專(zhuān)利名稱(chēng)：作為用來(lái)穩(wěn)定生物屏障的活性劑的肽的制作方法
作為用來(lái)穩(wěn)定生物屏障的活性劑的肽本發(fā)明涉及化合物，尤其是肽，其能夠穩(wěn)定上皮和內(nèi)皮的屏障功能。本發(fā)明的肽和其它化合物可用于治療和預(yù)防與上皮和內(nèi)皮屏障功能的局部或全身衰竭(系統(tǒng)衰竭，系統(tǒng)破壞，系統(tǒng)崩潰，systemic breakdown)相關(guān)的疾病或病癥(障礙)。借助于本文提供的肽或其它化合物、方法和應(yīng)用加以治療和/或預(yù)防的特定疾病和病癥是燒傷、急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、通氣機(jī)引起的肺損傷(VILI)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、急性腎損傷(AKI)、膿毒病、多器官功能障礙綜合征(MODS)、或水腫。Rho GTP酶控制細(xì)胞行為的許多方面如細(xì)胞骨架的組構(gòu)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞増殖、細(xì)胞分化、基因表達(dá)、細(xì)胞存活和凋亡(Nature (2006)，440 (7087):1069-1072; Curr Drug Targets (2010), 11(9) : 1043-1058)。它們的功能的ー個(gè)主要方面是控制血管表面的通透性(Cardiovasc Res (2010), 87 (2) : 243-253; ThrombHaemost (2010) , 103(1) : 4 0 - 5 5 ;A m J PhysiolLung Cell MolPhysiol (2005), 288 (2) : L294-L306)和上皮表面的通透性(AmJ Pathol (2010), 177(2):512-524;Physiology (Bethesda) (2010)，25 (I) : 16-26)。由于它們?cè)谡{(diào)節(jié)通透性方面的重要作用，所以Rho GTP酶的激活對(duì)于與上皮和內(nèi)皮屏障功能的衰竭相關(guān)的許多病理生理過(guò)程是決定性的。這樣的病理過(guò)程可以是病癥和疾病，其包括燒傷、急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、通氣機(jī)引起的肺損傷(VILI)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、急性腎損傷(AKI)、膿毒病、多器官功能障礙綜合征(MODS) (Med Sci Monit (2010)，16 (4):112-118;Microvasc Res (2009)，77 (I):39-45;Anesthesiology(2010), 113:1134-1143;Curr Pharm Des (2009)，15(27):3108-3115;Mol Interventions(2004), 4(6):349-357;Circ Res (2006)，98(3):322—334;Am J Physiol Renal Physiol(2009), 297(2):F316-F326;Exp CellRes(2011)，317(6):859-872;Transl Res(2010)，155(1):44-54;Burns (2003), 29(8) :820-827)或水腫，尤其是與進(jìn)行性組織水腫相關(guān)的疾病(N Engl JMed (2010) ,363:689-691)。對(duì)于這些疾病的治療，Rho GTP酶以及隨后Rho-激酶的藥理抑制是有前途的方法(Trends Cell Biol (2008)，18:210-219)。斯達(dá)汀和ニ膦酸鹽是這樣的物質(zhì)，其影響類(lèi)異戊ニ烯的生物合成，因而防止Rho GTP酶的脂質(zhì)修飾，其是它們的激活所必要的，如下所述。斯達(dá)汀和ニ膦酸 鹽在臨床研究中被測(cè)試作為抵抗癌癥和心臟疾病的藥物，以及被測(cè)試它們改善病癥的血管和上皮屏障功能的能力。例如，法舒地爾是Rho-激酶抑制劑，其用于腦動(dòng)脈的血管痙攣和肺高血壓。另外，已描述了，通過(guò)抑制Rho GTP酶RhoA, VE-1丐黏著蛋白結(jié)合、血纖蛋白衍生的蛋白質(zhì)，15-42,可以穩(wěn)定內(nèi)皮屏障(PloSONE(2009)，4(4):e5391)。由于它們?cè)诩?xì)胞生物學(xué)中的重要作用，所以Rho GTP酶的活性受到嚴(yán)格控制。RhoGTP酶在無(wú)活性的、⑶P結(jié)合狀態(tài)和活性的GTP結(jié)合狀態(tài)之間循環(huán)。Rho GTP酶可以與它們的效應(yīng)物分子相互作用并僅以GTP-結(jié)合形式影響它們的功能。大多數(shù)活性形式的GTP酶被結(jié)合于細(xì)胞膜。這種膜靶向是由C端多堿區(qū)和Rho GTP酶的翻譯后異戊ニ烯化所介導(dǎo)?；钚孕问絻H存在有限的時(shí)間，這是因?yàn)?，由于Rho GTP酶的水解活性，結(jié)合的GTP被迅速轉(zhuǎn)化成GDP。GDP-結(jié)合狀態(tài)是更加穩(wěn)定的，因此細(xì)胞RhoGTP酶的主要部分是無(wú)活性的。所謂的胍解離抑制劑(⑶I)掩蔽RhoGTP酶的膜靶向序列并穩(wěn)定⑶P-結(jié)合構(gòu)象。RhoGTP酶的激活是通過(guò)特定的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子(GEF)介導(dǎo)的，其催化GDP交換為GTP;還參見(jiàn)下文。GEF可以增強(qiáng)⑶P的離解速率并穩(wěn)定Rho GTP酶的核苷酸游離形式。因?yàn)镚TP以高分子過(guò)量存在于細(xì)胞中，所以有利于GTP的結(jié)合。GTP-結(jié)合會(huì)誘發(fā)Rho GTP酶的構(gòu)象變化，使得GEF解離。通過(guò)另ー組調(diào)節(jié)蛋白，GTP酶-激活蛋白(GAP)，來(lái)進(jìn)ー步調(diào)節(jié)在活性和無(wú)活性RHO GTP酶之間的平衡。GAP會(huì)增加Rho GTP酶的內(nèi)源性Rho GTP酶水解活性，因而有利于它們的失活(Trend Cell Biol (2008)，18:210-219)。在它們的活性形式中，Rho GTP酶以高親和力與多種下游效應(yīng)物之一相互作用?；钚誀顟B(tài)是非常短暫的；它是由GTP到GDP的水解(由GAP刺激的反應(yīng))所終止。另外，鳥(niǎo)嘌呤核苷酸解離因子會(huì)穩(wěn)定Rho GTP酶的無(wú)活性形式(Genes Dev. 1997; 11:2295-2322; Biochem Soc Trans (2005) ; 33:891-895; Cell (2004);116:167-179)。用來(lái)控制鄰近特異性(context-speciFIc) Rho GTP酶活性的ー種可能性是經(jīng)由鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子(GEF)。GEF是RhoGTP酶活性的上游調(diào)節(jié)子。GEF以時(shí)空和部分鄰近特異性方式來(lái)控制Rho GTP酶活性(NatureCell Biol (2011)，13:159-166)。換句話(huà)說(shuō)，GEF允許在給定的細(xì)胞內(nèi)在限定的時(shí)間和位置中來(lái)激活Rho。它們整合和處理多個(gè)外部信號(hào)并且它們本身受到嚴(yán)格控制。它們表現(xiàn)得像將輸入信號(hào)連接于某種RhoGTP酶驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞生物反應(yīng)的界面(Trends Cell B iol 2008; 18:210-19) AEF的調(diào)節(jié)特點(diǎn)是起因于它們的多域結(jié)構(gòu)。第一 Rho GEF分離自淋巴瘤細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化基因并且被命名為Dbl (Nat Rev MolCell Biol (2005)，6 (2) :167-180)。此外，Dbl同源家族包含超過(guò)70種蛋白。大多數(shù)GEF包含高度保守的約200個(gè)氨基酸的同源結(jié)構(gòu)域，其介導(dǎo)在Rho GTP酶中的GDP和GTP的交換。該域被指定為DH-域。該DH域賦予GEF對(duì)單個(gè)或ー組GTP酶的特異性。N端域是自抑制的，即，在無(wú)活性狀態(tài)中，N端被磷酸化并與DH-域相互作用。在去磷酸化以后，自動(dòng)抑制被消除(Trend Cell Biol (2008), 18:210-219; Protein Sci (2011)，20:107-111)。