專利名稱：一種具有三螺旋結(jié)構(gòu)的活性膠原的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有三螺旋結(jié)構(gòu)的活性膠原的制備方法，屬于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域， 該產(chǎn)品為保持三螺旋結(jié)構(gòu)的活性膠原，具有低免疫原性、高生物相容性，可生物降解，適用于醫(yī)療用途。
背景技術(shù)：
膠原是脊椎動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣泛的一組硬蛋白，分子量約為300000， 均可在細(xì)胞外形成超分子聚集物，大量存在于骨、軟骨、肌腱及皮膚中，占人體或其他動(dòng)物體總蛋白含量的25%-33%。同一組織中常含有幾種類型的膠原，常以某種為主。I型膠原遍布于肌體的各部分，主要為皮膚、肌腱及韌帶中，具有很強(qiáng)的抗張能力。II型膠原主要存在于透明軟骨、玻璃體中，具有較強(qiáng)的抗壓能力。III型膠原廣泛分布于伸展性大的組織中，如疏松結(jié)締組織等，具有伸展性及應(yīng)變性。其中，I型膠原占生物體總膠原量的90%，因此，I型膠原在生物材料中的使用也最廣泛。膠原在分子水平結(jié)構(gòu)相同，由3條a鏈多肽組成，每一條膠原鏈都是左手螺旋構(gòu)型。3條左手螺旋鏈又相互纏繞成右手螺旋結(jié)構(gòu)，即超螺旋結(jié)構(gòu)為膠原蛋白獨(dú)特的三重螺旋結(jié)構(gòu)，使其分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定。3條鏈富含甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸，缺乏半胱氨酸和色氨酸，酪氨酸含量也很低，但含獨(dú)特的羥化氨基酸(羥脯氨酸和羥賴氨酸)。由于原纖維的方向性和成束直徑及密度的不同，不同組織的膠原存在結(jié)構(gòu)差異，并具有各自的功能和結(jié)構(gòu)特征。在結(jié)締組織中，膠原除了機(jī)械支撐外，還是細(xì)胞粘附和移動(dòng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，膠原被認(rèn)為是胚胎發(fā)育和組織再生中重要的形態(tài)發(fā)生因素，在組織工程中得到廣泛應(yīng)用。能被稱為膠原的，必須是其三螺旋結(jié)構(gòu)沒有改變的那類蛋白質(zhì)，還保留有完全生物活性。而膠原蛋白是膠原的水解產(chǎn)物，膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)徹底松開，成為3條自由的肽鏈，且降解成多分散的肽段，其中包括小肽。因此膠原蛋白是多肽混合物，相對分子量從幾千到幾萬，分子量分布很寬，沒有生物活性，能溶于冷水，而且能被蛋白酶利用。CNl 110284中公開了一種膠原的制備方法，以酸提取，鹽沉淀，膜過濾，最后凍干， 其提取效率和純度都較低。CN101250218公開了一種以鱈魚皮為原料制備膠原蛋白的方法， 其制備方法會破壞膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)。現(xiàn)有技術(shù)公開的方法在膠原的提取制備過程中往往破壞膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)，或者提取效率較低，無法實(shí)現(xiàn)既能夠保留活性膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)， 又同時(shí)提高提取效率和純度。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，本發(fā)明的目的是提供一種具有三螺旋結(jié)構(gòu)的活性膠原的制備方法。本發(fā)明使用酸酶結(jié)合處理加漸進(jìn)式超聲波處理的制備方法，不僅能夠保持膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí)顯著的提高了膠原的提取效率。本發(fā)明使用H2A溶液處理加酸溶鹽析純化加透析純化有效的提高了膠原產(chǎn)品的純度。