專利名稱：蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的純化方法。
背景技術(shù)：
蠶蛹是人類的一種新營養(yǎng)源，是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的作為普通食品管理的食品新資源名單中唯一的昆蟲類食品。蠶蛹具有極高的營養(yǎng)價值，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素。食用蠶蛹對膽固醇酯化，降低血中膽固醇和甘油三酯；降低血液粘稠度，改善血液微循環(huán)有一定的功效。但目前，市場上基本還未出現(xiàn)以蠶蛹中有效成分作為藥物開發(fā)的產(chǎn)品，缺乏這些天然成分的的純化方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)一種蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的純化方法，能利用蠶蛹作為原料，通過分離純化獲得具有降低血液粘稠度，改善血液微循環(huán)的天然藥用蛋白，該方法操作簡便，且產(chǎn)量高，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，提純的天然蛋白可作為保健藥物，無毒副作用。為此，本發(fā)明的包括下步驟(1)蠶蛹預(yù)處理，將新鮮蠶蛹與預(yù)冷的PBS液，溫度1 5°C，pH值為7. 4，按重量比1 1加入到榨汁機(jī)中勻漿30sec，在冰上冰浴4 8min，繼續(xù)勻漿，重復(fù)三次，使蠶蛹中的蛋白充分溶解，將所得品轉(zhuǎn)移到離心杯中4°C，12000rpm離心20min，取上清液通過九層紗布過濾除去大顆粒不溶雜質(zhì)，將濾液再次離心過濾，重復(fù)三次，收集過濾后的濾液4°C，60 %硫酸銨沉淀蛋白，去除油脂，8000rpm離心30min，棄上清，用預(yù)冷的PBS液重懸沉淀，0. 45 μ m濾膜真空抽濾，得預(yù)處理上清液，4°C保存；(2)人生長激素類似脂蛋白的初步分離，選擇AKTA explorer 10中的Size Exclusion對預(yù)處理上清液進(jìn)行分離并脫去色素，流動相為PBS液，pH值為7. 4，壓力 0. 5Mpa，流速1. 5ml/min ；程序結(jié)束后，共出現(xiàn)6個蛋白吸收峰，根據(jù)目的出峰時間判斷第5 和第6號蛋白吸收峰為17kDa以下的色素及小分子物質(zhì)，人生長激素類似脂蛋白，分子量 30kDa,應(yīng)出現(xiàn)在第4號峰，因此收集前面4個蛋白吸收峰，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Wfestern Blot檢測，結(jié)果表明人生長激素類似脂蛋白存與第4號蛋白峰中，用4號蛋白吸收峰的所得品進(jìn)行后續(xù)純化；(3)親和層析純化，用4號蛋白吸收峰的所得品進(jìn)行親和層析純化，親和層析柱的制備取2mL 50%的Plus coupling Resin裝入柱殼中，平衡至室溫， 放出殘余液體，加入 3 倍柱體積 Coupling Buffer,0. IM Sodium phosphate,0. 15M NaCl, pH值為7. 2，平衡柱子，之后加入2mL hGH標(biāo)準(zhǔn)品lmg/ml和40 μ L Cyanoborohy dride，室溫下?lián)u床孵育4h或4°C保持7 9h，在通風(fēng)櫥里打開蓋子，收集放出的液體，用BCA蛋白定量，計(jì)算偶聯(lián)效率；再加入5倍柱體積Quenching Buffer, IM Tris-HCl，pH值為7. 4，0. 05% NaN3,洗填料，之后加入 2mL Quenching Buffer 和 40 μ L Cyanoborohy dride，室溫下?lián)u床孵育30min ；在通風(fēng)櫥打開蓋子放出反應(yīng)的氣體和溶液，加入5倍體積Wash Solution, IM NaCl，0.05% Na^洗柱子；再用Coupling Buffer平衡柱子，4°C保存；