另外，存在GEF的第二亞家族，其包括11個(gè)成員，它們并不攜帶DH域。代替DH域，它們包含兩個(gè)同源區(qū)，即 DHRl 和 DHR2(?？客磪^(qū) I 和 2) (Trends Cell Biol (2008)，18:210-219; J CellSci (2005)，118:4937-4946; Nat Rev Mol Cell Biol (2005)，6 (2) : 167-180)。借助于它們的同源域，GEF結(jié)合Rho GTP酶，因而有助于⑶P與GTP的交換。GEF包含靠近DH域的Pleckstrin-域(PH-域)。PH域涉及蛋白-蛋白相互作用的催化活性和介導(dǎo)。DH和PH域一起提供為GTP酶激活所需要的最小結(jié)構(gòu)。PH-域涉及GEF 的亞細(xì)胞分布以及涉及調(diào)節(jié)活性(Genes Dev (2002), 16:1587-1609; Nat Rev Mol CellBiol (2005)，6 (2) :167-180)。例如，當(dāng)它與微管蛋白和緊密連接相關(guān)時(shí)，GEF-Hl是無(wú)活性的。在活性狀態(tài)中，GEF-Hl重新定位到細(xì)胞質(zhì)中(Mol Biol Cell (2008)，19 (5) : 2147-2153;DevCell(2005)，8:777-786)。通過(guò)分子內(nèi)抑制來(lái)控制GEF活性。GEF的N端域用作自動(dòng)抑制劑，其中通過(guò)磷酸化來(lái)中和分子內(nèi)相互作用。因此，目標(biāo)GTP酶可以與DH域相互作用。在特定亞細(xì)胞區(qū)的Rho GEF的靶向也是GEF活性的重要的控制機(jī)制。例如，無(wú)活性的GEF-Hl與微管蛋白相關(guān)，其中它結(jié)合于內(nèi)膜。在活性狀態(tài)中，GEF-Hl解離并重新定位在細(xì)胞質(zhì)中(Trends in CellBiol (2008)，18:210-219)。GEF/RhoGTP酶途徑調(diào)節(jié)許多中心細(xì)胞生物過(guò)程如細(xì)胞骨架的組構(gòu)、基因表達(dá)、細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞分化以及凋亡和非凋亡過(guò)程和細(xì)胞遷移、抗原呈遞、上皮和內(nèi)皮通透性(Cardiovasc Res(2010), 87(2):243-253;Thromb Haemost(2010)，103(I):40-55;Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol(2005), 288(2):L294-L306;Am J Pathol(2010), 177(2):512-524;Physiology (Bethesda) (2010)，25 (I) : 16-26)。由于它在細(xì)胞生理學(xué)中的重要作用，所以GEF/RhoGTP酶途徑的調(diào)節(jié)異常是在炎性疾病、內(nèi)皮和上皮屏障功能病癥以及癌癥中病理生理信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要成分。GEF-Hl/RhoA-途徑激活由肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白組成的細(xì)胞收縮裝置并且是接頭解離所需要的(Mol Biol Cell (2007)，18:3429-3439)。相反地，pll4RhoGEF 誘導(dǎo)的RhoA激活是緊密連接裝配所需要的(Nat Cell Biol (2011)，13 (2) : 159-166)。對(duì)于生理屏障如上皮和內(nèi)皮層的維持，RhoA的部位及鄰近特異性調(diào)節(jié)是決定性的。內(nèi)皮和上皮細(xì)胞形成分別內(nèi)襯血管的內(nèi)腔或內(nèi)臟腔的連續(xù)層。它們形成半滲透屏障并調(diào)節(jié)鄰近組織的流體和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換。平衡的RhoA活性對(duì)于生理上皮和內(nèi)皮屏障功能是關(guān)鍵的。靜止內(nèi)皮和上皮細(xì)胞顯示基底R(shí)hoA活性，肌動(dòng)蛋白纖維和肌球蛋白束被限于細(xì)胞邊境以穩(wěn)定組織(Endothelial Biomedicine, Cambridge Press (2007), 696-706; J CellBioI (1996)，133:1403-1415)。促炎劑或促血栓形成劑的刺激導(dǎo)致GEF/RhoA途徑的激活，其又誘導(dǎo)細(xì)胞骨架激活(J Cell Biol (1996)，133:1403-1415)。肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白形成收縮束，由于細(xì)胞收縮，其遍及細(xì)胞，從而相鄰細(xì)胞松開(kāi)它們的接觸。細(xì)胞-細(xì)胞邊境的打開(kāi)是重要的生理過(guò)程，例如，在用來(lái)促進(jìn)炎性細(xì)胞遷移的組織增生和炎癥過(guò)程中。但異常的GEF/RhoA過(guò)度激活導(dǎo)致上皮和/或內(nèi)皮屏障的衰竭并且是許多嚴(yán)重疾病的病理生理學(xué)的主要貢獻(xiàn)者(Adv Drug Deliv Rev (2000), 41:329-40; Ann NY AcadSci (2008)，1123:134-45; Trends Cell Biol (2008)，18:210-219)。例如，在小鼠模型中GEF-Hl抑制可以預(yù)防由機(jī)械通氣引起的急性肺損傷(AU) (Am J Physiol Lung Cell MolPhysiol (2010)，298(6) :L837-L848)。急性肺損傷(ALI)是由雙側(cè)肺浸潤(rùn)和缺氧定義的嚴(yán)重病癥(N EnglJMed (2005)，353(16) :1736-8; Am J Resp Crit Care Med (1994)，149:818-824)。急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是ALI的嚴(yán)重形式。ALI是重癥監(jiān)護(hù)治療病房(ICU)中的主要問(wèn)題，其中發(fā)生率為79/100. 000以及死亡率為40%。ALI是由對(duì)肺的影響(如肺炎、酸吸入、煙吸入、機(jī)械通氣)所誘導(dǎo)或發(fā)展為膿毒病和創(chuàng)傷的后遺癥。即使ALI發(fā)展自不同的病因，但所有患者顯示共同癥狀如富含蛋白質(zhì)的水腫和在肺中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)(N EnglJMed(2000);342(18):1334-1349;Am J Respir Cel Mol Biol (2005)，33(4):319-327)。嚙齒動(dòng)物的LPS吸入模型廣泛用于尋找ALI的治療性干預(yù)的可能性。LPS吸入會(huì)誘導(dǎo)富含蛋白質(zhì)的水腫和細(xì)胞炎癥，這是由于內(nèi)皮和上皮屏障的衰竭(Am J Physiol LungCell Mol Physiol(2008)，295(3):L379-L399;Jama(2003)，289(16):2104-2112;Natur6(2005)，436:112-116)<^ -111抑制可以減小在通氣機(jī)引起的肺損傷(VILI)的小鼠模型中的肺損傷(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2010)，298 (6) :L837_L848)并改善內(nèi)皮屏障功能病癥(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2006)，290 (3) : L540-L548)。侵襲大于15%的總體表面積的主要皮膚燒傷(熱灼傷和化學(xué)燒傷)不僅導(dǎo)致局部組織損傷而且還導(dǎo)致廣泛的全身性炎癥如全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，其引起在燒傷部位遠(yuǎn)側(cè)的器官系統(tǒng)損害。SIRS還包括水腫、微血管通透性過(guò)高、低血容量性休克和多器官功能衰竭(多器官功能障礙綜合征)以及ARDSCJAm Coll Surg (2001)，192:241-254)。燒傷的最具破壞性的效應(yīng)之ー是全身性炎癥，其在發(fā)生以后的最初3h內(nèi)達(dá)到高峰并在以后的24 - 48h 期間下降(Clin Plast Surg (2000) ,27:11-22; World J Surg (1992), 16:2-9) 研究GEF/RhoA途徑在疾病(病癥)如重度燒傷的病理生理學(xué)中的作用的研究數(shù)目是非常有限的。