專利名稱：雜交瘤細(xì)胞株3d6及利用其制備抗甘草酸單克隆抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種能夠產(chǎn)生抗甘草酸單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，及利用其制備抗甘草酸單克隆抗體的方法。
背景技術(shù)：
甘草屬植物在我國(guó)分布有18個(gè)種和3個(gè)變種，僅有烏拉爾甘草 uralensis Fish.)、脹果甘草(GBat.)和光果甘草(G Wira L.)被《中國(guó)藥典》 收錄為甘草藥材原植物。甘草是我國(guó)重要的傳統(tǒng)大宗藥材之一，在我國(guó)不僅使用歷史悠久， 而且范圍廣泛，有“十方九草”、“無草不成方”之說。甘草被廣泛應(yīng)用于食品、化工產(chǎn)品、煙草等行業(yè)，但是甘草的質(zhì)量問題一直引起人們的普遍關(guān)注，如何準(zhǔn)確、快速對(duì)甘草進(jìn)行鑒定與質(zhì)量評(píng)價(jià)成為一個(gè)關(guān)鍵問題。甘草酸(結(jié)構(gòu)見附圖1)是甘草的主要藥用成分，是甘草質(zhì)量評(píng)價(jià)的核心指標(biāo)。目前，甘草酸的分析方法有重量法、比色法、高效液相色譜法(HPLC)、高效毛細(xì)管電泳法、薄層層析法、氣相色譜法等。這些方法的主要局限是樣品前處理時(shí)間長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)設(shè)備昂貴，同時(shí)要消耗大量的甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑；對(duì)于混合樣品的測(cè)定有一定的困難，尤其是在甘草真?zhèn)蔚目焖勹b定以及含甘草成分的復(fù)配藥品或食品中含量測(cè)定方面，存在不足。 免疫檢測(cè)方法(ELISA)可以快速檢測(cè)某一特定物質(zhì)的含量(尤其是微量成分)，是中草藥鑒定的一種快速、方便的有效方法，但要把免疫檢測(cè)方法應(yīng)用于甘草酸，需要制備出甘草酸單克隆抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于提供一種能夠產(chǎn)生抗甘草酸單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株 3D6 ；
本發(fā)明的另一目的是提供一種利用上述雜交瘤細(xì)胞株制備抗甘草酸單克隆抗體的方法。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的所采取的技術(shù)方案為
一種雜交瘤細(xì)胞株3D6，其保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期是2011年10月25日，保藏編號(hào)為CGMCC 5422 ；
該雜交瘤細(xì)胞株3D6是由甘草酸人工完全抗原免疫BalB/C小鼠，并通過雜交瘤技術(shù)獲
得；
所述的甘草酸人工完全抗原的獲得步驟是首先將甘草酸溶解在二甲基甲酰胺中，然后依次加入二環(huán)已基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，常溫下反應(yīng)M小時(shí)后，再與載體蛋白分別在常溫下混合，反應(yīng)6小時(shí)，最后將反應(yīng)液用0.05mol/L PBS緩沖液透析得到甘草酸人工完全抗原；
所述載體蛋白為血藍(lán)蛋白和卵清白蛋白；所述甘草酸用量為10-50 mg，二甲基甲酰胺用量為2-5ml ；加入二環(huán)已基碳二亞胺的量為15-25 mg ；所述加入N-羥基琥珀酰亞胺的量為2_6 g ；
上述反應(yīng)液用0. 05mol/L PBS緩沖液透析3_8次，每次2_6小時(shí)； 所述由甘草酸人工完全抗原免疫BalB/C小鼠的步驟為首先將稀釋、與等體積福氏完全佐劑乳化后的甘草酸人工完全抗原對(duì)BalB/C小鼠進(jìn)行腹腔及皮下多點(diǎn)免疫，免疫劑量 50-200 μ g，隨后在21天、35天和49天分別進(jìn)行三次加強(qiáng)免疫，佐劑為福氏非完全佐劑，免疫劑量50-100 μ g，至檢測(cè)免疫效價(jià)達(dá)到10000:1，并且半數(shù)抑制小于500 ppb時(shí)滿足融合條件；
所述通過雜交瘤技術(shù)獲得的具體步驟為
