專利名稱：芝麻蛋白源金屬螯合肽與肽微量元素螯合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及芝麻蛋白源金屬螯合肽與肽微量元素螯合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微量元素，是維持生命活動(dòng)和生長發(fā)育的重要營養(yǎng)物質(zhì)。微量元素的營養(yǎng)作用經(jīng)歷了四個(gè)發(fā)展階段，第一代產(chǎn)品即無機(jī)鹽類添加劑，如硫酸銅、硫酸鋅等；第二代產(chǎn)品即一些簡單的有機(jī)酸鹽，如葡萄糖酸鋅、富馬酸亞鐵等，這兩類產(chǎn)品穩(wěn)定性差，對(duì)胃腸刺激大，而且受腸內(nèi)容物干擾大，吸收利用差，總的生物利用率低于20 %。第三代產(chǎn)品即氨基酸微量元素螯合鹽具有抗干擾力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、易吸收等優(yōu)點(diǎn)，其生物效價(jià)為無機(jī)鹽類添加劑的2-3 倍。近年來，肽金屬螯合物引起科學(xué)家的廣泛關(guān)注。根據(jù)寡肽(主要是二肽、三肽)吸收理論，在粘膜紋狀緣存在著肽載體，它可利用一種稱為質(zhì)子梯度主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)肽的吸收。與氨基酸的吸收相比，具有吸收快、不易飽和、耗能低，且與氨基酸的吸收無競爭等特點(diǎn)。肽金屬螯合物可通過肽的吸收途徑轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，避免了與氨基酸之間的競爭，提高微量元素的利用率。有關(guān)這方面的研究已經(jīng)成為動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)、食療學(xué)和生理學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。肽本身容易消化吸收，可促進(jìn)動(dòng)物生長，改善飼料報(bào)酬，提高動(dòng)物的免疫力和抗應(yīng)急能力。一些寡肽還具有調(diào)味、抗菌、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、降血壓和抗氧化等多種生理功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種多肽混合物。本發(fā)明所提供的多肽混合物，是通過包括如下步驟的方法制備得到的用蛋白酶對(duì)芝麻蛋白進(jìn)行水解，得到含有氨基酸序列為Asn-Cys-Ser的多肽的水解產(chǎn)物，即得到多肽混合物。所述芝麻蛋白為從芝麻粕中提取得到的蛋白。所述用蛋白酶對(duì)芝麻蛋白進(jìn)行水解的方法包括如下步驟將芝麻蛋白與水混合，得到混合液；向所述混合液中加入蛋白酶，進(jìn)行水解反應(yīng)；所述水解反應(yīng)的溫度，依據(jù)所用蛋白酶的最適溫度，為37°C 60°C或37°C或55°C 或 60°C ；所述水解反應(yīng)的PH值，依據(jù)所用蛋白酶的最適PH值，為6. 2 8. 5或6. 2或8. 0 或 8. 5 ；所述水解反應(yīng)的時(shí)間為2小時(shí) 8小時(shí)或2小時(shí)或5小時(shí)或8小時(shí)；所述混合液中所述芝麻蛋白的質(zhì)量百分比濃度為2% 10%或2%或5%或10%;所述蛋白酶的加入量為20U-100U或20U或60U或100U每克芝麻蛋白；所述蛋白酶為胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或堿性蛋白酶。所述得到水解產(chǎn)物之后，還包括將所述水解產(chǎn)物進(jìn)行離心分離，收集上清液，該上清液即為所述多肽混合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種復(fù)合金屬螯合肽混合物。
