專利名稱：產(chǎn)生抗體組合物的細胞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種可產(chǎn)生抗體分子的細胞，抗體分子如用于多種疾病的抗體、抗體的片段和具有抗體Fc區(qū)的融合蛋白或類似物，以及采用該細胞產(chǎn)生抗體組合物的過程，抗體組合物及其用途。
背景技術：
由于抗體具有高的結(jié)合活性、結(jié)合特異性和在血中高的穩(wěn)定性，因此已經(jīng)嘗試應用抗體以診斷、預防和治療多種人類疾病[單克隆抗體原理和應用(Monoclonal Antibodies Principles and Applications)，Wiley-Liss，Inc.，第 2. 1 章(1995)]。此夕卜， 已經(jīng)采用基因重組技術嘗試了產(chǎn)生人源化抗體，如人嵌合抗體或從動物而不是從人來源的抗體進行了人互補決定區(qū)(下文被稱作“CDR”)嫁接的抗體。人嵌合抗體是一種其抗體可變區(qū)(下文被稱作“V區(qū)”)來源于動物而不是人，其恒定區(qū)(下文被稱作“C區(qū)”)來源于人抗體的抗體。人CDR-移植抗體是一種人抗體的CDR被來自動物而不是人的抗體的CDR 替代的抗體。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在來自哺乳動物的抗體中有5類，即IgM, IgD, IgG, IgA和IgE0人IgG 類抗體主要用于診斷、預防和治療多種人類疾病，因為它們具有功能性特性如在血中的長半衰期、多種效應子功能和類似特性[單克隆抗體原理和應用，Wiley-Liss，Inc.，第1章 (1995) J0人IgG類抗體進一步分為下列4個亞類IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。到目前為止， 已經(jīng)對作為IgG類抗體效應子功能的抗體依賴的細胞介導細胞毒活性(下文被稱作“ADCC 活性”)和補體依賴的細胞毒活性(下文被稱作“CDC活性”)進行了大量的研究，據(jù)報道在人類IgG類抗體中，IgGl亞類具有最高的ADCC活性和CDC活性[Chemical Immunology, 65,88 (1997)]。考慮到上述情況，大多數(shù)抗腫瘤人源化抗體，包括市售的Rituxan和 Here印tin，都是人IgGl亞類抗體，為表達其效應需要高的效應子功能。人IgGl亞類抗體表達ADCC活性和⑶C活性需要將抗體的Fc區(qū)結(jié)合到存在于效應細胞表面上的抗體受體上，這些效應細胞如殺傷細胞、自然殺傷細胞、活化的巨噬細胞或類似細胞(下文被稱作“FcyR”)，并結(jié)合多種補體成分。就結(jié)合而言，已經(jīng)表明鉸合區(qū)的幾個氨基酸殘基和抗體C區(qū)的第二個結(jié)構區(qū)(下文被稱作“C γ 2區(qū)”)是很重要的 [Eur. J. Immunol. ,23,1098(1993), ImmunoloRY,86,319(1995), Chemical Immunology,65, 88 (1997)]，結(jié)合到 C 區(qū)的糖鏈[Chemical Immunology, 65,88 (1997)]也是很重要的。就糖鏈而言，Boyd等人已經(jīng)通過用多種糖水解酶處理人⑶R-移植抗體 CAMPATH-1H(人IgGl亞類)檢測了糖鏈對ADCC活性和⑶C活性的影響，該抗體是由中國倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)或小鼠黑素瘤NSO細胞(NS0細胞)產(chǎn)生的，據(jù)報道，去除非還原端唾液酸并不影響兩者的活性，但進一步去除半乳糖殘基可單獨影響CDC活性，活性降低大約50%，完全去除糖鏈可引起兩者的活性都消失[Molecular Immunol. ,32,1311 (1995) ] 0 Lifely等人也分析了與人⑶R移植抗體CAMPATH_1H(人IgGl亞類)結(jié)合的糖鏈，該抗體由CHO細胞、NSO細胞或大鼠黑素瘤YO細胞產(chǎn)生，測定其ADCC活性，據(jù)報道來自YO細胞的 CAM1ATH-1H顯示最高的ADCC活性，這表明對切位置上的N-乙酰氨基葡萄糖(下文也被稱作“GlcNAc”)對活性是很重要的[Glycobiology,5,813(1995) ；WO 99/54342]。這些報道表明糖鏈結(jié)構在人IgGl亞類抗體的效應子功能上具有很重要的作用，通過改變糖鏈結(jié)構制備具有更高效應子功能的抗體是可能的。但是，實際上，糖鏈的結(jié)構是多樣的和復雜的， 還不能說對效應子功能實際上重要的結(jié)構是確定的。 根據(jù)與蛋白部分的結(jié)合形式，糖蛋白的糖鏈大體分成兩種類型，即與天冬酰胺結(jié)合的糖鏈(N-糖苷連接的糖鏈)和與其它氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸結(jié)合的糖鏈(0-糖苷連接的糖鏈)。N-糖苷連接的糖鏈具有多種結(jié)構[生化實驗方法23-研究糖蛋白糖鏈的方法
(Biochemical Experimentation Method 23-Method for Studying Glycoprotein Sugar
Chain) (Gakujutsu Shuppan 中心)，由 Reiko Takahashi 編輯(1989)]，但已知的是它們有基本共同的核心結(jié)構，在下面的結(jié)構式(I)中顯示結(jié)構式(I)與天冬酰胺結(jié)合的糖鏈末端稱為還原末端，另一端稱為非還原端。已知N-糖苷連接的糖鏈包括高甘露糖型，其中甘露糖單獨與核心結(jié)構的非還原端結(jié)合；復合體型，其中核心結(jié)構的非還原末端有半乳糖-N-乙酰氨基葡萄糖(下文被稱作“Gal-GlcNAc”)的至少一個平行分支，Gal-GlcNAc的非還原末端具有唾液酸、對切N-乙酰氨基葡萄糖或類似物質(zhì)的結(jié)構；雜交型，其中核心結(jié)構的非還原末端具有高甘露糖型和復合體型兩者的分支； 和類似結(jié)構。在IgG型抗體的Fc區(qū)存在兩個N-糖苷連接的糖鏈結(jié)合位點。在血清IgG中， 一般在糖鏈結(jié)合位點上，結(jié)合著具有兩個以上分支的復合體型糖鏈，其中添加的唾液酸或?qū)η蠳-乙酰氨基葡萄糖是很少的。已知對于向復合體型糖鏈的非還原末端添加半乳糖， 和向N-乙酰氨基葡萄糖的還原末端添加巖藻糖而言，形式是多樣的[Biochemistry，巡， 130(1997)]。已經(jīng)考慮到，這樣一種糖鏈結(jié)構是由糖鏈基因決定的，即合成糖鏈的糖基轉(zhuǎn)移酶基因和水解糖鏈的糖水解酶基因。N-糖苷連接糖鏈的合成如下描述。糖蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(下文被稱作“ER”)腔中被糖鏈修飾。在N-糖苷連接糖鏈的生物合成步驟中，相對大的糖鏈傳遞至在ER腔內(nèi)延長的多肽鏈上。在轉(zhuǎn)化作用中， 糖鏈首先在長鏈脂質(zhì)載體的磷酸基團之后連續(xù)性添加上，該載體包含大約20個α-異戊二烯單位，稱為長醇磷酸酯(下文也被稱作“P-Dol”)。也就是，N-乙酰氨基葡萄糖傳遞至長醇磷酸酯上，從而形成GlcNAc-P-P-Dol，然后另一個GIcNAC被傳遞形成 GlcNAc-GlcNAc-P-P-Dol。下一步，5個甘露糖(甘露糖在下文被稱作“Man”)被傳遞，因此形成(Man)5-(GlcNAc)2-P-P-D0I,然后傳遞4個甘露糖和3個葡萄糖(葡萄糖在下文也被稱作“Glc”)。因此，形成了稱為核心寡糖的糖鏈前體，(Glc) 3- (Man) 9- (GlcNAc) 2-P-P-Dol 0 含14個糖的糖鏈前體作為一個整體在ER腔中傳遞至具有天冬酰胺-X-絲氨酸或天冬酰胺-X-蘇氨酸序列的多肽上。在反應中，結(jié)合至核心寡糖的長醇焦磷酸磷酸酯(P-P-Dol) 被釋放，但在焦磷酸酶的水解作用下再次成為長醇磷酸酯，并再循環(huán)。糖鏈的修剪在糖鏈結(jié)合至多肽上后立即開始。也就是說，3個葡萄糖和1或2個甘露糖在ER上被剔除，且已知 α -1,2-糖苷酶I、α -1,3-糖苷酶II和α -1,2-甘露糖苷酶與剔除作用有關。在ER上經(jīng)受修剪的糖蛋白被傳遞至高爾基體，被進行各種各樣的修飾。在高爾基體的0內(nèi)側(cè)部分，存在有與添加磷酸甘露糖相關的N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰氨基葡萄糖1-磷酸二酯α "N-乙酰氨基葡萄糖酶和α -甘露糖苷酶I，并將甘露糖殘基減少至5。在高爾基體的中部，存在有與添加復合體型N-糖苷連接糖鏈的第一個外側(cè)GIcNAC 有關的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I (&ιΤΙ)、與剔除2個甘露糖有關的α -甘露糖苷酶II、 與從外側(cè)添加第二個GIcNAc有關的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶II (GnTII)、和與向還原末端N-乙酰氨基葡萄糖添加巖藻糖有關的α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。在高爾基體的()外側(cè)部分，存在與添加半乳糖有關的半乳糖轉(zhuǎn)移酶、和與添加唾液酸如N-乙酰神經(jīng)氨酸有關的唾液?；D(zhuǎn)移酶、或類似酶。已知N-糖苷連接糖鏈是通過這些多種酶的活動而形成的。一般地，大多數(shù)用于藥物的人源化抗體考慮采用基因重組技術制備，并采用中國倉鼠卵巢組織來源的CHO細胞作為宿主細胞產(chǎn)生。但如上所述，因為糖鏈結(jié)構在抗體效應子功能中具有非常明顯的重要作用，且在宿主表達的糖蛋白糖鏈結(jié)構上觀察到了差異，所以期望開發(fā)可用于生產(chǎn)具有更高效應子功能的抗體的宿主細胞。為了修飾所產(chǎn)生的糖蛋白的糖鏈結(jié)構，已經(jīng)嘗試了多種方法，如1)采用對抗涉及糖鏈修飾的酶的抑制劑，2)選擇突變體，3)導入編碼與糖鏈修飾有關的酶的基因，和類似方法。特殊的實例描述如下。與對抗糖鏈修飾有關的酶的抑制劑實例包括，選擇性抑制GlcNAc-P-P-Dol形成的衣霉素(timicamycin)，GlcNAc-P-P-Dol是形成N-糖苷連接糖鏈的前體-核心寡糖的第一步，糖苷酶I的抑制劑栗精胺和N-甲基-1-脫氧野尻毒素，糖苷酶II的抑制劑溴環(huán)己烯四醇(bromocondulitol)，甘露糖苷酶I的抑制劑1_脫氧野尻毒素和1，4_ 二氧基-1， 4-亞氨基-D-甘露醇，甘露糖苷酶II的抑制劑八氫吲嗪三醇和類似抑制劑。對糖基轉(zhuǎn)移酶特異的抑制劑的實例包括，針對N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V(^iTV)的底物的脫氧衍生物和類似物質(zhì)[Glycobiology系列2-細胞中糖鏈的命運(Glycobiology Series 2-Destiny of Chain in Cell)(Kodan-sha Scientific), Katsutaka Nagai> Senichiro Hakomori 禾口 Akira KcAata編輯(1993)]。此外，已知1_脫氧野尻毒素抑制復合體型糖鏈的合成，并增加高甘露糖型和雜交型糖鏈的比例。實際上，已經(jīng)報道當抑制劑加入培養(yǎng)基中時，IgG的糖鏈結(jié)構被改變，如抗原結(jié)合活性等的特性被改變[Molecular Immunol.，巡，1113 (1989)]。與糖鏈修飾有關的酶活性相關的突變體被主要選擇，并獲得植物凝血素抗性細胞系。例如，使用以下植物凝血素已經(jīng)獲得了作為植物凝血素抗性細胞的具有多種糖鏈結(jié)構的CHO細胞突變體，如WGA (來自T. vulgaris的麥胚凝集素)、刀豆素A (來自C. ensiformis Wcocanavalin A)、RIC(來自 R. communis 的一種毒素)、L-PHA (來自 P. vulgaris 的白細胞凝集素)、LCA (來自L. culinaris的扁豆凝集素)、PSA (來自P. sativum的豌豆凝集素) 或類似物[Somatic Cell Mol. Genet.，叢，51 (1986)]。作為通過向宿主細胞中導入與糖鏈修飾有關的酶的基因而獲得的產(chǎn)物的糖鏈結(jié)構修飾的實例，已經(jīng)報道，通過向CHO細胞中導入大鼠β -半乳糖苷- α -2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，可產(chǎn)生在糖鏈非還原端加入許多唾液酸的蛋白質(zhì)[J. Biol. Chem. ,261,13848(1989)].而且，已經(jīng)證實，H抗原(Fuc α l-2Gal β 1-)通過將人β -半乳糖苷_2_ α -巖藻糖轉(zhuǎn)移酶導入小鼠L細胞中而被表達，在H抗原中巖藻糖(下文也被稱作“Fuc”)被添加至糖鏈的非還原端[Science, 252,1668 (1991) J0另外，根據(jù)這樣的知識，N-糖苷連接糖鏈的對切位置的N-乙酰氨基葡萄糖添加對于抗體的ADCC活性是很重要的，Umana等人已經(jīng)制備了表達β-1，4-Ν-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶ΙΙΙ(&ιΤΠΙ)的CHO細胞，并比較了它與親代細胞系的&1ΤΙΙΙ表達。已證實，在CHO細胞的親代細胞系中未觀察到&1ΤΙΙΙ的表達 [J. Biol. Chem.，2紅，13370 (1984)]，采用所生產(chǎn)的表達GnTIII的CHO細胞所表達的抗體所具有的ADCC活性較采用親代細胞系表達的抗體高16倍WlycobiologyJ，813 (1995) W099/54342]。這時，Umana等人也已經(jīng)生產(chǎn)了 CHO細胞，其中導入了 β-1，4_Ν_乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V(^iTV)，據(jù)報道&1TIII或&iTV的過度表達顯示對CHO細胞有毒性。

發(fā)明內(nèi)容
于是，為了修飾要產(chǎn)生的糖蛋白的糖鏈結(jié)構，已試圖在宿主細胞中控制涉及糖鏈修飾的酶的活性，但實際上，糖鏈結(jié)構是多樣的和復雜的，糖鏈生理學作用的解釋是不充分的，因此試驗和錯誤不斷地重復出現(xiàn)。特別是，盡管已經(jīng)逐漸地清楚抗體的效應子功能受糖鏈結(jié)構的影響非常大，但真正重要的糖鏈結(jié)構還尚未被說明。因此，鑒定對抗體的效應子功能有影響的糖鏈并開發(fā)可以在其中加入這種糖鏈結(jié)構的宿主細胞，是藥物開發(fā)所期望的。本發(fā)明的目的是，提供產(chǎn)生抗體組合物的宿主細胞并控制與抗體分子結(jié)合的糖鏈結(jié)構，提供可以產(chǎn)生具有高ADCC活性(抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用)的抗體組合物的細胞，提供采用該細胞生產(chǎn)抗體組合物的方法及通過此生產(chǎn)方法產(chǎn)生的抗體組合物。本發(fā)明涉及如下(1)至(61)。(1)中國倉鼠卵巢組織來源的CHO細胞，其中導入了編碼抗體分子的基因，它產(chǎn)生由抗體分子組成的抗體組合物，該抗體分子具有N-糖苷連接糖鏈與Fc區(qū)結(jié)合的復合體，其中在該組合物內(nèi)與Fc區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈的總復合體中，巖藻糖沒有在糖鏈還原末端與N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比率是20%或以上。(2)根據(jù)(1)的CHO細胞，其中所述的沒有與巖藻糖結(jié)合的糖鏈是N-糖苷連接糖鏈復合體，其中巖藻糖1號位置不與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。(3)根據(jù)(1)或⑵的CHO細胞，其中所述的抗體分子屬于1gG類。(4)根據(jù)(1)至(3)任一項的CHO細胞，其中涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖合成的酶的活性，和/或涉及糖鏈修飾的酶的活性是降低或刪除的，在糖鏈修飾中，巖藻糖1 號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在N-糖苷連接糖鏈復合體中在還原末端經(jīng)α -鍵連接。)根據(jù)(4)的CHO細胞，其中涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖合成的酶選自下列(a)、 (b)和(c)(a) GMD (⑶P-甘露糖4，6_脫氫酶)；(b)Fx (⑶P-酮-6-脫氧甘露糖3，5-差向異構酶4_還原酶)；