1)將BalB/C小鼠的脾臟取出、用不完全培養(yǎng)基清洗、剝?nèi)ソY(jié)締組織后，制備成脾細(xì)胞懸液，離心處理后再將細(xì)胞沉淀用不完全培養(yǎng)基離心洗滌，然后重新制備成IOml細(xì)胞懸液，混勻，備用。 2)將上述制備好的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按照4 1的數(shù)量，及不完全培養(yǎng)基充分混合后離心，棄上清液，
3 )在37°C條件下緩慢滴加37°C的50%聚乙二醇，后lmin、2min、^iin加入完全培養(yǎng)基， 攪動(dòng)離心管使聚乙二醇徹底稀釋而失去融合作用，離心，沉淀用HAT選擇培養(yǎng)液懸起，混合均勻，最后加入到已加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C，5% 二氧化碳飽和濕度溫箱中培養(yǎng)，
4)待雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底1/3-1/2時(shí)，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液用ELISA檢測(cè)法檢測(cè)，將 ELISA檢測(cè)為陽性的細(xì)胞孔，轉(zhuǎn)移至M孔板中，隔天測(cè)定效價(jià)仍為陽性，則進(jìn)行亞克隆，其中抑制效果最好的命名為3D6 ；
上述能夠產(chǎn)生抗甘草酸單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3D6制備抗甘草酸單克隆抗體的方法，其步驟為
1)用液體石蠟致敏BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml/只；
2)一周后，取1-2 X IO6個(gè)細(xì)胞注射小鼠腹腔；
3)觀察小鼠不活躍并且腹部明顯腫大時(shí)，收集腹水，隨后每隔1一 2天采集一次，反復(fù)采集直到老鼠自然死亡為至；
4)收集到的腹水在4°C下保藏M小時(shí)，在2000rpm離心5min后收集的上清液即為抗甘草酸單克隆抗體；
上述所得到的抗甘草酸單克隆抗體采用如下步驟進(jìn)行純化
1)將抗甘草酸單克隆抗體用5000rpm高速冷凍離心機(jī)離心lOmin，取上層清亮腹水，按 1 2的比例加入0. 05mol/L ρΗ4· 4醋酸稀釋，得稀釋液；
2)按每毫升稀釋液加33μ 1辛酸的比例，在4°C，攪拌狀態(tài)下逐滴加入辛酸，IOmin內(nèi)加完，4°C靜置2小時(shí)；
3)在IOOOOrpm離心15分鐘，取上清液，在冰浴條件下用氨水調(diào)pH至7.4 ；
4)將上清液用0.05mol/L PBS緩沖液透析5次，每次2小時(shí)；
5)取透析處理后溶液，在冰浴下攪拌，緩慢加入等體積飽和硫酸銨，然后在4°C靜置
2h ；
6)在5000rpm下離心15min，取沉淀用0.Olmol/L, pH 7. 4 PBS緩沖液復(fù)溶，并在4°C條件下用PBS透析3次，即得純化后的抗甘草酸單克隆抗體。甘草酸是小分子物質(zhì)，不具備免疫原性，不能直接刺激動(dòng)物產(chǎn)生抗體，因此，要想制備甘草酸單克隆抗體，首先得把甘草酸與相應(yīng)大分子載體蛋白偶聯(lián)構(gòu)建人工合成抗原， 再利用該人工合成抗原獲得甘草酸免疫抗原免疫動(dòng)物，然后獲取能穩(wěn)定分泌抗甘草酸單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的制備，進(jìn)而獲得了抗甘草酸單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)證明，該抗體可應(yīng)用于甘草酸的免疫組織化學(xué)方法定位和定量檢測(cè)。本發(fā)明的方法可以方便快捷地獲得甘草酸人工抗原，成本低，效果好，且利用抗甘草酸單克隆抗體進(jìn)行甘草真?zhèn)舞b定與含量測(cè)定時(shí)，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。


圖1甘草酸(GA)結(jié)構(gòu)圖2血藍(lán)蛋白(KLH)紫外掃描圖； 圖3卵清白蛋白(OVA)紫外掃描圖； 圖4甘草酸(GA)紫外掃描圖； 圖5甘草酸人工抗原GA-KLH紫外掃描圖； 圖6甘草酸人工抗原GA-OVA紫外掃描圖； 圖7酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)GA含量。
具體實(shí)施例方式具體說明應(yīng)理解，以下實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1
甘草酸完全抗原的合成
1、稱取甘草酸(GA)39mg，溶于2ml二甲基甲酰胺(DMF)中；
