專利名稱：一種抗her2或/和抗her3抗體蛋白的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗HER2或/和抗HER3抗體蛋白的
純化方法。
背景技術(shù)：
隨著生物醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，越來越多的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)治療性重組蛋白質(zhì)，比如單克隆抗體、細(xì)胞因子、激素、生長因子、其它還有某些酶類、凝血因子等。涉及到的治療領(lǐng)域也越來越廣泛，包括內(nèi)分泌、心腦血管、外科、血液病、抗腫瘤等等。治療性重組蛋白的生產(chǎn)過程中，人們常根據(jù)每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會(huì)有差異，利用這些差異通過采用離子交換(IEX)、凝膠過濾 (GF)、疏水(HIC)、反相(RPC)、親和(AC)等多種方法組合分離出目的蛋白，比如單克隆抗體，從細(xì)胞發(fā)酵上清液產(chǎn)生后，需要經(jīng)過多個(gè)步驟的純化過程，才能達(dá)到足夠的純度，用于人體的注射。發(fā)酵料液的成分非常復(fù)雜，而目的蛋白只占其中很小的部分，蛋白純化步驟越多，目的蛋白的回收率就越低。如市面上銷售的抗HER2的單克隆抗體藥物Hercept in 是由美國Genentech公司生產(chǎn)，其純化工藝流程為細(xì)胞上清收獲、蛋白A層析、低pH病毒滅活、陽離子交換層析、陰離子交換層析、疏水層析。此工藝的不足有1)層析步驟多，有四個(gè)層析過程。2、無病毒過濾步驟。具有潛在病毒風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有抗HER2或/和抗HER3純化方法的問題， 提供了一種抗HER2或/和抗HER3的純化方法，以便能簡化純化步驟，提高目的蛋白的回收率，且能清除病毒，降低潛在病毒風(fēng)險(xiǎn)。為此，本發(fā)明公開了一種抗HER2或/和抗HER3抗體蛋白的純化方法，包括下列步驟澄清發(fā)酵液；親和層析；酸性pH值病毒滅活；陽離子交換層析；陰離子交換層析；病毒過濾；其中所述酸性pH值病毒滅活步驟和病毒過濾步驟可隨意穿插在親和層析步驟后任一步驟位置。在一些實(shí)施例中，所述抗HER2或/和抗HER3抗體蛋白為抗HER2抗體蛋白。在一些實(shí)施例中，所述發(fā)酵料液的澄清方式為離心、深層過濾或終端微濾中之一或任何組合，可根據(jù)發(fā)酵料液的狀態(tài)和處理體積，可采用不同的處理方式或組合。其中優(yōu)選深層過濾，最優(yōu)選為采用兩級(jí)深層過濾，濾膜為Millipore公司DOHC和AlHC濾膜。深層過濾是比較新的一種過濾方式，它采用了疏松多空的纖維素骨架結(jié)構(gòu)，并填充了硅藻土成分，進(jìn)樣端的表面孔徑成漏斗狀，這些結(jié)構(gòu)擯棄了傳統(tǒng)微濾表面截留結(jié)構(gòu)易造成阻塞、過濾效率低的缺點(diǎn)，又具備了離心機(jī)所沒有的截留小體積細(xì)胞碎片的優(yōu)勢，同時(shí)依靠硅藻土的吸附作用，能截留高達(dá)50 %的DNA和15 %的HCP。在一些實(shí)施例中，所述抗HER2或/和抗HER 3抗體蛋白具有的標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST-Tag)、六聚組氨酸肽(His-Tag)、Arg-tag、蛋白質(zhì)A(protein A)、FLAG-Tag和Mr印-tag等。通過特殊性蛋白或多肽與目標(biāo)蛋白構(gòu)成融合蛋白的形式，表達(dá)后利用所述的標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽的特殊性質(zhì)可對目標(biāo)蛋白進(jìn)行分離和純化。