但有研究表明肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和Rho激酶對(duì)燒傷以后的SIRS和毛細(xì)血管滲漏的發(fā)展的貢獻(xiàn)。兩種分子，MLCK和Rho激酶，均是RhoA的下游效應(yīng)物。已表明，在用分離自燒傷大鼠的血漿重新溫育以后，內(nèi)皮細(xì)胞松弛了它們的屏障功能。通過(guò)用MLCK抑制劑來(lái)處理內(nèi)皮細(xì)胞，可以恢復(fù)內(nèi)皮通透性過(guò)高(AM J PhysiolLung Cell MolPhysiol (2004), 286: L841-L847) 在燙傷以后，MLCK的藥理學(xué)抑制可以改善體內(nèi)結(jié)果(Shock(2003), 20:363-368)。在燒傷的小鼠模型中，在小鼠中MLCK-210的敲除會(huì)減少毛細(xì)血管滲漏并改善存活(Shock(2007) ,28:589-595)。在燙傷以后，Rho激酶的抑制會(huì)體內(nèi)降低血管滲漏(Burns (2003)，29 (8) : 820-827)。因此，在治療與Rho GTP酶的高活性相關(guān)的病癥和疾病中，降低RhoGTP酶活性可以是有用的策略。當(dāng)_在抑制GEF功能(用于減少Rho GTP酶)時(shí)，主要問(wèn)題是在時(shí)間和位置方面實(shí)現(xiàn)特異性以及靶向蛋白-蛋白相互作用位點(diǎn)。然而，仍未完全明了這些相互作用位點(diǎn)的復(fù)雜特性。事實(shí)上，已知的Rho GTP酶抑制劑和Rho-激酶抑制劑全身起作用，即，它們也在健康的細(xì)胞/組織中影響Rho-GTP酶和Rho-激酶，因而可以意味著嚴(yán)重的副作用如中毒性肌病(對(duì)于斯達(dá)汀而言)并且可以引起低血壓(法舒地爾MSurgNeurol (2007)，68 (2) : 126-131)。另外，斯達(dá)汀必須被提供為預(yù)防性治療，即，需要院前治療(Crit Care Med(2011)，39 (6) : 1343-1350)。這也適用于法舒地爾，其中在動(dòng)物模型中需要預(yù)處理(Life Sci (2011) ,88 (1-2) :104-109)。因此，需要特異性Rho GTP酶抑制劑。通過(guò)本文提供的和如在所附實(shí)施例和在權(quán)利要求中提供的實(shí)施方式已解決了上述技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明描述并提供了包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列組成的肽GX1RPX2X3X4X5GGX6(SEQ ID NO:1)其中X1是選自由R和A組成的組的氨基酸；X2缺失(不存在)或者是選自由L和V組成的組的氨基酸；X3缺失(不存在)或者是由I至5個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列；X4缺失(不存在)或者是由GG組成的氨基酸序列；X5表示選自由A、I和S組成的組的兩個(gè)氨基酸；以及X6缺失(不存在)或者是由I至5個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列。在某些情況下，X6還可以包含如下文描述的多于5個(gè)的氨基酸或者由多于5個(gè)的氨基酸組成。本發(fā)明的肽優(yōu)選包含以下氨基酸或者由以下氨基酸組成不多于19個(gè)氨基酸，更優(yōu)選不多于14個(gè)氨基酸,最優(yōu)選不多于11個(gè)氨基酸或不多于9個(gè)氨基酸。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽包含11個(gè)氨基酸或由11個(gè)氨基酸組成。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指本領(lǐng)域已知的任何氨基酸并且包括如本領(lǐng)域中已知的蛋白原氨基酸和非蛋白原氨基酸。蛋白原氨基酸(proteinogenic aminoacids)包括丙胺酸(Ala ；A)、精氨酸(Arg ；R)、天冬酰胺(Asn ；N)、天冬氨酸(Asp ；D)、半月光氨酸(Cys ；C)、谷氨酰胺(Gin ；Q)、谷氨酸(Glu ；E)、甘氨酸(Gly ；G)、組氨酸(His ；H)、異亮氨酸(He ；1)、亮氨酸(Leu ；L)、賴(lài)氨酸(Lys ；K)、蛋氨酸(Met ；M)、苯丙氨酸(Phe ；F)、脯氨酸(Pro ;P)、絲氨酸(Ser ;S)、蘇氨酸(Thr ;T)、色氨酸(Trp ;W)、酪氨酸(Tyr ;Y)、纈氨酸(Val ;V)、硒代半胱氨酸(Sec ；U)以及吡咯賴(lài)氨酸(Pyl ;0)。用于非蛋白原氨基酸的非限制性實(shí)例是羥脯氨酸、硒代蛋氨酸、肉堿、Y-氨基丁酸(GABA)、羊毛硫氨酸、脫氫丙氨酸、鳥(niǎo)氨酸、或瓜氨酸。如本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易明了的，在一些情況下，非蛋白原氨基酸還可以是蛋白質(zhì)的一部分。在本文中通過(guò)單字母代碼或三字母代碼來(lái)簡(jiǎn)稱(chēng)氨基酸，如本領(lǐng)域中通常使用的以及如下文陳述的。如在本發(fā)明的范圍內(nèi)已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本文描述和提供的肽能夠抑制GTP酶。這已在所附的關(guān)于RhoA的實(shí)施例中得到示例性地證明。特別是，如本文中描述和舉例說(shuō)明的，這些本發(fā)明的肽可用于治療或預(yù)防由Rho GTP酶的異常激活所引起的疾病或病癥。這樣的疾病和病癥(障礙)尤其包括與內(nèi)皮和/或上皮屏障功能的喪失有關(guān)的炎性疾病。例如，本發(fā)明的肽表明可以降低與較少肺損傷相關(guān)的肺部炎癥和降低肺水腫；參見(jiàn)

圖1。內(nèi)皮和/或上皮屏障的衰竭(降低)是與上皮或內(nèi)皮屏障功能的局部或全身衰竭相關(guān)的疾病或病癥的病理生理學(xué)的主要成分。通過(guò)本發(fā)明的方式和方法可治療或可預(yù)防的疾病或病癥尤其包括燒傷、急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、通氣機(jī)引起的肺損傷(VILI)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、急性腎損傷(AKI)、膿毒病、多器官功能障礙綜合征(MODS)或水腫。如已經(jīng)提到的，按照本發(fā)明，SIRS還包括水腫、微血管通透性過(guò)高、和低血容量性休克。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，通過(guò)如本文提供的方式和方法可治療和/或可預(yù)防的水腫可以特別是與進(jìn)行性組織水腫相關(guān)的疾病，如在本領(lǐng)域中已知的以及如例如在N Engl JMed(2010), 363:689-691中所描述的。本文提供的肽通過(guò)它們的以下能力來(lái)起作用穩(wěn)定內(nèi)皮和上皮屏障，從而減少水腫形成和炎癥，進(jìn)而改善器官功能。因此，本文描述和提供的方式和方法特別可用于治療和/或預(yù)防與上皮或內(nèi)皮屏障功能的局部或全身衰竭相關(guān)的疾病或病癥。尤其是，本發(fā)明的肽和方法可用于治療和/或預(yù)防燒傷、急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、通氣機(jī)引 起的肺損傷(VILI)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、急性腎損傷(AKI)、膿毒病、多器官功能障礙綜合征(MODS)或水腫。在本發(fā)明中描述和提供的肽源自扣帶蛋白，ー種已知的GEF-Hl抑制劑(NY AcadSci (2009)，1165:88-98;Dev Cell (2005), 8:777-786;Dev Cell (2007)，12:699-712)。另外，本文中描述和提供的肽顯示與VE-鈣黏著蛋白結(jié)合和RhoA-抑制蛋白B ^ 15-42的序列相似性(PLoS ONE (2009), 4 (4) : e5391)。B ^ 15-42的活性已重復(fù)被描述為強(qiáng)烈地依賴(lài)于最初的4個(gè)氨基酸(Int J Cancer (2009)，125:577-584)。尤其是，15-42的His16 (B ^ 15-42的第二位置)和Arg17 (B ^ 15-42的第三位置)已被描述為對(duì)于B ^ 15-42的功能是關(guān)鍵的(BiOChemiStry(2002)，41:4107-4116)。與此相反，在本發(fā)明中描述和提供的肽并不具有在第二位置處的His，然而顯示具有強(qiáng)RhoA-抑制效應(yīng)。此外，本文描述的肽靶向內(nèi)皮和上皮細(xì)胞，后者缺少VE-鈣黏著蛋白。另外，在本發(fā)明中已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本文描述和提供的肽比15-42顯著更有效，如利用ALI的動(dòng)物模型示例性地證明的(參見(jiàn)，例如，實(shí)施例6)。