2、加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)9. ang，混勻，再加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 5. 5mg， 室溫反應(yīng)過夜；
3、量取KLH和OVA各20mg，加入上述反應(yīng)液，使小分子量與蛋白摩爾比為10:1，室溫反應(yīng)6h ；
4,0. 05 mol/L PBS (pH7. 2)透析5次，每次2h。分別獲得GA-KLH和GA-0VA偶聯(lián)物， 分裝_20°C備用。5、甘草酸完全抗原的鑒定將甘草酸(GA)及其免疫抗原GA-KLH和GA-OVA及KLH、 OVA進(jìn)行紫外掃描，從圖可以看出，GA-KLH (紫外掃描，見附圖5)和GA-OVA (紫外掃描，見附圖6)的吸收峰，與KLH (紫外掃描，見附圖2)、0VA (紫外掃描，見附圖3)、GA (紫外掃描， 見附圖4)的吸收峰相比，發(fā)生了明顯變化，表明完全抗原GA-KLH和GA-OVA的偶聯(lián)是成功的。實(shí)施例2
雜交餾細(xì)胞株的獲得
UBALB/C小鼠(購(gòu)自解放軍第四軍醫(yī)大學(xué))免疫及檢測(cè)
(1)將GA-KLH稀釋到ang/ml，并與等體積福氏完全佐劑充分乳化，腹腔及皮下多點(diǎn)免疫，免疫劑量IOOyg ；(2)于第21d，進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫，佐劑為腹水非完全佐劑，免疫劑量IOOyg;
(3)分別于第35d、49d進(jìn)行第2次、第3次加強(qiáng)免疫，免疫方式及劑量同上；
(4)第3次加強(qiáng)免疫后斷尾取血，測(cè)定血清中抗體免疫效價(jià)及抑制情況，免疫效價(jià)達(dá)到 10000 1，并且半數(shù)抑制小于500 ppb，滿足融合條件；
(5)進(jìn)行細(xì)胞融合前進(jìn)行最后一次免疫，免疫方式為尾靜脈注射。2、細(xì)胞融合及篩選
(1)取BALB/C小鼠，將小鼠頸椎脫臼處死，75% (體積百分含量)酒精消毒5 10min ； (2 )將小鼠移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，無菌取出脾臟。放入已盛有不完全培養(yǎng)基的無菌平皿中清冼，剝?nèi)ブ車Y(jié)締組織；
(3)將脾臟移入另一無菌平皿內(nèi)，制備脾細(xì)胞懸液，SOOrpm離心lOmin，細(xì)胞沉淀用不完全培養(yǎng)基同法離心洗滌一次，然后將細(xì)胞重懸至10ml，混勻，臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞記數(shù)后備用；
(4)取準(zhǔn)備好的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0，由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系贈(zèng)送)按4 1數(shù)量，加入50ml的一次性無菌離心管內(nèi)，加不完全培養(yǎng)基至30ml充分混勻后，800rpm離心lOmin，棄上清；
(5)用手指彈擊管底，使兩種細(xì)胞松散均勻。將離心管置于盛有37°C蒸餾水的燒杯中， 吸取37°C預(yù)熱的50%聚乙二醇(PEG)溶液Iml在60s內(nèi)緩慢滴入，邊加邊轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，靜止 Imin ；
(6)分別于lmin、2min、;3min加入完全培養(yǎng)基，攪動(dòng)離心管使PEG徹底稀釋而失去融合作用；離心，沉淀用HAT選擇培養(yǎng)液懸起，混合均勻，用八道排槍加入到已加有飼養(yǎng)細(xì)胞的 96孔培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 1 ；將培養(yǎng)板放置37°C，5% 二氧化碳飽和濕度溫箱中培養(yǎng)。(7)待雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底1/3-1/2時(shí)，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液100 1，既可用建立好的ELISA方法檢測(cè)上清，以SP2/0細(xì)胞上清作為陰性對(duì)照。ELISA檢測(cè)為陽性的細(xì)胞孔，將其轉(zhuǎn)移至M孔板中，隔天測(cè)定效價(jià)如仍為陽性，及時(shí)進(jìn)行亞克隆。應(yīng)用該方法獲得雜交瘤細(xì)胞株3D6，并于2011年10月M日，保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保存號(hào)為CGMCC M22。實(shí)施例3