親和純化人生長激素類似脂蛋白，室溫平衡柱子，之后打開蓋子棄去保護(hù)液，用5 倍柱體積的Binding Buffer, 0. 15M PBS, pH值為7. 4，再次平衡柱子；所得品經(jīng)過0. 45 μ m 濾膜過濾后上柱，室溫?fù)u床孵育lh，放出溶液，用Wash Buffer, 0. 15M PBS，pH7. 4，洗去未結(jié)合樣品，最后加入Elution Buffer (0. IM Glycine-HCl，pH值為2. 5，洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白，用 Neutralization Buffer,0. 5M Tris_HCl，pH值為 8. 5，調(diào) pH值至中性；收集樣品， BCA蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測；(4)超濾濃縮，使用中空纖維膜進(jìn)行超濾，選擇合適的中空纖維膜規(guī)格，截留分子量為3kDa，進(jìn)行清洗后加樣，用適量無菌PBS，pH值為7. 4，超濾濃縮，無菌分裝，_50°C冷凍干燥，制成凍干粉，得本發(fā)明的成品。所述的親和層析純化是用4號蛋白吸收峰的所得品進(jìn)行親和層析純化。上述方法實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能利用蠶蛹作為原料，通過分離純化獲得具有降低血液粘稠度， 改善血液微循環(huán)的天然藥用蛋白，該方法操作簡便，且產(chǎn)量高，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，提純的天然蛋白可作為保健藥物，無毒副作用。


圖1(1)、(2)和圖2是蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的初步分離圖。其中M.為低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1.總蠶蛹蛋白樣品；2. 1#吸收峰蛋白樣品； 3. 2#吸收峰蛋白樣品；4. 3#吸收峰蛋白樣品；5. 4#吸收峰蛋白樣品。圖3是蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的Western Blot檢測圖。其中M.為低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1. 4#吸收峰蛋白樣品；3.純化樣品。圖4和圖5是K562細(xì)胞體外檢測人生長激素類似脂蛋白促生長作用比較圖。
具體實(shí)施例方式如圖1至圖5所示，一種蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的純化方法。包括下步驟 ⑴蠶蛹預(yù)處理，將新鮮蠶蛹與預(yù)冷的PBS液，溫度1 5°C，pH值為7. 4，按重量比1 1 加入到榨汁機(jī)中勻漿30sec，在冰上冰浴4 8min，繼續(xù)勻漿，重復(fù)三次，使蠶蛹中的蛋白充分溶解。所得品轉(zhuǎn)移到離心杯中4°C，12000rpm離心20min，取上清液通過九層紗布過濾除去大顆粒不溶雜質(zhì)，將濾液再次離心過濾，重復(fù)三次。收集過濾后的濾液4°C，(重量比)60%硫酸銨沉淀蛋白，去除油脂，SOOOrpm離心30min，棄上清，用預(yù)冷的PBS液重懸沉淀，0.45μπι濾膜真空抽濾，得預(yù)處理上清液，4°C保存。( 人生長激素類似脂蛋白的初步分離，選擇AKTA explorerlO中的Size Exclusion對預(yù)處理上清液進(jìn)行分離并脫去色素， 流動相為PBS液，pH值為7. 4，壓力0. 5Mpa，流速1. 5ml/min ；程序結(jié)束后，共出現(xiàn)6個蛋白吸收峰，根據(jù)目的出峰時間判斷第5和第6號蛋白吸收峰為17kDa以下的色素及小分子物質(zhì)，人生長激素類似脂蛋白，分子量30kDa，應(yīng)出現(xiàn)在第4號峰，因此收集前面4個蛋白吸收峰，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western Blot檢測，結(jié)果表明人生長激素類似脂蛋白存與第4號蛋白峰中，用4號蛋白吸收峰的所得品進(jìn)行后續(xù)純化。(3)親和層析純化，用4號蛋白吸收峰的所得品進(jìn)行親和層析純化。親和層析柱的制備取2mL 50%的Plus coupling Resin裝入柱殼中，平衡至室溫，放出殘余液體，加入3倍柱體積Coupling Buffer,0. IM Sodium phosphate, 0. 15M NaCl，pH值為 7. 