專利名稱：蛋白質(zhì)中賴氨酸丁烯?；蔫b定方法及其親和試劑研制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真核細(xì)胞中一種新型蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定方法及其相關(guān)親和檢測(cè)試劑的研制。具體而言，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)賴氨酸丁烯?；蔫b定方法及其蛋白親和檢測(cè)試劑的研制。蛋白質(zhì)賴氨酸丁烯?；且环N蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式(簡(jiǎn)稱PTM)。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)控著各種細(xì)胞學(xué)過程并與多種疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，是后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的主要對(duì)象之一。迄今為止，超過300多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式被鑒定出來，這些修飾方式為了解蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的多樣化及其功能提供了更多的線索。 賴氨酸是已知的被核糖體編碼的15個(gè)能發(fā)生共價(jià)修飾的氨基酸之一，其側(cè)鏈所發(fā)生的多種共價(jià)修飾極大地拓展了蛋白分子網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。賴氨酸側(cè)鏈的富電性及親核性使之易與多種親電子的底物發(fā)生共價(jià)蛋白質(zhì)翻譯后修飾反應(yīng)，包括甲基化、乙?；?、生物素?；?、泛素化及類泛素化等，它們?cè)诩?xì)胞的生理及病理過程中發(fā)揮著極其重要的功能。以組蛋白為例，已知組蛋白能夠發(fā)生多種翻譯后修飾，包括甲基化、乙?；?、泛素化、類泛素化及核糖基化等。組蛋白上發(fā)生的多種翻譯后修飾稱為“組蛋白標(biāo)記”，它們通過調(diào)控基因表達(dá)及染色質(zhì)的可塑性決定著組蛋白的功能。通過生物化學(xué)手段(Jemwein， et al. 2001)與質(zhì)譜分析(Garcia, et al. 2007 ；Boyne, et al. 2006 ；Medzihradszky, et al. 2004)，組蛋白的翻譯后修飾目前得到了廣泛的研究。賴氨酸乙?；且环N高豐度、可逆的、受到高度調(diào)控的翻譯后修飾方式。盡管該修飾最初在組蛋白中被鑒定出來，隨后的研究表明賴氨酸乙酰化廣泛地存在于非組蛋白的蛋白底物上，如P53蛋白。蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明細(xì)胞內(nèi)及多種細(xì)胞器中存在著豐富的賴氨酸乙酰化底物并發(fā)揮著多樣化的功能，如細(xì)胞凋亡、代謝、基因轉(zhuǎn)錄和脅迫應(yīng)答等。有意義的是，該修飾在線粒體蛋白及代謝通路的調(diào)控酶中廣泛存在，表明賴氨酸乙?；?xì)地調(diào)控著線粒體的功能和能量代謝過程。除了調(diào)控上述基本的生物學(xué)過程外，賴氨酸乙酰化及其調(diào)控酶(乙?；概c去乙?；?也與衰老、腫瘤發(fā)生、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等重大疾病有著密切的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的專屬目的之一在于提供一種親和試劑用于檢測(cè)在賴氨酸殘基上形成的翻譯后修飾方式。該目的可以通過開發(fā)出的一種蛋白親和試劑，如抗體，特異性識(shí)別含有丁烯酰化賴氨酸的蛋白或多肽、而不充分識(shí)別不含有丁烯?；嚢彼岬牡鞍谆蚨嚯牡目贵w而實(shí)現(xiàn)。蛋白質(zhì)類親和試劑是指能夠充分、并特異性識(shí)別及結(jié)合含有丁烯?；嚢彼岬哪愁惖鞍谆蚨嚯牡娜魏蔚鞍谆蚨嚯?，該類親和試劑的的一個(gè)例子是抗體。此外，用于檢測(cè)賴氨酸丁烯酰化修飾的某種親和試劑能夠從蛋白庫(kù)中篩選獲得，該蛋白庫(kù)包括但不局限于噬菌體庫(kù)與酵母庫(kù)。本發(fā)明的另一目的在于提供一種方法去鑒定在賴氨酸殘基上形成的翻譯后修飾方式。該目的由包含以下幾個(gè)步驟的鑒定過程而實(shí)現(xiàn)(a)獲得包含有多肽的一種樣品； (b)根據(jù)分子量的不同將樣品中的多肽加以分離；(C)利用特異性識(shí)別含有丁烯?；嚢彼岬亩嚯?、而不充分識(shí)別不含有丁烯?；嚢彼岬亩嚯牡目贵w去親和結(jié)合一個(gè)或更多個(gè)分離的多肽；(d)檢測(cè)抗體與多肽的結(jié)合，由此抗體與多肽的親和結(jié)合表明該多肽中含有丁烯酰化賴氨酸。本發(fā)明具體實(shí)施過程中所采用的樣品可能來自于不同條件下的活體組織或某一器官的臨床體液，例如病理?xiàng)l件下或某種治療處理。與此類似，對(duì)照樣品可來自于健康條件下同一活體組織或器官的臨床體液。在從樣品準(zhǔn)備組蛋白多肽過程中，需要加入相關(guān)的酶的抑制劑以防止不希望的降解發(fā)生。這些酶的抑制劑包括抑蛋白酶肽(TrasylolTM)、苯甲磺酰氟(PMSF)、苯甲脒、丙氟磷(DIFP)、亮肽酶素、胃蛋白酶抑制劑、乙二胺四乙酸、乙二醇雙四乙酸、丁酸鈉、曲古菌素A、辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)、Π^88、煙堿與Sirtinol。為了分離多肽，樣品必須加熱到一定溫度以變性多肽但又不會(huì)顯著地導(dǎo)致多肽的肽鍵斷裂。在用親和試劑去特異性結(jié)合多肽中的丁烯?；嚢彼釙r(shí)，被分離的多肽可以事先被固定化到一種固體基質(zhì)上。該固體基質(zhì)可以包括在一種檢測(cè)試劑盒中。以不局限于本發(fā)明的例子說明，對(duì)親和試劑(如抗體)與蛋白或多肽中一個(gè)或多個(gè)丁烯?；嚢彼峤M成的復(fù)合物可以通過免疫印跡的方法加以檢測(cè)。