如His-Tag與Ni-Chelating kpharose柱特異性結(jié)合；Arg-tag可結(jié)合到陽離子交換樹脂SP-S^hadexi ；GST-Tag與交聯(lián)谷胱甘肽的層析介質(zhì)結(jié)合；所述的標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽可以在純化后用位點(diǎn)特異性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、腸激酶和fe 因子等，以獲得目標(biāo)蛋白。在一些實(shí)施例中，所述親和層析為蛋白A親和層析，利用蛋白A對抗體Fc片段高特異性的吸附，能夠達(dá)到95%以上的抗體回收率和99%以上的純度。所述蛋白A親和層析的條件為流速300士 lOOcm/h ；柱高20士2cm ；平衡緩沖液 25mM Tris-HCl+75mM NaCl, pH 7. 2士0. 2 ；洗脫液IOOmM 醋酸鈉，pH 3. 6士0.1。所述酸性pH值病毒滅活為調(diào)整pH值至微酸性(pH值約3. 7)。在該pH值下，膜病毒的外膜破壞，失去感染性。但是，對于沒有外膜的病毒類型，則無滅活效果。所述酸性PH 值病毒滅活步驟為加入20%乙酸，調(diào)整pH值到3.7士0. 1，室溫放置1-2小時(shí)，加入2M Tris 調(diào)整PH值到5. 2 士0.2。在一些實(shí)施例中，所述陽離子交換層析的條件為流速100-180cm/h;柱高 20士2cm ；預(yù)平衡緩沖液100mM醋酸鹽緩沖液加IM NaCl, pH 5. 0士0. 4 ；平衡緩沖液50mM 醋酸鹽緩沖液，PH 5. 2士0. 2 ；洗脫液260mM醋酸鹽緩沖液，pH 6.0士0.2。樣品pH為 5. 2士0. 2，電導(dǎo)為 2. 0-3. OmS/cm。陽離子交換層析的原理是分子表面帶正電荷的區(qū)域和層析填料上帶負(fù)電荷的基團(tuán)，通過異性電荷的靜電吸引力進(jìn)行結(jié)合。不同的分子表面帶電程度決定了其靜電結(jié)合力的強(qiáng)度，從而在層析過程中得到分離?？贵w分子表面往往具有帶大量正電荷的區(qū)域，其結(jié)合填料的能力高于一般的雜質(zhì)，例如大部分宿主蛋白、內(nèi)毒素、DNA、脫落的ftOtein A等。此外，陽離子交換層析還能有效地去除抗體聚合物，異構(gòu)體等雜質(zhì)。陰離子交換層析往往采用流穿模式，即蛋白流過層析柱而雜質(zhì)被結(jié)合在層析柱上。通過陰離子交換層析這一個(gè)步驟，蛋白進(jìn)一步被去除殘余的DNA、潛在的病毒、宿主蛋白、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使經(jīng)過此步驟純化的蛋白溶液完全符合質(zhì)量要求。在一些實(shí)施例中，所述陰離子交換層析的條件為流速180-360cm/h;柱高 20士2cm ；預(yù)平衡緩沖液50mM Tris-HCl 加 IM NaCl，pH 8. 0士0. 4 ；平衡緩沖液50mM Tris-HCl加IOmM NaCl, pH 8. 0 士 0. 2 ；樣品陰離子交換層析洗脫蛋白，調(diào)整pH到 8. 0 士0. 2，電導(dǎo) 3. 0-5. OmS/cm。在一些實(shí)施例中，所述病毒過濾為一步20nm孔徑的病毒過濾，確保任何可能存在的病毒顆粒都被去除。由于病毒顆粒的直徑往往都大于20nm，病毒經(jīng)過該過濾步驟，能夠穩(wěn)定可靠地被去除(> 4個(gè)log值的去除率)。用壓縮空氣(2. 0-2. 2Bar)將陰離子交換層析后樣品，濾過病毒過濾膜。
本發(fā)明所述方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1)層析步驟減少為三步，提高了生產(chǎn)效率，減少了生產(chǎn)成本?；迷黾恿瞬《具^濾過程，提高了安全性。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。1.發(fā)酵液上清的收獲采用兩級(jí)深層過濾的方法。發(fā)酵液嘉和生物藥業(yè)的細(xì)胞株所表達(dá)產(chǎn)生的含有抗HER2單克隆抗體的發(fā)酵液。濾膜=Millipore公司DOHC和AlHC濾膜。