(c) GFPP (⑶P- β -L-巖藻糖焦磷酸化酶)。(6)根據(jù)(5)的CHO細胞，其中所述的GMD是由下列(a)或(b)DNA編碼的蛋白(a)包括由SEQ ID NO 65描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)與包括SEQ ID NO 65描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有GMD活性的蛋白的DNA。(7)根據(jù)(5)的CHO細胞，其中GMD是選自下列(a)、(b)和(c)的蛋白(a)包括由SEQ ID NO 71描繪的氨基酸序列的蛋白；(b)包括在SEQ ID NO :71描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有GMD活性的蛋白；(c)包括與SEQ ID NO 71描繪的氨基酸序列有至少80%同源性的氨基酸序列并具有GMD活性的蛋白。(8)根據(jù)(5)的CHO細胞，其中！^是由下列(a)或(b)DNA編碼的蛋白(a)包括由SEQ ID NO 48描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)包括與SEQ ID NO 48描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有h活性的蛋白的DNA。(9)根據(jù)(5)的CHO細胞，其中！^是選自下列(a)、(b)和(c)的蛋白(a)包括由SEQ ID NO -J2描繪的氨基酸序列的蛋白；(b)包括在SEQ ID NO :72描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有&活性的蛋白；(c)包括與SEQ ID NO 72描繪的氨基酸序列至少有80%同源性的氨基酸序列并具有&活性的蛋白。(10)根據(jù)(5)的CHO細胞，其中所述的GFPP是由下列(a)或(b)DNA編碼的蛋白(a)包括由SEQ ID NO 51描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)與包括SEQ ID NO 51描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有GFPP活性的蛋白的DNA。(11)根據(jù)(5)的CHO細胞，其中所述的GFPP是選自下列(a)、(b)和(c)的蛋白(a)包括由SEQ ID NO 73描繪的氨基酸序列的蛋白；(b)包括在SEQ ID NO :73描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有GFPP活性的蛋白；(c)包括與SEQ ID NO 73描繪的氨基酸序列至少有80%同源性的氨基酸序列并具有GFPP活性的蛋白。(12)根據(jù)(4)的CHO細胞，其中涉及糖鏈修飾的酶是α _1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，糖鏈中，巖藻糖的1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖的6號位置在N-糖苷連接糖鏈復合體中在還原末端經(jīng)α-鍵連接。(13)根據(jù)(12)的CHO細胞，其中的α _1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由下列(a)或(b)DNA編碼的蛋白(a)包括由SEQ ID NO 1描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)與包括SEQ ID NO :1描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有α-1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA。(14)根據(jù)(12)的CHO細胞，其中所述的α_1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是選自下列 (a)、(b)和(c)的蛋白(a)包括由SEQ ID NO 23描繪的氨基酸序列的蛋白；(b)包括在SEQ ID NO :23描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；(c)包括與SEQ ID NO :23描繪的氨基酸序列至少有80%同源性的氨基酸序列，并具有α-1，6_巖藻糖基乳糖轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白。(15)根據(jù)(4)至(14)任一項的CHO細胞，其中的酶活性通過選自下列(a)、(b)、 (c)、(d)和(e)的技術被降低或去除(a)定向編碼該酶之基因的基因破壞技術；(b)導入編碼該酶之基因的顯性失活突變體的技術；(c)在酶中引入突變的技術；(d)抑制編碼該酶之基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的技術；(e)選擇抵抗凝血素的細胞系的技術，凝血素識別在N-糖苷連接糖鏈復合體中1 號位置的巖藻糖與6號位置的N-乙酰氨基葡萄糖在還原末端經(jīng)α -鍵連接的糖鏈。(16)根據(jù)(4)至(1 任一項的CHO細胞，它抵抗至少一種凝血素，凝血素識別在 N-糖苷連接糖鏈復合體中巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng) α-鍵連接的糖鏈。(17)根據(jù)(4)至(16)任一項的CHO細胞，它產(chǎn)生的抗體組合物較獲取自其親代 CHO細胞的抗體組合物具有更高的抗體依賴的細胞介導的細胞毒活性。(18)根據(jù)(17)的細胞，它產(chǎn)生的抗體組合物較一種抗體組合物具有更高的抗體依賴的細胞介導的細胞毒活性，在后者結(jié)合到Fc區(qū)的N-糖苷連接糖鏈總復合體中，巖藻糖沒有在糖鏈還原端與N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比率不足20%。(19)根據(jù)(18)的CHO細胞，其中其上沒有連接巖藻糖的糖鏈是N-糖苷連接糖鏈復合體，其中巖藻糖1號位置不與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。(20)產(chǎn)生抗體組合物的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)(1)至(19)中任一項的 CHO細胞以便在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和積累抗體組合物；并從培養(yǎng)物中回收抗體組合物。(21)用根據(jù)00)的方法產(chǎn)生的抗體組合物。(22)含有由CHO細胞產(chǎn)生的抗體分子的抗體組合物，抗體分子具有連接到Fc區(qū)的N-糖苷連接糖鏈復合體，其中在結(jié)合到該組合物Fc區(qū)的N-糖苷連接糖鏈總復合體中， 巖藻糖沒有在糖鏈還原端與N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比率為20%或更高。(23) 一種細胞，其中的酶活性通過基因工程技術被降低或消除，所述的酶活性涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，和/或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。(24)根據(jù)03)的細胞，其中涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖合成的酶是選自以下(a)、(b)和(C)的酶(a) GMD (⑶P-甘露糖4，6_脫氫酶)；(b)Fx (⑶P-酮-6-脫氧甘露糖3，5-差向異構酶4_還原酶)；(c) GFPP (⑶P- β -L-巖藻糖焦磷酸化酶)。(25)根據(jù)04)的細胞，其中所述的GMD是由下列(a)或(b)DNA編碼的蛋白(a)包括由SEQ ID NO 65描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)與包括SEQ ID NO 65描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有GMD活性的蛋白的DNA。(26)根據(jù)(24)的細胞，其中所述的GMD是選自以下(a)、(b)和(c)的蛋白(a) 包括SEQ ID NO :71描繪的氨基酸序列的蛋白；(b)包括在SEQ ID NO :71描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有GMD活性的蛋白；(c)包括與SEQ ID NO 71描繪的氨基酸序列至少有80%同源性的氨基酸序列并具有GMD活性的蛋白。(27)根據(jù)04)的細胞，其中所述的！^是由下列(a)或(b)DNA編碼的蛋白(a)包括SEQ ID NO 48描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)與包括SEQ ID NO 48描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有h活性的蛋白的DNA。(28)根據(jù)04)的細胞，其中所述的！^是選自下列(a)、(b)和(c)的蛋白(a)包括SEQ ID NO 72描繪的氨基酸序列的蛋白；(b)包括在SEQ ID NO :72描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有&活性的蛋白；(c)包括與SEQ ID NO 72描繪的氨基酸序列至少有80%同源性的氨基酸序列并具有&活性的蛋白。(29)根據(jù)04)的細胞，其中所述的GFPP是由下列(a)或(b)DNA編碼的蛋白(a)包括SEQ ID NO 51描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)與包括SEQ ID NO 51描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有GFPP活性的蛋白的DNA。(30)根據(jù)(24)的細胞，其中所述的GFPP是選自下列(a)、(b)和(c)的蛋白(a)包括SEQ ID NO 73描繪的氨基酸序列的蛋白；(b)包括在SEQ ID NO :73描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有GFPP活性的蛋白；(c)包括與SEQ ID NO 73描繪的氨基酸序列至少有80%同源性的氨基酸序列并具有GFPP活性的蛋白。(31)根據(jù)的細胞，其中涉及糖鏈修飾的酶是α ，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，糖鏈中巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。(32)根據(jù)(31)的細胞，其中所述的α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由選自下列(a)、 (b)、(c)和(d)的DNA編碼的蛋白(a)包括SEQ ID NO=I描繪的核苷酸序列的DNA ；
(b)包括SEQ ID NO 2描繪的核苷酸序列的DNA ；(c)與包括SEQ ID NO :1描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有α-1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA。(d)與包括SEQ ID NO :2描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有α-1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA。(33)根據(jù)(31)的細胞，其中的α-1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是選自下列(a)、(b)、 (c)、⑷、(e)和(f)的蛋白(a)包括SEQ ID NO 23描繪的氨基酸序列的蛋白；(b)包括SEQ ID NO 24描繪的氨基酸序列的蛋白；(c)包括在SEQ ID NO :23描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；(d)包括在SEQ ID NO : 描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有α-1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；(e)包括與SEQ ID NO :23描繪的氨基酸序列至少有80%同源性的氨基酸序列，并具有α-1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白。(f)包括與SEQ ID NO 描繪的氨基酸序列至少有80%同源性的氨基酸序列，并具有α-1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白。(34)根據(jù)03)至(33)任一項的細胞，其中的基因工程技術是選自以下(a)、(b)、 (c)和(d)的技術(a)定向編碼該酶之基因的基因破壞技術；(b)導入編碼該酶之基因的顯性失活突變體的技術；(c)在酶中引入突變的技術；(d)抑制編碼該酶之基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的技術。(35)根據(jù)至(34)任一項的細胞，對至少一種凝血素是抵抗的，凝血素識別 N-糖苷連接糖鏈中巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接的糖鏈。(36)根據(jù)03)至(35)任一項的細胞，細胞是選自以下(a)至(i)(a)來自中國倉鼠卵巢組織的CHO細胞；(b)大鼠骨髓瘤細胞系，YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 細胞；(c)小鼠骨髓瘤細胞系，NSO細胞；(d)小鼠骨髓瘤細胞系，SP2/0-Agl4細胞；(e)來自敘利亞倉鼠腎組織的BHK細胞；(f)產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞；(g)人白血病細胞系，Namalwa細胞；(h)胚胎干細胞；⑴受精卵細胞。(37)根據(jù)03)至(36)任一項的細胞，其中導入了編碼抗體分子的基因。(38)根據(jù)(37)的細胞，其中的抗體分子屬于IgG類。(39)產(chǎn)生抗體組合物的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)(37)或(38)的細胞以在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和積累抗體組合物；并從培養(yǎng)物中回收抗體組合物。(40)根據(jù)(39)的方法，它產(chǎn)生的抗體組合物較獲取自其親代細胞系的抗體組合物具有更高的抗體依賴的細胞介導的細胞毒活性。(41)用根據(jù)(39)或00)的方法產(chǎn)生的抗體組合物。(42)轉(zhuǎn)基因非人動物或植物或其后代，其含有基因組，該基因組被修飾從而使酶的活性被降低，所述的酶活性涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，和/或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接糖鏈中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。