正如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的、具備常規(guī)專業(yè)背景的人所理解，該檢測(cè)方法包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照或兩者兼?zhèn)?。正如本發(fā)明所具體體現(xiàn)，作為一種能夠特異識(shí)別丁烯?；嚢彼岬挠H和試劑，如丁烯?；嚢彼峥贵w，可以從免疫的兔子所產(chǎn)生的血清中加以分離?？贵w也可以是單克隆抗體或處于單鏈的可變區(qū)的形式?？贵w包括能夠特異性識(shí)別組蛋白Η2Α第36、118、119或 125位丁?；嚢彼岬目贵w；包括能夠特異性識(shí)別組蛋白Η2Β第5、11、12、15、16、20、23或 34位丁?；嚢彼岬目贵w；包括能夠特異性識(shí)別組蛋白Η3第4、9、18、23、27或56位丁?；嚢彼岬目贵w；包括能夠特異性識(shí)別組蛋白Η4第5、8、12或16位丁?；嚢彼岬目贵w； 包括能夠特異性識(shí)別組蛋白Hl第33、63、84、89、96、158或167位丁酰化賴氨酸的抗體。上述所列舉的抗體僅以例證提供，并非僅限于本發(fā)明所指。根據(jù)本發(fā)明所描述的同樣或相似的方法，或采用文獻(xiàn)中已有的方法，識(shí)別其他賴氨酸丁烯?；鞍椎目贵w能夠被該領(lǐng)域具備一般背景而無不當(dāng)實(shí)驗(yàn)的人所制備。本發(fā)明屬性的新穎特性由本公開專利所附屬、并為本專利一部分的權(quán)利聲明中體現(xiàn)出來。為了更好地理解本發(fā)明、發(fā)明運(yùn)用優(yōu)勢(shì)及發(fā)明運(yùn)用的特定目的，相關(guān)針對(duì)發(fā)明圖示、發(fā)明描述的引用文獻(xiàn)將被提供。在這些發(fā)明圖示與發(fā)明描述中，本發(fā)明的具體實(shí)施方案因此而展現(xiàn)并被充分描述。


圖1顯示組蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)的鑒定策略及鑒定結(jié)果。(A)HeLa細(xì)胞中組蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)的鑒定策略。提取的組蛋白分別采取溶液內(nèi)酶解無化學(xué)丙?；磻?yīng)(方法 1)、溶液內(nèi)酶解后經(jīng)化學(xué)丙?；磻?yīng)(方法2)、化學(xué)丙?；磻?yīng)后經(jīng)酶解(方法3)以及經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后進(jìn)行膠內(nèi)酶解。經(jīng)方法1與方法2所獲得的酶解多肽樣品進(jìn)一步進(jìn)行等電聚焦分離以產(chǎn)生12個(gè)多肽組分。(B)根據(jù)(A)所描述方法得到的組蛋白多肽經(jīng)質(zhì)譜分析所獲得的多肽序列覆蓋率。(C)本發(fā)明中所鑒定的組蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)的列表匯總。me 單甲基化；me2 雙甲基化；me3 三甲基化；fo 甲?；?；ac 乙?；?；oh 輕基化；cr 丁烯?；?。(D)本發(fā)明中所鑒定的組蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)的圖示匯總。 蛋白序列中相關(guān)氨基酸殘基的位置編號(hào)見序列下方?；疑c無色標(biāo)注框分別表示組蛋白的氨基端及內(nèi)部球狀核心域。(E)本發(fā)明所鑒定的人HeLa細(xì)胞及小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中組蛋白賴氨酸丁烯?；稽c(diǎn)的示意圖。所有鑒定的賴氨酸丁烯?；稽c(diǎn)由紅色并帶下劃線標(biāo)注。已報(bào)道的賴氨酸乙?；稽c(diǎn)由藍(lán)色標(biāo)注。圖2顯示短鏈賴氨酸?；?A)以賴氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶(KATs)為催化酶、乙酰輔酶A為輔因子的賴氨酸乙?；磻?yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)及反應(yīng)示意圖以及假定中的以丁烯酰化輔酶A為輔因子的賴氨酸丁烯?；磻?yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)及反應(yīng)示意圖。(B) 丁烯?；鶊F(tuán)與乙?；鶊F(tuán)的球-棍模型。處在一個(gè)平面上的丁烯?；鶊F(tuán)的一個(gè)氧原子與四個(gè)碳原子的剛性三維排列示意圖(左)。丁烯?；鶊F(tuán)的兩個(gè)烯族碳原子以黃色表示。與丁烯?；鶊F(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，乙?；乃拿骟wCH3能夠旋轉(zhuǎn)(右)。(C)乙烯乙酰賴氨酸(vinylacetyllysine)、甲基丙火希賴MSI (methacryllysine)與環(huán)丙g酸賴(cyclopropanecarboxyllysine)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。(D) 丁烯酰輔酶A的代謝通路。丁烯酰輔酶A由丁酰輔酶A或戊二酰輔酶A被氧化為乙酰輔酶A經(jīng)多反應(yīng)步驟產(chǎn)生。圖3顯示賴氨酸丁烯?；嚯腜EPAKcrSAPAPK的確認(rèn)與驗(yàn)證(丁烯?；嚢彼嵋?Kcr表示)。(A,B,C)來自提取的體內(nèi)組蛋白Η2Α多肽(A)，對(duì)應(yīng)的人工合成多肽(B)、及上述兩種多肽的混合肽(C)PEPAKSAPAH(的高解析度二級(jí)質(zhì)譜分析圖譜。經(jīng)鑒定該多肽的其第五位賴氨酸有+68. 0230Da的質(zhì)量位移。上述三種類型的多肽產(chǎn)生完全一致的二級(jí)質(zhì)譜電離片斷及相同的前離子質(zhì)量。Inset表明前離子質(zhì)量。(D)體內(nèi)PEPAK+68. 0230SAPAPK 肽段，對(duì)應(yīng)的人工合成賴氨酸丁烯酰化多肽、及上述兩種多肽的混合肽的萃取離子色譜圖 (XICs)。利用反相高效液相色譜柱的nano-HPLC/MS/MS分析，上述多肽表現(xiàn)出同樣的共洗脫特性。