專利名稱：一種天然抗氧化肽Tiannanin-B1及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種具有抗氧化活性的多肽一天然抗氧化肽Tiarmanin-Bl及其制備方法和在化妝品中的應用。
背景技術(shù)：
自由基是機體氧化反應中產(chǎn)生的有害化合物，具有強氧化性，可損害機體的組織和細胞，進而引起慢性疾病及衰老效應。在正常生理狀態(tài)下，機體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但當機體處于不良環(huán)境狀態(tài)下，以及隨著年齡的增長，體內(nèi)的自由基將會產(chǎn)生過多或清除過慢。自由基清除劑也稱為抗氧化劑，可清除體內(nèi)多余的自由基，減輕它們對機體的損傷。目前，一直公認的自然界生物體中存在著2套抗氧化系統(tǒng)，第一套是蛋白質(zhì)大分子，比如SOD ；第二套為有機小分子，比如Vc、BHT等?；瘜W合成的抗氧化劑如BHA、BHT等， 本身具有毒、副作用，各國政府紛紛對其強制規(guī)定了 ADI值，控制其過量添加。化妝品中常見的抗氧化劑，如維生素C、維生素E及SOD等，其氧化活性又有限。而天然蝦青素之類的天然抗氧化劑的添加產(chǎn)品，由于其賣點為“天然”，售價普遍過高，難以為大眾所接受。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種天然抗氧化肽Tiarmanin-Bl及其制備方法和在化妝品中的應用，用中國特有臭蛙的皮膚中存在的天然抗氧化肽替代傳統(tǒng)的抗氧化劑，開發(fā)新一代天然，極低毒、高效的抗氧化類化妝品。隨著多肽組學和基因組學的發(fā)展，本發(fā)明在青蛙皮膚中發(fā)現(xiàn)了第三套抗氧化系統(tǒng)，其由基因編碼的多肽構(gòu)成，這種多肽多由10-20個氨基酸殘基組成。這種天然抗氧化肽是高原地區(qū)兩棲動物的皮膚對抗紫外損傷有效而強大的武器，對其生存是至關(guān)重要的，且其來源天然，低毒、高效的特性，更符合現(xiàn)代人對化妝品的要求。本發(fā)明所獲得的天然抗氧化肽來源于中國特有的臭蛙(Odorrana andersonii)的皮膚分泌物。蛙類，是動物從水生生活到陸生生活的重要過渡類型，其皮膚裸露，富含腺體， 能分泌大量的活性物質(zhì)，包括抗菌肽、激肽、鎮(zhèn)痛肽等，其中還有大量未知功能的多肽。臭蛙是蛙類動物的“祖先”，因其皮膚在受刺激時能分泌具有刺激性氣味的混合物而得名。根據(jù)以往工作的經(jīng)驗顯示，選取祖先種提取到的有效成分，其活性較強，本發(fā)明選用了蛙類的祖先云南臭蛙，且實驗結(jié)果符合預期的推測。本發(fā)明的天然抗氧化肽Tiarmanin-Bl按以下方法制備①皮膚分泌物的獲取用6V的電壓刺激云南臭蛙的皮膚6s，之后以25mM Tris-HCl緩沖液(pH = 7.8)清洗臭蛙的身體，收集皮膚分泌物，將收集到的分泌物于 4000rpm離心15min，將上清液真空冷凍干燥，并儲存于_80°C備用；②多肽的純化將凍干的上清液樣品重新溶解，上預先用25mM Tris-HCl緩沖液 (pH = 7. 8，含有0. IM NaCl)平衡好的S印hadex G-75凝膠過濾柱，以0. 3ml/min的流速進行洗脫，每IOmin收集一次。洗脫產(chǎn)物用280nm監(jiān)測，繪制分離純化圖譜，收集到抗氧化活性成分，并用C4柱除去里面的鹽分后冷凍真空干燥。之后，用20mM的NaAc-HAc緩沖液(pH =4. 0)溶解樣品，用相同緩沖液平衡好的Resource S分離柱進行純化，利用含有IM NaCl 的同一緩沖液、以lml/min的流速進行洗脫，洗脫液用215nm波長進行監(jiān)測，收集到具有抗氧化活性的成分，之后用含0.1% (v/v)TFA的超純水平衡好的HPLC C18分離柱進行分離， 利用含有0. 