—種具有三螺旋結(jié)構(gòu)的活性膠原的制備方法，包括如下步驟原料預(yù)處理、除脂、酸酶結(jié)合處理、超聲波處理、H2A溶液處理、酸溶鹽析純化、透析純化、干燥。所述的原料為選自新鮮豬皮、牛皮、牛跟腱中的一種。所述的酸酶結(jié)合處理為經(jīng)過預(yù)處理的原料浸入0. 6 0. 7mol/L冰醋酸和600 700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續(xù)攪拌25 30小時(shí)左右。所述的超聲波處理優(yōu)選采用漸進(jìn)式超聲波處理，先使用100 200W超聲處理30 分鐘，再使用200 300W超聲處理30分鐘，最后使用300 400W超聲處理1小時(shí)。所述的一種具有三螺旋結(jié)構(gòu)的活性膠原的制備方法，具體步驟如下(1)取新鮮豬皮，切割清除油脂層和毛皮層，去除雜質(zhì)，清洗，將豬皮破碎成小顆粒狀，按照固液比1 30 1 40的比例，加入0.01 0.03mol/L的氫氧化鈉水溶液，于 6 8°C浸泡1 2小時(shí)，過濾，備用；( 在上述預(yù)處理后的豬皮中加入質(zhì)量為豬皮質(zhì)量6 8倍的無水乙醚或者丙酮， 于35 40°C回流5-8小時(shí)，之后用蒸餾水沖洗至無異味，備用；(3)將上述豬皮浸入0. 6 0. 7mol/L冰醋酸和600 700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續(xù)攪拌25 30小時(shí)左右；(4)對上述混合物采用漸進(jìn)式超聲波處理，先使用100 200W超聲處理30分鐘， 再使用200 300W超聲處理30分鐘，最后使用300 400W超聲處理1小時(shí)；(5)加入2 3%的H202溶液，混合靜置2 4小時(shí)，調(diào)節(jié)pH至5. 0，離心；(6)取上清液，加入NaCl，攪拌20-30小時(shí)，離心，沉淀物加入0. 6-0. 7moL/L冰醋酸溶解，離心，取上清液，調(diào)節(jié)PH至7. 5，加入NaCl，攪拌20-30小時(shí)，離心；(7)將步驟(6)得到的沉淀物溶解于0. 6 0. 7moL/L冰醋酸，先以0. 6 0. 7moL/ L的冰醋酸為透析外液透析2次，每次4小時(shí)，再以蒸餾水為透析外液透析5 7次，每次4 小時(shí)，至外液檢測不到氯離子，得到膠原液體；(8)將上述液體冷凍干燥，得到具有三螺旋結(jié)構(gòu)活性的膠原。所述的具有三螺旋結(jié)構(gòu)活性膠原的大小一般為20000 30000道爾頓。酸酶結(jié)合處理本發(fā)明所述的酸酶結(jié)合處理是指經(jīng)過預(yù)處理的原料浸入0. 6 0. 7mol/L冰醋酸和600 700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續(xù)攪拌25 30小時(shí)左右。該方法結(jié)合了酸法和酶法提取制備膠原的特點(diǎn)，防止了對活性膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的破壞，有效的提高了提取效率。超聲波處理本發(fā)明所述的酸酶結(jié)合處理是指采用漸進(jìn)式超聲波處理，先使用 100 200W超聲處理30分鐘，再使用200 300W超聲處理30分鐘，最后使用300 400W 超聲處理1小時(shí)。本發(fā)明采用超聲波處理結(jié)合酸酶法提取制備膠原蛋白，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，采用超聲波處理能夠有效的提高提取效率。采用漸進(jìn)式超聲波處理與采用固定功率超聲處理相比，能夠更好的防止膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)的破壞，并且有效的降低超聲波處理階段的生產(chǎn)能耗。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明使用酸酶結(jié)合處理加漸進(jìn)式超聲波處理的制備方法， 最大程度上減少了對膠原結(jié)構(gòu)的破壞，保持活性膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí)顯著的提高了膠原的提取效率，降低了生產(chǎn)成本。同時(shí)，漸進(jìn)式超聲波處理也在超聲波處理環(huán)節(jié)一定程度上降低了能耗。