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一種從鏈霉菌發(fā)酵液中提純子囊霉素的方法

文檔序號(hào):3509825閱讀:465來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:一種從鏈霉菌發(fā)酵液中提純子囊霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種從發(fā)酵液中提純子囊霉素的工藝,屬于生物工程領(lǐng)域,具體涉及生物制藥,發(fā)酵產(chǎn)物的提取、分離和純化方法,特別涉及一種從鏈霉菌發(fā)酵液中提純子囊霉素的方法。
背景技術(shù)
子囊霉素(Ascomycin,Immunomycin, FK-520)為二十三碳的大環(huán)內(nèi)酯類化合物, 是免疫抑制劑Π(-506(他克莫司,tacrolimus)乙基類似物,40多年前日本藤澤制藥公司從含有吸水鏈霉菌(Sti^ptomyces hygroscopicus)的土壤中分離得到。自從其結(jié)構(gòu)類似物他克莫司的免疫抑制活性被發(fā)現(xiàn)后,迅速推動(dòng)了子囊霉素及其衍生物的免疫抑制活性研究。研究發(fā)現(xiàn)子囊霉素具有很強(qiáng)的免疫抑制劑作用,目前子囊霉素已被用作生產(chǎn)半合成 API (如吡美莫司)的中間體。吡美莫司是第一個(gè)被設(shè)計(jì)用于皮膚病的子囊霉素衍生物,由子囊霉素經(jīng)縮環(huán)反應(yīng)而形成。吡美莫司主要應(yīng)用于特應(yīng)性皮炎(AD)、變應(yīng)性接觸性皮炎、銀屑病,紅斑狼瘡,扁平苔蘚,白癜風(fēng),Nethenton綜合癥,移植物抗宿主病等自身免疫疾病的治療。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外主要選用以吸水鏈霉菌為代表的微生物發(fā)酵法來(lái)生產(chǎn)子囊霉素。 1962年,日本藤澤制藥公司首次從壤中分離的吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus No. KK317的發(fā)酵液中提取得到子囊霉素。特別是二十世紀(jì)八十年代末,F(xiàn)ujisawa及Abbott 公司從吸水鏈霉菌變種的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了 FR-900520和ATCC14891,它們?cè)诠庾V、色譜、化學(xué)結(jié)構(gòu)上與子囊霉素相同。2008年,匈牙利科學(xué)家Attila K0nya等從土壤中篩選到一株子囊霉素產(chǎn)生菌Mi^ptomyces tubercidicus DSMZ42761,證實(shí)了非吸水鏈霉菌也能產(chǎn)生子囊霉素的事實(shí)。國(guó)內(nèi)對(duì)子囊霉素的研究尚處于起步階段,中國(guó)專利CN101036649公開了子囊霉素作為免疫抑制劑在制備治療自身免疫性糖尿病和皮膚抑制排斥反應(yīng)的藥物中的用途。昆明理工大學(xué)穆云龍通過對(duì)子囊霉素菌種選育及發(fā)酵條件的的初步研究,發(fā)酵培養(yǎng)96小時(shí),發(fā)酵效價(jià)最高可達(dá)131. 7mg/L。但對(duì)于如何分離提取產(chǎn)物并為具體說(shuō)明。1988年日本藤澤制藥公司報(bào)道提取子囊霉素的方法。由于發(fā)酵液中會(huì)存在多種子囊霉素類似物且由于子囊霉素在水相中存在異構(gòu)現(xiàn)象,而提取分離方法中多含有水相,這就使得從發(fā)酵液中提純子囊霉素主要技術(shù)研究存在較大技術(shù)難度。目前對(duì)于子囊霉素的大部分研究工作集中在子囊霉素發(fā)酵、子囊霉素衍生物的開發(fā)、抗菌活性及臨床應(yīng)用等方面?,F(xiàn)階段子囊霉素分離提取的主要問題是子囊霉素的收率不高,分離成本高等問題。另外,由于子囊霉素在水相中存在異構(gòu)現(xiàn)象,目前提取分離方法中多含有水相,產(chǎn)品中含有子囊霉素結(jié)構(gòu)類似物,影響產(chǎn)品純度及產(chǎn)品形態(tài)。