2，平衡柱子，之后加入 2mL hGH標(biāo)準(zhǔn)品 lmg/ml 和 40 μ L Cyanoborohy dride，室溫下?lián)u床孵育4h或4°C保持7 9h，在通風(fēng)櫥里打開蓋子， 收集放出的液體，用BCA蛋白定量，計(jì)算偶聯(lián)效率；再加入5倍柱體積Quenching Buffer, IM Tris-HCl，pH 值為 7· 4，0· 05% NaN3,洗填料，之后加入 2mL Quenching Buffer 禾口 40 μ L Cyanoborohy dride，室溫下?lián)u床孵育30min ；在通風(fēng)櫥打開蓋子放出反應(yīng)的氣體和溶液，加入 5 倍體積 Wash Solution，IMNaCl，0· 05% NaN3 洗柱子；再用 Coupling Buffer 平衡柱子， 4°C保存。親和純化人生長激素類似脂蛋白，室溫平衡柱子，之后打開蓋子棄去保護(hù)液，用5 倍柱體積的Binding Buffer, 0. 15M PBS, pH值為7. 4，再次平衡柱子；所得品經(jīng)過0. 45 μ m 濾膜過濾后上柱，室溫?fù)u床孵育lh，放出溶液，用Wash Buffer, 0. 15M PBS，pH7. 4，洗去未結(jié)合樣品，最后加入Elution Buffer (0. IM Glycine-HCl，pH值為2. 5，洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白，用 Neutralization Buffer,0. 5M Tris_HCl，pH值為 8. 5，調(diào) pH值至中性；收集樣品， BCA蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。(4)超濾濃縮，使用中空纖維膜進(jìn)行超濾，選擇合適的中空纖維膜規(guī)格，截留分子量為3kDa，進(jìn)行清洗后加樣，用適量無菌PBS，pH值為7.4， 超濾濃縮，無菌分裝，_50°C冷凍干燥，制成凍干粉，得本發(fā)明的成品。所述的親和層析純化是用4號蛋白吸收峰的所得品進(jìn)行親和層析純化。本發(fā)明的保存及檢測是將所得品無菌分裝，-50°C冷凍干燥，制成凍干粉。12% SDS-PAGE跑電泳，檢測樣品，在30kDa處有目的蛋白的條帶。本發(fā)明的生物活性鑒定是取凍干后的0. 5mg樣品溶于ImlPBS緩沖液中(0. 5mg/ ml)用Cy5標(biāo)記蛋白，尾靜脈注射小鼠，24h后檢測血脂含量。通過K562細(xì)胞體外檢測其促生長作用。從圖1可看出，其中圖1(1)為參考曲線圖，圖1(2)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖，蠶蛹蛋白組分經(jīng)蛋白純化系統(tǒng)處理后，得到了很好的分離效果，共得到6個蛋白吸收峰，根據(jù)參考曲線已知分子量樣品出峰時間判斷，實(shí)驗(yàn)組中4號峰樣品分子量大小介于17-43kDa之間，5號6號峰為17kDa以下的小分子物質(zhì)。從圖2可看出分子量為30kDa左右的蛋白群得到了很好的分離，主要集中在4號蛋白峰上。從圖3可看出人生長激素類似脂蛋白分布在4號蛋白峰中，且分子量為30kDa，在天然狀態(tài)下是以單體形式存在。從圖4可看出經(jīng)過親和層析純化后，可得到高純度的人生長激素類似脂蛋白從圖5可看出，選用K562細(xì)胞體外檢測系統(tǒng)檢測人生長激素類似脂蛋白的促生長作用，以人生長激素作為陽性對照，3天后測得給藥劑量為200ng/ml濃度時K562細(xì)胞明顯擴(kuò)增，其效果為人生長激素對照組的一半?？傊景l(fā)明能利用蠶蛹作為原料，通過分離純化獲得具有降低血液粘稠度，改善血液微循環(huán)，促生長的天然藥用蛋白，該方法操作簡便，且產(chǎn)量高，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，提純的天然蛋白無毒副作用，可作為保健藥物開發(fā)，彌補(bǔ)市場該領(lǐng)域的空白。
權(quán)利要求
1.一種蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的純化方法，其特征在于包括下步驟，(1)蠶蛹預(yù)處理，將新鮮蠶蛹與預(yù)冷的PBS液，溫度1 5°C，PH值為7.4，按重量比 1 1加入到榨汁機(jī)中勻漿30sec，在冰上冰浴4 8min，繼續(xù)勻漿，重復(fù)三次，使蠶蛹中的蛋白充分溶解，將所得品轉(zhuǎn)移到離心杯中4°C，12000rpm離心20min，取上清液通過九層紗布過濾除去大顆粒不溶雜質(zhì)，將濾液再次離心過濾，重復(fù)三次，收集過濾后的濾液4°C，60%硫酸銨沉淀蛋白，去除油脂，SOOOrpm離心30min，棄上清， 用預(yù)冷的PBS液重懸沉淀，0. 