本發(fā)明所提供的復(fù)合金屬螯合肽混合物，是通過包括如下步驟的方法制備得到的將所述多肽混合物以金屬螯合樹脂為螯合介質(zhì)進(jìn)行金屬螯合親和層析，用含有濃度為0. 3M、0. 6M和0. 9M NH4Cl的0. OlM磷酸緩沖液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；收集金屬螯合率為20% -25%的洗脫峰，即得到復(fù)合金屬螯合肽混合物。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種多肽。本發(fā)明所提供的多肽，其氨基酸序列為Asn-Cys-kr。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種肽微量元素螯合物。本發(fā)明所提供的肽微量元素螯合物，為由所述多肽混合物、所述復(fù)合金屬螯合肽混合物或所述多肽與微量元素進(jìn)行螯合反應(yīng)得到的螯合物。所述微量元素為!^e、Si或Cu。所述螯合反應(yīng)中所述多肽與所述微量元素的摩爾比為1 1-4 1或1 1或 3 1 或4 1 ；所述螯合反應(yīng)的溫度為20°C -80°C或50°C _80°C或20°C或50°C或80°C ；所述螯合反應(yīng)的pH值為6-8或6或7或8 ；所述螯合反應(yīng)的的時(shí)間為1小時(shí)-4小時(shí)或1小時(shí)或3小時(shí)或4小時(shí)。所述多肽混合物、所述復(fù)合金屬螯合肽混合物或所述多肽在制備肽微量元素螯合物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述多肽混合物、所述復(fù)合金屬螯合肽混合物、所述多肽或所述肽微量元素螯合物在制備促進(jìn)人或動(dòng)物對(duì)微量元素吸收的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明又一個(gè)目的是提供一種促進(jìn)人或動(dòng)物對(duì)微量元素吸收的產(chǎn)品。本發(fā)明所提供的促進(jìn)人或動(dòng)物對(duì)微量元素吸收的產(chǎn)品，其活性成分為所述肽微量元素螯合物。本發(fā)明所制備的芝麻蛋白源金屬螯合肽與肽微量元素螯合物，原料成本低，芝麻粕一般用于制作飼料的原料，而成品具有高附加值；本發(fā)明提供的金屬螯合肽是2 3個(gè)氨基酸的金屬螯合肽，分子量小，更易被消化道直接吸收；且生產(chǎn)技術(shù)對(duì)設(shè)備要求不高，具有投資少，易開發(fā)利用。本發(fā)明所制備的金屬螯合肽的金屬螯合作用強(qiáng)，不僅可以替代無機(jī)鹽類和簡單的有機(jī)酸鹽等用作食品的添加劑，而且可以作為活性功能性成分。該產(chǎn)品可以用于食品、保健品甚至動(dòng)物食品和飼料等，應(yīng)用范圍極其廣泛，社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益都很顯著。本發(fā)明所制備的芝麻蛋白源金屬螯合肽，可同時(shí)作營養(yǎng)強(qiáng)化劑和助鮮劑，既增加了常用調(diào)味料醬油的，又提高產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量，此外還可以增加鮮味，可作為綠色、安全、健康的多功能食品配料。芝麻蛋白金屬螯合肽溶液作為新一代飼料用營養(yǎng)補(bǔ)充劑能作為運(yùn)輸鈣、 鐵、鋅等微量元素的載體，提高微量元素的腸吸收效率和生物利用度?；钚噪娜芤罕旧磉€可迅速補(bǔ)充動(dòng)物蛋白營養(yǎng)，促進(jìn)生長以及增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力等。


圖1為芝麻蛋白水解液經(jīng)金屬親和層析柱(鋅柱)分離的洗脫曲線(圖1中B) 及四個(gè)組分(1、2、3和4)的金屬螯合率和抗氧化能力(圖1中A)。圖2為圖1中組分2經(jīng)反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離的譜圖(圖1中A)，及Pl峰純化后的RP-HPLC譜圖(圖1中B)。圖3為pi組分的質(zhì)譜圖(圖1中A)及其中m/z = 353. 4的串聯(lián)質(zhì)譜圖(圖1中 B)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、酶法制備含金屬螯合肽的芝麻蛋白水解物方法I一、超聲波輔助堿溶酸沉法提取芝麻蛋白芝麻粕(購于北京市茂芝源商貿(mào)有限責(zé)任公司)的預(yù)處理將芝麻粕充分粉碎后， 用石油醚浸提2次，去殘油，得到預(yù)處理芝麻粕。稱取經(jīng)預(yù)處理的芝麻粕100g，加入300mL 水，用NaOH調(diào)pH值至11，超聲波提取Ih，然后于4000rpm離心20分鐘，收集上清液，反復(fù)提取2次。