(43)根據(jù)0 的轉(zhuǎn)基因非人動物或植物或其后代，其中的一個基因被敲除，所述的基因編碼涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，和/或涉及編碼糖鏈修飾的酶，其中在N-糖苷連接的糖鏈中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng) α-鍵連接。(44)根據(jù)0 或的轉(zhuǎn)基因非人動物或植物或其后代，其中涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖合成的酶是選自以下(a)、(b)和(c)的酶(a) GMD (⑶P-甘露糖4，6_脫氫酶)；(b) Fx (⑶P-酮-6-脫氧甘露糖3，5-差向異構酶4-還原酶)；(c) GFPP (⑶P- β -L-巖藻糖焦磷酸化酶)。(45)根據(jù)04)的轉(zhuǎn)基因非人動物或植物或其后代，其中所述的GMD是由下列(a) 或(b) DNA編碼的蛋白(a)包括SEQ ID NO 65描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)與包括SEQ ID NO 65描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有GMD活性的蛋白的DNA。(46)根據(jù)04)的轉(zhuǎn)基因非人動物或植物或其后代，其中所述的h是由下列(a) 或(b) DNA編碼的蛋白(a)包括SEQ ID NO 48描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)與包括SEQ ID NO 48描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有h活性的蛋白的DNA。(47)根據(jù)04)的轉(zhuǎn)基因非人動物或植物或其后代，其中所述的GFPP是由下列 (a)或(b)DNA編碼的蛋白(a)包括SEQ ID NO 51描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)與包括SEQ ID NO 51描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有GFPP活性的蛋白的DNA。(48)根據(jù)0 或的轉(zhuǎn)基因非人動物或植物或其后代，其中涉及糖鏈修飾的酶是α -1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，所述的糖鏈中巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在N-糖苷連接糖鏈中的還原末端經(jīng)α-鍵連接。(49)根據(jù)08)的轉(zhuǎn)基因非人動物或植物或其后代，其中α _1，6_墨角藻糖基轉(zhuǎn)移酶是由選自下列(a)、(b)、(c)和(d)的DNA編碼的蛋白(a)包括SEQ ID NO=I描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)包括SEQ ID NO 2描繪的核苷酸序列的DNA ；
(c)與包括SEQ ID NO :1描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有α-1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA。(d)與包括SEQ ID NO 2描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有α-1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA。(50)根據(jù)0 至09)任一項的轉(zhuǎn)基因非人動物或植物或其后代，其中轉(zhuǎn)基因非人動物選自牛、綿羊、山羊、豬、馬、小鼠、大鼠、禽類、猴和兔。(51)產(chǎn)生抗體組合物的方法，該方法包括將編碼抗體分子的基因?qū)敫鶕?jù)G2) 至(50)任一項的轉(zhuǎn)基因非人動物或植物或其后代中；飼養(yǎng)該動物或植物；從飼養(yǎng)的動物或植物中分離含導入抗體的組織或體液；從分離的組織或體液中回收抗體組合物。(52)根據(jù)(51)的方法，其中所述的抗體分子屬于IgG類。(53)根據(jù)(51)或(5 的方法，它產(chǎn)生的抗體組合物較從基因組未被修飾的非人動物或植物或其后代獲取的抗體組合物具有更高的抗體依賴的細胞介導細胞毒活性。(54)采用根據(jù)(51)至(5 任一項的方法產(chǎn)生的抗體組合物。(55)含有根據(jù)01)、(22), (41)和(54)任一項的抗體組合物作為活性成分的藥物。(56)根據(jù)(5 的藥物，其中所述的藥物是診斷藥物、預防藥物或下列疾病的治療藥物腫瘤相關疾病、變態(tài)反應相關疾病、炎癥相關疾病、自身免疫性疾病、循環(huán)器官疾病、 病毒感染相關疾病或細菌感染相關疾病。(57)選自以下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、⑴和(j)的蛋白(a)含有SEQ ID NO 71描繪的氨基酸序列的蛋白；(b)包括在SEQ ID NO :71描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有GMD活性的蛋白；(c)含有SEQ ID NO -J2描繪的氨基酸序列的蛋白；(d)包括在SEQ ID NO :72描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有&活性的蛋白；(e)含有SEQ ID NO 73描繪的氨基酸序列的蛋白；(f)包括在SEQ ID NO :73描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有GFPP活性的蛋白；(g)含有SEQ ID NO 23描繪的氨基酸序列的蛋白；(h)包括在SEQ ID NO :23描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；(i)含有SEQ ID NO 24描繪的氨基酸序列的蛋白；(j)包括在SEQ ID NO : 描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白；(58)編碼根據(jù)(57)的蛋白的DNA。(59)選自以下(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的 DNA (a)含有SEQ ID NO 1描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)含有SEQ ID NO 2描繪的核苷酸序列的DNA ；(c)含有SEQ ID NO 65描繪的核苷酸序列的DNA ；
(d)含有SEQ ID NO 48描繪的核苷酸序列的DNA ；(e)含有SEQ ID NO 51描繪的核苷酸序列的DNA。(60)選自以下(a)、(b)和(c)的基因組DNA (a)含有SEQ ID NO 3描繪的核苷酸序列的基因組DNA ；(b)含有SEQ ID NO 67描繪的核苷酸序列的基因組DNA ；(c)含有SEQ ID NO 70描繪的核苷酸序列的基因組DNA。(61)同源重組的靶載體，其包括根據(jù)(58)至(60)任一項的全長DNA，或其一部分。按照本發(fā)明被導入了編碼抗體分子的基因的中國倉鼠卵巢組織來源的CHO細胞， 可以是任何CHO細胞，只要它是中國倉鼠卵巢組織來源的CHO細胞，其中導入了編碼抗體分子的基因，并產(chǎn)生含有結(jié)合到抗體分子Fc區(qū)的N-糖苷連接糖鏈復合體的抗體組合物，其中在該組合物內(nèi)結(jié)合到Fc區(qū)的N-糖苷連接糖鏈總復合體中，巖藻糖沒有在糖鏈還原末端與 N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比率是20%或更高。在本發(fā)明中，抗體分子包括任何分子，只要它含有抗體的Fc區(qū)。實例包括抗體、抗體片斷、含F(xiàn)c區(qū)的融合蛋白，等等。抗體是作為外源抗原刺激的結(jié)果，通過免疫反應在活體中產(chǎn)生的蛋白，并具有與抗原特異結(jié)合的活性。抗體的實例包括雜交瘤細胞分泌的抗體，雜交瘤細胞制備自用抗原免疫的動物脾細胞；通過基因重組技術制備的抗體，即通過將插入抗體基因的抗體表達載體導入宿主細胞中獲得的抗體；等等。特殊實例包括由雜交瘤產(chǎn)生的抗體、人源化抗體、人抗體等。雜交瘤是通過B細胞與來自小鼠等的骨髓瘤細胞間的細胞融合而獲得的細胞，能夠產(chǎn)生具有所需抗原特異性的單克隆抗體，B細胞是通過用抗原免疫除人以外的哺乳動物獲得的。人源化抗體的實例包括人嵌合抗體、人CDR-移植的抗體等。人嵌合抗體是包括以下部分的抗體，抗體重鏈可變區(qū)(下文被稱作“HV”或“VH”， 重鏈被稱作“H鏈”)和抗體輕鏈可變區(qū)(此后提作“LV”或“VL”，輕鏈是“L鏈”)的抗體， 兩者都是除人以外動物的，人抗體重鏈恒定區(qū)(下文也被稱作“CH”)和人抗體輕鏈恒定區(qū)(下文也被稱作“CL”)。作為除人以外的動物，可以使用任何動物如小鼠、大鼠、倉鼠、兔等，只要可以從中制備雜交瘤。人嵌合抗體可以通過以下步驟產(chǎn)生從產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤中獲得編碼VH 和VL的cDNA，將它們插入具有編碼人抗體CH和人抗體CL基因的宿主細胞表達載體中，從而構建人嵌合抗體表達載體，然后將此載體導入宿主細胞中以表達抗體。作為人嵌合抗體的CH，可以使用任何CH，只要它屬于人免疫球蛋白(下文被稱作 “hlg”)就可被使用。但那些屬于hlgG類者是優(yōu)選的，可以使用屬于hlgG類中的任一亞類如hIgGl、hIgG2、hIgG3和hIgG4。此外，作為人嵌合抗體的CL，可以使用任何CL，只要它屬于hlg類，還可以使用那些屬于κ類或λ類者。人CDR-移植的抗體是來自除人以外動物抗體VH和VL的CDR的氨基酸序列被移植進人抗體VH和VL的合適位置的抗體。人⑶R-移植的抗體可以通過以下步驟產(chǎn)生構建編碼V區(qū)的cDNA，其中來自除人以外動物抗體VH和VL的CDR被移植進人抗體VH和VL的CDR，將它們插入具有編碼人抗體CH和人抗體CL基因的宿主細胞表達載體中，從而構建人CDR-移植抗體的表達載體，然后將此表達載體導入宿主細胞中以表達人⑶R-移植的抗體。作為人⑶R-移植抗體的CH，可以使用任何CH，只要它屬于hlg，但hlgG類是優(yōu)選的，可以使用屬于hlgG類中的任一亞類如hlgGl、hIgG2、hIgG3和hIgG4。此外，作為人 CDR-移植抗體的CL，可以使用任何CL，只要它屬于hlg類，還可以使用那些屬于κ類或λ類者。人抗體是最初天然存在于人體內(nèi)的抗體，但也包括獲取自人抗體噬菌體文庫、產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物和產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因植物的抗體，它們是根據(jù)基因工程、細胞工程和發(fā)育工程技術的新近進展制備的。關于人體內(nèi)存在的抗體，通過分離人外周血淋巴細胞可以培養(yǎng)能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細胞，用EB病毒(埃-巴二氏病毒)等感染使之長期存在并克隆之，可以從培養(yǎng)物中純化抗體。人抗體噬菌體文庫中，通過將從人B細胞制備的抗體的編碼基因插入噬菌體基因中，使如Fab、單鏈抗體等的抗體片段在噬菌體表面表達。表達具有所需抗原結(jié)合活性的抗體片段的噬菌體，可以利用其與固定抗原的底物結(jié)合的活性作為標記物，從文庫中回收?？贵w片段可以通過基因工程技術被進一步轉(zhuǎn)換成由兩個全H鏈和兩個全L鏈組成的人抗體分子。產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因非人動物是人抗體基因被導入細胞中的動物。特別是，產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物可以通過如下制備將人抗體基因?qū)胄∈驟S細胞，將此ES細胞接種進其它小鼠的早期胚胎并培育之。通過將人嵌合抗體基因?qū)胧芫巡⑴嘤?，也可以制備轉(zhuǎn)基因動物。關于從產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物中制備人抗體的方法，采用通常在除人以外哺乳動物中進行的雜交瘤制備方法獲得產(chǎn)生人抗體的雜交瘤，然后培養(yǎng)它，可以在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和積累人抗體。轉(zhuǎn)基因非人動物的實例包括牛、綿羊、山羊、豬、馬、小鼠、大鼠、禽類、猴、兔等。此外，在本發(fā)明中，優(yōu)選的抗體是識別腫瘤相關抗原的抗體、識別過敏或炎癥相關抗原的抗體、識別循環(huán)器官疾病相關抗原的抗體、識別自身免疫病相關抗原的抗體或識別病毒或細菌感染相關抗原的抗體，且屬于IgG類的人抗體是優(yōu)選的?？贵w片段是含有抗體Fc區(qū)的片段?？贵w片段的實例包括H鏈單體、H鏈二聚體寸。含F(xiàn)c區(qū)的融合蛋白是含抗體Fc區(qū)的抗體或抗體片段與如酶、細胞因子等蛋白融合的成分。在本發(fā)明中，結(jié)合抗體分子Fc區(qū)的糖鏈的實例包括N-糖苷連接的糖鏈。N-糖苷連接糖鏈的實例包括復合型，其中核心結(jié)構的非還原末端具有一個或多個平行的半乳糖-N-乙酰氨基葡萄糖(下文被稱作“Gal-GlcNAc”)分支，Gal-GlcNAc的非還原末端具有的結(jié)構如唾液酸、對切的N-乙酰氨基葡萄糖等等。在一個抗體中，F(xiàn)c區(qū)具有N-糖苷連接的糖鏈結(jié)合的位置，這將在以后描述。因此， 每一個抗體分子連接兩個糖鏈。由于與抗體連接的N-糖苷連接的糖鏈包括任何具有結(jié)構式(I)所描繪的核心結(jié)構的糖鏈，與抗體連接的兩個N-糖苷連接的糖鏈可能有許多糖鏈組合。因此，物質(zhì)的同一性可以從結(jié)合到Fc區(qū)的糖結(jié)構角度來判斷。在本發(fā)明中，包括在Fc區(qū)具有N-糖苷連接糖鏈復合體的抗體分子組的組合物 (下文被稱作“本發(fā)明的抗體組合物”)，可以包括具有相同糖鏈結(jié)構的抗體或具有不同糖鏈結(jié)構的抗體，只要從該組合物中獲得本發(fā)明的作用。在本發(fā)明中，在與抗體組合物中包含的Fc區(qū)連接的N-糖苷連接的糖鏈總復合體中，巖藻糖不在糖鏈還原末端與N-乙酰氨基葡萄糖連接的糖鏈所占的比率，是巖藻糖不在糖鏈還原末端與N-乙酰氨基葡萄糖連接的糖鏈的數(shù)目與連接在組合物中包含的Fc區(qū)上的 N-糖苷連接糖鏈復合體的總數(shù)目的比值。在本發(fā)明中，巖藻糖不在N-糖苷連接糖鏈復合體的還原末端與N-乙酰氨基葡萄糖連接的糖鏈是巖藻糖不在N-糖苷連接糖鏈復合體的還原末端經(jīng)α -鍵與N-乙酰氨基葡萄糖連接的糖鏈。實例包括N-糖苷連接糖鏈復合體，其中巖藻糖1號位置不與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置經(jīng)α-鍵連接。當巖藻糖不在糖鏈還原端與N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈與結(jié)合到本發(fā)明抗體組合物包含的Fc功能區(qū)上的N-糖苷連接糖鏈總復合體的比率優(yōu)選為20%或更高、更優(yōu)選地25 %或更高、更加優(yōu)選地30 %或更高、極優(yōu)選地40 %或更高、最優(yōu)選50 %或更高時，抗體組合物顯示高的ADCC活性。隨抗體濃度的下降，ADCC活性下降，但甚至當抗體濃度低時仍可以獲得高的ADCC活性，只要巖藻糖不在糖鏈還原端與N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比率是20%或更高。巖藻糖不在組合物中包含的糖鏈還原端與N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比率可以通過以下步驟測定，所說的組合物包括在Fc區(qū)具有N-糖苷連接糖鏈復合體的抗體分子采用已知的方法如胼解作用、酶消化等[生物化學實驗方法23-糖蛋白糖鏈研究方法 (Japan Scientific Societies Press), Reiko Takahashi 編著(1989)]，從抗體分子中釋放糖鏈，對釋放的糖鏈進行熒光標記或放射性同位素標記，然后通過層析分離標記的糖鏈。 此外，還可以通過HPAED-PAD方法[J. Liq. Chromatogr.，6，1557(1983)]的分析測定釋放的糖鏈。在本發(fā)明中，中國倉鼠卵巢組織來源的CHO細胞包括從中國倉鼠(灰倉鼠)卵巢組織建立的細胞系的任何細胞。實例包括在下述文獻中描述的CHO細胞如，Journal of Experimental Medicine, 108,945(1958) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA,M' 1275 (1968)； Genetics, 55, 513 (1968) ；Chromosoma, 4j_, 129 (1973) ；Methods in Cell Science, 18,115(1996) ；Radiation Research,148 260 (1997) ；Proc, Natl.Acad. Sci. USA,77, 4216(1980) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA,60,1275(1968) ；Cell,6,121 (1975) ；Molecular Cell Genetics, Appendix I， II (pp. 883—900)；等。此夕卜，在 ATCC(The American Type Culture Collection)中注冊的 CH0-K1 (ATCC CCL-61)、DUXBll (ATCC CCL-9096)和 Pro-5(ATCCCCL-1781)，和可從商業(yè)獲得的 CHO-S (Life Technologies, Cat#11619)或通過采用各種媒介物改造細胞系獲得的亞細胞系，也可以被舉例。 在本發(fā)明中，涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖合成的酶可以是任何酶，只要它涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，作為糖鏈的巖藻糖供應源。涉及細胞內(nèi)糖核苷酸， GDP-巖藻糖合成的酶是對細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成有影響的酶。