而我國(guó)目前還未有子囊霉素工業(yè)化生產(chǎn)報(bào)道,其市場(chǎng)基本被日本和美國(guó)等國(guó)外公司占領(lǐng)。因此,本領(lǐng)域迫切需要提供一種生產(chǎn)成本低廉、適合于工業(yè)化生產(chǎn)的提純子囊霉素的生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷或不足,而提供了一種采用從鏈霉菌發(fā)酵液中提純子囊霉素的方法,操作方便、工藝簡(jiǎn)單、降低了成本、提高了效率,適合工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種從鏈霉菌發(fā)酵液中提純子囊霉素的方法,其特征在于采用發(fā)酵液過濾、菌絲體超聲破碎提取、大孔樹脂吸附、硅膠柱層析和結(jié)晶技術(shù)得到子囊霉素純品。其具體步驟如下1)將鏈霉菌發(fā)酵液過濾,分別收集濾液及菌絲體;菌絲體采用超聲波輔助提取 3 5次,控制體系pH值,收集提取液,與濾液合并,得合并液;2)將步驟1)中得到的合并液,經(jīng)微濾膜過濾后,微濾透過液進(jìn)入超濾膜過濾,得濾液,轉(zhuǎn)移到裝有大孔樹脂的床層進(jìn)行吸附;并用4 5倍大孔樹脂柱床體積的有機(jī)溶劑進(jìn)行沖洗,1 3倍的大孔樹脂柱床體積的有機(jī)溶劑進(jìn)行解吸,控制柱床溫度,收集解吸液;3)將步驟2)收集的解吸液真空濃縮,旋干,得油狀物;4)將步驟幻中得到的油狀物用有機(jī)溶劑溶解,油狀物質(zhì)量與有機(jī)溶劑體積比 1 20 1 30g/ml,上樣層析硅膠柱,上樣液進(jìn)入層析硅膠后用4 6倍硅膠體積的洗脫劑洗脫,收集含子囊霉素的活性組分;5)將步驟4)收集的含子囊霉素的活性組分經(jīng)真空濃縮旋干,并用其質(zhì)量體積比為1 10 1 20g/ml的有機(jī)溶劑溶解,將溫度降低到0 10°C,保溫使子囊霉素結(jié)晶析出;冷凍離心,得到子囊霉素一次結(jié)晶;6)將步驟幻得到的子囊霉素晶體用有機(jī)溶劑攪拌溶解后,加入該溶解液5 10 倍體積的結(jié)晶溶劑靜置,結(jié)晶得到子囊霉素。優(yōu)選步驟1)中超聲波輔助提取中所用有機(jī)溶劑為甲醇、乙酸乙酯或乙醇;菌絲體與有機(jī)溶劑質(zhì)量體積比為1 10 1 15g/ml ;超聲頻率為25 50KHz ;功率為100 200W ;超聲提取時(shí)間為10 45分鐘;控制體系PH值為6 9。優(yōu)選所述的步驟幻中沖洗時(shí),有機(jī)溶劑為體積濃度50% 60%乙醇水溶液或 50% 60%甲醇水溶液;解吸時(shí),有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、丙酮或甲醇;控制柱床溫度為20 35 "C。優(yōu)選步驟4)中有機(jī)溶劑與洗脫劑均為體積比10 1 15 1的乙酸乙酯和甲
醇混合溶液。優(yōu)選步驟5)中有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、丙酮或甲醇;降溫速率為10 20°C/h;結(jié)晶時(shí)間為10 20小時(shí)。優(yōu)選步驟6)中攪拌溶解的有機(jī)溶劑為丙酮、甲醇或乙酸乙酯;晶體與有機(jī)溶劑質(zhì)量體積比為1 25 1 45g/ml;攪拌溫度為25 35°C ;結(jié)晶溶劑為環(huán)己烷或正己烷; 結(jié)晶溶劑的加入時(shí)間為5 20分鐘;結(jié)晶溫度為15 25°C ;結(jié)晶時(shí)間為3 10小時(shí)。優(yōu)選步驟3)和步驟5)中真空濃縮的溫度為30 40°C。本發(fā)明所述鏈霉菌發(fā)酵液中的鏈霉菌,其分類命名為鏈霉菌,菌種的拉丁學(xué)名是 Streptomyces sp.,參據(jù)的微生物:NJYH2618,保藏日期是2008年5月26日,保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)是CGMCC NO. 2519。