合并上清液，用HCl調(diào)pH至4. 0，于SOOOrpm離心15分鐘，收集沉淀，冷凍干燥， 得到芝麻蛋白。二、用酶法制備含金屬螯合肽的芝麻蛋白水解物將芝麻蛋白與純凈水混合，得到混合液，使得芝麻蛋白在混合液中的重量百分比濃度為2%，用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)混合液的pH值至6. 2，然后向混合液中加入木瓜蛋白酶 (papain)(蛋白酶(0. 5_2u/mg)(購自sigma，產(chǎn)品目錄號(hào)為p3250)，木瓜蛋白酶的加入量為 20U/g芝麻蛋白，于37°C進(jìn)行水解反應(yīng)8. 0小時(shí)；水解結(jié)束時(shí)，將水解產(chǎn)物在90°C加熱5分鐘，然后煮沸后再保持3分鐘，停止酶解反應(yīng)。將得到水解產(chǎn)物室溫下進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為SOOOg的條件下離心15分鐘，除去脂肪和大分子蛋白和雜質(zhì)，收集上清液，該上清液即為含金屬螯合肽的芝麻蛋白水解物；然后凍干，得到凍干粉。將上述得到的凍干粉配制成質(zhì)量百分比濃度為0. 2%的水溶液，即樣品溶液；測定其金屬螯合能力。金屬螯合能力測定方法取5. OmL樣品溶液，加入2mM FeSO4 · 7H20溶液0. ImL和 5mM ferrozine溶液0. 2mL。充分反應(yīng)10分鐘，在562nm下測吸光值?？瞻滓匀ルx子水代替樣品。吸光值越低，表示金屬螯合能力越強(qiáng)。同時(shí)，以l.OmM EDTA溶液為陽性對(duì)照，測定陽性對(duì)照的金屬螯合率。金屬螯合率(％) = 1_(樣品的吸光值/空白的吸光值)X 100%。結(jié)果含金屬螯合肽的芝麻蛋白水解物的金屬螯合率為70. 5% ；陽性對(duì)照的金屬螯合率91%。方法II一、超聲波輔助堿溶酸沉法提取芝麻蛋白與方法I相同。二、用酶法制備含金屬螯合肽的芝麻蛋白水解物將芝麻蛋白與純凈水混合，得到混合液，使得芝麻蛋白在混合液中的重量百分比濃度為5%，用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)混合液的pH值至8.0，然后向混合液中加入胰蛋白酶 (tyrpsin)(蛋白酶(250u/mg)(購自Sigma，產(chǎn)品目錄號(hào)為0458)，胰蛋白酶的加入量為60U每克所述芝麻蛋白，于進(jìn)行水解反應(yīng)5小時(shí)；水解結(jié)束時(shí)，將水解產(chǎn)物在90°C加熱5分鐘，然后煮沸后再保持3分鐘，停止酶解反應(yīng)。將得到水解產(chǎn)物常溫下進(jìn)行離心分離、轉(zhuǎn)速為8000*g的條件下離心15分鐘，除去脂肪和大分子蛋白和雜質(zhì)，收集上清液，該上清液即為含金屬螯合肽的芝麻蛋白水解物；然后凍干，得到凍干粉。將上述得到的凍干粉配制成質(zhì)量百分比濃度為0. 2%的水溶液，測定其金屬螯合能力。含金屬螯合肽的芝麻蛋白水解物的金屬螯合能力的測定方法與方法I相同。結(jié)果含金屬螯合肽的芝麻蛋白水解物的金屬螯合率為88. 1% ；陽性對(duì)照的金屬螯合率91%。方法III—、超聲波輔助堿溶酸沉法提取芝麻蛋白與方法I相同。二、用酶法制備含金屬螯合肽的芝麻蛋白水解物將芝麻蛋白與純凈水混合，得到混合液，使得芝麻蛋白在混合液中的重量百分比濃度為10%，用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)混合液的pH值至8. 5，然后向混合液中加入堿性蛋白酶 (Alcalase)(蛋白酶(2. 4Au/ml)(購自Sigma，產(chǎn)品目錄號(hào)為P4860)，堿性蛋白酶的加入量為20U每克所述芝麻蛋白，于60°C進(jìn)行水解反應(yīng)2小時(shí)；水解結(jié)束時(shí)，將水解產(chǎn)物在90°C 加熱5分鐘，然后煮沸后再保持3分鐘，停止酶解反應(yīng)。將得到水解產(chǎn)物室溫下進(jìn)行離心分離，轉(zhuǎn)速為8000*g的條件下離心15分鐘，除去脂肪和大分子蛋白和雜質(zhì)，收集上清液，該上清液即為含金屬螯合肽的芝麻蛋白水解物；然后凍干，得到凍干粉。將上述得到的凍干粉配制成質(zhì)量百分比濃度為0. 2%的水溶液，測定其金屬螯合能力。金屬螯合肽混合物的金屬螯合能力的測定方法與方法I相同。