠狀切片圖，結(jié)果顯示p75NTR-ED-Fc蛋白可促進(jìn)脊髓損傷后軸突的再生，標(biāo)尺80mm ；
圖7B是核黃(Nuclear yellow, NY)逆行示蹤結(jié)果顯示p75NTR_ED_Fc蛋白可促進(jìn)脊髓損傷后軸突的再生。以脊髓損傷部位頭側(cè)逆行標(biāo)記的陽性神經(jīng)元數(shù)目表示軸突的再生情況(與 SCI 組相比，_，p〈0. 0001)；
圖8A是免疫熒光法檢測(cè)損傷脊髓組織中NgR的表達(dá)，用兔抗NgR抗體免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示圖，標(biāo)尺80_ ；
圖8B是免疫熒光法檢測(cè)損傷脊髓組織中NgR的表達(dá)，NgR表達(dá)強(qiáng)度的定量分析結(jié)果圖 (與 SCI 組相比，***，p〈0. 0001)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施I :p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制備方法由以下步驟實(shí)現(xiàn)
(I) p75NTR-ED-Fc表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
為獲得大量天然表達(dá)的p75NTR-ED-Fc融合蛋白，本發(fā)明以真核表達(dá)載體 pcDNA-p75NTR-ED-Fc質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存)為模板,根據(jù)Genebank中編號(hào)為NM_002507. I 的p75NTR核苷酸序列及編號(hào)為XM_002348257. I的IgG的Fe段核苷酸序列分別設(shè)計(jì)特異的P75NTR正向引物和半特異的p75NTR/Fc反向引物，并在引物兩端分別引入Kpn I.Xho I 酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的保護(hù)堿基，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到p75NTR-ED-Fc片段，引物序列如下
Forward primer: 5' CGGGGTACCATGGGGGCAGGTGCCACC 3'
KpnI酶切位點(diǎn)
Reverse primer: 5’ CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3’
Xho I酶切位點(diǎn)按以下方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.P75NTR-ED-FC融合蛋白的制備方法，其特征在于，由以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)p75NTR-ED-Fc原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定以真核表達(dá)載體pcDNA-p75NTR-ED-Fc質(zhì)粒為模板，根據(jù)Genebank中編號(hào)為 NM_002507. I的p75NTR核苷酸序列及編號(hào)為XM_002348257. I的IgG的Fe段核苷酸序列分別設(shè)計(jì)特異的P75NTR正向引物和半特異的p75NTR/Fc反向引物，并在引物兩端分別弓I入 Kpn I, Xho I酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的保護(hù)堿基，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到p75NTR-ED_Fc片段，引物序列如下Forward primer: 5' CGGGGTACCATGGGGGCAGGTGCCACC 3'Kpn I酶切位點(diǎn)Reverse primer: 5’ CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3’Xho I酶切位點(diǎn)PCR擴(kuò)增獲得的p75NTR-ED-Fc片段，經(jīng)Kpn I和Xho I雙酶切后回收純化并將其克隆于同樣雙酶切的pET32a+表達(dá)載體中，最終獲得含硫氧還蛋白及His標(biāo)簽的 pET-p75NTR-ED-Fc原核表達(dá)載體，對(duì)獲得的pET-p75NTR-ED_Fc重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切和測(cè)序鑒定驗(yàn)證其插入序列的準(zhǔn)確性；(2)Trx-p75NTR-ED-Fc融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-p75NTR-ED-Fc轉(zhuǎn)化至疋co7i BL-21 pLys感受態(tài)細(xì)胞中， 挑選白色克隆于LB培養(yǎng)基中，35 39°C，220 280rpm振蕩培養(yǎng)約4 7小時(shí)，在OD6tltl達(dá)到O. 5 I. O時(shí)加入IPTG至終濃度為O. 8 I. 2mmol/L,繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)12 20小時(shí)，高速冷凍離心機(jī)離心收集培養(yǎng)好的菌體后重懸于Tris-HCl緩沖液中，然后用超聲破菌，離心， SDS-PAGE電泳初步檢測(cè)菌體上清及沉淀中蛋白的表達(dá)情況；(3)Trx-p75NTR-ED-Fc融合蛋白的純化取步驟(2)所得上清，利用His-tag親和層析柱純化破菌上清中的目標(biāo)融合蛋白 Trx-p75NTR-ED-Fc，將該純化后的目標(biāo)融合蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc通過脫鹽柱除去溶液中的咪唑和NaCl ；(4)酶切除去Trx在純化后的融合蛋白Trx-p75NTR-ED-Fc溶液中加入重組牛腸激酶，酶切除去Trx，獲得p75NTR-ED-Fc融合蛋白；(5)p75NTR-ED-Fc融合蛋白的純化利用Hi s-tag親和層析柱對(duì)酶切后的融合蛋白p75NTR-ED-Fc進(jìn)行純化，得到含有切去融合標(biāo)簽Trx的融合蛋白p75NTR-ED-Fc，利用陰離子交換層析柱對(duì)所得融合蛋白 p75NTR-ED-Fc進(jìn)一步純化，并進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western blot鑒定，將純化后的融合蛋白采用透析緩沖液透析到保存緩沖液中，獲得最終蛋白產(chǎn)品。
2.p75NTR-ED-Fc融合蛋白在損傷中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制備及應(yīng)用。該p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制備方法能夠提高p75NTR-ED-Fc融合蛋白的表達(dá)效率和生物活性，p75NTR-ED-Fc融合蛋白能夠用于促進(jìn)損傷中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102586313SQ201210053808
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月5日
發(fā)明者伍亞民, 朱楓, 王永堂, 魯秀敏, 黃鵬, 龍?jiān)谠?申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所