本發(fā)明使用H2O2溶液處理加酸溶鹽析純化加透析純化有效的提高了膠原產(chǎn)品的純度。本發(fā)明的方法直接制得的膠原產(chǎn)品具有低免疫原性和高生物相容性，已經(jīng)通過工業(yè)化生產(chǎn)，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)療產(chǎn)品，如皮膚代用品、骨骼代用品、膠原蛋白敷料、生物工程膜等。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明實(shí)施例1(1)取新鮮牛皮，切割清除油脂層和毛皮層，去除雜質(zhì)，清洗，將牛皮破碎成小顆粒狀，按照固液比1 30的比例，加入0.03mol/L的氫氧化鈉水溶液，于6 8°C浸泡2小時(shí)， 過濾，備用；(2)在上述預(yù)處理后的牛皮中加入質(zhì)量為牛皮質(zhì)量8倍的無水乙醚或者丙酮，于 35°C回流8小時(shí)，之后用蒸餾水沖洗至無異味，備用；(3)將上述牛皮浸入0. 6mol/L冰醋酸和700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續(xù)攪拌 25小時(shí)左右；(4)對上述混合物采用漸進(jìn)式超聲波處理，先使用100W超聲處理30分鐘，再使用 300W超聲處理30分鐘，最后使用400W超聲處理1小時(shí)；(5)加入2%的H2A溶液，混合靜置4小時(shí)，調(diào)節(jié)pH至5. 0，離心；(6)取上清液，加入NaCl，攪拌20小時(shí)，離心，沉淀物加入0. 7moL/L冰醋酸溶解， 離心，取上清液，調(diào)節(jié)pH至7. 5，加入NaCl，攪拌20小時(shí)，離心；(7)將步驟(6)得到的沉淀物溶解于0. 7moL/L冰醋酸，先以0. 7moL/L的冰醋酸為透析外液透析2次，每次4小時(shí)，再以蒸餾水為透析外液透析5次，每次4小時(shí)，至外液檢測不到氯離子，得到膠原液體；(8)將上述液體冷凍干燥，得到具有三螺旋結(jié)構(gòu)活性的膠原。實(shí)施例2(1)取新鮮牛跟腱，切割清除油脂層和毛皮層，去除雜質(zhì)，清洗，將牛跟腱破碎成小顆粒狀，按照固液比1 40的比例，加入0. 01mol/L的氫氧化鈉水溶液，于6 8°C浸泡1 小時(shí)，過濾，備用；(2)在上述預(yù)處理后的牛跟腱中加入質(zhì)量為牛跟腱質(zhì)量6倍的無水乙醚或者丙酮，于40°C回流5小時(shí)，之后用蒸餾水沖洗至無異味，備用；(3)將上述牛跟腱浸入0. 7mol/L冰醋酸和600mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續(xù)攪拌30小時(shí)左右；(4)對上述混合物采用漸進(jìn)式超聲波處理，先使用100W超聲處理30分鐘，再使用 200W超聲處理30分鐘，最后使用300W超聲處理1小時(shí)；(5)加入3%的H2A溶液，混合靜置2小時(shí)，調(diào)節(jié)pH至5. 0，離心；(6)取上清液，加入NaCl，攪拌30小時(shí)，離心，沉淀物加入0. 6moL/L冰醋酸溶解， 離心，取上清液，調(diào)節(jié)pH至7. 5，加入NaCl，攪拌30小時(shí)，離心；(7)將步驟(6)得到的沉淀物溶解于0. 6moL/L冰醋酸，先以0. 6moL/L的冰醋酸為透析外液透析2次，每次4小時(shí)，再以蒸餾水為透析外液透析7次，每次4小時(shí)，至外液檢測不到氯離子，得到膠原液體；(8)將上述液體冷凍干燥，得到具有三螺旋結(jié)構(gòu)活性的膠原。
實(shí)施例3(1)取新鮮豬皮，切割清除油脂層和毛皮層，去除雜質(zhì)，清洗，將豬皮破碎成小顆粒狀，按照固液比1 35的比例，加入0. 02mol/L的氫氧化鈉水溶液，于6 8°C浸泡1. 5小時(shí)，過濾，備用；(2)在上述預(yù)處理后的豬皮中加入質(zhì)量為豬皮質(zhì)量7倍的無水乙醚或者丙酮，于 37°C回流6小時(shí)，之后用蒸餾水沖洗至無異味，備用；C3)將上述豬皮浸入0.65mol/L冰醋酸和650mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續(xù)攪拌 28小時(shí)左右；(4)對上述混合物采用漸進(jìn)式超聲波處理，先使用150W超聲處理30分鐘，再使用 250W超聲處理30分鐘，最后使用350W超聲處理1小時(shí)；(5)加入2. 