結(jié)果含金屬螯合肽的芝麻蛋白水解物的金屬螯合率為75. 1% ；陽性對(duì)照的金屬螯合率91%。實(shí)施例2、制備復(fù)合金屬絡(luò)合肽一、分離純化金屬螯合肽將實(shí)施例1中方法I得到的凍干粉用少量去離子水溶解，用金屬螯合親和層析柱 (鋅柱)進(jìn)行分離，首先用水洗脫鋅柱，分離出來的是金屬螯合能力較差的肽；然后用含有濃度為0. 3M、0. 6M和0. 9M NH4Cl的0. OlM磷酸緩沖液(pH = 6)作為流動(dòng)相梯度洗脫，流速為Iml/分鐘，溫度為室溫，混合物中的肽按金屬螯合能力由弱到強(qiáng)依次洗脫下來，這樣將肽的混合物分成四個(gè)組分，在254nm下檢測肽的濃度，并檢測各洗脫液對(duì)應(yīng)的金屬螯合能力(金屬螯合能力的測定方法與實(shí)施例1中相同)，如圖1所示，其中圖1中B為芝麻蛋白水解液經(jīng)金屬親和層析柱(鋅柱)分離的洗脫曲線；圖1中A為四個(gè)組分(組分1、組分2、 組分3和組分4)的金屬螯合率和抗氧化能力(柱圖中未顯示的部分是因?yàn)榛钚灾堤?。 其中四個(gè)組分所用的洗脫液分別為水、含0. 3M、0. 6M和0. 9M NH4Cl的pH = 6的磷酸緩沖液。收集金屬螯合率較高的組分2和組分3 (金屬螯合率為20% -25%的洗脫峰)，即得到復(fù)合金屬絡(luò)合肽；然后用凍干機(jī)凍干成粉狀。
金屬螯合親和層析柱的制備方法如下取2g殼聚糖溶解在IOOmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的CH3COOH溶液中，攪拌至完全溶解。取 250ml三角瓶，加入液體石蠟(IOOml)與span80 (Iml)，充分混勻，在120rpm的攪拌速度下， 緩慢加入2%的殼聚糖溶液，待形成殼聚糖微球后滴入戊二醛至濃度為2%，在40°C恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)2h。加入適量石油醚和2mol/L的NaOH溶液，去除石蠟并沉淀殼聚糖微球， 水洗并用布氏漏斗抽干。將得到的戊二醛交聯(lián)濕狀殼聚糖微粒加入50ml NaBH4與NaOH混合液(8. 76g Na0H+0. 75g NaBH4定容至100ml)，在室溫下反應(yīng)池，涮洗抽濾，將收集的殼聚糖微球定容到100ml，并按1 1體積比加入環(huán)氧氯丙烷溶液，在室溫下反應(yīng)池，水洗并用布氏漏斗抽干。以活化殼聚糖(g)為基準(zhǔn)，按1 2(g mmol/L)的比例加入適量濃度的亞氨基二乙酸(IDA)溶液50ml，在65°C水浴搖床中反應(yīng)Mh，水洗并用布氏漏斗抽干。將制備好的IDA-殼聚糖裝柱，用純凈水流洗3-5個(gè)床體積，加入0. lmol/L的ZnCl2溶液50ml， 在恒溫下反應(yīng)2h，使填料充分吸附鋅離子，得到Si-IDA-殼聚糖IMAC填料，即得到金屬螯合樹脂。再用去離子水流洗3-5個(gè)床體積，除去未結(jié)合的金屬離子，并用3-5個(gè)床體積含有 0. 05mol/L的pH = 6. 0的磷酸緩沖溶液進(jìn)行平衡。所用試劑來源殼聚糖購自山東奧康生物科技有限公司；亞氨基二乙酸(IDA)購于美國sigma公司；乙酸、液體石蠟、span80、戊二醛、NaBH4, NaOH、環(huán)氧氯丙烷、硫酸鋅、 EDTA-2Na、鉻黑T均為分析純，購于北京化學(xué)試劑公司。實(shí)施例3、制備金屬螯合肽純凈物一、制備金屬螯合肽NCS將上述實(shí)施例2制備得到的復(fù)合金屬絡(luò)合肽用反相高效液相色譜HPLC分離純化。 用 HPLC 分離時(shí)，使用 ODS 柱(YMC ODS-AQ S_5 120A, 4. 6 X 250mm, USA)。上樣量為 20 μ L0 洗脫溶劑為Α，含0. 三氟乙酸(TFA)的純水(ν/ν) ；B，添加0. 1 % TFA的80%乙腈溶液。 用A和B的混合液進(jìn)行梯度洗脫，(溶劑B的體積百分?jǐn)?shù)從10%到60% )。流速1. Oml/ 分鐘，洗脫時(shí)間30分鐘。210nm下檢測肽的出峰位置，如圖2所示，其中圖2中A為圖1中組分2經(jīng)反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離的譜圖；收集并測定各吸收峰對(duì)應(yīng)的洗脫液的金屬螯合能力(金屬螯合能力的測定方法與實(shí)施例1中相同)，其中Pl組分的金屬螯合能力較強(qiáng)；將Pl組分收集后凍干，用水溶解，再次用HPLC進(jìn)行分離，圖2中B為A中pi峰純化后的RP-HPLC譜圖。