細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖是通過從頭合成途徑或補救合成途徑供給的。因此，所有涉及合成途徑的酶類均包括在涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖合成的酶中。涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖從頭合成途徑的酶實例包括，GDP-甘露糖4， 6-脫氫酶(下文被稱作“GMD” )、⑶P-酮-6-脫氧甘露糖3，5-差向異構酶4-還原酶(下文被稱作“Fx”)等等。涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，⑶P-巖藻糖補救合成途徑的酶的實例包括，⑶Ρ_β -L-巖藻糖焦磷酸化酶(下文被稱作“GFPP” )、巖藻糖激酶等。作為對細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成有影響的酶，影響涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖合成的酶活性的酶和影響作為酶底物的物質(zhì)結(jié)構的酶也包括在內(nèi)。在本發(fā)明內(nèi)，GMD的實例包括由下列(a)或(b)的DNA編碼的蛋白(a)包括SEQ ID NO 65描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)與包括SEQ ID NO 65描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有GMD活性的蛋白的DNA，(c)包括SEQ ID NO 71描繪的氨基酸序列的蛋白，(d)包括在SEQ ID NO :71描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有GMD活性的蛋白，(e)包括與SEQ ID NO 71描繪的氨基酸序列至少有80%同源性的氨基酸序列并具有GMD活性的蛋白，等等。而且，編碼GMD氨基酸序列的DNA的實例包括含有SEQ IDNO 65描繪的核苷酸序列的DNA和與含有SEQ ID NO :65描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有 GMD活性的氨基酸序列的DNA。在本發(fā)明中，F(xiàn)x的實例包括由下列(a)或(b)的DNA編碼的蛋白(a)包括SEQ ID NO 48描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)與包括SEQ ID NO 48描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有h活性的蛋白的DNA，(c)包括SEQ ID NO ,12描繪的氨基酸序列的蛋白，(d)包括在SEQ ID NO :72描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有&活性的蛋白，(e)包括與SEQ ID NO 72描繪的氨基酸序列至少有80%同源性的氨基酸序列并具有&活性的蛋白，等等。而且，編碼h氨基酸序列的DNA的實例包括含有SEQ ID NO 48描繪的核苷酸序列的DNA和含有SEQ ID NO :48描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有h 活性的氨基酸序列的DNA。在本發(fā)明中，GFPP的實例包括由下列(a)或(b)的DNA編碼的蛋白(a)包括SEQ ID NO 51描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)與包括SEQ ID NO 51描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有GFPP活性的蛋白的DNA，
(c)包括SEQ ID NO 73描繪的氨基酸序列的蛋白，(d)包括在SEQ ID NO :73描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有GFPP活性的蛋白，(e)包括與SEQ ID NO 73描繪的氨基酸序列至少有80%同源性的氨基酸序列并具有GFPP活性的蛋白，等等。而且，編碼GFPP的氨基酸序列的DNA實例包括含有SEQ ID NO 51描繪的核苷酸序列的DNA和含有SEQ ID NO :51描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有 Fx活性的氨基酸序列的DNA。在本發(fā)明中，涉及N-糖苷連接糖鏈復合體中巖藻糖的1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖的6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接的糖鏈修飾的酶包括任何酶，只要它涉及N-糖苷連接糖鏈復合體中巖藻糖的1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖的6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接的反應。涉及N-糖苷連接糖鏈復合體中巖藻糖的1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖的6 號位置在還原末端經(jīng)α-鍵的連接反應的酶是指，對N-糖苷連接糖鏈復合體中巖藻糖的1 號位置與N-乙酰氨基葡萄糖的6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵的連接反應有影響的酶。涉及N-糖苷連接糖鏈復合體中巖藻糖的1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖的6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵的連接反應的酶的實例包括α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、α-L-巖藻糖苷酶等。而且，實例包括影響涉及N-糖苷連接的糖鏈復合體中巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵的連接反應的酶活性的酶，和影響作為酶底物的物質(zhì)結(jié)構的酶。在本發(fā)明中，α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的實例包括由下列(a)、(b)、(c)或(d)的DNA編碼的蛋白(a)包括SEQ ID NO=I描繪的核苷酸序列的DNA ；(b)包括SEQ ID NO 2描繪的核苷酸序列的DNA ；(c)與包括SEQ ID NO :1描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA;(d)與包括SEQ ID NO :2描繪的核苷酸序列的DNA在嚴格條件下雜交，并編碼具有α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白的DNA;(e)包括SEQ ID NO 23描繪的氨基酸序列的蛋白，(f)包括SEQ ID NO 24描繪的氨基酸序列的蛋白，(g)包括在SEQ ID NO :23描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有α -1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白，(h)包括在SEQ ID NO : 描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有α -1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白，(i)包括與SEQ ID NO :23描繪的氨基酸序列至少有80%同源性的氨基酸序列，并具有α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白，(j)包括與SEQ ID NO 描繪的氨基酸序列至少有80%同源性的氨基酸序列，并具有α-1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白，等等。而且，編碼α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的DNA實例包括含有SEQ IDNO :1或2描繪的核苷酸序列的DNA和與含有SEQ ID NO :1或2描繪的核苷酸序列的DNA 在嚴格條件下雜交，并編碼具有α -1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性的氨基酸序列的DNA。在本發(fā)明中，在嚴格條件下雜交的DNA是通過如下方法獲得的DNA，如集落雜交、 噬菌斑雜交或DNA印跡雜交，采用以下DNA作為探針如具有SEQ ID NO :1、2、48、51或65所描繪的核苷酸序列的DNA或其部分片段，并特別包括可以通過以下步驟被鑒定的DNA 采用固定有集落或噬菌斑來源的DNA片段的濾器，在存在0. 7至1. OM氯化鈉的情況下于65°C 進行雜交，然后用0. 1至2X SSC溶液(含150mM氯化鈉和15mM檸檬酸鈉的IX SSC溶液的組合物)在65°C沖洗濾器?？梢园凑找韵挛墨I中描述的方法進行雜交，如分子克隆，實驗室指南，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)(下文被稱作“分子克隆，第二版”)，分子生物學現(xiàn)代方法，John Wiley & Sons，1987-1997 (下文被稱作“分子生物學現(xiàn)代方法”)；DNA克隆1:核心技術，實踐方法，第二版，牛津大學(1995)；等?？呻s交的DNA 的實例包括與SEQ ID NO :1、2、48、51或65所描繪的核苷酸序列具有同源性的DNA，同源性至少60%或更高，優(yōu)選地70%或更高，更優(yōu)選地80%或更高，更加優(yōu)選地90%或更高，極優(yōu)選地95 %或更高，最優(yōu)選地98 %或更高。在本發(fā)明中，包括在SEQ ID NO :23、M、71、72或73所描繪的氨基酸序列中至少一個氨基酸被刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸序列，并具有α -1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性、GMD活性、Fx活性或GFPP活性的蛋白可以通過如下步驟獲得，例如在具有SEQ ID NO :1、2、65、48或51所描繪的氨基酸序列的蛋白的編碼DNA中分別導入定點突變，采用以下文獻中描述的定點誘變方法，如分子克隆，第二版；分子生物學現(xiàn)代方法；Nucleic Acids Research, 10,6487(1982) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) ；Gene, M' 315(1985) ；Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 488(1985)；等。要刪除、取代、插入和/或添加的氨基酸數(shù)目是一個或以上，此數(shù)目不是特別限定的，但該數(shù)目是通過已知技術如定點誘變可以被刪除、取代或添加的數(shù)目，例如是1 至數(shù)十，優(yōu)選地1至20，更優(yōu)選地1至10，最優(yōu)選地1至5。此外，為保持要在本發(fā)明中使用的蛋白的α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶活性、GMD 活性、Fx活性或GFPP活性，當采用分析軟件如BLAST [J. Mol. Biol. ,^5,403 (1990)]、 FASTA[Methods in Enzymology, 183,63 (1990)]等計算時，與 SEQ ID NO :23、24、71、72 或 73所描繪的氨基酸序列至少有80%或更高的同源性，優(yōu)選地85%或更高，更優(yōu)選地90%或更高，更加優(yōu)選地95%或更高，極優(yōu)選地97%或更高，最優(yōu)選地99%或更高。本發(fā)明的CHO細胞的實例包括其中的酶活性被降低或去除的細胞。其中的酶活性被降低或刪除的細胞包括，其中涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖合成的酶活性，或涉及糖鏈修飾的酶活性被降低或刪除的細胞，在糖鏈中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在N-糖苷連接糖鏈復合體的還原末端經(jīng)α-鍵連接。作為獲得這種細胞的方法，可以使用任何技術，只要它可以降低或去除目的酶的活性。降低或去除酶活性的技術實例包括(a)定向編碼酶的基因的基因破壞技術；(b)編碼酶的基因的顯性失活突變體的導入技術；(c)在酶中引入突變的技術；(d)抑制編碼酶的基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的技術；