本文中描述和提供的肽可以進(jìn)ー步包含在C端的X7，其中X7是這樣的部分，該部分適合于延遲原發(fā)性腎過(guò)濾，延長(zhǎng)血清半衰期和/或防止本文提供的肽的蛋白水解降解(尤其是肽酶)。這樣的部分在本領(lǐng)域中是已知的。這樣的部分的非限制性實(shí)例是NH2、白蛋白、聚こニ醇、葡聚糖、鐵蛋白、羥こ基淀粉和抗體的Fe部分。X7還可以是或包含氨基酸一段序列(aminoacid stretch),其能夠延長(zhǎng)血清半衰期,如在例如WO 08/155134中所描述的，或氨基酸序列，如在 WO 07/103515 或在 Nat Biotechnol (2009) ,27:1186-1190 中所描述的。在下文中，描述了本文中描述和提供的肽的通用序列的變量(變體)X1至X6的非限制性實(shí)例。本發(fā)明的肽可以包含變量的以下具體實(shí)例之一或其兩種、三種或更多種的組合。X1例如是R。X2可以是L或V,例如しX3可以缺失或者可以是PPP,例如缺失。X4可以是GG。X5可以是IS或AS，例如IS。X6可以缺失或可以是另外的氨基酸或氨基酸一段序列。X6的所述I至5個(gè)氨基酸可以選自如本文描述的任何氨基酸。另外，在某些情況下，X6可以包含多于5個(gè)的氨基酸或由多于5個(gè)的氨基酸組成。還預(yù)期，X6可以包括較長(zhǎng)的氨基酸一段序列，甚至大干15個(gè)氨基酸的氨基酸一段序列。這樣的一段序列(stretch)還可以包含這樣的氨基酸一段序列，其延長(zhǎng)血清半衰期(如上文針對(duì)X7所描述的)，如在WO 08/155134中提供的“ PAS” 序列、或在 TO 07/103515 中或在 Nat Biotechnol (2009), 27:1186-1190中提供的肽序列。然而，乂6還可以缺失。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽包含氨基酸序列 GRRPLX4ISGG(SEQ ID NO:2)或由氨基酸序列 GRRPLX4ISGG(SEQ ID N0:2)組成，例如，GRRPLGGISGG(SEQ ID NO:3)或 GRRPLISGG(SEQ ID NO:4) 在另ー種實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽包含氨基酸序列Grrpvx4ISgg (seq id no:5)或由氨基酸序列g(shù)rrpvx4isgg(seq idN0:5)組成，例如，GRRPVGGISGG(SEQ ID NO:6)或 GRRPVISGG(SEQ ID NO:7) 在ー種具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的肽包含氨基酸序列GRRPLGGISGG(SEQ ID N0:3)或由氨基酸序列GRRPLGGISGG(SEQ ID NO:3)組成。本發(fā)明涉及用于本文中描述和提供的肽的以下非限制性具體實(shí)例。尤其是，本發(fā)明的肽可以包含以下序列中的任何一種或由以下序列中的任何一種組成GRRPLGGIS GG(SEQ ID NO:3)；GRRPVGGISGG(SEQ ID NO :6)；GRRPLISGG(SEQ ID NO :4)；GRRPVISGG(SEQ ID NO :7)；GRRPLPPPISGG(SEQ ID NO :8)；GRRPVPPPISGG(SEQ ID NO :9)；GRRPLGGAAGG(SEQ ID NO:10)；GRRPVGGAAGG(SEQ ID NO:11)；GRRPLPPPAAGG(SEQ ID NO:12)；GRRPVPPPAAGG(SEQ ID NO:13)；GRRPLGGASGG(SEQ ID NO:14)；GRRPVGGASGG(SEQ ID NO:15)；GRRPLPPPASGG(SEQ ID NO:16)；GRRPVPPPASGG(SEQ ID NO:17)；GRRPLGGIAGG(SEQ ID NO:18)；
GRRPVGGIAGG(SEQ ID NO:19)；GRRPLPPPIAGG(SEQ ID NO :20)；GRRPVPPPIAGG(SEQ ID NO:21)；GARPLGGISGG(SEQ ID NO :22)；GARPVGGISGG(SEQ ID NO :23)；GARPLPPPISGG(SEQ ID NO :24)；GARPVPPPISGG(SEQ ID NO :25)；GARPLGGAAGG(SEQ ID NO :26)；GARPVGGAAGG(SEQ ID NO :27)；GARPLPPPAAGG(SEQ ID NO :28)；GARPVPPPAAGG(SEQ ID NO :29)；GARPLGGASGG(SEQ ID NO :30)；GARPVGGASGG(SEQ ID NO:31)；GARPLPPPASGG(SEQ ID NO :32)；GARPVPPPASGG(SEQ ID NO :33)；GARPLGGIAGG(SEQ ID NO :34)；GARPVGGIAGG(SEQ ID NO :35)；GARPLPPPIAGG(SEQ ID NO :36);或GARPVPPPIAGG(SEQ ID NO:37)。如已經(jīng)提到的，按照本發(fā)明，包含上述特定序列的任何之一或由上述特定序列的任何之一組成的肽可以進(jìn)ー步包含在C端的部分X7,如本文所定義的。用于合成肽的方法是本領(lǐng)域中已知的，并且包括，例如，如在文獻(xiàn)中描述的標(biāo)準(zhǔn) FMOC 合成(例如，固相妝合成-“A practical approach “by E. Atherton, R.C. Sheppard, Oxford University press 1989),或液相合成，其中利用混合策略并通過(guò)BOC化學(xué)和片段縮合法來(lái)組裝肽，如在文獻(xiàn)中描述的(E. ffunsch, 〃Synthese vonPeptiden in Methoaen der organischenChemie (Houben-ffeyl),15Ausg. 4, Teil Iund2Thieme, Stuttgart, 1974)。 本文中描述和提供的肽能夠抑制Rho GTP酶，例如，RhoA,的活性。用于評(píng)估Rho GTP酶活性的方法是本領(lǐng)域中已知的并且如本文中描述和舉例說(shuō)明的。適用于評(píng)估Rho GTP酶活性的方法的非限制性實(shí)例包括全局Rho GTP酶活性的確定，如在J Biol Chem(2004)，279:7169-7179中所描述的。這樣的測(cè)定可以通過(guò)利用標(biāo)記有GST的Rho底物(例如，Rhotekin)來(lái)進(jìn)行，其被混合到細(xì)胞裂解液中，接著是利用抗GST抗體的下拉?？梢酝ㄟ^(guò)凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡并利用抗Rho抗體(如本領(lǐng)域中已知的)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。評(píng)估Rho GTP酶活性的另ー種適宜的方法是G-LISA測(cè)定，如在Basic Res Cardiol (2009)，104:333-340中所描述的。用來(lái)評(píng)估Rho GTP酶活性的又ー種方式可以是在給定細(xì)胞內(nèi)的位點(diǎn)時(shí)空RHO激活的確定，其中通過(guò)利用Rho GTP酶激活生物傳感器如GFP-效應(yīng)物傳感器或單分子或雙分子FRET傳感器(轉(zhuǎn)染或重組表達(dá)在給定細(xì)胞中)。這些生物傳感器允許單個(gè)活性Rho GTP酶的體內(nèi)時(shí)空成像(J CellScience (2010)，123:1841-1850)。此外，可獲得用于評(píng)估RhoGTP酶活性的商業(yè)化試劑盒，如，例如，來(lái)自 Cytoskeleton, Inc.的“RhoGEF Exchange Assay Biochem Kit”。例如，給定肽可以被認(rèn)為是本發(fā)明的肽，(I)如果它包含或由如本文所定義的序列組成，以及(2)與未用肽處理的參比細(xì)胞(屬于相同細(xì)胞系)的各自的Rho GTP酶活性(例如，RhoA)相比，如果它降低測(cè)試細(xì)胞的Rho GTP酶(例如，RhoA)的活性至少1. 5倍、至少2倍、至少2. 5倍或至少3倍。本發(fā)明還涉及編碼本文中描述和提供的肽的多核苷酸。這些多核苷酸可以是核酸類(lèi)似物如，例如，DNA分子、RNA分子、寡核苷酸硫代磷酸、取代的核糖寡核苷酸、LNA分子、PNA分子、GNA(ニ醇核酸)分子、TNA(蘇糖核酸)分子、或嗎啉代多核苷酸。