甘草酸單克隆抗體的獲得 1、腹水制備
(1)在接種雜交瘤細(xì)胞的前1周，先用液體石蠟致敏8-12周齡雌性BALB/c小鼠，腹腔注射0. &iil/只，共注射10只；
(2)—周后收集雜交瘤細(xì)胞，用PBS或者不完全培養(yǎng)基洗滌2次，取1-2X IO6個(gè)細(xì)胞注射小鼠腹腔；
(3)接種后注意觀察小鼠狀態(tài)，一周后小鼠不活躍并且腹部明顯腫大，這時(shí)即可收集腹水，先用酒精棉球消毒腹部皮膚，用5ml注射器針頭刺入腹腔，從針頭另一側(cè)有淡黃色的腹水滴出，用無菌離心管收集，每隔1一2d采集一次，多次反復(fù)采集直到老鼠自然死亡；
(4)收集到的腹水放置冰箱內(nèi)4°C過夜，2000rpm離心5min，取上清，分裝，標(biāo)記，-70°C保存。2、抗體純化
(1)取待純化的腹水預(yù)先離心(高速冷凍離心機(jī)5000rpm，IOmin)去除細(xì)胞、殘?jiān)⑿☆w粒物質(zhì)；
(2)離心后，取上層清亮腹水。按1:2比例向腹水中加入醋酸buffer (0.05mol/L pH4. 4)稀釋，得稀釋腹水；
(3)按每毫升稀釋腹水加33μ 1辛酸的比例，4°C條件下逐滴加入辛酸，產(chǎn)生大量沉淀； 滴加的過程中用磁力攪拌器攪拌，IOmin內(nèi)加完，4°C靜置池；
(4)取出溶液離心(lOOOOrpm，15min)，取上清。在冰浴條件下用氨水調(diào)pH至7.4 ；
(5)用量筒量取透析后溶液，冰浴條件下緩慢加入等體積飽和硫酸銨(50%)，滴加的過程中用磁力攪拌器攪拌，4°C靜置池；
(6)離心(5000rpm，15min)，留沉淀，棄上清。沉淀用PBS (0. 01mol/L, pH 7. 4)復(fù)溶， 4°C條件下用PBS透析，換液3次。加防腐劑(0. 05% PR0CLIN300)。3、抗體鑒定
應(yīng)用ELISA方法測(cè)定腹水效價(jià)表1腹水效價(jià)
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞株3D6，其保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期是2011年10月M日，保藏編號(hào)為CGMCC 5422。
2.按照權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株3D6，其特征在于該雜交瘤細(xì)胞株3D6是由甘草酸人工完全抗原免疫BalB/C小鼠，并通過雜交瘤技術(shù)獲得。
3.按照權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株3D6，其特征在于所述的甘草酸人工完全抗原的獲得步驟是首先將甘草酸溶解在二甲基甲酰胺中，然后依次加入二環(huán)己基碳二亞胺和 N-羥基琥珀酰亞胺，常溫下反應(yīng)M小時(shí)后，再與載體蛋白分別在常溫下混合，反應(yīng)6小時(shí)， 最后將反應(yīng)液用0. 05mol/L PBS緩沖液透析得到甘草酸人工完全抗原。
4.按照權(quán)利要求3所述的雜交瘤細(xì)胞株3D6，其特征在于所述載體蛋白為血藍(lán)蛋白和卵清白蛋白。
5.按照權(quán)利要求3所述的雜交瘤細(xì)胞株3D6，其特征在于所述甘草酸用量為10-50mg， 二甲基甲酰胺用量為2-5ml ；加入二環(huán)己基碳二亞胺的量為15-25mg ；所述加入N-羥基琥珀酰亞胺的量為2-6g。
6.按照權(quán)利要求3所述的雜交瘤細(xì)胞株3D6，其特征在于上述反應(yīng)液用0.05mol/LPBS 緩沖液透析3-8次，每次2-6小時(shí)。
7.按照權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株3D6，其特征在于所述由甘草酸人工完全抗原免疫BalB/C小鼠的步驟為首先將稀釋、與等體積福氏完全佐劑乳化后的甘草酸人工完全抗原對(duì)BalB/C小鼠進(jìn)行腹腔及皮下多點(diǎn)免疫，免疫劑量50-200 μ g，隨后在21天、35天和 49天分別進(jìn)行三次加強(qiáng)免疫，佐劑為福氏非完全佐劑，免疫劑量50-100 μ g，至檢測(cè)免疫效價(jià)達(dá)到10000 1，并且半數(shù)抑制小于500ppb時(shí)滿足融合條件。