上述鏈霉菌Sti^ptomyces sp.,參據(jù)的微生物(株)NJYffi618是由本實(shí)驗(yàn)室從南京中山陵地區(qū)的土壤中,初篩得到31株能抑制假絲酵母生長(zhǎng)的放線菌;經(jīng)搖瓶復(fù)篩,用 HPLC(高效液相色譜)檢測(cè)獲得一株子囊霉素產(chǎn)生菌,通過生理生化特性實(shí)驗(yàn)和16S rDNA 序列相似性分析,分類鑒定命名為鏈霉菌,并保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心,其簡(jiǎn)稱為CGMCC,登記入冊(cè)的編號(hào)是CGMCC No. 2519,保藏日期是2008年5月洸日。以此菌種作為生產(chǎn)菌株。CGMCC No. 2519菌株具有下述性質(zhì)1、形態(tài)特征菌株在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)中度,氣生菌絲生長(zhǎng)中度,孢子絲呈波曲狀,孢子成鏈狀排列,在電子顯微鏡下孢子成橢圓形。2、培養(yǎng)特征培養(yǎng)7-14天,觀察菌株在下列各種培養(yǎng)基上的特征。表ICGMCC No. 2519菌株的培養(yǎng)特征
培養(yǎng)基氣生菌絲基內(nèi)菌絲可溶性色素高氏合成一號(hào)灰藍(lán)色褐白色無(wú)克氏合成一號(hào)灰白色白色無(wú)察氏瓊脂培養(yǎng)基灰白色褐白色無(wú)馬鈴薯浸汁瓊脂灰藍(lán)色褐黃色無(wú)肉湯培養(yǎng)基灰白色褐黃色無(wú)燕麥瓊脂培養(yǎng)基灰藍(lán)色褐黃色無(wú)3、生理生化性質(zhì)表2CGMCC No. 2519菌株的生理生化性質(zhì)
碳源利用情況 (7d)利用情況 (14d)碳源利用情況 (7d)利用情況 (14d)可溶性淀粉L-鼠李糖D-甘露糖■f木糖-麥芽糖乳糖-D-果糖L-山梨糖--葡萄糖+ 為可利用;-為不可利用4、16S rDNA 序列分析
用溶菌酶法從新鮮菌體提取基因組DNA,采用鏈霉菌通用引物進(jìn)行16SrDNA擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)、純化后交由TAKARA公司進(jìn)行測(cè)序。所測(cè)的16SrDNA序列經(jīng)校對(duì)、 拼接后與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)種屬的序列進(jìn)行BLAST比較得知,菌種Str印tomyces sp. NJYH2618(CGMCC No. 2519)屬于鏈霉菌測(cè)得16S rDNA大部分序列143;3bp,具體如下5:CATGCAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCA ATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACTTCCACTCTCCTGGGTGGAGG TTAAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGA CGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTG GGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTC TTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA TACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAG ACCGGGGCTTAACCCCGGTTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTA GCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGC GAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACA TTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAG GAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTTGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTG ACATACACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCG TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGAT GGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCT TGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCAGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCTGT CTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGG TGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAAC CCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAA-3、有益效果采用本發(fā)明提純子囊霉素,通過對(duì)子囊霉素發(fā)酵液采用發(fā)酵液過濾、超聲輔助提取、微濾、超濾、大孔樹脂吸附、硅膠柱層析、結(jié)晶得到子囊霉素純品且晶形較為理想,純度 >98.5%,收率81% 91%。本發(fā)明較已報(bào)道方法大幅度縮短提取時(shí)間,提高了效率,且較少使用水相溶劑,減少了子囊霉素結(jié)構(gòu)類似物,具有操作方便、工藝簡(jiǎn)單和成本低等特點(diǎn), 易于工業(yè)化生產(chǎn),為子囊霉素的生產(chǎn)提供了可行的提取工藝。保藏信息上述鏈霉菌Sti^ptomyces sp.,參據(jù)的微生物(株):NJYffi618是由本實(shí)驗(yàn)室選育并保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京朝陽(yáng)區(qū)大屯路甲3號(hào), 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所),其簡(jiǎn)稱為CGMCC,登記入冊(cè)的編號(hào)是CGMCC No. 2519,保藏日期是2008年5月洸日
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明,但實(shí)施案例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。
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實(shí)施例11)將鏈霉菌CGMCC No. 2519發(fā)酵液過濾,分別收集濾液及菌絲體。菌絲體采用超聲波輔助提取3次,超聲波輔助提取中所用有機(jī)溶劑為甲醇,菌絲體與甲醇質(zhì)量體積比(g/ ml)為1 15,超聲頻率為45KHz,功率為120W,超聲提取時(shí)間為30分鐘,體系pH6. 5,收集提取液,與濾液合并,得合并液;2)將步驟1)中得到的合并液,經(jīng)微濾膜過濾后,微濾透過液進(jìn)入超濾膜過濾,得濾液,轉(zhuǎn)移到裝有SP207大孔樹脂的床層進(jìn)行吸附;并用4倍大孔樹脂柱床體積的60%乙醇進(jìn)行沖洗,1倍大孔樹脂柱床體積的乙酸乙酯進(jìn)行解吸,柱床溫度25°C,收集解吸液;3)將步驟2、收集的解吸液在30°C下真空濃縮,旋干,得油狀物;4)將步驟3)中得到的油狀物用與其質(zhì)量體積比(g/ml)為1 20的乙酸乙酯-甲醇(乙酸乙酯甲醇=15 1,V/V)混合溶液溶解,上樣層析硅膠柱,上樣液進(jìn)入層析硅膠后用4倍硅膠體積的乙酸乙酯-甲醇(乙酸乙酯甲醇=10 1,V/V)洗脫,收集含子囊霉素的活性組分;5)將步驟4)收集的含子囊霉素的活性組分經(jīng)30°C真空濃縮旋干,并用其質(zhì)量體積比(g/ml)為1 10的丙酮溶解,以20°C /h將溫度降低到5°C,保溫IOh使子囊霉素結(jié)晶析出;冷凍離心,得到子囊霉素一次結(jié)晶;6)將步驟5)得到的子囊霉素晶體在25°C下用與其質(zhì)量體積比(g/ml)為1 30 的丙酮攪拌至溶解,在10分鐘內(nèi)加入該溶解液6倍體積的環(huán)己烷,在15°C下靜置4h,得到子囊霉素,純度99. 5 %,收率86 %。實(shí)施例21)將鏈霉菌CGMCC No. 2519發(fā)酵液過濾,分別收集濾液及菌絲體。