使用液相色譜-質(zhì)譜連用法(HPLC-MS)、串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)法進(jìn)一步鑒定肽的氨基酸序列，如圖3所示。圖3中A為pi組分的質(zhì)譜圖(MS譜圖)；從圖中可以看出，pi中含有多個(gè)分子量在450以下的寡肽；將其中質(zhì)荷比為345的寡肽進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，圖3中B 為其中m/z = 345. 0的串聯(lián)質(zhì)譜圖(MS/MS譜圖)。通過分析譜圖鑒定出金屬螯合肽的氨基酸序列為Asn-Cys-kr，將其命名為金屬螯合肽NCS，分子量為322。查找已發(fā)表的有關(guān)芝麻蛋白的氨基酸序列，Asn-Cys-Ser對(duì)應(yīng)于芝麻蛋白的 sesamum indicum 片段 7 (113-115)，8 (113-115)，9 (113-115)，10(114-116)， 從而進(jìn)一步驗(yàn)證了此金屬螯合肽來源于芝麻蛋白。采用化學(xué)合成法(多肽合成儀)合成金屬螯合肽NCS (純度在90%以上)，其氨基酸序列為Asn-Cysler。二、測定金屬螯合肽NCS對(duì)微量元素Fe和Si的螯合率
1、鋅螯合率的測定取1. OmL 0. 02M ZnCl2 (用乙醇溶解)于25mL圓底燒瓶中，緩慢滴入含有上述制備得到的金屬螯合肽NCS的50%乙醇溶液(質(zhì)量百分比)10mL，得到混合溶液，混合溶液中 NCS的濃度為20g/L。然后加入100 μ L三乙胺，室溫下攪拌反應(yīng)lh，至有白色沉淀生成，即得到反應(yīng)液?？偭夸\含量的測定準(zhǔn)確移取反應(yīng)液5mL于50mL容量瓶中，定容，搖勻，用EDTA絡(luò)合滴定法滴定鋅的總量。螯合肽鋅含量的測定另移取反應(yīng)液5mL于燒瓶中濃縮至近干，加入15mL無水乙醇離心分離，將所得白色沉淀用水溶解定容在50mL容量瓶中，定容，搖勻。用EDTA絡(luò)合滴定法測定螯合態(tài)鋅的含量。結(jié)果NCS的鋅螯合率為73. 7士0. 02%。EDTA絡(luò)合滴定分別取容量瓶中溶液20mL于錐形瓶中，加兩滴二甲酚橙指示劑， 滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的六亞甲基四胺至溶液呈穩(wěn)定的紫紅色，再加入4mL六亞甲基四胺， 用0.02M EDTA滴定至溶液由紫紅色變成黃色時(shí)為終點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。螯合率(％) = C(V1-V0)/C(V2-V0) X100%= (V1-V0)/(V2-V0) X 100%其中=C-EDTA溶液的濃度，M 空白，即用水代替樣品滴定所消耗的EDTA溶液體積，mL ;Vr滴定螯合態(tài)鋅所消耗的EDTA溶液體積，mL ;V2-滴定總鋅所消耗的EDTA溶液體積。2、鐵螯合率的測定在兩只燒瓶中加入質(zhì)量百分比濃度為2%的NCS水溶液10mL，一口抽真空一口通氮?dú)猓猿テ渲械难鯕?，然后依次加入IOmL 0. 02M FeSO4 · 7H20和0. 05g鐵粉，繼續(xù)通氮?dú)猓覝?，攪拌反?yīng)lh，即得到反應(yīng)液。總量鐵含量的測定準(zhǔn)確移取IOmL反應(yīng)液于50mL容量瓶中，定容搖勻。用EDTA 絡(luò)合滴定法測定鐵的總量。螯合態(tài)鐵含量的測定另移取反應(yīng)液IOmL于錐形瓶中，加入30mL丙酮，離心分離， 將所得的沉淀用水溶解定容在50mL容量瓶中，定容，搖勻。用EDTA絡(luò)合滴定法測定其中鐵的含量(即螯合鐵部分)。EDTA絡(luò)合滴定各取總量鐵與螯合態(tài)鐵容量瓶中溶液20mL于錐形瓶中，分別加入 30% H2023mL,用乙酸控制體系的pH為2. 0，分別加熱至50_60°C，放涼，加入2%的磺基水楊酸5-8滴，用0. OlM EDTA滴定至溶液由紫色變成紅色時(shí)為終點(diǎn)(試樣中鐵含量低時(shí)，滴定終點(diǎn)為無色)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。螯合率(％) = C (V1-V0) /C (V2-V0) X100%= (V1-V0) / (V2-V0) X 100 %。其中=C-EDTA溶液的濃度，M ；Vtl-空白，即用水代替樣品滴定所消耗的EDTA溶液體積，mL ;Vr滴定螯合肽鐵所消耗的EDTA溶液體積，mL ;V2-滴定總鐵所消耗的EDTA溶液體積。結(jié)果NCS的鐵螯合率為61. 3 士 0.01%。二、測定金屬螯合肽對(duì)微量元素狗和Si的螯合率1、鋅螯合率的測定測定方法與方法I相同。測定結(jié)果與方法I無顯著差異。