圖4顯示組蛋白賴氨酸丁烯酰化的免疫印跡檢測(cè)。(A)利用斑點(diǎn)免疫印跡對(duì)賴氨酸丁烯?；贵w的特異性檢測(cè)。通道對(duì)五種多肽庫(kù)的斑點(diǎn)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)賴氨酸丁烯酰化抗體的特異性，每種多肽庫(kù)的用量如圖所示。每種多肽庫(kù)含有13個(gè)氨基酸殘基 (CXXXXXKXXXXXX)，C表示半胱氨酸，X表示除半胱氨酸之外的其余19個(gè)氨基酸的混合氨基酸，第七位殘基為固定的未修飾的賴氨酸殘基(K)、或丙?；嚢彼釟埢?Kpr)、或丁?；嚢彼釟埢?Kbu)、丁烯?；嚢彼釟埢?Kcr)。(B)利用牛血清白蛋白衍生物的免疫印跡對(duì)賴氨酸丁烯酰化抗體的特異性檢測(cè)。100納克牛血清白蛋白、100納克賴氨酸乙烯乙?；Ｑ灏椎鞍住?00納克賴氨酸基丙烯化牛血清白蛋白與100納克賴氨酸丁烯?；Ｑ灏椎鞍捉?jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)賴氨酸丁烯?；贵w的特異性。(C)免疫印跡及競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)對(duì)賴氨酸丁烯?；贵w特異性的檢測(cè)。Img 提取的人HeLa細(xì)胞組蛋白用賴氨酸丁烯?；贵w進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)賴氨酸丁烯?；盘?hào)。抗體事先與未修飾的賴氨酸多肽庫(kù)、賴氨酸基丙烯化多肽庫(kù)或賴氨酸丁烯酰化多肽庫(kù)競(jìng)爭(zhēng)性孵育。(D)免疫印跡及競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)對(duì)賴氨酸丁烯酰化抗體特異性的檢測(cè)。Img提取的人HeLa細(xì)胞組蛋白用賴氨酸丁烯?；贵w進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)賴氨酸丁烯?；盘?hào)。抗體事先與未修飾的賴氨酸多肽庫(kù)、賴氨酸乙酰化多肽庫(kù)、賴氨酸丁烯?；嚯?、賴氨酸丙酰化多肽庫(kù)或賴氨酸丁烯?；嚯膸?kù)競(jìng)爭(zhēng)性孵育。
圖5顯示體內(nèi)D4-丁烯酸酯同位素標(biāo)記對(duì)賴氨酸丁烯?；鞍椎孜锏拇_認(rèn)(A) 丁烯酸酯處理下組蛋白賴氨酸丁烯?；揎椀膭?dòng)態(tài)性。人胰腺癌細(xì)胞系Dul45分別在終濃度為0mM、50mM、IOOmM的丁烯酸酯下標(biāo)記M小時(shí)，隨后提取組蛋白用賴氨酸丁烯?；贵w進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)賴氨酸丁烯酰化信號(hào)。(B)從D4-丁烯酸酯標(biāo)記樣品中鑒定的 PEPAKD4-crSAPAH(肽段的二級(jí)質(zhì)譜分析圖譜。D4_、D3_與D2- 丁烯?；鶊F(tuán)的混合物被用來鑒定D4- 丁烯?；嚯?。圖6顯示不同細(xì)胞類型中組蛋白賴氨酸丁烯?；臋z測(cè)。提取酵母、線蟲、果蠅S2 細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞以及人HeLa細(xì)胞中的核心組蛋白，隨后用賴氨酸丁烯?；贵w進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)提取樣品中的賴氨酸丁烯?；盘?hào)。圖7顯示賴氨酸丁烯?；贵w對(duì)人HeLa細(xì)胞裂解液中賴氨酸丁烯?；鞍椎臋z測(cè).HeLa細(xì)胞在不含有或含有50mM的丁烯酸酯的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)。細(xì)胞經(jīng)裂解后提取總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。賴氨酸丁烯?；贵w進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)總蛋白中的賴氨酸丁烯酰化信號(hào)。圖8顯示位點(diǎn)特異性抗體對(duì)組蛋白HI23與K56 丁烯?；揎椀拿庖哂≯E檢測(cè)。 提取的人HeLa細(xì)胞的組蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后用與賴氨酸未修飾或丁烯?；揎椀男蛄刑禺愋远嚯母?jìng)爭(zhēng)后的組蛋白H3K23與K56 丁烯酰化抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式材料本發(fā)明中所用到的所有多肽用芴甲氧羰?；?丁烯?；嚢彼?羥基 (Fmoc-Lysine (crotonyl)-0H)為原料合成。所有高純度及分析純化學(xué)品與Flag M2抗體購(gòu)自 Sigma-Aldrich 公司(St. Louis, MO)。HA 抗體購(gòu)自 Roche Diagnostics 公司 (Indianapolis, IN。根據(jù)已知的實(shí)驗(yàn)方法(Shechter et al. ,2007 ；Tateishi et al.， 2009)組蛋白分別從酵母、果蠅S2細(xì)胞(S2)、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、高加索人肺胚胎成纖維細(xì)胞(IMR90)與 HeLa 細(xì)胞中提取。4，4，4，3-D4-丁烯酸(4，4，4，3-D4_crotonic acid)通過 D4_ 乙酸(D4-acetaldehyde ；Cambridge Isotope Laboratories, Andover, ΜΑ) 與丙二酸(malonic acid)為原料合成。多克隆賴氨酸丁烯?；贵w(anti-Kcr)與賴氨酸乙?；贵w(anti-Kac)由實(shí)驗(yàn)室自制，制備方法見下述。HeLa細(xì)胞中組蛋白的提取HeLa細(xì)胞中組蛋白的提取參照已知方法(Zhang et al.，2010)。