(e)選擇抵抗凝集素的細胞系的技術，凝集素識別在N-糖苷連接的糖鏈復合體中巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接的糖鏈，等等。因此，可以通過以下方法獲得抗凝集素的細胞系在含有預定濃度凝集素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，然后選擇獲得這種特性的細胞系，即其存活率比親代細胞系具有統(tǒng)計顯著性的升高至少2倍，優(yōu)選地3倍，更優(yōu)選地5倍或更高。此外，還可以這樣獲得，在含有凝集素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，然后選擇凝集素濃度是其親代細胞系的至少2倍、優(yōu)選地5倍、更優(yōu)選地10倍、最優(yōu)選地20倍或以上的情況下，能夠以特定的存活率，如以80%存活率培養(yǎng)的細胞系。當凝集素識別在N-糖苷連接糖鏈中巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接的糖鏈結(jié)構時，可以使用任何能夠識別此糖鏈結(jié)構的凝集素。 實例包括兵豆(Lens culinaris)凝集素LCA(來自Lens culinaris的晶狀體凝集素)、 豌豆凝集素PSA (來自豌豆(Pisum sativum)的豌豆凝集素)、蠶豆凝集素VFA (來自蠶豆 (Viciafaba)的凝集素)、Aleuria aurantia 凝集素 AAL (來自 Aleuria aurantia 的凝集素)等。本發(fā)明的CHO細胞可以產(chǎn)生一種抗體組合物，同在應用降低或刪除目的酶活性的技術前親代CHO細胞所產(chǎn)生的抗體組合物相比，具有較高的ADCC活性。此外，本發(fā)明的CHO細胞可以產(chǎn)生一種抗體組合物，同其中巖藻糖不在糖鏈還原端結(jié)合到N-乙酰氨基葡萄糖上的糖鏈占與抗體組合物中含有的Fc功能區(qū)結(jié)合的N-糖苷連接糖鏈總復合體的比率不足20%的抗體組合物相比，具有較高的ADCC活性。被用于本發(fā)明的親代細胞系的實例是其中的酶活性沒有下降的細胞，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。特別地， 使用沒有被處理以降低或刪除酶活性的細胞，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。在本發(fā)明中，ADCC活性是細胞毒活性，其中結(jié)合到活體內(nèi)腫瘤細胞上細胞表面抗原上的抗體，經(jīng)抗體Fc區(qū)和效應細胞表面上存在的Fc受體激活效應細胞，從而阻礙腫瘤細胞等[單克隆抗體原理和應用，Wiley-Liss Jnc.，2. 1章(1955)]。效應細胞的實例包括殺傷細胞、自然殺傷細胞、活化的巨噬細胞等。本發(fā)明還涉及通過基因工程技術降低了其中酶活性的細胞(下文被稱作“本發(fā)明的宿主細胞”)，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。本發(fā)明的宿主細胞被用作產(chǎn)生具有高ADCC活性的抗體組合物的宿主細胞。本發(fā)明的宿主細胞可以是任何宿主，只要它可以表達抗體分子。實例包括酵母細胞、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等。細胞的實例包括將在后面第3項中的細胞。在動物細胞中，優(yōu)選的實例包括來自中國倉鼠卵巢組織的CHO細胞、大鼠骨髓瘤細胞系TO2/3HL. P2.G11. 16Ag. 20細胞、小鼠骨髓瘤細胞系NSO細胞、小鼠骨髓瘤SP2/0-Agl4細胞、來自敘利亞倉鼠腎組織的BHK細胞、產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞、人白血病細胞系Namalwa細胞、胚胎干細胞、受精卵細胞等。本發(fā)明在下面詳細描述。1.制備本發(fā)明的宿主細胞本發(fā)明的宿主細胞可以通過下列技術制備。(1)定向編碼酶基因的基因破壞技術本發(fā)明的宿主細胞可以采用基因破壞技術制備，該技術定向涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾的酶，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖 1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。涉及細胞內(nèi)糖核苷酸， ⑶P-巖藻糖合成的酶的實例包括GMD、Fx、GFPP、巖藻糖激酶等。涉及N-糖苷連接的糖鏈復合體中巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接的糖鏈修飾的酶的實例包括α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、α-L-巖藻糖苷酶等。這里所用的基因包括DNA和RNA?；蚱茐姆椒梢允侨魏畏椒?，只要它可以破壞所包括的靶酶的基因。實例包括反義方法、核酶方法、同源重組方法、RNA-DNA寡核苷酸法、RNAi法、應用逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法、應用轉(zhuǎn)座子的方法等。這些方法在下面特別地描述。(a)通過反義方法或核酶方法制備本發(fā)明的宿主細胞本發(fā)明的宿主細胞可以通過下面文獻中描述的核酶方法制備，Cell Technology, 12,239(1993) ；BIO/TECHNOLOGY, Γ7,1097(1999) ；Hum. Mol. Genet. ,5,1083(1995) ；Cell Technology,13, 255 (1994) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96，1886 (1999)；或類似的方法，如通過下面的定向酶的方式，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。制備編碼酶的cDNA或基因組DNA，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。測定制備的cDNA或基因組DNA的核苷酸序列。根據(jù)測定的DNA序列，設計合適長度的反義基因或含編碼酶的DNA部分或其一部分非翻譯區(qū)或內(nèi)含子的的核酶構建物，所述DNA編碼的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。為在細胞內(nèi)表達反義基因或核酶，通過將制備的DNA的片斷或全長插入合適的表達載體的啟動子下游中，制備重組載體。通過將重組載體導入適合表達載體的宿主細胞中獲得轉(zhuǎn)化體。通過根據(jù)酶活性選擇轉(zhuǎn)化體可以獲得本發(fā)明的宿主細胞，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖 1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。還可以根據(jù)細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構或產(chǎn)生的抗體分子的糖鏈結(jié)構，通過選擇轉(zhuǎn)化體而獲得本發(fā)明的宿主細胞。作為用于產(chǎn)生本發(fā)明宿主細胞的宿主細胞，可以使用任何細胞如酵母、動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞，只要它具有編碼靶酶的基因，所述的靶酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸， GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。實例包括將在后面第3項中描述的宿主細胞。作為表達載體，使用的載體可在宿主細胞中自主復制或被整合進染色體中，并在設計的反義基因或核酶可以被傳遞的位置含有啟動子。實例包括將在后面第3項中描述的表達載體。關于將基因引導進各種宿主細胞的方法，可以使用將在后面第3項中描述的、導入適合各種宿主細胞的重組載體的方法。下面的方法可以作為根據(jù)酶活性選擇轉(zhuǎn)化體的方法而被舉例，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。詵擇轉(zhuǎn)化體的方法細胞選擇方法的實例包括下列文獻中描述的生物化學方法或基因工程技術 新生物化學實驗系列3-糖類I，糖蛋白(New Biochemical Experimentation Series 3-Saccharides I，Glycoprotein) (Tokyo Kagaku Doj in)，由日本生物化學會編著 (1988)；細胞工程，增補，實驗方法系列，糖生物學實驗方法，糖蛋白，糖脂和蛋白聚糖 (Shujun-sha)， Naoyuki Taniguchi, Akemi Suzuki, Kiyoshi Furukawa 禾口 Kazuyuki Sugawara編著(1996)；分子克隆，第二版；分子生物學現(xiàn)代方法；等，所選細胞中的酶活性是下降的，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在 N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。生物化學方法的實例包括采用酶特異的底物評價酶活性的方法等?；蚬こ碳夹g的實例包括Northern分析(RNA印跡分析)、逆轉(zhuǎn)錄酶-多聚酶鏈式反應(RT-PCR) 等，它測量編碼酶的基因的mRNA的量。根據(jù)細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構選擇轉(zhuǎn)化體的方法的實例包括將在后面第1(5) 項中描述的方法。根據(jù)產(chǎn)生的抗體分子的糖鏈結(jié)構選擇轉(zhuǎn)化體的方法的實例包括將在后面第5和6項中描述的方法。作為編碼酶的cDNA的制備方法以下面的方法為例，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。DNA 的制備從人或非人動物的組織或細胞中制備總RNA或mRNA。從制備的總RNA或mRNA建立cDNA文庫。根據(jù)酶的氨基酸序列產(chǎn)生簡并引物，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接，采用建立的cDNA文庫作為模板通過PCR獲得編碼酶的基因片段，所述的基因片段編碼的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成， 或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。
采用獲得的基因片段作為探針，通過篩選cDNA文庫可以獲得編碼酶的DNA，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。關于人或非人組織或細胞的mRNA，可以使用商業(yè)購得的產(chǎn)品(如由Clontech生產(chǎn)的)，或可以從人或非人動物組織或細胞中以下面的方式制備。從人或非人動物組織或細胞中制備總RNA的方法的實例包括，硫氰酸胍-三氟醋酸銫法[Methods in Enzymology,154, 3 (1987)]、酸性硫氰酶胍酚氯仿(AGPC)法[Analytical Biochemistry, 162,156 (1987)； Experimental Medicine,9,1937(1991)]等。此外，從總RNA制備mRNA為poly (A) +RNA的方法的實例包括寡聚(dT)固定化纖維素柱法(分子克隆，第二版)等。另外，mRNA可以采用試劑盒制備，如Fast Track mRNA分離試劑盒(Invitrogen制造)、Quick Prep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制造)或類似試劑盒。cDNA文庫是從制備的人或非人動物組織或細胞的mRNA中建立的。建立cDNA文庫的方法的實例包括下面文獻中所描述的方法分子克隆，第二版；分子生物學現(xiàn)代方法；實驗室指南，第二版(1989)；等，或采用商業(yè)購買試劑盒的方法如用于cDNA合成的 SuperScript Plasmid System 禾口 Plasmid Cloning (Life Technologies 制造)、ZAP-cDNA 合成試劑盒(STRATAGENE制造)等。作為用于建立cDNA文庫的克隆載體，可以使用任何載體如噬菌體載體、質(zhì)粒載體、或類似載體，只要它在大腸桿菌K12中可自主復制。實例包括ZAP Express [STRATAGENE 制造，Strategies，互，58 (1992)]，pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)]、λ ZAP II (STRATAGENE 制造)，XgtlOiP Xgtll [DNA Cloning, A Practical Approach,!,49(1985)], λ TriplEx (Clontech 制造)，λ ExCell(Pharmacia 制造)， pcD2 [Mol. Cell. Biol. ,3, 280 (1983) ]，pUC18 [Gene, 33,103 (1985)]等。任何微生物可以被用作宿主微生物，但大腸桿菌是優(yōu)選使用的。實例包括大腸桿菌 XLl-Blue MRF，[STRATAGENE 制造，Strategies, 5,81 (1992)]，大腸桿菌 C600 [Genetics, 39,440 (1954)]，大腸桿菌 Y1088 [Science, 222, 778 (1983)]，大腸桿菌 Y1090 [Science, 222,778(1983)1、大腸桿菌 NM522 [J. Mol. Biol.，166，1 (1983) 1，大腸桿菌 K802 [J. Mol. Biol. ,16,118 (1966)]，大腸桿菌 JM105 [Gene, 38, 275 (1985)]等。cDNA文庫可被用在如隨后的分析中，且為了通過減少非全長cDNA的比例而盡可能有效地獲得全長cDNA，由Sugano等人開發(fā)的寡聚帽方法制備的cDNA文庫Wene，！^， 171 (1994) ;Gene,200,149(1997) ；Protein, Nucleic Acid and Protein,41,603 (1996)； Experimental Medicine, 11, 2491 (1993) ；cDNA 克隆(Yodo-sha) (1996)；制備基因文庫的方法(Yodo-sha) (1994)]可被用于下面的分析中。根據(jù)酶的氨基酸序列制備對推測的編碼該氨基酸序列的核苷酸序列的5’ -末端和3’ -末端特異的簡并引物，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接，采用制備的cDNA文庫作為模板通過PCR[PCR方法，Academic Press (1990)]擴增DNA，以獲得編碼酶的基因片段，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。通過通常用于核苷酸分析的方法，如Sanger等人的雙脫氧方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74' 5463 (1977)]、核苷酸序列分析儀如 ABIPRISM 377DNA 測序儀(PE Biosystems制造)或類似的方法，可以確定所獲得的基因片段是編碼酶的DNA，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。通過對從人或非人動物組織或細胞中含有的mRNA合成的cDNA或cDNA文庫進行集落雜交或噬菌斑雜交(分子克隆，第二版)，采用基因片段作為DNA探針，可以獲得編碼酶的DNA，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在 N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng) α-鍵連接。此外，采用從人或非人動物組織或細胞中含有的mRNA合成的cDNA或cDNA文庫作為模板，并采用獲取編碼酶的基因片段所使用的引物，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸， GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接，通過PCR進行篩選，也可以獲得編碼酶的DNA，其中所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾， 其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。獲得的編碼酶的DNA的核苷酸序列，從其末端開始分析，并通過通常用于核苷酸分析的方法，如 Sanger 等人的雙脫氧方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 5463 (1977) ] 苷酸序列分析儀如ABIPRISM 377DNA測序儀(PE Biosystems制造)或類似的方法來確定， 所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。