菌絲體采用超聲波輔助提取4次,超聲波輔助提取中所用有機(jī)溶劑為乙酸乙酯,菌絲體與乙酸乙酯質(zhì)量體積比(g/ml)為1 10,超聲頻率為35KHz,功率為180W,超聲提取時(shí)間為15分鐘,體系 PH7,收集提取液,與濾液合并,得合并液;2)將步驟1)中得到的合并液,經(jīng)微濾膜過濾后,微濾透過液進(jìn)入超濾膜過濾,得濾液,轉(zhuǎn)移到裝有SP825大孔樹脂的床層進(jìn)行吸附;并用4倍大孔樹脂柱床體積的55%甲醇進(jìn)行沖洗,2倍大孔樹脂柱床體積的丙酮進(jìn)行解吸,柱床溫度25°C,收集解吸液;3)將步驟2、收集的解吸液在30°C下真空濃縮,旋干,得油狀物;4)將步驟3)中得到的油狀物用與其質(zhì)量體積比(g/ml)為1 25的乙酸乙酯-甲醇(乙酸乙酯甲醇=10 1,V/V)混合溶液溶解,上樣層析硅膠柱,上樣液進(jìn)入層析硅膠后用5倍硅膠體積的乙酸乙酯-甲醇(乙酸乙酯甲醇=15 1,V/V)洗脫,收集含子囊霉素的活性組分;5)將步驟4)收集的含子囊霉素的活性組分經(jīng)30°C真空濃縮旋干,并用其質(zhì)量體積比(g/ml)為1 20的乙酸乙酯溶解,以15°C/h將溫度降低到0°C,保溫15h使子囊霉素結(jié)晶析出;冷凍離心,得到子囊霉素一次結(jié)晶;6)將步驟5)得到的子囊霉素晶體在30°C下用與其質(zhì)量體積比(g/ml)為1 35 的甲醇攪拌至溶解,在15分鐘內(nèi)加入該溶解液10倍體積環(huán)己烷,在20°C下靜置他,得到子囊霉素,純度98. 7 %,收率90 %。實(shí)施例3
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1)將鏈霉菌CGMCC No. 2519發(fā)酵液過濾,分別收集濾液及菌絲體。菌絲體采用超聲波輔助提取5次,超聲波輔助提取中所用有機(jī)溶劑為乙醇,菌絲體與乙醇質(zhì)量體積比(g/ ml)為1 12,超聲頻率為30KHz,功率為150W,超聲提取時(shí)間為45分鐘,體系pH7. 5,收集提取液,與濾液合并,得合并液;2)將步驟1)中得到合并液,經(jīng)微濾膜過濾后,微濾透過液進(jìn)入超濾膜過濾,得濾液,轉(zhuǎn)移到裝有DlOl大孔樹脂的床層進(jìn)行吸附;并用5倍大孔樹脂柱床體積的50%乙醇進(jìn)行沖洗,3倍大孔樹脂柱床體積的甲醇進(jìn)行解吸,柱床溫度30°C,收集解吸液;3)將步驟2、收集的解吸液在35°C下真空濃縮,旋干,得油狀物;4)將步驟3)中得到的油狀物用與其質(zhì)量體積比(g/ml)為1 30的乙酸乙酯-甲醇(乙酸乙酯甲醇=10 1,V/V)混合溶液溶解,上樣層析硅膠柱,上樣液進(jìn)入層析硅膠后用6倍硅膠體積的乙酸乙酯-甲醇(乙酸乙酯甲醇=10 1,V/V)洗脫,收集含子囊霉素的活性組分;5)將步驟4)收集的含子囊霉素的活性組分經(jīng)35°C真空濃縮,并用其質(zhì)量體積比 (g/ml)為1 15的甲醇溶解,以10°C /h將溫度降低到10°C,保溫20h使子囊霉素結(jié)晶析出;冷凍離心,得到子囊霉素一次結(jié)晶;6)將步驟5)得到的子囊霉素晶體在35°C下用與其質(zhì)量體積比(g/ml)為1 40 的乙酸乙酯攪拌至溶解,在5分鐘內(nèi)加入該溶解液8倍體積正己烷,在25°C下靜置10h,得到子囊霉素,純度99. 2 %,收率83 %。
權(quán)利要求
1.一種從鏈霉菌發(fā)酵液中提純子囊霉素的方法,其特征在于采用發(fā)酵液過濾、菌絲體超聲破碎提取、大孔樹脂吸附、硅膠柱層析和結(jié)晶技術(shù)得到子囊霉素純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其具體步驟如下1)將鏈霉菌發(fā)酵液過濾,分別收集濾液及菌絲體;菌絲體采用超聲波輔助提取3 5 次,控制體系PH值,收集提取液,與濾液合并,得合并液;2)將步驟1)中得到的合并液,經(jīng)微濾膜過濾后,微濾透過液進(jìn)入超濾膜過濾,得濾液, 轉(zhuǎn)移到裝有大孔樹脂的床層進(jìn)行吸附;并用4 5倍大孔樹脂柱床體積的有機(jī)溶劑進(jìn)行沖洗,1 3倍的大孔樹脂柱床體積的有機(jī)溶劑進(jìn)行解吸,控制柱床溫度,收集解吸液;3)將步驟2)收集的解吸液真空濃縮,旋干,得油狀物;4)將步驟幻中得到的油狀物用有機(jī)溶劑溶解,油狀物質(zhì)量與有機(jī)溶劑體積比 