HeLa細(xì)胞預(yù)先培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，經(jīng)含有5mM的丁酸鈉的磷酸鹽緩沖液兩次洗滌后，細(xì)胞被收集并用TEB裂解液裂解細(xì)胞(磷酸鹽緩沖液含0.5% (v/v)Triton X-100, 2mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)，0.02% (w/v)疊氮化鈉(NaN3))。離心去上清，沉淀經(jīng)再次洗滌、離心后重懸在0.4N的硫酸中，4°C過夜。離心取上清，在上清中添加終體積20% (ν/ ν)的三氯乙酸，-20°C靜置4小時(shí)沉淀組蛋白。組蛋白沉淀經(jīng)離心收集，0.1%的丙酮-鹽酸洗滌一次后，再用預(yù)冷的丙酮洗滌兩次。室溫風(fēng)干后，提取的組蛋白溶于水中。組蛋白的溶液內(nèi)酶解消化及化學(xué)衍生化組蛋白的溶液內(nèi)裂解參照已知方法(Kim et al. ,2006 ；Luo et al.，2008)。組蛋白提取物及胰酶解組蛋白多肽的體外丙酰化反應(yīng)參照已有文獻(xiàn)的報(bào)道(Garcia et al., 2007a)。本發(fā)明中對(duì)提取了組蛋白采用了三種不同的蛋白裂解方式(i)溶液內(nèi)酶解消化， 無體外化學(xué)丙酰化反應(yīng)；( )溶液內(nèi)酶解消化后，采用體外化學(xué)丙?；磻?yīng)；(iii)溶液內(nèi)酶解消化前，采用體外化學(xué)丙?；磻?yīng)。等點(diǎn)聚焦分離酶解消化的組蛋白多肽用Agilent 31000FFGEL 分離儀(Agilent，Santa Clara, CA)按多肽等電點(diǎn)不同加以分離，分離方法參照儀器使用說明。每次等電聚焦分離實(shí)驗(yàn)將產(chǎn)生12個(gè)多肽組分。牛血清白蛋白的衍生物的合成5毫克的but-3-enonylic acid，或丁烯酸，或馬丁烯酸與5毫克牛血清白蛋白在 4毫升的磷酸鹽緩沖液中混合，隨后加入25毫克的l-ethyl-3-(3-dimethylamin0pr0pyl) Carbodiimide(EDC)。該混合物在室溫下攪動(dòng)反應(yīng)4小時(shí)以生成乙烯乙?；Ｑ灏椎鞍?、 或丁烯?；Ｑ灏椎鞍?、或基丙烯化牛血清白蛋白。未反應(yīng)的EDC及其他小分子用凝膠過濾法從牛血清白蛋白衍生物中去除。被修飾的牛血清白蛋白通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)加以確認(rèn)。固定化的丁烯?；嚢彼岘傊菢渲闹苽湟罁?jù)產(chǎn)品說明書描述，丁烯酰化的賴氨酸殘基結(jié)合到AminoLink Plus Coupling樹脂上(Pierce Biotechnology, Rockford，IL)。2毫升的樹脂經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌后重懸于6毫升的磷酸鹽緩沖液中，隨后與預(yù)先溶于2毫升磷酸鹽緩沖液的2毫克丁烯酰賴氨酸混合并加入NaCNBH3至終濃度50mM。室溫?cái)嚢璺跤?小時(shí)后，樹脂用4毫升的磷酸鹽緩沖液洗滌一次，隨后用2毫升1. OM Tris -HCl,pH 7. 4室溫封閉30分鐘。樹脂最后經(jīng)10毫升的1. OM NaCl與4毫升的磷酸鹽緩沖液依次洗滌。賴氨酸丁烯?；贵w的制備抗賴氨酸丁烯?；庖咔虻鞍淄ㄟ^以賴氨酸丁烯酰化的牛血清白蛋白為抗原免疫10只兔子而獲得。每只兔子經(jīng)四次免疫注射。每只兔子采集五批次血清。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，具有最高測(cè)定值的血清用于純化抗賴氨酸丁烯?；目贵w。制備的固定化的丁烯酰化賴氨酸瓊脂糖樹脂用于從兔血清中純化抗賴氨酸丁烯?；目贵w。約IOml的兔血清與2ml的丁烯酰化賴氨酸瓊脂糖樹脂過夜孵育。隨后樹脂依次用20ml含0. 5% NP-40的磷酸鹽緩沖液、20ml磷酸鹽緩沖液、6ml含0. 8M NaCl的磷酸鹽緩沖液及6ml磷酸鹽緩沖液洗滌。樹脂上結(jié)合的抗體用0. IM glycine (pH 3.0)洗脫并立刻用1.0M Tris-HCKpH 8. 5)中和。洗脫的抗體在預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液中于4oC過夜透析。斑點(diǎn)印跡與免疫印跡分析用于檢測(cè)所純化抗體的質(zhì)量?？官嚢彼嵋阴；贵w通過以賴氨酸乙?；呐Ｑ灏椎鞍诪榭乖庖咄米佣@得?？贵w純化通過制備的乙酰化的賴氨酸瓊脂糖樹脂按上述方法進(jìn)行。圖7顯示賴氨酸丁烯?；贵w的實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用賴氨酸丁烯酰化抗體的免疫印跡方法檢測(cè)HeLa細(xì)胞中賴氨酸丁烯?；揎?。本實(shí)驗(yàn)中，HeLa細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加或不添加丁烯酸酯(50mM)處理12個(gè)小時(shí)。細(xì)胞收集裂解后提取總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后用賴氨酸丁烯?；贵w進(jìn)行免疫印跡分析。序列特異性的賴氨酸丁烯酰化抗體的制備
以組蛋白HI23的丁烯?；贵w制備為例。組蛋白HI23 丁烯酰化的序列特異性抗體由CQLATKAARK為抗原免疫兔子而獲得，其中C被半胱氨酸殘基，帶下劃線的K為丁烯?；馁嚢彼釟埢Ｍ米庸脖幻庖?次，每只兔子共取5批次血清，選取具有最高ELISA測(cè)定值的血清用于純化H;3K23 丁烯?；男蛄刑禺愋钥贵w。賴氨酸丁烯?；稽c(diǎn)特異性抗體的純化通過將抗原共價(jià)結(jié)合到樹脂上進(jìn)行。血清首先在20，OOOg下離心去除可能的蛋白顆粒。約10毫升血清和2毫升與含有丁烯?；嚢彼釟埢亩嚯目乖矁r(jià)偶聯(lián)的樹脂在純化柱過夜孵育。樹脂隨后依次用20毫升的PBSN緩沖液(含0. 5%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液)、6毫升磷酸鹽緩沖液洗滌。樹脂上結(jié)合的抗體用0. IM的氨基乙酸(pH 3. 0)洗脫并立即用1. OM的Tris-HCl (ρΗ8· 5)中和。洗脫的抗體在磷酸鹽緩沖液中透析過夜。為去除抗體的非特異性結(jié)合，將賴氨酸未修飾的CQLATKAARK多肽偶聯(lián)到樹脂上，然后該樹脂與所獲得的抗體孵育以吸附抗體中的非特異性的成分。