另外，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”被認(rèn)為與術(shù)語(yǔ)“核酸分子”等效并且尤其可以是指DNA、RNA、PNA或LNA或它們的雜交體或它們的本領(lǐng)域中已知的任何修飾(關(guān)于修飾的實(shí)例，參見(jiàn)，例如，US 5，525，711、US 4，711，955、US 5，792，608 或 EP 302175)。由本文描述和提供的多核苷酸構(gòu)成的核酸殘基可以是天然存在的核酸殘基或人工合成的核酸殘基。用于核酸殘基的實(shí)例是腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、黃嘌呤(X)、和次黃嘌呤(HX)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員明了的，可以互換使用胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，其取決于多核苷酸的各自類(lèi)型。例如，如技術(shù)人員明了的，作為DNA的一部分的胸腺嘧啶(T)對(duì)應(yīng)于作為相應(yīng)轉(zhuǎn)錄的mRNA的一部分的尿嘧啶(U)。本文描述和提供的多核苷酸可以是單鏈或雙鏈的、線(xiàn)性或環(huán)狀的、天然的或合成的。另外，根據(jù)本發(fā)明，可以將本文描述和提供的多核苷酸克隆到載體中。因此，本發(fā)明還涉及包含如本文描述和提供的多核苷酸的載體。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“載體”特別是指質(zhì)粒、黏粒、病毒、噬菌體和通常用于基因工程的其它載體。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，這些載體適合于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，如真菌細(xì)胞，微生物的細(xì)胞如酵母或原核細(xì)胞。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，這樣的載體適合于細(xì)菌細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，例如從而表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。 因此，在本發(fā)明的ー個(gè)方面中，如提供的載體是表達(dá)載體。通常，在文獻(xiàn)中，已廣泛地描述了表達(dá)載體。通常，在所選的宿主中，它們不僅可以包含選擇標(biāo)記基因和復(fù)制起點(diǎn)以確保復(fù)制，而且還可以包含啟動(dòng)子，以及在大多數(shù)情況下，用于轉(zhuǎn)錄的終止信號(hào)。在啟動(dòng)子和終止信號(hào)之間優(yōu)選存在至少ー個(gè)限制位點(diǎn)或多接頭，其使得能夠插入所期望表達(dá)的核酸序列/分子。應(yīng)當(dāng)明了，當(dāng)通過(guò)利用在現(xiàn)有技術(shù)中已知的已經(jīng)包含啟動(dòng)子(其適合用于本發(fā)明的范圍，例如如上所述的多核苷酸的表達(dá))的表達(dá)載體來(lái)產(chǎn)生本文描述和提供的載體吋，以ー種方式將核酸構(gòu)建體插入上述載體中，使得產(chǎn)生的載體僅包含適合用于本發(fā)明的范圍的一種啟動(dòng)子。技術(shù)人員知道如何可以實(shí)施這樣的插入。例如，在連接以前，啟動(dòng)子可以切除自核酸構(gòu)建體或切除自表達(dá)載體。其中克隆有本文描述和提供的多核苷酸的載體的非限制性實(shí)例是腺病毒載體、腺相關(guān)病毒(AAV)載體、慢病毒載體、基于HIV的慢病毒載體、或非病毒小環(huán)載體。適合于包含本發(fā)明的多核苷酸以形成本文描述的載體的載體的另外的實(shí)例在本領(lǐng)域中是已知的并且是，例如，用于細(xì)菌和真核表達(dá)系統(tǒng)的其它載體。另外，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可以將本文描述和提供的多核苷酸和/或載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或用其它方式引入宿主細(xì)胞中。因此，本發(fā)明還涉及包含如本文描述和提供的多核苷酸和/或載體的宿主細(xì)胞。例如，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，例如，細(xì)菌細(xì)胞。作為非限制性實(shí)例，宿主細(xì)胞還可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本文描述的宿主細(xì)胞g在特別可用于產(chǎn)生本文中描述和提供的肽。通常，本文描述的宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞，其包含本文描述和提供的多核苷酸或載體，或源自上述細(xì)胞并且包含核酸構(gòu)建體或載體的細(xì)胞。在一種實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞包含，即，以這樣的方式用本文描述和提供的多核苷酸或載體加以基因修飾，使得它包含整合到基因組中的多核苷酸。例如，本文描述的這樣的宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌、酵母、或真菌細(xì)胞。在ー個(gè)特定方面，宿主細(xì)胞能夠表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。待用于產(chǎn)生本文描述的宿主細(xì)胞的不同的相應(yīng)表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例的概述，例如，包括在 Methods in Enzymology 153 (1987)，385-516、Bitter (MethodsinEnzymology 153 (1987)，516-544)、Sawers(Applied Microbiology andBiotechnology46 (1996),1-9)> Billman-Jacobe(Current Opinion inBiotechnology 7(1996)，500-4)、Hockney(Trends in Biotechnology 12 (1994)，456-463)、和 Griffiths(Methods inMolecular Biology 75 (1997)，427-440)中?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)進(jìn)行具有本文描述和提供的多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或基因工程，如例如在Sambrook and RusselI (2001), MolecularCloning:A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor,NY, USA;Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold SpringHarborLaboratory Press, 1990 中描述的。本發(fā)明進(jìn)一歩涉及組合物，該組合物包含如本文描述和提供的肽、多核苷酸、載體和/或宿主細(xì)胞?？梢砸约slng /kg體重至約100mg/kg體重的量，將這樣的組合物給予需要醫(yī)療干預(yù)的受試者(主體)。這樣的受試者可以是哺乳動(dòng)物，例如，人類(lèi)，其需要加以治療或其中需要預(yù)防如本文描述的與異常GTP酶活性相關(guān)的病癥。如所提到的，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，與異常的GTP酶活性相關(guān)的疾病或病癥的實(shí)例是與上皮或內(nèi)皮屏障功能的局部或全身衰竭(系統(tǒng)衰竭)相關(guān)的疾病。在該背景下，待治療和/或預(yù)防的特定疾病和病癥是燒傷、急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、通氣機(jī)引起的肺損傷(VILI)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、急性腎損傷(AKI)、膿毒病、多器官功能障礙綜合征(MODS)、或水腫。本文描述和提供的組合物可以包含本發(fā)明的肽，含量為約I U g/kg體重至約40mg/kg體重/天、或約lmg/kg體重至約30mg/kg體重、或約lmg/kg體重至約20mg/kg體重/天、或約lmg/kg體重至約15mg/kg體重/天、或約lmg/kg體重至約10mg/kg體重/天、或約10mg/kg體重至約15mg/kg體重/天。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，包含如本文描述和提供的肽、多核苷酸、載體和/或宿主細(xì)胞的組合物可以進(jìn)一歩包含藥用載體。