1% (v/v)TFA的乙腈以0. 7ml/min的流速洗脫，洗脫液在215nm下進行監(jiān)測，最終獲取天然抗氧化肽Tiarmanin-Bl純品?？寡趸钚栽u估樣品抗氧化活性的評估反映在其對自由基的清除率上，具體如下首先配置ABTS儲存液在水溶液溶解2. 8mM過硫酸鉀和7mM ABTS,避光反應至少6小時，之后，立即用水稀釋125倍，50微升溶于水的樣品加入50微升ABTS稀釋液，避光反應至少10分鐘，之后，在415nm波長下讀其吸光度，樣品抗氧化活性用如下公式進行計算
(Ablank-Asample) X 100/Ablank。經(jīng)上述方法制備得到天然抗氧化肽Tiarmanin-Bl，其為基因編碼產(chǎn)物。N端到C端的序列VVKFPYRCKAAF。活性2ug/ml的濃度下即可清除30%的自由基，具有一定的殺菌、 免疫調(diào)節(jié)以及水平衡調(diào)節(jié)的活性。產(chǎn)品主要技術(shù)指標抗氧化肽的活性評估標準是能發(fā)揮作用的最小濃度(ug/ml 或 umol/ml)。本發(fā)明的天然抗氧化肽Tiarmanin-Bl，應用于化妝品的制備，將天然抗氧化肽直接投入到化妝品的配方中去，具有純天然、高效的特點，并具有一定的殺菌、免疫調(diào)節(jié)以及水平衡調(diào)節(jié)的活性。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較具有以下優(yōu)點①采自中國特有臭蛙的皮膚，其在蛙類皮膚中的主要作用是保護裸露在外的皮膚不受紫外線的傷害——回歸本源、純天然，符合現(xiàn)如今大眾的消費要求。②活性比傳統(tǒng)的抗氧化劑BHT強1000倍。③除了具有抗氧化活性，還具有一定的抗菌活性、免疫調(diào)節(jié)活性、抑制黑色素形成活性。本發(fā)明的應用是化妝品行業(yè)的一次創(chuàng)舉，將成為化妝品行業(yè)的新一枝標桿。


圖1是本發(fā)明的天然抗氧化肽Tiarmanin-Bl制備的工藝流程圖。
具體實施例方式①皮膚分泌物的獲取用6V的電壓刺激云南臭蛙的皮膚6s，之后以25mM Tris-HCl緩沖液(pH = 7.8)清洗臭蛙的身體，收集皮膚分泌物，將收集到的分泌物于 4000rpm離心15min，將上清液真空冷凍干燥，并儲存于_80°C備用；②多肽的純化將凍干的上清液樣品重新溶解，上預先用25mM Tris-HCl緩沖液 (pH = 7. 8，含有0. IM NaCl)平衡好的S印hadex G-75凝膠過濾柱，以0. 3ml/min的流速進行洗脫，每IOmin收集一次。洗脫產(chǎn)物用280nm監(jiān)測，繪制分離純化圖譜，收集到抗氧化活性成分，并用C4柱除去里面的鹽分后冷凍真空干燥。之后，用20mM的NaAc-HAc緩沖液(pH = 4. 0)溶解樣品，用相同緩沖液平衡好的Resource S分離柱進行純化，利用含有IM NaCl的同一緩沖液、以lml/min的流速進行洗脫，洗脫液用215nm波長進行監(jiān)測，收集到具有抗氧化活性的成分，之后用含0. 1% (v/v) TFA的超純水平衡好的HPLC C18分離柱進行分離，利用含有0. 1% (v/v)TFA的乙腈以0. 7ml/min的流速洗脫，洗脫液在215nm下進行監(jiān)測，最終獲取天然抗氧化肽Tiarmanin-Bl純品。其為基因編碼產(chǎn)物。N端到C端的序列 VVKFPYRCKAAF?；钚?ug/ml的濃度下即可清除30%的自由基，具有一定的殺菌、免疫調(diào)節(jié)以及水平衡調(diào)節(jié)的活性?？寡趸钚栽u估樣品抗氧化活性的評估反映在其對自由基的清除率上，具體如下首先配置ABTS儲存液在水溶液溶解2. 8mM過硫酸鉀和7mM ABTS,避光反應至少6小時，之后，立即用水稀釋125倍，50微升溶于水的樣品加入50微升ABTS稀釋液，避光反應至少10分鐘，之后，在415nm波長下讀其吸光度，樣品抗氧化活性用如下公式進行計算