正如本發(fā)明常規(guī)專業(yè)背景的人所能理解，用其他的多肽抗原而不是本發(fā)明中所用的特定抗原， 如CQLATKAARK，或許亦能夠獲得令人滿意的結(jié)果。多肽抗原的設(shè)計(jì)基于某蛋白中丁烯?；嚢彼岬闹苓呅蛄?，該蛋白的丁烯?；揎椖鼙槐绢I(lǐng)域中具備一般技能背景的人所檢測(cè)。利用同樣的方法，本發(fā)明開發(fā)出了組蛋白H;3K56的丁烯酰化修飾抗體。抗體的制備及純化與上述一致，除外所設(shè)計(jì)的抗原是針對(duì)組蛋白H3第56位賴氨酸的丁烯?；揎棥１M管本發(fā)明的具體體現(xiàn)使用了賴氨酸丁烯?；贵w，具備本發(fā)明常規(guī)專業(yè)背景的人可以使用相應(yīng)的單克隆抗體或單鏈可變區(qū)(scFvs)重復(fù)本發(fā)明并獲得滿意的結(jié)果。圖8顯示序列特異性抗體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用上述制備的抗體檢測(cè)組蛋白H;3K23與 H3K56位的丁烯?；揎?。本實(shí)驗(yàn)中，人HeLa細(xì)胞組蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，后用被非修飾的(K)或丁烯?；?Kcr)序列特異性多肽所競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。利用賴氨酸丁烯?；贵w對(duì)賴氨酸丁烯?；嚯牡挠H和富集純化的抗賴氨酸乙烯?；贵w經(jīng)4°C孵育4小時(shí)固定化到ftOtein A樹脂上(GE Healthcare Biosciences,Pittsburgh,PA)。離心去除上清后，樹脂用NTEN緩沖液洗滌三次 (50mM Tris .HCUpH 8. 0], IOOmM NaCl, ImM EDTA,0. 5% NP40) 經(jīng)酶解消化的組蛋白多肽溶于NETN緩沖液中，然后與20微升固定化的賴氨酸乙烯?；贵w-Protein A樹脂4oC緩慢搖晃過夜孵育。樹脂經(jīng)3次NETN緩沖液洗滌及2次ETN緩沖液洗滌后(50mM Tris -HCl PH 8.0, IOOmM NaCl, ImM EDTA)，樹脂上親和富集的多肽用0. 1 %的三氟乙酸洗脫三次，每次50微升。洗脫液匯集后于旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀內(nèi)真空干燥。多肽庫(kù)的競(jìng)爭(zhēng)性免疫印跡1微克的組蛋白提取物經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氯乙烯膜上(PVDF)。丁烯?；嚢彼峥贵w在分別與非修飾性抗原多肽庫(kù)、乙?；乖嚯膸?kù)、丙?；乖嚯膸?kù)、丁?；乖嚯膸?kù)、基丙烯化抗原多肽庫(kù)與丁烯?；乖嚯膸?kù)孵育后，與轉(zhuǎn)移有組蛋白提取物的PVDF膜孵育以檢測(cè)丁烯?；嚢彼岬男盘?hào)。組蛋白的溶液內(nèi)酶解消化與化學(xué)衍生化組蛋白的胰酶解肽段通過三種方法獲得⑴未經(jīng)體外賴氨酸丙?；慕M蛋白多肽的獲取。依前述方法獲得的組蛋白重懸于50mM的碳酸氫銨溶液中(pH 8. 4)，然后按已報(bào)道的方法進(jìn)行溶液胰酶裂解(Kim et al. ,2006 ；Luo et al.，2008)。(ii)組蛋白溶液內(nèi)酶解消化后，進(jìn)行體外化學(xué)丙?；磻?yīng)，該反應(yīng)參照已有文獻(xiàn)的報(bào)道(Garcia et al., 2007b)。為了獲得衍生化的組蛋白多肽，3毫克胰酶裂解的組蛋白多肽溶于25微升的50mM 的碳酸氫銨溶液中(pH 8. 0)，隨后加入600微升含50%丙酸酐的甲醇(ν/ν)，混合液的ρΗ 值用氫氧化銨快速調(diào)制8.0。51oC反應(yīng)20分鐘后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中使反應(yīng)溶液蒸發(fā)干燥。為保證反應(yīng)完全，上述實(shí)驗(yàn)過程重復(fù)兩次。(iii)提取的組蛋白先進(jìn)行體外丙酰化反應(yīng)，隨后胰酶裂解消化。組蛋白的體外丙?；磻?yīng)如上述，丙?；慕M蛋白隨后在37oC環(huán)境下用胰酶進(jìn)行過夜酶解。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC/MS/MQ分析與蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索經(jīng)干燥的多肽溶于3微升的HPLC溶劑A中(0. 1 %甲酸水溶液，ν/ν)。1微升的樣品注射入 Nano-LC-ID plus HPLC 系統(tǒng)中(Eksigent Technologies，Dublin，CA)，該系統(tǒng)連接有自制的毛細(xì)管Jupiter C12柱(柱長(zhǎng)10厘米，內(nèi)徑75微米；樹脂顆粒大小4微米， 孔徑 90 A;Phenomenex，St. Torrance, CA)。多肽用 2%到 80%梯度的 HPLC 溶劑 B (0. 甲酸乙腈溶液，ν/ν)按每分鐘200納升的流速按兩小時(shí)工作時(shí)間洗脫出。洗脫出的多肽經(jīng)離子化后用納升電噴離子源的LTQ Orbitrap Velos質(zhì)譜儀分析(ThermoFishei^cientific， San Jose, CA) 0全掃描式的高解析度一級(jí)電離譜(質(zhì)荷比從350至1400)在鎖定質(zhì)量質(zhì)荷比445. 120025、質(zhì)荷比400、解析度R = 6000的Orbitrap獲得，。隨后20個(gè)具有最強(qiáng)離子化的一級(jí)電離片斷在線形離子胼中按35%的碰撞激活解離能量進(jìn)行二級(jí)電離片斷化。數(shù)據(jù)依賴掃描的排除持續(xù)設(shè)定為36秒，排除范圍設(shè)定值為質(zhì)荷比士0.01%。二級(jí)電離數(shù)據(jù)通過非限制性序列比對(duì)算法PTMap加以分析(Chen et al.，2009)， 利用Mascot算法進(jìn)行限制性、預(yù)先設(shè)定的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型的序列比對(duì)。