45 μ m濾膜真空抽濾，得預(yù)處理上清液，4°C保存；(2)人生長激素類似脂蛋白的初步分離，選擇AKTAexplorerlO中的Size Exclusion 對預(yù)處理上清液進(jìn)行分離并脫去色素，流動相為PBS液，pH值為7. 4，壓力0. 5Mpa,流速 1. 5ml/min ；程序結(jié)束后，共出現(xiàn)6個蛋白吸收峰，根據(jù)目的出峰時間判斷第5和第6號蛋白吸收峰為17kDa以下的色素及小分子物質(zhì)，人生長激素類似脂蛋白，分子量30kDa，應(yīng)出現(xiàn)在第4號峰，因此收集前面4個蛋白吸收峰，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳和flfestern Blot檢測， 結(jié)果表明人生長激素類似脂蛋白存與第4號蛋白峰中，用4號蛋白吸收峰的所得品進(jìn)行后續(xù)純化；(3)親和層析純化，用4號蛋白吸收峰的所得品進(jìn)行親和層析純化，親和層析柱的制備取2mL 50%的Plus coupling Resin裝入柱殼中，平衡至室溫，放出殘余液體，加入3倍柱體積 Coupling Buffer,0. IM Sodium phosphate,0· 15M NaCl，pH 值為 7. 2，平衡柱子，之后加入2mL hGH標(biāo)準(zhǔn)品lmg/ml和40 μ L Cyanoborohy dride,室溫下?lián)u床孵育4h或4°C保持 7 9h，在通風(fēng)櫥里打開蓋子，收集放出的液體，用BCA蛋白定量，計(jì)算偶聯(lián)效率；再加入5 倍柱體積 Quenching Buffer, IM Tris-HCl，pH值為 7. 4,0. 05% NaN3，洗填料，之后加入 2mL Quenching Buffer和40 μ L Cyanoborohy dride，室溫下?lián)u床孵育30min ；在通風(fēng)櫥打開蓋子放出反應(yīng)的氣體和溶液，加入5倍體積Wash Solution, IM NaCl，0.05% NaR洗柱子；再用Coupling Buffer平衡柱子，4°C保存；親和純化人生長激素類似脂蛋白，室溫平衡柱子，之后打開蓋子棄去保護(hù)液，用5倍柱體積的Binding Buffer, 0. 15M PBS，pH值為7. 4，再次平衡柱子；所得品經(jīng)過0. 45 μ m濾膜過濾后上柱，室溫?fù)u床孵育lh，放出溶液，用Wash Buffer, 0. 15M PBS，pH7. 4，洗去未結(jié)合樣品，最后加入Elution Buffer (0. IMGlycine-HCl, pH值為2. 5，洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白， 用 Neutralization Buffer, 0. 5M Tris-HCl，pH值為 8· 5，調(diào) pH值至中性；收集樣品，BCA 蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測；(4)超濾濃縮，使用中空纖維膜進(jìn)行超濾，選擇合適的中空纖維膜規(guī)格，截留分子量為 3kDa,進(jìn)行清洗后加樣，用適量無菌PBS，pH值為7. 4，超濾濃縮，無菌分裝，_50°C冷凍干燥， 制成凍干粉，得本發(fā)明的成品。
2.按權(quán)利要求1所述的蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的純化方法，其特征在于所述的親和層析純化是用4號蛋白吸收峰的所得品進(jìn)行親和層析純化。
全文摘要
本發(fā)明屬于一種蠶蛹中人生長激素類似脂蛋白的純化方法，方法包括蠶蛹預(yù)處理，人生長激素類似脂蛋白的初步分離，用4號蛋白吸收峰的所得品進(jìn)行親和層析純化和超濾濃縮等步驟。本發(fā)明能利用蠶蛹作為原料，通過分離純化獲得具有降低血液粘稠度，改善血液微循環(huán)的天然藥用蛋白，該方法操作簡便，且產(chǎn)量高，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，提純的天然蛋白可作為保健藥物，無毒副作用。
文檔編號C07K1/22GK102424701SQ201110309518
公開日2012年4月25日 申請日期2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月13日
發(fā)明者葉曼, 張耀洲, 陳劍清, 陳昊 申請人:天津耀宇生物技術(shù)有限公司