5%的H2A溶液，混合靜置3小時(shí)，調(diào)節(jié)pH至5. 0，離心；(6)取上清液，加入NaCl，攪拌25小時(shí)，離心，沉淀物加入0. 65moL/L冰醋酸溶解， 離心，取上清液，調(diào)節(jié)PH至7. 5，加入NaCl，攪拌25小時(shí)，離心；(7)將步驟(6)得到的沉淀物溶解于0. 65moL/L冰醋酸，先以0. 65moL/L的冰醋酸為透析外液透析2次，每次4小時(shí)，再以蒸餾水為透析外液透析6次，每次4小時(shí)，至外液檢測不到氯離子，得到膠原液體；(8)將上述液體冷凍干燥，得到具有三螺旋結(jié)構(gòu)活性的膠原。
權(quán)利要求
1.一種具有三螺旋結(jié)構(gòu)的活性膠原的制備方法，其特征在于，包括如下步驟原料預(yù)處理、除脂、酸酶結(jié)合處理、超聲波處理、H2A溶液處理、酸溶鹽析純化、透析純化、干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的原料為選自新鮮豬皮、牛皮、 牛跟腱中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的酸酶結(jié)合處理為經(jīng)過預(yù)處理的原料浸入0. 6 0. 7mol/L冰醋酸和600 700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持續(xù)攪拌25 30小時(shí)左右。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的超聲波處理優(yōu)選采用漸進(jìn)式超聲波處理，先使用100 200W超聲處理30分鐘，再使用200 300W超聲處理30分鐘， 最后使用300 400W超聲處理1小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，具體步驟如下(1)取新鮮豬皮，切割清除油脂層和毛皮層，去除雜質(zhì)，清洗，將豬皮破碎成小顆粒狀， 按照固液比1 30 1 40的比例，加入0. 01 0. 03mol/L的氫氧化鈉水溶液，于6 8°C浸泡1 2小時(shí)，過濾，備用。(2)在上述預(yù)處理后的豬皮中加入質(zhì)量為豬皮質(zhì)量6 8倍的無水乙醚或者丙酮，于 35 40°C回流5-8小時(shí)，之后用蒸餾水沖洗至無異味，備用。(3)將上述豬皮浸入0.6 0. 7mol/L冰醋酸和600 700mg/L胃蛋白酶的混合液中， 持續(xù)攪拌25 30小時(shí)左右。(4)對上述混合物采用漸進(jìn)式超聲波處理，先使用100 200W超聲處理30分鐘，再使用200 300W超聲處理30分鐘，最后使用300 400W超聲處理1小時(shí)。(5)加入2 3%的H2A溶液，混合靜置2 4小時(shí)，調(diào)節(jié)pH至5.0，離心。(6)取上清液，加入NaCl，攪拌20-30小時(shí)，離心，沉淀物加入0.6-0. 7moL/L冰醋酸溶解，離心，取上清液，調(diào)節(jié)PH至7. 5，加入NaCl，攪拌20-30小時(shí)，離心。(7)將步驟(6)得到的沉淀物溶解于0.6 0. 7moL/L冰醋酸，先以0. 6 0. 7moL/L的冰醋酸為透析外液透析2次，每次4小時(shí)，再以蒸餾水為透析外液透析5 7次，每次4小時(shí)，至外液檢測不到氯離子，得到膠原液體。(8)將上述液體冷凍干燥，得到具有三螺旋結(jié)構(gòu)活性的膠原。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種膠原的制備方法，以新鮮豬皮為原料，經(jīng)預(yù)處理，去除脂肪，經(jīng)酸酶法處理后，使用超聲波處理，進(jìn)一步提高提取效率，最后純化制得高純度的膠原產(chǎn)品。本發(fā)明膠原的制備方法提取效率高，產(chǎn)品純度達(dá)到98％以上。該產(chǎn)品為保持三螺旋結(jié)構(gòu)的活性膠原，具有低免疫原性、高生物相容性，可生物降解，適用于醫(yī)療用途。
文檔編號C07K14/78GK102391374SQ20111036103
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者任偉業(yè) 申請人:無錫貝迪生物工程有限公司