對(duì)于非丙酰化的組蛋白，為了尋找多樣化的翻譯后修飾類型，蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的參數(shù)設(shè)定包括賴氨素單甲基化、賴氨酸雙甲基化、賴氨酸三甲基化、賴氨酸甲?；?、賴氨酸乙酰化、精氨酸單甲基化、精氨酸雙甲基化、酪氨酸羥基化、甲硫氨酸氧化與賴氨酸乙烯酰化(質(zhì)量位移 +68. 02621Da)。對(duì)于先丙?；磻?yīng)、后胰酶裂解的組蛋白樣品，設(shè)定的參數(shù)還包括了賴氨酸丙酰甲基化(質(zhì)量位移+70.04187Da)與賴氨酸丙酰化。對(duì)于先胰酶裂解、后丙?；磻?yīng)的組蛋白樣品，氨基端的丙烯化作為固定的修飾包括在設(shè)定的參數(shù)中。數(shù)據(jù)分析中其他的參數(shù)好包括6個(gè)允許的酶解不完全片斷；前離子的IOppm的質(zhì)量誤差，碎片離子0. 6Da的質(zhì)量誤差；+1、+2與+3的電荷狀態(tài)被賦予母離子。如果一個(gè)多肽產(chǎn)生多于一個(gè)肽譜，則具有最高M(jìn)ascot或PTMap分析數(shù)值的肽譜被用來做手工分析。按已有文獻(xiàn)報(bào)道，所有PTMap > 0. 8或Mascot > 20的多肽被用來做進(jìn)一步的手工檢驗(yàn)(Chen et al. . 2005)。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC/MS/MQ分析對(duì)賴氨酸丁烯?；拇_認(rèn)組蛋白酶解肽段中的賴氨酸丁烯?；嚯摹?duì)應(yīng)的合成型賴氨酸丁烯?；嚯囊约吧鲜鰞煞N多肽的混合物被注入到nano-HPLC系統(tǒng)中，隨后用Orbitrap質(zhì)譜儀進(jìn)行高解析度的一級(jí)電離及二級(jí)電離分析。全掃描式一級(jí)電離在鎖定質(zhì)量質(zhì)荷比445. 120025、質(zhì)荷比 400、解析度R = 30000下獲得，目標(biāo)肽段的二級(jí)電離譜質(zhì)荷比400、解析度R = 7500下獲得。賴氨酸丁烯?；嚯牡蔫b定組蛋白富含高比例的賴氨酸與精氨酸，因此，胰酶消化將產(chǎn)生相對(duì)較小且親水性的多肽片斷，其中一些由于不能駐留在C18RP-HPLC柱中而不能進(jìn)行隨后的質(zhì)譜檢測(cè)。該問題可以通過對(duì)酶解前或酶解后蛋白樣品的氨基基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)衍生化而解決(如酰氨的氨基端、未修飾及單甲基化賴氨酸的ε_(tái)氨基基團(tuán)的丙?；?。同樣，在酶解前或酶解后，組蛋白的賴氨酸丙?；瘜a(chǎn)生互補(bǔ)的多肽，這將增加質(zhì)譜鑒定時(shí)的序列覆蓋程度。此外，利用等電聚焦法分離的12個(gè)多肽組分將能進(jìn)一步減少每次分析時(shí)的樣品復(fù)雜性及提高檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍。本發(fā)明中，為了最大程度地提高序列覆蓋率、檢測(cè)的靈敏度及鑒定新的翻譯后修飾位點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了綜合性的實(shí)驗(yàn)策略去系統(tǒng)地鑒定組蛋白上的修飾方式。本發(fā)明中，我們采用了四種平行的方法獲得組蛋白的酶解肽段，然后分別進(jìn)行質(zhì)譜分析(圖1Α) :(i)組蛋白溶液內(nèi)酶解消化，無體外化學(xué)丙?；磻?yīng)；(ii)組蛋白溶液內(nèi)酶解消化后，采用體外化學(xué)丙酰化反應(yīng)；(iii)丙?；M蛋白，隨后胰酶解；(iν)通過酶解單一組蛋白獲得酶解肽段。我們利用一次能鑒別某一蛋白中所有可能的翻譯后修飾方式的PTMap算法(Chen et al. ,2009)去分析所獲得的組蛋白質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)。正如預(yù)期，對(duì)于進(jìn)行了化學(xué)丙?；磻?yīng)的多肽，無論是酶解前或酶解后，質(zhì)譜鑒定的多肽序列覆蓋程度都顯著的提高(圖1B)。 在所采用的四個(gè)方法中，方法三(丙酰化組蛋白，隨后胰酶解)對(duì)組蛋白Hl. 2達(dá)到了 100% 的序列覆蓋，組蛋白H2A達(dá)到了 90. 7%的序列覆蓋，組蛋白H2B達(dá)到了 94. 4%的序列覆蓋。 方法四(通過酶解單一組蛋白獲得酶解肽段)對(duì)組蛋白H3與H4達(dá)到了最佳的序列覆蓋， 分別為87. 3%與82. 3%。綜合數(shù)據(jù)后，我們?nèi)〉昧藢?duì)組蛋白Hl. 2100%的序列覆蓋，H2A 90. 7%的序列覆蓋，H2B 100%的序列覆蓋，H397%的序列覆蓋，H487. 3%的序列覆蓋。就我們所知，這是迄今為止所報(bào)道的組蛋白質(zhì)譜分析中最高的序列覆蓋率。利用述方法，我們?cè)诮M蛋白中共鑒定出130個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)，包括本發(fā)明中所列的觀個(gè)賴氨酸丁烯?；稽c(diǎn)。余下的102個(gè)位點(diǎn)中包括了 39個(gè)以前未見報(bào)道的新的翻譯后修飾位點(diǎn)，其中18個(gè)賴氨酸單甲基化位點(diǎn)、1個(gè)賴氨酸雙甲基化位點(diǎn)、4個(gè)賴氨酸甲?；稽c(diǎn)、2個(gè)賴氨酸乙酰化位點(diǎn)、8個(gè)精氨酸單甲基化位點(diǎn)和6個(gè)酪氨酸羥基化位點(diǎn)(圖 1C)。本發(fā)明中所鑒定的所有賴氨酸丁烯?；稽c(diǎn)和非丁烯?；稽c(diǎn)見圖ID與圖IE所示。所鑒定出的組蛋白翻譯后修飾多肽的二級(jí)質(zhì)譜圖均按以前報(bào)道的方法經(jīng)嚴(yán)格的手工檢驗(yàn)(Chen et al.，2005)。利用對(duì)相應(yīng)的人工合成的修飾性多肽的二級(jí)質(zhì)譜分析，我們進(jìn)一步確認(rèn)了所有鑒定的賴氨酸丁烯酰化位點(diǎn)和10個(gè)新的非賴氨酸丁烯?；姆g后修飾位