通過搜索核苷酸序列數(shù)據(jù)庫如GenBank、EMBL、DDBJ等，采用同源性檢索程序如以確定的cDNA核苷酸序列為基礎的BLAST，也可以從數(shù)據(jù)庫中的基因確定編碼酶的基因，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。通過本方法獲得的基因的核苷酸序列實例包括由SEQ ID NO :48,51或65所描繪的核苷酸序列，所述的基因編碼涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖合成的酶。基因的核苷酸序列的實例包括由SEQ ID NO :1或2所描繪的核苷酸序列，所述的基因編碼涉及N-糖苷連接的糖鏈復合體中巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接的糖鏈修飾的酶。用DNA合成儀如Perkin Elmer生產(chǎn)的392型DNA合成儀或類似儀器，采用亞磷酰胺(phosphamidite)方法，根據(jù)確定的DNA核苷酸序列，也可以獲得編碼酶的cDNA，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。作為制備基因組DNA的方法的實例，下面描述的方法是舉例說明的，所述的基因組DNA編碼的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接?；蚪MDNA的制備制備基因組DNA的方法實例包括下面文獻中描述的已知方法分子克隆，第二版； 分子生物學現(xiàn)代方法；等。此外，基因組DNA也可以采用試劑盒分離，如Genome DNA Library Screening System (Genome Systems 制造)、Universal GenomeWalker 試齊[J盒(CLONTECH 制造)或類似試劑盒，所述的基因組DNA編碼的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。通過本方法獲得的基因組DNA核苷酸序列的實例包括由SEQ ID NO 67或70所描繪的核苷酸序列，所述的基因組DNA編碼涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖合成的酶?；蚪MDNA核苷酸序列的實例包括由SEQ ID NO :3所描繪的核苷酸序列，所述的基因組DNA 編碼涉及N-糖苷連接的糖鏈復合體中巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接的糖鏈修飾的酶。此外，本發(fā)明的宿主細胞也可以不采用表達載體而通過直接引導反義寡核苷酸或核糖酶進入宿主細胞來獲得，反義寡核苷酸或核糖酶是根據(jù)編碼酶的核苷酸序列設計的， 所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。反義寡核苷酸或核糖酶可以用通常的方法或采用DNA合成儀來制備。特別是，可以根據(jù)具有cDNA和基因組DNA的核苷酸序列中連續(xù)的5至150個堿基、優(yōu)選地5至60個堿基、更優(yōu)選地10至40個堿基的相應序列的寡核苷酸的序列信息，通過合成對應于該寡核苷酸(反義寡核苷酸)或含該寡核苷酸序列的核糖酶的互補序列的寡核苷酸來制備，所述 cDNA和基因組DNA編碼的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。寡核苷酸的實例包括寡聚RNA和該寡核苷酸的衍生物(下文被稱作“寡核苷酸衍生物”)。寡核苷酸衍生物的實例包括，寡核苷酸中磷酸二酯鍵更換為磷硫胺鍵者、寡核苷酸中磷酸二酯鍵更換成Ν3’ -Ρ5’磷酸胺鍵者、寡核苷酸中核糖和磷酸二酯鍵更換為肽-核酸鍵者、寡核苷酸中尿嘧啶被替換成C-5丙炔尿嘧啶者、寡核苷酸中尿嘧啶被替換成C-5噻唑尿嘧啶者、寡核苷酸中胞嘧啶被替換成C-5丙炔胞嘧啶者、寡核苷酸中胞嘧啶被替換成吩嗪修飾的胞嘧啶者、寡核苷酸中核糖被替換成2’ -0-丙基核糖者和寡核苷酸中核糖被替換成 2，-甲氧基乙氧基核糖者[Cell Technology, 16,1463 (1997) ] 0(b)通過同源重組制備本發(fā)明的宿主細胞采用編碼酶的基因作為靶基因，經(jīng)同源重組技術通過修飾染色體上的靶基因，可以產(chǎn)生本發(fā)明的宿主細胞，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。
染色體上的靶基因可以通過采用以下文獻中描述的方法被修飾操作鼠胚胎(Manipulating the Mouse Embryo),實驗室指南，第二 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)(下文被稱作“操作鼠胚胎，實驗室指南”)；基因靶向(Gene Targeting)，實踐方法，IRL Press at Oxford University Press (1993)；生物指南系列 8， 基因革巴向，用 ES 細胞制備突變鼠(Gene Targeting, Preparation of Mutant Mice using ES Cells)，Yodo-sha(1995)(下文被稱作“生物指南系列8，基因靶向，用ES細胞制備突變鼠”)；或類似文獻，例如下面所述。制備基因組DNA，它編碼的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。根據(jù)基因組DNA的核苷酸序列，制備靶載體以同源重組要被修飾的靶基因(如，酶的結(jié)構基因或啟動子基因，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接)。通過引導制備的靶載體進入宿主細胞，并選擇在靶基因和靶載體之間發(fā)生同源重組的細胞，可以產(chǎn)生本發(fā)明的宿主細胞。作為宿主細胞，可以使用任何細胞如酵母、動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞，只要它具有編碼酶的基因，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。實例包括將在后面第3項中描述的宿主細胞。制備基因組DNA的方法的實例包括在第1 (1) (a)項中制備基因組DNA中描述的方法等，基因組DNA編碼的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接?；蚪MDNA核苷酸序列的實例包括由SEQ ID NO 67或70所描繪的核苷酸序列， 基因組DNA編碼涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖合成的酶。基因組DNA核苷酸序列的實例包括由SEQ ID NO :3所描繪的核苷酸序列，所述基因組DNA編碼涉及N-糖苷連接的糖鏈復合體中巖藻糖的1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖的6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接的糖鏈修飾的酶。用于同源重組靶基因的靶載體可以按照下面文獻中描述的方法制備基因靶向， 實踐方法，IRL Press at Oxford University Press (1993)；生物指南系列8，基因靶向，用 ES細胞制備突變鼠，Yodo-sha(1995)(下文被稱作“生物指南系列8，基因靶向，用ES細胞制備突變鼠”)；或類似文獻。靶載體可被用作替換型或插入型。為引導靶載體進入各種宿主細胞，可以使用將在后面第3項中描述的、引導適合各種宿主細胞的重組載體的方法。有效地選擇同源重組體的方法實例包括下列方法如，陽性選擇、啟動子選擇、陰性選擇或在下面文獻中描述的PolyA選擇基因靶向，實踐方法，IRL Press at Oxford University Press (1993)；生物指南系列8，基因靶向，用ES細胞制備突變鼠， Yodo-sha(1995)；或類似文獻。從選擇的細胞系中選擇目的同源重組體的方法的實例包括基因組DNA的DNA印跡雜交方法(分子克隆，第二版)、PCR[PCR方法，Academic Press (1990)]等。(c)通過RDO方法制備本發(fā)明的宿主細胞例如，本發(fā)明的宿主細胞可以通過如下的RD0(RNA_DNA寡核苷酸)方法，通過靶向編碼酶的基因而制備，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。制備編碼酶的cDNA或基因組DNA，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。檢測制備的cDNA或基因組DNA的核苷酸序列。根據(jù)檢測的DNA序列，設計和合成含DNA部分或其一部分非翻譯區(qū)或內(nèi)含子的合適長度的RDO構建物，所述DNA部分編碼的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖 6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。本發(fā)明的宿主細胞可以通過引導合成的RDO進入宿主細胞，然后選擇在靶酶中發(fā)生突變的轉(zhuǎn)化體，靶酶就是涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖合成的酶，或涉及N-糖苷連接的糖鏈復合體中巖藻糖的1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖的6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接的糖鏈修飾的酶。作為宿主細胞，可以使用任何細胞如酵母、動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞，只要它具有編碼靶酶的基因，靶酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾， 其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。實例包括將在后面第3項中描述的宿主細胞。引導RDO進入各種宿主細胞的方法的實例包括引導適合各種宿主細胞的重組載體的方法，它將在后面第3項中描述。制備cDNA的方法的實例包括在第1(1) (a)項中制備DNA中描述的方法等，cDNA編碼的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。制備基因組DNA的方法的實例包括在第1 (1) (a)項中制備基因組DNA中描述的方法等，基因組DNA編碼的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖的1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖的6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。DNA的核苷酸序列可以通過以下步驟檢測用合適的限制酶消化DNA，將其片段克隆進質(zhì)粒如pBluescript SK(-) (Mratagene制造)或類似者中，對克隆進行通常用作核苷酸序列分析方法的反應，如Sanger等人的雙脫氧法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)]或類似方法，然后用自動核苷酸序列分析儀如A. L. F. DNA測序儀(Pharmacia 制造)或類似儀器分析該克隆。RDO可以通過通常的方法或應用DNA合成儀制備。通過引導ROD進入宿主細胞而在編碼涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，⑶P-巖藻糖的合成，或涉及N-糖苷連接的糖鏈復合體中巖藻糖的1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖的6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接的糖鏈修飾酶的基因中選擇發(fā)生突變的細胞的方法實例包括在分子克隆，第二版、分子生物學現(xiàn)代方法等中描述的直接檢測染色體基因突變的方法；在1(1) (a)項中描述的經(jīng)評價導入的酶活性而選擇轉(zhuǎn)化體的方法，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接；采用以后將在1 項中描述的細胞膜上糖蛋白的糖結(jié)構而選擇轉(zhuǎn)化體的方法；和根據(jù)以后將在5或6 項中描述的產(chǎn)生的抗體分子的糖結(jié)構而選擇轉(zhuǎn)化體的方法，等。ROD構建物可以按照下面文獻中描述的方法設計Science，@，1386(1996)； Nature Medicine, 4, 285 (1998) ；Hepatology, 25, 1462 (1997) ；Gene Therapy, 5^. 1960(1999) ;J. Mol. Med. ,75,829(1997) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 8774 (1999)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 8768 (1999) ；Nuc. Acids. Res. ,27,1323 (1999) ；Invest. Dematol. ,111,1172(1998) ；Nature Biotech.,16,1343(1998) ；Nature Biotech. ,18, 43(2000) ；Nature Biotech. ,18,555(2000)；等。(d)通過RNAi方法制備本發(fā)明的宿主細胞例如，本發(fā)明的宿主細胞可以通過如下的RNAi (RNA干預)方法，通過靶向編碼酶的基因而制備，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。制備編碼酶的cDNA，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。檢測制備的cDNA的核苷酸序列。根據(jù)檢測的DNA序列，設計含DNA編碼部分或其一部分非翻譯區(qū)的合適長度的 RNAi基因構建物，所述DNA編碼部分編碼的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖 6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。為在細胞內(nèi)表達RNAi基因，通過將制備的DNA的片段或全長插入到合適的表達載體的啟動子下游中而制備重組載體。通過引導重組載體進入適合表達載體的宿主細胞中獲得轉(zhuǎn)化體。通過根據(jù)酶的活性、或細胞膜上糖蛋白或產(chǎn)生的抗體分子的糖鏈結(jié)構選擇轉(zhuǎn)化體，可以獲得本發(fā)明的宿主細胞，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6 號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。作為宿主細胞，可以使用任何細胞如酵母、動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞，只要它具有編碼靶酶的基因，靶酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾， 其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。實例包括將在后面第3項中描述的宿主細胞。作為表達載體，使用可在宿主細胞中自主復制的載體，或可以被整合進染色體并在設計的RNAi基因可以被傳遞的位置上含有啟動子的載體。實例包括將在后面第3項中描述的表達載體。作為將基因?qū)敫鞣N宿主細胞中的方法，可以使用將在后面第3項中描述的、引導適合各種宿主細胞的重組載體的方法。根據(jù)酶的活性選擇轉(zhuǎn)化體的方法實例包括1 (1) (a)項中描述的方法，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。