(Ablank-Asample) X 100/Ablank。本發(fā)明的天然抗氧化肽Tiarmanin-Bl應用于化妝品的制備，將天然抗氧化肽直接投入到化妝品的配方中去，純天然、高效、具有一定的殺菌、免疫調(diào)節(jié)以及水平衡調(diào)節(jié)的活性。
權(quán)利要求
1.一種天然抗氧化肽Tiarmanin-Bl，其特征在于天然抗氧化肽Tiarmanin-Bl，其為基因編碼產(chǎn)物，N端到C端的序列VVKFPYRCKAAF。
2.權(quán)利要求1所述的天然抗氧化肽Tiarmanin-Bl的制備方法，其特征在于按以下步驟進行①皮膚分泌物的獲取用6V的電壓刺激云南臭蛙的皮膚6s，之后以25mMTris-HCl 緩沖液pH = 7. 8清洗臭蛙的身體，收集皮膚分泌物，將收集到的分泌物于4000rpm離心 15min，將上清液真空冷凍干燥，并儲存于-80°C備用；②多肽的純化將凍干的上清液樣品重新溶解，上預先用25mMTris-HCl緩沖液pH = 7. 8，含有0. IM NaCl平衡好的kphadex G-75凝膠過濾柱，以0. 3ml/min的流速進行洗脫， 每IOmin收集一次洗脫液；洗脫液用280nm監(jiān)測，繪制分離純化圖譜，收集到抗氧化活性成分，并用C4柱除去里面的鹽分后冷凍真空干燥后，用20mM的NaAc-HAc緩沖液pH = 4. 0溶解樣品，用相同緩沖液平衡好的Resource S分離柱進行純化，利用含有IM NaCl的同一緩沖液、以lml/min的流速進行洗脫，洗脫液用215nm波長進行監(jiān)測，收集到具有抗氧化活性的成分后，用含0. 1%V/VTFA的超純水平衡好的HPLC C18分離柱進行分離，利用含有0. 1% v/vTFA的乙腈以0. 7ml/min的流速洗脫，洗脫液在215nm下進行監(jiān)測，最終獲取天然抗氧化月太 Tiannanin-Bl 純品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的天然抗氧化肽Tiarmanin-Bl的制備方法，其特征在于抗氧化活性評估具體如下首先配置ABTS儲存液在水溶液溶解2. 8mM過硫酸鉀和7mM ABTS,避光反應至少6小時，之后，立即用水稀釋125倍，50微升溶于水的樣品加入50微升ABTS稀釋液，避光反應至少10分鐘，之后，在415nm波長下讀其吸光度，樣品抗氧化活性用如下公式進行計算(Ablank-Asample) X 100/Ablank0
4.權(quán)利要求1所述的天然抗氧化肽Tiarmanin-Bl的應用，其特征在于將抗氧化活性的多肽Tiarmanin-Bl應用于化妝品的制備中，將天然抗氧化肽直接投入到化妝品的配方中。
全文摘要
本發(fā)明是一種天然抗氧化肽Tiannanin-B1及其制備方法和應用。該天然抗氧化肽Tiannanin-B1為基因編碼產(chǎn)物，N端到C端的序列VVKFPYRCKAAF。其采自中國特有臭蛙的皮膚制備而成，其在蛙類皮膚中的主要作用是保護裸露在外的皮膚不受紫外線的傷害，將抗氧化活性的多肽Tiannanin-B1應用于化妝品的制備中?；貧w本源、純天然，符合現(xiàn)如今大眾的消費要求?；钚员葌鹘y(tǒng)的抗氧化劑BHT強1000倍。除了具有抗氧化活性，還具有一定的抗菌活性、免疫調(diào)節(jié)活性、抑制黑色素形成活性。
文檔編號C07K7/08GK102532273SQ20121001412
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月17日
發(fā)明者梁醒財 申請人:梁醒財