因此，本發(fā)明還涉及藥物組合物，該藥物組合物包含如本文描述和提供的肽、多核苷酸、載體和/或宿主細(xì)胞，以及可選地，進(jìn)ー步包含藥用載體、賦形劑和/或稀釋劑。通常，適宜的藥物載體的實(shí)例是本領(lǐng)域中眾所周知的并且包括磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳狀液如油/水乳狀液、不同類(lèi)型的濕潤(rùn)劑、無(wú)菌溶液等?？梢酝ㄟ^(guò)眾所周知的常規(guī)方法來(lái)配制包含上述載體的組合物?？梢砸赃m宜的劑量，即，約I U g/kg體重至約40mg/kg體重/天、或約lmg/kg體重至約30mg/kg體重、或約lmg/kg體重至約20mg/kg體重/天、或約lmg/kg體重至約15mg/kg體重/天、或約lmg/kg體重至約10mg/kg體重/天、或約10mg/kg體重至約15mg/kg體重/天,將這些藥物組合物給予受試者?？梢酝ㄟ^(guò)不同途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)(藥物)組合物的給予或給予(藥物)組合物，例如，胃腸道外途徑(例如，靜脈內(nèi)途徑、皮下途徑、經(jīng)皮途徑、肌內(nèi)途徑或腹腔內(nèi)途徑)、通過(guò)吸入(例如，支氣管內(nèi)途徑)、作為由可生物降解聚合物(例如，聚乳酸酯或聚甘醇酸酷)構(gòu)成的可溶蝕性植入物、腸途徑(例如，丸劑、片劑(口腔、舌下、ロ服、崩解、膠囊劑、薄膜、液體溶液或懸浮液)、散齊U、固體晶體或液體)、直腸途徑(例如，栓劑、灌腸劑)、經(jīng)皮途徑、局部途徑、陰道途徑、表皮途徑、或鼻內(nèi)途徑。將由主治醫(yī)師和臨床因素來(lái)確定劑量方案。如在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的，用于任何一位患者的劑量取決于許多因素，包括患者體型、體表面積、年齡、待給予的特定化合物、性別、給予的時(shí)間和途徑、一般健康、和同時(shí)給予的其它藥物?？梢跃植炕蛉斫o予包含如本文描述和提供的肽、多核苷酸、載體和/或宿主細(xì)胞的(藥物)組合物。將優(yōu)選以胃腸道外途徑給予本發(fā)明的肽，例如，靜脈內(nèi)途徑或皮下途徑。還可以將包含如本文描述和提供的肽、多核苷酸、載體和/或宿主細(xì)胞的(藥物)組合物直接給予目標(biāo)部位，例如，通過(guò)生物導(dǎo)彈遞送到內(nèi)部或外部目標(biāo)部位或通過(guò)導(dǎo)管遞送到在動(dòng)脈中的部位。用于胃腸道外給予的制劑包括無(wú)菌水溶液或非水溶液、懸浮液、和乳狀液。非水溶劑的實(shí)例是丙ニ醇、聚こニ醇、植物油如橄欖油，以及注射用有機(jī)酯如油酸こ酷。水性載體包括水、醇/水溶液、乳狀液或懸浮液，其包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸道外賦形劑包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏、或固定油。靜脈內(nèi)賦形劑包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(如那些基于林格氏葡萄糖的電解質(zhì)補(bǔ)充劑)等。還可以存在防腐劑和其它添加齊IJ如，例如，抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體等。另外，尤其是考慮到上述因素，還設(shè)想低于或高于上述示例性范圍的劑量。還可以以本文提供的兩種或更多種肽的組合來(lái)使用本發(fā)明的肽。因此，本發(fā)明的組合物可以包含本文提供的兩種或更多種肽，可選地還連同本文描述和提供的其它化合物。另外，本發(fā)明的肽可以用于聯(lián)合療法，其中連同血管活性藥劑如氧化氮、前列環(huán)素、外源性表面活性剤、抗凝血?jiǎng)?、靶向組織因子活性的藥劑、有潛力改善肺泡液體清除的藥劑如P 2-激動(dòng)劑、抑制TNF作用的藥劑、抗IL-8和抗⑶40L療法(CurrMed Chem(2008), 15(19) : 1911-1924)、吸入的激活蛋白 C(Crit Care (2010), 14(2) :R70)、免疫抑制劑如糖皮質(zhì)激素或環(huán)孢霉素、抗生素、！ES溶液、用于容積膨脹的膠體(EmergMedJ(2003)，20:306-315)、或靶向腎素-血管緊張素系統(tǒng)的病理性失衡的藥劑。技術(shù)人員知道，給予個(gè)體的藥物組合物的有效量將尤其取決于化合物的特性。例如，如果所述化合物是如本文描述的肽，則胃腸道外給予的每劑量的藥物組合物的總藥物有效量可以為約I U g/kg/天至100mg/kg患者體重/天、或I ii g/kg體重至約40mg/kg體重/天、或約lmg/kg體重至約30mg/kg體重、或約lmg/kg體重至約20mg/kg體重/天、或約lmg/kg體重至約15mg/kg體重/天、或約lmg/kg體重至約10mg/kg體重/天、或約IOmg/kg體重至約15mg/kg體重/天，但是，如上所述，這將取決于治療酌情決定。然而，取決于治療酌情決定，可以進(jìn)ー步減小或増加這種劑量，特別是如果同時(shí)施加某些脂質(zhì)或如果肽經(jīng)受某些化學(xué)修飾?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的常規(guī)試驗(yàn)來(lái)確定特定量。還可以通過(guò)緩釋系統(tǒng)來(lái)適當(dāng)?shù)亟o予本文描述和提供的藥物組合物。緩釋組合物的適宜實(shí)例包括成形物品形式的半滲透聚合物基質(zhì)，例如，薄膜、或微膠囊。緩釋基質(zhì)包括聚交酯(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3，773，919、EP-Al 58481)、L-谷氨酸和Y _こ基-L-谷氨酸酯的共聚物(Biopolymers (I983)，22:547-556)、聚(2_ 羥こ基甲基丙烯酸酯)(J BiomedMater Res (1981)，15:167-277;Langer, Chem Tech(1982)，12:98-105)、こ烯こ酸こ烯酯(Langer, loc. cit.)或聚-D-(-)-3-輕基丁酸(EP-A1 133988)。緩釋藥物組合物還可以包括脂質(zhì)體截留化合物?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備包含藥物組合物的脂質(zhì)體，如在 DE 3218121 ；Proc Natl Acad Sci USA(1985), 82:3688-3692 ；Proc NatlAcadSci USA 77:4030-4034(1980) ；EP-A1 52322 ；EP-A1 36676 ；EP-A188046 ；EP-A1 143949 ；EP-Al 142641 ;日本專(zhuān)利申請(qǐng)83-118008 ;美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，485，045 和 4，544，545 ; WlEP-Al102324中描述的。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可以通過(guò)用液體載體或細(xì)分的固體載體或兩者均勻地和緊密地接觸藥物組合物的成分來(lái)制備本文描述的劑型(配方)。然后，如有必要，可以將產(chǎn)物成型為所期望的劑型。載體可以是胃腸道外載體，例如，與受體血液等滲的溶液。上述載體賦形劑的實(shí)例包括水、鹽水、林格氏液、和葡萄糖溶液。本文中還可以使用非水載體如固定油和油酸こ酷，以及如本文描述的脂質(zhì)體。載體可以適當(dāng)包含少量的添加劑如增強(qiáng)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。這樣的材料優(yōu)選在所采用的劑量和濃度下對(duì)受體是無(wú)毒的，并且可以包括緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、こ酸、和其它有機(jī)酸或它們的鹽；抗氧化劑如抗壞血酸；低分子量(少于約10個(gè)殘基)(多)肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚こ烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、或精氨酸；單糖、ニ糖、和其它糖類(lèi)，包括纖維素或它的衍生物、葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA ;糖醇如甘露醇或山梨醇；抗衡離子如鈉；和/或非離子型表面活性劑如聚山梨酷、泊洛沙姆、或PEG。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，待用于治療給予的藥物組合物的成分優(yōu)選為無(wú)菌的?？梢越柚?