根據(jù)細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構選擇轉(zhuǎn)化體的方法的實例包括將在后面1 (5)項中描述的方法。根據(jù)產(chǎn)生的抗體分子的糖鏈結(jié)構選擇轉(zhuǎn)化體的方法的實例包括將在后面5 或6項中所描述的方法。制備cDNA的方法的實例包括在第1(1) (a)項中制備DNA中描述的方法等，cDNA編碼的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。此外，本發(fā)明的宿主細胞也可以不采用表達載體而通過直接導入RNAi基因來獲得，RNAi基因是根據(jù)編碼酶的核苷酸序列設計的，酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。RNAi基因可以通過通常的方法或應用DNA合成儀制備。RNAi基因構建物可以按照以下文獻中描述的方法來設計Nature，391 806(1998) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA,95,15502 (1998) ；Nature, 395,854(1998) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 5049 (1999) ；Cell,95,1017(1998) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96,1451 (1999) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA,95,13959(1998) ；Nature Cell Biol. ,2, 70(2000)；等。(e)采用轉(zhuǎn)座子方法制備本發(fā)明的宿主細胞本發(fā)明宿主細胞的制備可以通過，采用Nature Genet. ,25,35(2000)或類似文獻中描述的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)誘導突變，然后根據(jù)酶的活性、或細胞膜上或產(chǎn)生的抗體分子的糖蛋白糖鏈結(jié)構選擇突變體，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是通過在染色體中隨機插入一個外源基因而誘導突變的系統(tǒng)，其中在轉(zhuǎn)座子之間插入的外源基因通常被用作誘導突變的載體，且隨機地在染色體中插入基因的轉(zhuǎn)座酶表達載體被同時導入細胞中?？梢允褂萌魏无D(zhuǎn)座酶，只要它適合于所要使用的轉(zhuǎn)座子的序列。作為外源基因，可以使用任何基因，只要它能夠在宿主細胞DNA中誘導突變。作為宿主細胞，可以使用任何細胞如酵母、動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞，只要它具有編碼靶酶的基因，靶酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾， 其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。實例包括將在后面第3項中描述的宿主細胞。為引導基因進入各種宿主細胞，可以使用將在后面第3項中描述的、引導適合各種宿主細胞的重組載體的方法。
根據(jù)酶的活性選擇突變體的方法的實例包括1 (1) (a)項中描述的方法，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。根據(jù)細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構選擇突變體的方法的實例包括將在后面1(5)項中描述的方法。根據(jù)產(chǎn)生的抗體的糖鏈結(jié)構選擇突變體的方法的實例包括將在后面5或6 項中所描述的方法。(2)導入編碼酶的基因的顯性失活突變體的方法采用導入酶的顯性失活突變體的技術，通過靶向編碼酶的基因可以制備本發(fā)明的宿主細胞，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在 N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng) α -鍵連接。涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，⑶P-巖藻糖合成的酶的實例包括GMD、Fx、GFPP、墨角藻糖激酶等。涉及N-糖苷連接的糖鏈復合體中巖藻糖1號位置的與N-乙酰氨基葡萄糖的 6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接的糖鏈修飾的酶的實例包括α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、 α-L-巖藻糖苷酶等。酶催化具有底物特異性的特異性反應，酶的顯性失活突變體可以通過破壞酶的活性中心而制備，要破壞的酶催化具有底物特異性的催化活性。制備顯性失活突變體的方法如下特別地參考靶酶中的GMD來描述。作為大腸桿菌來源的GMD三維結(jié)構的分析結(jié)果，已經(jīng)顯示，4個氨基酸(133位置的蘇氨酸、135位置的谷氨酸、157位置的酪氨酸和161位置的賴氨酸)對酶的活性具有重要作用(MrUctUre，§，2，2000)。也就是說，根據(jù)三維結(jié)構信息，當用其它不同的氨基酸取代這 4個氨基酸制備突變體時，所有突變體的酶活性均顯著地下降。另一方面，在突變體中，GMD 與GMD輔酶NADP和其底物GDP-甘露糖的結(jié)合能力的改變幾乎觀察不到。因此，顯性失活突變體可以通過取代控制GMD酶活性的4個氨基酸來制備。例如，CHO細胞來源的GMD (SEQ ID NO 65)中，顯性失活突變體的制備可以通過，用其它氨基酸取代155位置的蘇氨酸、157 位置的谷氨酸、179位置的酪氨酸和183位置的賴氨酸，采用根據(jù)大腸桿菌來源的GMD結(jié)果的氨基酸序列信息比較同源性并預測三維結(jié)構。被引入氨基酸取代的這種基因可以通過下面文獻中所描述的定點誘變而制備分子克隆，第二版，分子生物學現(xiàn)代方法或類似文獻。本發(fā)明的宿主細胞可以按照分子克隆，第二版，分子生物學現(xiàn)代方法或類似文獻中所描述的方法，采用制備的靶酶的顯性失活突變體基因來制備，舉例如下。制備編碼酶的顯性失活突變體的基因(下文被稱作“顯性失活突變體基因”)，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。如果必要，根據(jù)制備的顯性失活突變體基因的全長DNA，制備含有編碼蛋白部分的合適長度的DNA片段。通過將DNA片段或全長DNA插入適當表達載體的啟動子下游，產(chǎn)生了重組載體。通過引導重組載體進入適于表達載體的宿主細胞獲得了轉(zhuǎn)化體。通過根據(jù)酶的活性、或細胞膜上或產(chǎn)生的抗體分子的糖蛋白糖鏈結(jié)構選擇轉(zhuǎn)化體，可以制備本發(fā)明的宿主細胞，所述的酶活性涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成， 或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。作為宿主細胞，可以使用任何細胞如酵母、動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞，只要它具有編碼靶酶的基因，靶酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾， 其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。實例包括將在后面第3項中描述的宿主細胞。作為表達載體，使用可在宿主細胞中自主復制的載體，或可以被整合進染色體并在DNA轉(zhuǎn)錄可以被影響的位置上含有啟動子的載體，所述DNA編碼目的顯性失活突變體。實例包括將在后面第3項中描述的表達載體。為將基因?qū)敫鞣N宿主細胞，可以使用將在后面第3項中描述的、引導適合各種宿主細胞的重組載體的方法。根據(jù)酶的活性選擇轉(zhuǎn)化體的方法實例包括1 (1) (a)項中描述的方法，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。根據(jù)細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構選擇轉(zhuǎn)化體的方法實例包括將在后面1(5)項中描述的方法。根據(jù)產(chǎn)生的抗體分子的糖鏈結(jié)構選擇轉(zhuǎn)化體的方法實例包括將在后面5或6 項中所描述的方法。(3)在酶中引入突變的方法本發(fā)明宿主細胞的制備可以通過，在編碼酶的基因中引入突變，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中， 巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接，然后選擇該酶中發(fā)生了突變的目的細胞系。涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，⑶P-巖藻糖合成的酶的實例包括GMD、Fx、GFPP、墨角藻糖激酶等。涉及N-糖苷連接的糖鏈復合體中1號位置的巖藻糖與6號位置的N-乙酰氨基葡萄糖在還原末端經(jīng)α -鍵連接的糖鏈修飾的酶的實例包括α -1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、α _L_巖藻糖苷酶等。方法的實例包括1)從用誘變劑對親代細胞系進行突變誘導處理獲得的突變體或自發(fā)產(chǎn)生的突變體中，根據(jù)酶的活性選擇所需細胞系的方法，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接，幻從用誘變劑對親代細胞系進行誘變處理獲得的突變體或自發(fā)產(chǎn)生的突變體中，根據(jù)產(chǎn)生的抗體分子的糖鏈結(jié)構選擇所需細胞系的方法，和幻從用誘變劑對親代細胞系進行誘變處理獲得的突變體或自發(fā)產(chǎn)生的突變體中，根據(jù)細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構選擇所需細胞系的方法。作為突變誘導處理，可以使用任何處理，只要它可以在親代細胞系的細胞DNA中誘導點突變或刪除或移碼突變。實例包括用乙基亞硝基脲、亞硝基胍、苯并芘或吖啶顏料處理以及用放射處理。此外，各種烷基化試劑和致癌物可以被用作誘變劑。使誘變劑作用在細胞上的方法的實例包括以下文獻中描述的方法組織培養(yǎng)技術，第3版(Asakura Shoten)，由Japanese Tissue Culture Association 編著(1996), Nature Genet，M，314 QOOO)，等。自發(fā)產(chǎn)生的突變體的實例包括在通常的細胞培養(yǎng)條件下，不使用特殊的突變誘導
30處理，通過連續(xù)傳代培養(yǎng)而自發(fā)形成的突變體。檢測酶活性的方法的實例包括1 (1) (a)項中描述的方法，所述的酶活性涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。識別制備的抗體分子的糖鏈結(jié)構的方法的實例包括將在后面5或6項中描述的方法。識別細胞膜上糖蛋白的糖鏈結(jié)構的方法的實例包括將在后面1(5)項中描述的方法。(4)抑制編碼酶的基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的方法本發(fā)明的宿主細胞可以通過抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯而制備，采用的方法如反義 RNA/DNA 技術[Bioscience and Industry, 50 322 (1992) ；Chemistry, 46 681(1991) ；Biotechnology,9,358(1992) ；Trendsin Biotechnology,10,87(1992) ；Trends in Biotechnology, 10,152 (1992) ；Cell Engineering，叢，1463 (1997)]，三重螺旋技術 [Trends in Biotechnology,10,132 (1992)]或類似方法，采用編碼酶的基因作為靶標，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，⑶P-巖藻糖合成的酶的實例的包括GMD、Fx、GFPP、墨角藻糖激酶等。涉及N-糖苷連接的糖鏈復合體中巖藻糖的1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖的 6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接的糖鏈修飾的酶的實例包括α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、 α-L-巖藻糖苷酶等。(5)選擇抗凝集素的細胞系的方法，凝集素識別在N-糖苷連接的糖鏈中巖藻糖1 號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接的糖鏈結(jié)構本發(fā)明的宿主細胞可以通過采用選擇抵抗植物凝血素的細胞系的方法而制備，植物凝血素識別在N-糖苷連接的糖鏈中巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接的糖鏈結(jié)構。選擇抗凝集素的細胞系的方法的實例包括，在Somatic Cell Mol. Genet. ,12, 51(1986)等中描述的，采用凝集素的方法，凝集素識別在N-糖苷連接的糖鏈中巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接的糖鏈結(jié)構。作為凝集素，可以使用任何凝集素，只要它是識別在N-糖苷連接的糖鏈中巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接的糖鏈結(jié)構的凝集素。實例包括，Lens culinaris 凝集素LCA(來自Lens culinaris的扁豆凝集素)、豌豆凝集素PSA(來自Pisum sativum 的豌豆植物凝集素)、蠶豆植物凝集素VFA(來自蠶豆的凝集素)、Aleuria aurantia凝集素AAL (來自Aleuria aurantia的凝集素)等。特別地，本發(fā)明的抵抗凝集素的細胞系可以通過以下步驟選擇采用含凝集素濃度為1 μ g/ml至lmg/ml的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞1天至2周，優(yōu)選地1天至1周，傳代培養(yǎng)存活的細胞或收集一個集落并將其轉(zhuǎn)移進培養(yǎng)皿中，隨后用含凝集素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，所述的凝集素識別在N-糖苷連接的糖鏈中巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接的糖鏈結(jié)構。通過該方法獲得的細胞系的實例包括在實施例14(2) 中獲得的 CH0/CCR4-LCA Nega-13 (FERMBP-7756)，它將在以后描述。2.制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動物或植物或其后代本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動物或植物或其后代是其中基因組基因被修飾的轉(zhuǎn)基因非人動物或植物或其后代，基因組基因被修飾的方式使得涉及抗體分子糖鏈修飾的酶的活性可以被控制，且它可以按照與1項中相似的方法，采用編碼酶的基因作為靶標而被制備，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。在轉(zhuǎn)基因非人動物中，可以通過對預期的非人動物，如牛、綿羊、山羊、豬、馬、小鼠、大鼠、禽類、猴、兔或類似動物，的胚胎干細胞應用與1項中相似的方法，制備酶活性被控制的本發(fā)明胚胎干細胞，所述的酶活性涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。