1 20 1 30g/ml,上樣層析硅膠柱,上樣液進(jìn)入層析硅膠后用4 6倍硅膠體積的洗脫劑洗脫,收集含子囊霉素的活性組分;5)將步驟4)收集的含子囊霉素的活性組分經(jīng)真空濃縮旋干,并用其質(zhì)量體積比為 1 10 1 20g/ml的有機(jī)溶劑溶解,將溫度降低到0 10°C,保溫使子囊霉素結(jié)晶析出; 冷凍離心,得到子囊霉素一次結(jié)晶;6)將步驟幻得到的子囊霉素晶體用有機(jī)溶劑攪拌溶解后,加入該溶解液5 10倍體積的結(jié)晶溶劑靜置,結(jié)晶得到子囊霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于所述的步驟1)中超聲波輔助提取中所用有機(jī)溶劑為甲醇、乙酸乙酯或乙醇;菌絲體與有機(jī)溶劑質(zhì)量體積比為1 10 1 15g/ml; 超聲頻率為25 50KHz ;功率為100 200W ;超聲提取時(shí)間為10 45分鐘;控制體系PH 值為6 9。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于所述的步驟幻中沖洗時(shí),有機(jī)溶劑為體積濃度50% 60%乙醇水溶液或50% 60%甲醇水溶液;解吸時(shí),有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、丙酮或甲醇;控制柱床溫度為20 35°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于步驟4)中有機(jī)溶劑與洗脫劑均為體積比 10 1 15 1的乙酸乙酯和甲醇混合溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于步驟5)中有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、丙酮或甲醇;降溫速率為10 20°C /h ;結(jié)晶時(shí)間為10 20小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于步驟6)中攪拌溶解的有機(jī)溶劑為丙酮、 甲醇或乙酸乙酯;晶體與有機(jī)溶劑質(zhì)量體積比為1 25 1 45g/ml ;攪拌溫度為25 350C ;結(jié)晶溶劑為環(huán)己烷或正己烷;結(jié)晶溶劑的加入時(shí)間為5 20分鐘;結(jié)晶溫度為15 250C ;結(jié)晶時(shí)間為3 10小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于步驟幻和步驟幻中真空濃縮的溫度為 30 40"C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于所述鏈霉菌發(fā)酵液中的鏈霉菌,其分類命名為鏈霉菌,菌種的拉丁學(xué)名是MMptomyces sp.,參據(jù)的微生物NJYH2618,保藏日期是 2008年5月洸日,保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)是CGMCCN0. 2519。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從鏈霉菌發(fā)酵液中提純子囊霉素的方法,屬于生物工程領(lǐng)域。采用發(fā)酵液過濾、菌絲體超聲破碎、大孔樹脂吸附、硅膠柱層析及結(jié)晶技術(shù)得到子囊霉素純品。本發(fā)明采用超聲破碎大幅度提高提取效率,操作方便、工藝簡(jiǎn)單、成本低、效率高,適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07D498/18GK102408435SQ20111020024
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月18日
發(fā)明者楊文革, 王瑤函, 胡永紅 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)
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