，例如，通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾膜(例如，0.2微米膜)的過(guò)濾來(lái)容易地實(shí)現(xiàn)無(wú)菌性?？梢詫⑺幬锝M合物的治療性成分放入具有無(wú)菌入口的容器，例如，靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶，其具有通過(guò)皮下注射針可穿透的瓶塞。通?？梢詫⑺幬锝M合物的成分貯存在単位或多劑量容器，例如，密封的安瓿或小瓶中，作為水溶液或作為凍干制劑，用于再構(gòu)成。作為凍干制劑的非限制性實(shí)例，10-ml小瓶可以填充有5ml的無(wú)菌過(guò)濾的l%(w/v)水溶液，然后可以冷凍干燥所得物?？梢酝ㄟ^(guò)使用抑制細(xì)菌的注射用水來(lái)再構(gòu)成(重組)一種或多種冷凍干燥化合物來(lái)制備輸注溶液。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本文描述和提供的肽、多核苷酸、載體、宿主細(xì)胞、組合物和藥物組合物可以用于治療或預(yù)防 與異常的GTP酶活性相關(guān)的疾病或病癥。與異常的GTP酶活性相關(guān)的疾病和病癥的非限制性實(shí)例是與上皮或內(nèi)皮屏障功能的局部或全身衰竭相關(guān)的疾病。特定疾病和病癥包括燒傷、急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、通氣機(jī)引起的肺損傷(VILI)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、急性腎損傷(AKI)、膿毒病、多器官功能障礙綜合征(MODS)、或水腫。例如，本發(fā)明涉及包含序列GRRPLGGISGG(SEQ ID NO: 3)或由序列GRRPLGGISGG(SEQ ID NO: 3)組成的肽，用于治療或預(yù)防疾病或病癥，該疾病或病癥選自由與上皮或內(nèi)皮屏障功能的局部或全身衰竭相關(guān)的疾病組成的組。通過(guò)本文提供的方式和方法加以治療和/或預(yù)防的特定疾病和病癥包括燒傷、急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、通氣機(jī)引起的肺損傷(VILI)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、急性腎損傷(AKI)、膿毒病、多器官功能障礙綜合征(MODS)、或水腫。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于治療或預(yù)防與上皮或內(nèi)皮屏障功能的局部或全身衰竭相關(guān)的疾病或病癥的方法。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，通過(guò)本文提供的方法或通過(guò)本文提供的化合物加以治療和/或預(yù)防的特定疾病和病癥特別包括燒傷、急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、通氣機(jī)引起的肺損傷(VILI)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、急性腎損傷(AKI)、膿毒病、多器官功能障礙綜合征(MODS)、或水腫。這樣的方法特別包括將有效劑量的本文描述和提供的ー種或多種肽、ー種或多種多核苷酸、ー種或多種載體、ー種或多種宿主細(xì)胞、一種或多種組合物和/或ー種或多種藥物組合物給予受試者。在一種實(shí)施方式中，受試者是人。附圖示出圖1:通氣機(jī)引起的肺損傷(VILI)總細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白質(zhì)和IgM含量作為替代參數(shù)來(lái)評(píng)估屏障功能病癥。(*p>0. 05**p>0. 01 ;***p>0. 001)?？s寫(xiě)是LPS LPS 吸入；LVt :低量潮通氣；HVt :高量潮通氣；sc :雜亂肽 GGGGGSRRIPL(SEQ ID NO: 38) ；XIBl-b GRRPLGGISGG(SEQ ID NO: 3) 圖1比較了在用sc或XIBl-b治療的動(dòng)物中并在支氣管肺泡灌洗中LPS激發(fā)、接著LVt或HVt對(duì)總細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、總蛋白含量和IgM含量的影響。在所有組中，XIBl-b降低所有參數(shù)。獲得如由星號(hào)表示的顯著性O(shè)p〈0. 5，***p〈0. 01)。以下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1 :肽對(duì)于以下示例性研究，本發(fā)明的具有氨基酸序列GRRPGGASGG(SEQ ID N0:39;稱(chēng)作XIBl-a)和GRRPLGGISGG(SEQ IDN0:3 ;稱(chēng)作XIBl-b)的肽被用作活性剤。為了對(duì)照的目的，使用了氨基酸序列為GGGGGLSRRIP (SEQ ID NO: 40)的隨機(jī)肽或溶劑對(duì)照(0，9%NaCl)。這些肽以及要求的所有其它肽的合成是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)FMOC合成，如在文獻(xiàn)(例如，solidphase peptide synthesis (固 相月太合成)-“A practicalapproach “by E. Atherton, R.C. Sheppard, Oxford University press 1989)中描述的，或通過(guò)液相合成來(lái)合成,其中利用混合策略并通過(guò)BOC-化學(xué)和片段縮合法來(lái)組裝肽,如在文獻(xiàn)(E. Wiinsch, 〃Synthese vonPeptiden in Methoden der organischen Cnemie (Houben-ffeyl), 15Ausg. 4, Teil Iund2Thieme, Stuttgart, 1974)中描述的。實(shí)施例2 GEF活性的抑制為了測(cè)量GEF-抑制效應(yīng)，使用了以下細(xì)胞系Caco-2 (來(lái)自腺癌的上皮細(xì)胞)、ECV304(來(lái)自膀胱癌的上皮細(xì)胞)和HpMec (內(nèi)皮細(xì)胞，永生化肺微血管細(xì)胞)。在標(biāo)準(zhǔn)條件(37° C、5%C02和95%相対濕度(rH))下生長(zhǎng)所有細(xì)胞。使用了培養(yǎng)基，對(duì)于Caco_2為DMEM+ImM丙酮酸鈉+20%FCS+1%青霉素鏈霉素；對(duì)于ECV 304為RPMI 1640+10%FCS+1%青霉素鏈霉素；以及對(duì)于HpMec為MDM+25mM H印es+10%人血清+1%青霉素鏈霉素+1%L_谷氨酰胺+ECGS/肝素2ml。在實(shí)驗(yàn)以前4小時(shí)，通過(guò)血清清除來(lái)饑餓細(xì)胞。為了誘導(dǎo)GEF活性，在有或沒(méi)有50 u g/mlXIBl-a或XIBl-b存在的條件下，用凝血酶、脂多糖(LPS)或PMA刺激細(xì)胞指定的時(shí)間。在刺激以后，通過(guò)利用來(lái)自Biochain Institutes的市售“CompartementalProtein Extraction Kit”來(lái)制備膜部分。按照制造商的說(shuō)明來(lái)制備膜部分。通過(guò)利用來(lái)自 Cytoskeleton Inc.的“RhoGEF ExchangeAssay Biochem Kit” 并按照制造商的說(shuō)明來(lái)確定在膜裂解液中的GEF活性。利用來(lái)自Thermo Electron公司的Fluoroskan Ascent FL
2.6，測(cè)量GEF活性為熒光。將激發(fā)濾光片波長(zhǎng)設(shè)定為355nm并將發(fā)射濾光片波長(zhǎng)設(shè)定為460nmo
表1與未刺激對(duì)照相比的相對(duì)值；(*)p〈0. 05，比較于測(cè)試w/o XIBl-a或XIBl_b
權(quán)利要求
1.一種肽，包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列組成GX1RPX2X3X4X5GGX6 (SEQ ID NO:1)其中X1是選自由R和A組成的組的氨基酸；X2缺失或者是選自由L和V組成的組的氨基酸；X3缺失或者是由I至5個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列；X4缺失或者是由GG組成的氨基酸序列；X5表示選自由A、I和S組成的組的兩個(gè)氨基酸；以及 X6缺失或者是由I至5個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，所述肽能夠抑制RhoGTP酶的活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的肽，進(jìn)一步包括在所述序列的C端的X7,其中X7是選自由NH2、白蛋白、聚乙二醇、葡聚糖、鐵蛋白、羥乙基淀粉和抗體的Fe部分組成的組中的部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的肽，其中，X1是R。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的肽，其中，X2是L或V。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的肽，其中，X2是匕