2、鐵螯合率的測定測定方法與方法I相同。測定結(jié)果與方法I無顯著差異。實(shí)施例4、制備肽微量元素螯合物一、制備含有小肽鋅螯合物的混合物將實(shí)施例1制備得到的含有金屬螯合肽的芝麻蛋白水解物與鋅鹽(ZnSO4 ·Η20)水溶液按照摩爾比為3 1的比例混合，調(diào)節(jié)ρΗ至8，在室溫下攪拌，進(jìn)行螯合反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為4h，邊反應(yīng)邊攪拌，反應(yīng)產(chǎn)物即為含有小肽鋅螯合物的混合物。將產(chǎn)物在70°C下真空濃縮后，在80°C下真空干燥，產(chǎn)品可作為動(dòng)物飼料添加劑使用。二、制備復(fù)合小肽鋅鰲合物將上述得到含有小肽鋅螯合物的混合物繼續(xù)純化，即向上述濃縮后的反應(yīng)產(chǎn)物添加3倍體積的95%乙醇水溶液，在室溫下進(jìn)行離心，收集沉淀，即得到復(fù)合小肽鋅鰲合物。三、制備小肽鋅螯合物方法I將含有2%金屬螯合肽NCS的乙醇水溶液(質(zhì)量百分比)與0.02M的鋅鹽溶液 (ZnSO4 · H2O)按照摩爾比為1 1的比例混合，調(diào)節(jié)ρΗ至6，在溫度為20°C下進(jìn)行螯合反應(yīng)，邊反應(yīng)邊攪拌，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)。反應(yīng)后，添加2倍體積無水乙醇，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，并將沉淀離心分離，70°C下真空干燥，即得到小肽鋅鰲合物。方法II將實(shí)施例2中的復(fù)合金屬螯合肽溶液與0. 02M的鋅鹽(ZnSO4 · H2O)溶液按照摩爾比為3 1的比例混合，調(diào)節(jié)ρΗ至7.0，在溫度為50°C進(jìn)行螯合反應(yīng)，反應(yīng)過程中進(jìn)行攪拌，3小時(shí)后，得到反應(yīng)產(chǎn)物；對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行濃縮，然后添加2倍體積的95%乙醇水溶液， 將沉淀離心分離，即得到小肽鋅鰲合物。方法III將實(shí)施例2中的復(fù)合金屬螯合肽溶液與鋅鹽(ZnSO4 ·Η20)溶液按照摩爾比為4 1 的比例混合，得到混合溶液；調(diào)節(jié)PH至8. 0，添加混合溶液體積的的三乙胺，在80°攪拌反應(yīng)4小時(shí)，然后添加2倍體積的95%乙醇，將產(chǎn)生的沉淀進(jìn)行離心分離，65°C下真空干燥，即得到小肽鋅鰲合物。四、制備小肽鐵螯合物方法I將實(shí)施例2中的復(fù)合金屬螯合肽溶液與亞鐵鹽(FeSO4 · 7H20)溶液按照摩爾比為
1 1的比例混合，調(diào)節(jié)PH至6.5，加入鐵粉，在溫度為50°C進(jìn)行螯合反應(yīng)，同時(shí)加以攪拌， 反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)。反應(yīng)后在60°C條件下濃縮，添加2倍體積的95%乙醇水溶液，將沉淀分離，即得到小肽鐵鰲合物。方法II將實(shí)施例2中的復(fù)合金屬螯合肽溶液與亞鐵鹽(FeSO4 · 7H20)溶液按照摩爾比為