點(diǎn)ο組蛋白中賴氨酸丁烯?；稽c(diǎn)的鑒定蛋白質(zhì)翻譯后修飾會(huì)引起修飾位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)及成分變化，并由此帶來相應(yīng)的分子量的改變。本發(fā)明中，組蛋白多肽中所鑒定的觀個(gè)賴氨酸殘基中帶有+68Da的質(zhì)量位移，該質(zhì)量位移與以前所知的任何翻譯后修飾方式均不對(duì)應(yīng)(圖1E)，暗示了一種新的未被報(bào)道的“組蛋白標(biāo)記”的存在。為解析該修飾的結(jié)構(gòu)，含有該修飾的一條多肽PEPAK+68SAPAPK(組蛋白H2B第5 位賴氨酸修飾)被用來做進(jìn)一步分析。經(jīng)對(duì)該多肽高解析度的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的手工分析 (前離子質(zhì)量質(zhì)荷比580. 8181)，我們確定該修飾的準(zhǔn)確質(zhì)量位移為+68. 0230Da。通過設(shè)置允許質(zhì)量誤差士0. OlDa(約9ppm，在所用質(zhì)譜的質(zhì)量精確度范圍內(nèi))以及指定最多兩個(gè)氮原子，根據(jù)質(zhì)量位移，該修飾基團(tuán)的組成為C4H50或H6N03，而C4H50(質(zhì)量位移外加一個(gè)中子)是該修飾唯一可能的分子式。對(duì)于該分子的組成成分，總共有四種可能的結(jié)構(gòu)丁烯?；嚢彼?圖2A，2B)、乙烯乙酰賴氨酸(vinylacetyllysine)、基丙烯賴氨酸 (methacryllysine)與環(huán)丙；^酸賴M酸(cyclopropanecarboxyllysine)(圖 2C)。由于丁烯酰輔酶A在丁酰輔酶A與乙酰輔酶A代謝通路是一種重要且高豐度的中間物(圖2D)，我們因此認(rèn)為該質(zhì)量位移對(duì)應(yīng)為賴氨酸丁烯酰化修飾合成多肽的二級(jí)質(zhì)譜分析與高效液相色譜的共洗脫分析為了驗(yàn)證+68. 0230Da的質(zhì)量位移由賴氨酸丁烯酰化引起，我們合成了修飾性的 PEPAKcrSAPAra多肽，并將其質(zhì)譜分析的圖譜與體內(nèi)對(duì)應(yīng)多肽的圖譜比較。帶有修飾性賴氨酸質(zhì)量位移為+68. 0230Da體內(nèi)多肽、具有與體內(nèi)多肽同樣序列的PEPAKcrSAPAPK的合成多肽、以及這兩種多肽的混合物表現(xiàn)出完全一樣的本體質(zhì)量及高解析度的二級(jí)質(zhì)譜圖譜(圖 3A至C)。此外，兩種多肽的混合物在高效液相色譜/質(zhì)譜分析中被共同洗脫下來(圖3D)。 這些結(jié)果表明+68. 0230Da的質(zhì)量位移很可能有賴氨酸丁烯?；?。免疫印跡與免疫熒光分析對(duì)賴氨酸丁烯酰化的確認(rèn)為了進(jìn)一步確認(rèn)組蛋白中的賴氨酸丁烯?；揎棧覀冮_發(fā)出了賴氨酸丁烯?；Ｔ摽贵w能特異性地識(shí)別帶有丁烯?；嚢彼岬亩嚯膸?kù)，而不識(shí)別未修飾賴氨酸的多肽庫(kù)、乙?；嚢彼岫嚯膸?kù)、丙?；嚢彼岫嚯膸?kù)與丁?；嚢彼岫嚯膸?kù)(圖4A)。該抗體的特異性也被利用化學(xué)修飾的賴氨酸丁烯?；Ｑ灏椎鞍?、賴氨酸乙烯乙?；Ｑ灏椎鞍缀唾嚢彼峄┗Ｑ灏椎鞍椎拿庖哂≯E分析所證明。這些實(shí)驗(yàn)表明賴氨酸丁烯?；贵w僅識(shí)別賴氨酸丁烯酰化牛血清白蛋白，而不識(shí)別氨酸乙烯乙酰化牛血清白蛋白和賴氨酸基丙烯化牛血清白蛋白(圖4B，C)。該抗體隨后用于免疫印跡與免疫熒光實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)賴氨酸丁烯?；盘?hào)。實(shí)驗(yàn)表明，該抗體能夠檢測(cè)出所有核心組蛋白H2A、H2B、H3、H4及聯(lián)結(jié)組蛋白Hl中的賴氨酸丁烯?；盘?hào)。每一組蛋白中，賴氨酸丁烯?；盘?hào)能夠被帶有賴氨酸丁烯?；嚯膸?kù)所競(jìng)爭(zhēng)，而不能被未修飾賴氨酸的多肽庫(kù)(圖4C)、基丙烯化賴氨酸多肽庫(kù)(圖4C)、 乙?；嚢彼岫嚯膸?kù)、丙?；嚢彼岫嚯膸?kù)與丁?；嚢彼岫嚯膸?kù)(圖4D)所競(jìng)爭(zhēng)。經(jīng)五種相互獨(dú)立方法的驗(yàn)證，即質(zhì)譜分析、高效液相色譜的共洗脫、D4- 丁烯酸酯的標(biāo)記、免疫印跡及免疫熒光，本發(fā)明確定了組蛋白中賴氨酸丁烯酰化修飾的存在。不同細(xì)胞類型中組蛋白賴氨酸丁烯酰化的檢測(cè)利用本發(fā)明所使用的方法，我們進(jìn)一步證實(shí)了賴氨酸丁烯?；嬖谟谄渌愋驼婧思?xì)胞的組蛋白中。例如，我們?cè)诮湍浮⒐塖2細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞以及人HeLa細(xì)胞的組蛋白中檢測(cè)的賴氨酸丁烯?；盘?hào)(圖6)。利用賴氨酸丁烯?；贵w的親和富集實(shí)驗(yàn)與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，我們?cè)谛∈笈咛コ衫w維細(xì)胞中鑒定出M個(gè)賴氨酸丁烯酰化位點(diǎn)(圖1E)。因此，這些結(jié)果表明組蛋白賴氨酸丁烯?；钦婧思?xì)胞中一種進(jìn)化保守的修飾方式。本發(fā)明提出了一個(gè)綜合性的策略去系統(tǒng)地鑒定組蛋白的翻譯后修飾(圖1)。運(yùn)用該策略，本發(fā)明獨(dú)一無二地鑒定了人細(xì)胞內(nèi)130個(gè)組蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)被鑒定出來，包括63個(gè)已知的和67個(gè)新的“組蛋白標(biāo)記”位點(diǎn)(圖1C)，其中酪氨酸羥基化和賴氨酸丁烯?；癁殍b定出了兩種新的“組蛋白標(biāo)記”。因此，本發(fā)明拓展了對(duì)真核細(xì)胞中組蛋白翻譯后修飾類型及位點(diǎn)的認(rèn)識(shí)，并且為研究組蛋白調(diào)控機(jī)理提供了技術(shù)平臺(tái)理，為組蛋白調(diào)控相關(guān)疾病的治療提供了方向。盡管在此圖示和描述了本發(fā)明的較佳實(shí)施例，但在不偏離本發(fā)明的設(shè)計(jì)思想和范圍的前提下，本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員還可作多種省略、修改和替代設(shè)計(jì)。