8.按照權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株3D6，其特征在于所述通過雜交瘤技術(shù)獲得的具體步驟為1)將BalB/C小鼠的脾臟取出、用不完全培養(yǎng)基清洗、剝?nèi)ソY(jié)締組織后，制備成脾細(xì)胞懸液，離心處理后再將細(xì)胞沉淀用不完全培養(yǎng)基離心洗滌，然后重新制備成IOml細(xì)胞懸液，混勻，備用。2)將上述制備好的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按照4 1的數(shù)量，及不完全培養(yǎng)基充分混合后離心，棄上清液，3)在37°C條件下緩慢滴加37°C的50%聚乙二醇，后lmin、2minJmin加入完全培養(yǎng)基，攪動(dòng)離心管使聚乙二醇徹底稀釋而失去融合作用，離心，沉淀用HAT選擇培養(yǎng)液懸起， 混合均勻，最后加入到已加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C，5%二氧化碳飽和濕度溫箱中培養(yǎng)，4)待雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底1/3-1/2時(shí)，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液用ELISA檢測(cè)法檢測(cè)，將 ELISA檢測(cè)為陽性的細(xì)胞孔，轉(zhuǎn)移至M孔板中，隔天測(cè)定效價(jià)仍為陽性，則進(jìn)行亞克隆，其中抑制效果最好的命名為3D6。
9.一種利用如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株3D6制備抗甘草酸單克隆抗體的方法， 其步驟為1)用液體石蠟致敏BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml/只；2)一周后，取1-2 X IO6個(gè)細(xì)胞注射小鼠腹腔；3)觀察小鼠不活躍并且腹部明顯腫大時(shí)，收集腹水，隨后每隔1-2天采集一次，反復(fù)采集直到老鼠自然死亡為至；4)收集到的腹水在4°C下保藏M小時(shí)，在2000rpm離心5min后收集的上清液即為抗甘草酸單克隆抗體。
10.按照權(quán)利要求9所述的雜交瘤細(xì)胞株3D6制備抗甘草酸單克隆抗體的方法，其特征在于所得到的抗甘草酸單克隆抗體采用如下步驟進(jìn)行純化1)將抗甘草酸單克隆抗體用5000rpm高速冷凍離心機(jī)離心lOmin，取上層清亮腹水，按 1 2的比例加入0. 05mol/L ρΗ4· 4醋酸稀釋，得稀釋液；2)按每毫升稀釋液加33μ1辛酸的比例，在4°C，攪拌狀態(tài)下逐滴加入辛酸，IOmin內(nèi)加完，4°C靜置2小時(shí)；3)在IOOOOrpm離心15分鐘，取上清液，在冰浴條件下用氨水調(diào)pH至7.4 ；4)將上清液用0.05mol/L PBS緩沖液透析5次，每次2小時(shí)；5)取透析處理后溶液，在冰浴下攪拌，緩慢加入等體積飽和硫酸銨，然后在4°C靜置2h ；6)在5000rpm下離心15min，取沉淀用0.01mol/L，pH 7. 4PBS緩沖液復(fù)溶，并在4°C條件下用PBS透析3次，即得純化后的抗甘草酸單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供雜交瘤細(xì)胞株，及利用其制備抗甘草酸單克隆抗體的方法，本發(fā)明通過把甘草酸與相應(yīng)大分子載體蛋白偶聯(lián)構(gòu)建人工合成抗原，再利用該人工合成抗原獲得甘草酸免疫抗原免疫動(dòng)物，然后獲取能穩(wěn)定分泌抗甘草酸單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的制備，進(jìn)而獲得了抗甘草酸單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)證明，該抗體可應(yīng)用于甘草酸的免疫組織化學(xué)方法定位和定量檢測(cè)。本發(fā)明的方法可以方便快捷地獲得甘草酸人工抗原，成本低，效果好，且利用抗甘草酸單克隆抗體進(jìn)行甘草真?zhèn)舞b定與含量測(cè)定時(shí)，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/30GK102409029SQ20111037621
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月23日
發(fā)明者劉濱, 彭勵(lì), 徐晨, 李宏富, 王英華, 鄭麗萍, 馬玲悅 申請(qǐng)人:寧夏大學(xué)