(也可以采用其他廠家的深層過濾濾膜)過程使用前用純化水排空濾器中氣體，并充分浸潤濾器；發(fā)酵液過濾前取樣測濁度，利用蠕動(dòng)泵在100-300LMH的流速使發(fā)酵液通過濾器；發(fā)酵液過濾完后向膜包通入空氣排空膜包中殘留液體，過濾后的料液混合均勻后取樣測量濁度。5個(gè)批次的澄清結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種抗HER2或/和抗HER3抗體蛋白的純化方法，包括下列步驟a)澄清發(fā)酵液；b)親和層析；c)酸性pH值病毒滅活；d)陽離子交換層析；e)陰離子交換層析；f)病毒過濾；其中所述酸性PH值病毒滅活步驟和病毒過濾步驟可隨意穿插在親和層析步驟后任一步驟位置。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于所述抗HER2或/和抗HER3抗體蛋白為抗HER2抗體蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于所述澄清方式為離心、深層過濾或終端微濾中之一或任意兩種或兩種以上組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的純化方法，其特征在于所述深層過濾為兩級(jí)深層過濾，濾膜為Millipore公司DOHC和AlHC濾膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于所述親和層析為蛋白A親和層析。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于所述蛋白A親和層析的條件為流速 300士 100cm/h ；柱高:20士2cm ；平衡緩沖液:25mM Tris-HCl+75mM NaCl, pH 7. 2士0· 2 ；洗脫液IOOmM 醋酸鈉，pH 3. 6 士0.1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于所述酸性pH值病毒滅活步驟為加入 20%乙酸，調(diào)整pH值到3. 7士0. 1，室溫放置1-2小時(shí)，加入2M Tris調(diào)整pH值到5. 2士0. 2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于所述陽離子交換層析的條件為流速100-180cm/h ；柱高20 士 2cm ；預(yù)平衡緩沖液IOOmM醋酸鹽緩沖液加IM NaCl，pH 5. 0士0. 4 ；平衡緩沖液50mM醋酸鹽緩沖液，pH 5. 2士0. 2 ；洗脫液260mM醋酸鹽緩沖液， pH 6. 0士0. 2 ；樣品 pH 為 5. 2士0. 2，電導(dǎo) 2. 0-3. OmS/cm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于所述陰離子交換層析的條件為流速 180-360cm/h ；柱高20士2cm ；預(yù)平衡緩沖液50mM Tris-HCl 力卩 IM NaCl, pH 8. 0士0. 4 ；平衡緩沖液50mM Tris-HCl加IOmM NaCl,pH 8. 0士0. 2 ；樣品陰離子交換層析洗脫蛋白，調(diào)整 pH 到 8. 0 士0. 2，電導(dǎo) 3. 0-5. OmS/cm。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗HER2或/和抗HER3抗體蛋白的純化方法。本發(fā)明公開了一種抗HER2或/和抗HER3抗體蛋白的純化方法，包括下列步驟澄清發(fā)酵液；親和層析；酸性pH值病毒滅活；陽離子交換層析；陰離子交換層析；病毒過濾；其中所述酸性pH值病毒滅活步驟和病毒過濾步驟可隨意穿插在親和層析步驟后任一步驟位置。本發(fā)明所述方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1)層析步驟減少為三步，提高了生產(chǎn)效率，減少了生產(chǎn)成本。2)增加了病毒過濾過程，提高了安全性。
文檔編號(hào)C07K16/28GK102492040SQ20111045283
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者徐志豪, 王威, 陳霖杰 申請人:嘉和生物藥業(yè)有限公司