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的肽，其中，X3是PPP。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的肽，其中，X4是GG。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的肽，其中，X5是IS或AS。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的肽，其中，X5是IS。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的肽，其中，X6缺失。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的肽，其中，X1是R，X2是L，X3缺失，X5是IS 并且X6缺失，或者其中X1是R，X2是V，X3缺失，X5是IS并且X6缺失。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的肽，其中，所述肽包括選自由下述組成的組中的氨基酸序列或者由選自由下述組成的組中的氨基酸序列構(gòu)成GRRPLGGISGG(SEQ ID NO:3)；GRRPVGGISGG(SEQ ID NO :6)；GRRPLISGG(SEQ ID NO :4)；GRRPVISGG(SEQ ID NO :7)；GRRPLPPPISGG(SEQ ID NO :8)；GRRPVPPPISGG(SEQ ID NO :9)；GRRPLGGAAGG(SEQ ID NO:10)；GRRPVGGAAGG(SEQ ID NO:11)；GRRPLPPPAAGG(SEQ ID NO:12)；GRRPVPPPAAGG(SEQ ID NO:13)；GRRPLGGASGG(SEQ ID NO:14)；GRRPVGGASGG(SEQ ID NO:15)；GRRPLPPPASGG(SEQ ID NO:16)；GRRPVPPPASGG(SEQ ID NO:17)；GRRPLGGIAGG(SEQ ID NO:18)；GRRPVGGIAGG(SEQ ID NO:19)；GRRPLPPPIAGG(SEQ ID NO:20)；GRRPVPPPIAGG(SEQ ID NO:21)；GARPLGGISGG(SEQ ID NO :22)；GARPVGGISGG(SEQ ID NO :23)；GARPLPPPISGG(SEQ ID NO :24)；GARPVPPPISGG(SEQ ID NO :25)；GARPLGGAAGG(SEQ ID NO :26)；GARPVGGAAGG(SEQ ID NO :27)；GARPLPPPAAGG(SEQ ID NO :28)；GARPVPPPAAGG(SEQ ID NO :29)；GARPLGGASGG(SEQ ID NO :30)；GARPVGGASGG(SEQ ID NO:31)；GARPLPPPASGG(SEQ ID NO :32)；GARPVPPPASGG(SEQ ID NO :33)；GARPLGGIAGG(SEQ ID NO :34)；GARPVGGIAGG(SEQ ID NO :35)；GARPLPPPIAGG(SEQ ID NO :36);從及 GARPVPPPIAGG(SEQ ID NO:37)。
14.一種多核苷酸，編碼根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的肽或根據(jù)權(quán)利要求14所述的多核苷酸，用作藥物。
16.一種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至13或15中任一項(xiàng)所述的肽和/或根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的多核苷酸，可選地進(jìn)一步包含藥用載體和/或稀釋劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至13或15中任一項(xiàng)所述的肽，根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的多核苷酸，或者根據(jù)權(quán)利要求16所述的藥物組合物，用于治療或預(yù)防與上皮或內(nèi)皮屏障功能的局部或全身衰竭相關(guān)的疾病或病癥。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至13、或15中任一項(xiàng)所述的肽，根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的多核苷酸，根據(jù)權(quán)利要求16所述的藥物組合物，用于治療和/或預(yù)防選自由急性肺損傷(ALI)、 急性腎損傷(AKI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、通氣機(jī)引起的肺損傷(VILI)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、膿毒病、燒傷和多器官功能障礙綜合征(MODS)組成的組中的疾病或病癥。
19.一種通過(guò)將有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求1至13、15或17中任一項(xiàng)所述的肽，根據(jù)權(quán)利要求14、15或17中任一項(xiàng)所這的多核苷酸，或者根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的藥物組合物給予受試者來(lái)治療或預(yù)防與上皮或內(nèi)皮屏障功能的局部或全身衰竭相關(guān)的疾病或病癥的方法。
20.一種通過(guò)將有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求1至13、15或18中任一項(xiàng)所述的肽，根據(jù)權(quán)利要求14、15或18中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，或者根據(jù)權(quán)利要求16或18所述的藥物組合物給予受試者來(lái)治療或預(yù)防疾病或病癥的方法，所述疾病或病癥選自由急性肺損傷(ALI)、急性腎損傷(AKI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、通氣機(jī)引起的肺損傷(VILI)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、膿毒病、燒傷和多器官功能障礙綜合征(MODS)組成的組。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至13、15、17或18中任一項(xiàng)所述的肽，根據(jù)權(quán)利要求14、15、17或 18中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，根據(jù)權(quán)利要求16、17或18中任一項(xiàng)所述的藥物組合物或者根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的方法，其中，給予的途徑是胃腸道外途徑或口服途徑。
全文摘要
本發(fā)明涉及化合物，尤其是肽，其能夠穩(wěn)定上皮和內(nèi)皮的屏障功能。本發(fā)明的肽和其它化合物可用于治療和預(yù)防與上皮和內(nèi)皮屏障功能的局部或全身衰竭相關(guān)的疾病或病癥。借助于本文提供的肽或其它化合物、方法和應(yīng)用加以治療和/或預(yù)防的特定疾病和病癥是燒傷、急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、通氣機(jī)引起的肺損傷(VILI)、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、急性腎損傷(AKI)、膿毒病、多器官功能障礙綜合征(MODS)、或水腫。
文檔編號(hào)C07K14/75GK103038253SQ201180029927
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者彼得·佩策爾鮑爾, 索尼婭·雷因格魯貝爾 申請(qǐng)人:西伯爾科學(xué)有限公司