因此，應(yīng)當(dāng)理解， 本發(fā)明以圖示方案描述為例，但并不限于此。參考文獻(xiàn)1. 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權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)某一“組蛋白標(biāo)記”的方法，其特征在于，該方法包括(a)從一種組蛋白中準(zhǔn)備多肽混合物；(b)按分子量的差異分離多肽；(c)用一種能夠特異性結(jié)合含有一個(gè)丁烯酰化賴氨酸殘基多肽的親和試劑去分離多肽；(d)檢測(cè)上述親和試劑與上述多肽結(jié)合形成的復(fù)合物的存在，并由此說明組蛋白賴氨酸丁烯?；敖M蛋白，，標(biāo)記的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，親和試劑為一種抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，抗體制備的步驟包括(a)用含有一個(gè)丁烯?；嚢彼釟埢牡鞍锥嚯脑谝粋€(gè)時(shí)間段內(nèi)免疫哺乳動(dòng)物；(b)收集被免疫哺乳動(dòng)物的血清；(c)利用丁烯?；嚢彼峁矁r(jià)結(jié)合的樹脂選擇性地富集血清。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，抗體是用常規(guī)方法制備的單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，抗體是一單鏈可變區(qū)形式的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行步驟(c)之前，分離的多肽被固定化到一個(gè)固體基質(zhì)上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行步驟(c)之前，親和試劑固定化到一個(gè)固體基質(zhì)上。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，親和試劑能特異性結(jié)合組蛋白H2A上第 36、118、119或125位賴氨酸上的丁烯?；揎?。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，親和試劑能特異性結(jié)合組蛋白H2B上第 5、11、12、15、16、20、23或34位賴氨酸上的丁烯酰化修飾。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，親和試劑能特異性結(jié)合組蛋白H3上第4、9、18、23、27或56位賴氨酸上的丁烯?；揎?。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，親和試劑能特異性結(jié)合組蛋白H4上第5、8、12、或16位賴氨酸上的丁烯?；揎?。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，親和試劑能特異性結(jié)合組蛋白Hl上第 33、63、84、89、96、158或167位賴氨酸上的丁烯?；揎?。
13.分離的抗體，其特征在于，能夠特異性地結(jié)合含有一個(gè)丁烯?；嚢彼釟埢囊粋€(gè)蛋白或一個(gè)多肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的抗體，其特征在于，抗體是一種單克隆抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的抗體，其特征在于，抗體是一單鏈可變區(qū)形式的一種。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的抗體，其特征在于，抗體制備的步驟包括(a)用含有一個(gè)丁烯?；嚢彼釟埢牡鞍锥嚯脑谝粋€(gè)時(shí)間段內(nèi)免疫哺乳動(dòng)物；(b)收集被免疫哺乳動(dòng)物的血清；(c)利用丁烯?；嚢彼峁矁r(jià)結(jié)合的樹脂選擇性地富集血清。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的抗體，其特征在于，蛋白是指第36、118、119或125 位賴氨酸丁烯酰化的組蛋白H2A。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的抗體，其特征在于，蛋白是指第5、11、12、15、16、20、 23或34位賴氨酸丁烯?；慕M蛋白H2B。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的抗體，其特征在于，蛋白是指第4、9、18、23、27或56 位賴氨酸丁烯酰化的組蛋白H3。
20.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的抗體，其特征在于，蛋白是指第5、8、12、或16位賴氨酸丁烯?；慕M蛋白H4。
21.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的抗體，其特征在于，蛋白是指第33、63、84、89、96、 158或167位賴氨酸丁烯?；慕M蛋白HI。
22.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的抗體，其特征在于，蛋白是指組蛋白H2A，H2B,H3， H4 或 Hl。
全文摘要
一種方法及相關(guān)的親和試劑用于檢測(cè)新穎的“組蛋白標(biāo)記”。該新穎的“組蛋白標(biāo)記”是指組蛋白上賴氨酸殘基上的丁烯酰化修飾。檢測(cè)方法的步驟包括(a)從一種組蛋白中準(zhǔn)備多肽混合物；(b)按分子量的差異分離多肽；(c)用一種能夠特異性結(jié)合含有一個(gè)丁烯?；嚢彼釟埢嚯牡挠H和試劑去分離多肽；(d)檢測(cè)上述親和試劑與一條或多條多肽結(jié)合形成的復(fù)合物的存在，并由此說明組蛋白賴氨酸丁烯?；敖M蛋白”標(biāo)記的存在。該親和試劑可能是從哺乳動(dòng)物血清中純化的抗體、單克隆抗體或單鏈的可變區(qū)。
文檔編號(hào)C07K16/06GK102375065SQ201110141188
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者趙英明 申請(qǐng)人:杭州景杰生物科技有限公司