2 1的比例混合，調(diào)節(jié)ρΗ至6. 0，加入0. 5g/ml的異抗壞血酸鈉，在溫度為50°C進(jìn)行螯合反應(yīng)，邊反應(yīng)邊攪拌，反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)。反應(yīng)后，添加2倍體積的丙酮，濃縮，將沉淀離心分離，得到小肽鐵鰲合物。方法III將金屬螯合肽NCS (2%的水溶液)與亞鐵鹽溶液(FeSO4 · 7H20，濃度0. 02M)按照摩爾比為1 1的比例混合，調(diào)節(jié)PH至7. 5，加入1. Og/ml的異抗壞血酸鈉，在25°C下進(jìn)行螯合反應(yīng)，不停地?cái)嚢?，反?yīng)時(shí)間為2小時(shí)。反應(yīng)后，添加2倍體積的丙酮，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，并將沉淀離心分離，得到小肽鐵鰲合物。五、制備復(fù)合肽微量元素螯合物將微量元素Fe，Zn, Cu按動(dòng)物(家畜或家禽)的生理需要配合成復(fù)合微量元素溶液，再與實(shí)施例2中的復(fù)合金屬螯合肽按2 1(摩爾比)的比例混合，調(diào)節(jié)最適pH值在6， 室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)，形成混合多元微量元素肽螯合物溶液；加入沸石粉吸附，然后繼續(xù)烘干(控制在50°C -80°C )、粉碎，即得到混合微量元素肽飼料添加劑。實(shí)施例5、肽微量元素螯合物的應(yīng)用一、使用本發(fā)明的肽金屬螯合作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到阿膠口服液中阿膠鐵口服液生產(chǎn)配方如下A 阿膠 0.08mg/mlB小肽鐵0. 5mg/ml (由實(shí)施例4中實(shí)驗(yàn)四的方法I制備得到)C 維生素 C 2. Omg/mlD 紅糖芝麻蛋白源小肽鐵，可作營養(yǎng)強(qiáng)化劑，和阿膠以及紅糖等協(xié)同作用，提高產(chǎn)品的營養(yǎng)功效，作為適合婦女使用的營養(yǎng)品。二、使用本發(fā)明的肽金屬螯合作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到全脂奶粉中強(qiáng)化鋅奶粉生產(chǎn)配方如下A 奶粉B 卵磷脂C 小肽鋅(由實(shí)施例4中實(shí)驗(yàn)三的方法I制備得到)強(qiáng)化鐵生產(chǎn)配方(重量比)如下將上述配方中C替換為小肽鐵。三、使用本發(fā)明的肽微量元素螯合物作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到醬油中強(qiáng)化鋅醬油生產(chǎn)配方(重量比)如下A 生醬油，5%，主料；B 焦糖色素，按生產(chǎn)需要(0.05%左右)；C 味精及[I+G]，兩者按重量比；35 45 1混合，0.6% 0. 7% ；D 小肽鋅，添加量0. 3mg/ml ( 一般每人每天攝入10 15mg就能滿足生理需求)(由實(shí)施例4中實(shí)驗(yàn)三的方法II制備得到)；E 乳酸，0.05%，風(fēng)味劑，增加口感，提高營養(yǎng)；F 甘草，0. 008%，甜味劑，甜度為蔗糖200倍；I 氯化鈉和氯化鉀，按生產(chǎn)需要(2-3% )，咸味劑；K 尼泊金乙酯或丙酯，0.01 0.03%，防腐劑，延長產(chǎn)品保質(zhì)期。強(qiáng)化鐵醬油生產(chǎn)配方(重量比)如下
將上述配方中D替換為小肽鐵，添加量O.^ig/ml (成人鐵適宜攝入量男子15mg/d， 女子為20mg/d)四、使用本發(fā)明的肽微量元素螯合物作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到狗食中狗食配方如下以雞胸肉(49wt% )、大豆粉(27wt% )、精制面粉)組成的混合物為基料，添加占基料重量6wt%的白砂糖，l-2wt%的芝麻蛋白金屬螯合肽(由實(shí)施例2制備得到)，&iS04，添加量10-15mg/kg(干重)，添加0. 5wt%的食鹽以突出風(fēng)味，再加入2wt %的復(fù)合膨松劑(小蘇打40wt %，燒明礬52wt %，輕質(zhì)碳酸鈣3wt %，淀粉5wt % ) 進(jìn)行擠壓膨化。
權(quán)利要求
1.一種多肽混合物，是通過包括如下步驟的方法制備得到的用蛋白酶對(duì)芝麻蛋白進(jìn)行水解，得到含有氨基酸序列為Asn-Cys-Ser的多肽的水解產(chǎn)物，即得到多肽混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽混合物，其特征在于 所述用蛋白酶對(duì)芝麻蛋白進(jìn)行水解的方法包括如下步驟將芝麻蛋白與水混合，得到混合液；向所述混合液中加入蛋白酶，進(jìn)行水解反應(yīng)； 所述水解反應(yīng)的溫度為37°C 60°C或37°C或55°C或60°C ； 所述水解反應(yīng)的PH值為6. 2 8. 5或6. 2或8. 0或8. 5 ； 所述水解反應(yīng)的時(shí)間為2小時(shí) 8小時(shí)或2小時(shí)或5小時(shí)或8小時(shí)； 所述混合液中所述芝麻蛋白的質(zhì)量百分比濃度為2% 10%或2%或5%或10% ； 所述蛋白酶的加入量為20U-100U或20U或60U或100U每克芝麻蛋白； 所述蛋白酶為胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或堿性蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多肽混合物，其特征在于所述得到水解產(chǎn)物之后，還包括將所述水解產(chǎn)物進(jìn)行離心分離，收集上清液，該上清液即為所述多肽混合物。
4.一種復(fù)合金屬螯合肽混合物，是通過包括如下步驟的方法制備得到的將權(quán)利要求1所述的多肽混合物以金屬螯合樹脂為螯合介質(zhì)進(jìn)行金屬螯合親和層析， 用含有濃度為0. 3M、0. 6M和0. 9M NH4Cl的0. OlM磷酸緩沖液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；收集金屬螯合率為20% -25%的洗脫峰，即得到復(fù)合金屬螯合肽混合物。
5.一種多肽，其氨基酸序列為Asn-Cys-kr。
6.一種肽微量元素螯合物，為由權(quán)利要求1-3中任一所述的多肽混合物、權(quán)利要求4所述的復(fù)合金屬螯合肽混合物或權(quán)利要求5所述的多肽與微量元素進(jìn)行螯合反應(yīng)得到的螯合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的肽微量元素螯合物，其特征在于所述螯合反應(yīng)中所述多肽與所述微量元素的摩爾比為1 1-4 1或1 1或3 1 或4 1 ；所述螯合反應(yīng)的溫度為20°C -80°C或50°C -80°C或20°C或50°C或80°C ； 所述螯合反應(yīng)的pH值為6-8或6或7或8 ；所述螯合反應(yīng)的的時(shí)間為1小時(shí)-4小時(shí)或1小時(shí)或3小時(shí)或4小時(shí)。
8.權(quán)利要求1-3中任一所述的多肽混合物、權(quán)利要求4所述的復(fù)合金屬螯合肽混合物或權(quán)利要求5所述的多肽在制備肽微量元素螯合物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1-3中任一所述的多肽混合物、權(quán)利要求4所述的復(fù)合金屬螯合肽混合物、 權(quán)利要求5所述的多肽或權(quán)利要求6或7所述的肽微量元素螯合物在制備促進(jìn)人或動(dòng)物對(duì)微量元素的吸收產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10.一種促進(jìn)人或動(dòng)物對(duì)微量元素吸收的產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求6或7所述的肽微量元素螯合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了芝麻蛋白源金屬螯合肽與肽微量元素螯合物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種多肽混合物。本發(fā)明所提供的多肽混合物是通過包括如下步驟的方法制備得到的用蛋白酶對(duì)芝麻蛋白進(jìn)行水解，得到含有氨基酸序列為Asn-Cys-Ser的多肽的水解產(chǎn)物，即得到多肽混合物。本發(fā)明所制備的芝麻蛋白源金屬螯合肽與肽微量元素螯合物，原料成本低，芝麻粕一般用于制作飼料的原料，而成品具有高附加值；本發(fā)明提供的金屬螯合肽是2～3個(gè)氨基酸的金屬螯合肽，分子量小，更易被消化道直接吸收；且生產(chǎn)技術(shù)對(duì)設(shè)備要求不高，具有投資少，易開發(fā)利用。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102286105SQ20111015945
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月14日
發(fā)明者李博, 汪嬋 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)