特別地，制備了突變體克隆，其中通過已知的同源重組技術[如，Nature, 326, 6110,295(1987) ；Cell, 51, 3, 503 (1987)；或類似者]，編碼酶的基因是失活的或被任何序列取代，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng) α-鍵連接。采用制備的突變體克隆，通過注射嵌合體進入動物受精卵胚泡的方法或通過積累嵌合體方法，可以制備含胚胎干細胞克隆和正常細胞的嵌合個體。此嵌合個體與正常個體交配，使得可以獲得在全部體細胞中酶活性被降低或刪除的轉(zhuǎn)基因非人動物，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。此外，通過對目的非人動物的受精卵應用與1項中相似的方法，可以制備其中酶活性被降低或刪除的本發(fā)明受精卵細胞，所述非人動物如牛、綿羊、山羊、豬、馬、小鼠、大鼠、禽類、猴、兔或類似動物，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。采用操作鼠胚胎，第二版或類似文獻中描述的胚胎移植方法，通過將制備的受精卵細胞移植進假孕雌性的輸卵管或子宮中，在動物分娩后可以制備酶活性被降低的轉(zhuǎn)基因非人動物，所述的酶活性涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。在轉(zhuǎn)基因植物中，通過對目的植物的胼胝或細胞應用與1項中相似的方法，可以制備酶活性被減低或刪除的本發(fā)明胼胝，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α-鍵連接。按照已知的方法[Tissue Culture, 20 (1994) ；Tissue Culture, 21 (1995) ；Trends in Biotechnology,15,45 (1997)]，采用含植物生長素和細胞分裂素使其再分化的培養(yǎng)基， 通過培養(yǎng)制備的胼胝，可以制備酶活性被降低或刪除的轉(zhuǎn)基因植物，所述的酶涉及細胞內(nèi)糖核苷酸，GDP-巖藻糖的合成，或涉及糖鏈修飾，其中在N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接。3.產(chǎn)生抗體組合物的步驟抗體組合物可以采用如下文獻中描述的方法通過在宿主細胞中表達而獲得分子克隆，第二版；分子生物學現(xiàn)代方法；抗體，實驗室指南，Cold Spring Harbor Laboratory, 1988(下文被稱作“抗體”)；單克隆抗體原理和實踐，第三版，Acad.ft~ess，1993(下文被稱作“單克隆抗體”)；和抗體工程，實踐方法，IRL Press at Oxford University I^ress (下文被稱作“抗體工程”)，舉例如下。制備編碼抗體分子的全長cDNA和含抗體分子編碼部分的合適長度的DNA片段。通過將DNA片斷或全長cDNA插入合適的表達載體的啟動子下游，制備重組載體。通過引導重組載體進入適合表達載體的宿主細胞中可以獲得產(chǎn)生抗體分子的轉(zhuǎn)化體。作為宿主細胞，可以使用任何酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞或類似細胞，只要它可以表達目的基因。通過基因工程技術導入了酶的細胞，如酵母、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞或類似細胞，也可以被用作宿主細胞，所述的酶涉及與抗體分子Fc區(qū)連接的N-糖苷連接的糖鏈的修飾。作為表達載體，使用可在宿主細胞中自主復制、或可以被整合進染色體中并在編碼目的抗體分子的DNA可以被傳遞的位置含有啟動子的載體。按照1(1) (a)項DNA制備中描述的方法，采用如對目的抗體分子特異的探針引物，可以從人或非人組織或細胞中制備cDNA。當酵母被用作宿主細胞時，表達載體的實例包括YEP13(ATCC 37115) ,YEp24 (ATCC 37051)、YCp50(ATCC 37419)等?？梢允褂萌魏螁幼?，只要它可以在酵母中起作用。實例包括糖酵解途徑的基因如己糖激酶基因等的啟動子、PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、gal 1啟動子、gal 10啟動子、熱休克蛋白啟動子、MFa 1啟動子、CUP 1啟動子等。宿主細胞的實例包括屬于酵母菌屬、裂殖酵母菌屬、克魯維屬、絲孢酵母屬、 Schwanniomyces屬等的微生物，如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母菌、乳酸克魯維酵母、產(chǎn)糖毛孢子菌(Trichosporon pullulans)禾口 Schwanniomyces alluvius、等。作為引導重組載體的方法，可以使用任何方法，只要它可以引導DNA進入酵母。 實例包括電穿孔法[Methods in EnzymoloRY, 194，182 (1990) 1、原生質(zhì)球法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA，M，1929 (1978)]、乙酸鋰法[J. Bacteriol. , 153,163 (1983) ]、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,1929 (1978)中描述的方法等方法。當動物細胞被用作宿主時，表達載體的實例包括pcDNAI、pcDM8 (可從Funakoshi 獲得)、pAGE107[特開昭 No. 22979/91 ；Cytotechnology, 3,133 (1990) ], pAS3_3 (特開昭 No. 227075/90)、pCDM8「Nature，329,840 (1987) 1、pcDNAI/Amp (InvitroRen 制造)、 pREP4 (Invitrogen 制造)、pAGE103 [J. Biochemistry, 101，1307 (1987) ]、pAGE210 等。任何啟動子可以被使用，只要它可以在動物細胞中起作用。實例包括巨細胞病毒 (CMV)的IE(立即早期)基因的啟動子、SV40早期啟動子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRa啟動子等。此外，人CMV的IE基因的增強子可以與啟動子一起使用。宿主細胞的實例包括人細胞如Namalwa細胞、猴細胞如COS細胞、中國倉鼠細胞如 CHO細胞或HBT5637 (特開昭299/88)、大鼠骨髓瘤細胞、小鼠骨髓瘤細胞、來自敘利亞倉鼠腎的細胞、胚胎干細胞、受精卵細胞等。作為引導重組載體的方法，可以使用任何方法，只要它可以引導DNA進入動物細胞。實例包括電穿孔法[Cytotechnology，^，133 (1990)]、磷酸鈣法(特開昭 No. 227075/90)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA，M，7413 (1987)]、注射法[操控鼠胚胎，實驗室指南]、采用粒子槍(基因槍)的方法(日本專利No. 2606856，日本專利 No. 2517813)、二乙氨乙基葡聚糖法[生物指南系列4-基因傳遞及表達分析(Yodo-sha)，由 Takashi Yokota和Kenichi Arai編著(1994)]、病毒載體法(操控鼠胚胎，第二版)等。當昆蟲細胞被用作宿主時，蛋白可以通過以下文獻中描述的方法表達分子生物學現(xiàn)代方法，桿狀病毒表達載體，實驗室指南，W. H. Freeman and Company,New York (1992), Bio/Technology, 6,47 (1988)或類似文獻。即，通過將引入重組基因的載體和桿狀病毒同時導入昆蟲細胞以在昆蟲細胞培養(yǎng)上清液中獲得重組病毒，然后用重組病毒感染昆蟲細胞，可以表達蛋白。用于此方法的基因引入載體的實例包括pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(全部由 Invitrogen 制造)等。桿狀病毒實例包括感染夜蛾科(Barathra)昆蟲的的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。昆蟲細胞的實例包括Spodoptera frugiperda卵母細胞Sf9和Sf21 [分子生物學現(xiàn)代方法，桿狀病毒表達載體，實驗室指南，W. H. Freeman and Company, New York (1992)], 粉斑夜蛾卵母細胞High5 (Invitrogen制造)等。為制備重組病毒，同時引導重組基因引入載體和桿狀病毒的方法實例包括，磷酸鈣法(日本公布的經(jīng)實審的專利申請No. 227075/90)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法[Proc. Natl. Acad Sci. USA，M，7413 (1987)]等。當植物細胞被用作宿主時，表達載體的實例包括Ti質(zhì)粒、煙草花葉病毒等。作為啟動子，可以使用任何啟動子，只要它可以在植物細胞中起作用。實例包括花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子、水稻肌動蛋白1啟動子等。宿主細胞的實例包括煙草、馬鈴薯、番茄、胡蘿卜、豌豆、油菜、苜蓿、水稻、小麥、大麥等的植物細胞，等。作為引導重組載體的方法，可以使用任何方法，只要它可以引導DNA進入植物細胞。實例包括采用土壤桿菌的方法(特開昭No. 140885/84，特開昭No. 70080/85，WO 94/00977)、電穿孔法(特開昭No. 251887/85)、采用粒子槍(基因槍)的方法(日本專利 No. 2606856，日本專利 No. 2517813)等。作為表達基因的方法，除直接表達以外，可以按照分子克隆，第二版，或類似文獻中描述的方法，進行分泌生產(chǎn)，表達Fc區(qū)與其它蛋白的融合蛋白等。當基因被導入了涉及糖鏈合成的基因的細菌、酵母、動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞表達時，可以獲得通過導入的基因加上了糖或糖鏈的抗體分子。通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化體以在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和聚積抗體分子，然后從得到的培養(yǎng)物中回收，可以獲得抗體組合物。用培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的方法可以按照通常用于培養(yǎng)宿主細胞的方法進行。作為培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，可以是天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基，只要它含有如碳源、氮源、無機鹽等可以被有機體吸收的物質(zhì)并可以有效地進行轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)，所述的轉(zhuǎn)化體是用原核細胞如大腸桿菌等、或真核細胞如酵母等作為宿主細胞而獲得的。作為碳源，可以使用那些可以被有機體吸收者。實例包括碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖、含它們的糖蜜、淀粉、淀粉水解產(chǎn)物、等；有機酸如乙酸、丙酸、等；醇類如乙醇、丙醇、等；和類似物。氮源的實例包括氨；無機酸或有機酸的銨鹽如氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨、 等；其它含氮化合物；蛋白胨；肉汁；酵母抽提物；玉米漿；干酪素水解物；大豆餅；大豆餅水解物；各種發(fā)酵的細胞及其水解物；等。無機物質(zhì)的實例包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣、等。培養(yǎng)通常在有氧條件下進行如振蕩培養(yǎng)、浸沒-通氣攪拌培養(yǎng)或類似者。培養(yǎng)溫度優(yōu)選15至40°C，培養(yǎng)時間通常為16小時至7天。在培養(yǎng)期間，pH保持在3. 0至9. 0。調(diào)節(jié)PH使用無機或有機酸、堿性溶液、尿素、碳酸鈣、氨或類似物。如果必要，在培養(yǎng)過程中可以在培養(yǎng)基內(nèi)加入抗生素如氨芐青霉素、四環(huán)素或類似物。當培養(yǎng)用重組載體轉(zhuǎn)化的微生物時，如果必要，可以在培養(yǎng)基中加入誘導劑，所述的重組載體是用誘導型啟動子作為啟動子而獲得的。例如，當培養(yǎng)用重組載體轉(zhuǎn)化的微生物時，可以在培養(yǎng)基中加入異丙基-β-D-硫代乳吡喃糖苷，所述的重組載體是用Iac啟動子獲得的；當培養(yǎng)用重組載體轉(zhuǎn)化的微生物時，可以在培養(yǎng)基中加入吲哚丙烯酸，所述的重組載體是用trp啟動子獲得的。當用動物細胞作為宿主細胞獲得的轉(zhuǎn)化體被培養(yǎng)時，培養(yǎng)基的實例包括通常所 M W RPMI 1640 # S [The Journal of the American Medical Association, 199， 519 (1967) ]、Eagle，s MEM 培養(yǎng)基[Science, 122, 501 (1952) ]、Dulbecco 改進的 MEM 培養(yǎng)基[Virology,8,396(1959)],199 培養(yǎng)基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73,1 (1950)]和Whitten培養(yǎng)基[發(fā)育工程實驗指南-轉(zhuǎn)基因鼠的制備(Kodan-sha)，由Katshuki編著(1987)]，以及加入了胎牛血清等的培養(yǎng)基，和類似物。培養(yǎng)通常在pH6至8、30至40°C、有5% CO2存在的條件下進行1至7天。如果必要，在培養(yǎng)過程中可以在培養(yǎng)基內(nèi)加入抗生素如卡那霉素、青霉素、或類似物。用于培養(yǎng)以昆蟲細胞作為宿主細胞獲得的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基實例，包括通常所用的 TW-FH 培養(yǎng)基(Pharmingen 制造)、Sf-900II SFM 培養(yǎng)基(Life Technologies 制造)、 ExCell 400 和 ExCell 405 (均由 JRHBiosciences 制造)、Grace 昆蟲培養(yǎng)基[Nature, 195, 788(1962)]等。培養(yǎng)通常在pH6至7和25至30°C的培養(yǎng)基中進行1至5天。此外，作為偶然的需要，可以在培養(yǎng)過程中在培養(yǎng)基內(nèi)加入抗生素如慶大霉素。用植物細胞作為宿主獲得的轉(zhuǎn)化體可以作為細胞被培養(yǎng)，或通過分化成為植物細胞或器官。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基實例包括通常所用的Murashige和Skoog(MQ培養(yǎng)基和 White培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入了植物激素如植物生長素、細胞分裂素等，以及類似培養(yǎng)基。通常，培養(yǎng)在pH 5至9和20至40°C進行3至60天。如果必要，培養(yǎng)過程中在培養(yǎng)基內(nèi)可加入抗生素如卡那霉素、潮霉素或類似物。
因此，抗體組合物的產(chǎn)生可以通過，按照通常的培養(yǎng)方法培養(yǎng)來自微生物、動物細胞或植物細胞的轉(zhuǎn)化體，轉(zhuǎn)化體中含有的重組載體中插入了編碼抗體分子的DNA，由此產(chǎn)生和聚積抗體組合物，然后從培養(yǎng)物中回收抗體組合物。作為表達基因、分泌產(chǎn)物的方法，除直接表達以外，可以按照分子克隆，第二版中描述的方法，進行融合蛋白等的表達。產(chǎn)生抗體組合物的步驟的實例包括，宿主細胞的細胞內(nèi)表達方法、從宿主細胞向細胞外分泌的方法、和在宿主細胞膜外包被上產(chǎn)生的方法?？梢砸蛩玫乃拗骷毎淖兓虍a(chǎn)生的抗體組合物結(jié)構來選擇方法。當本發(fā)明的抗體組合物在宿主細胞內(nèi)或宿主細胞膜外包被上產(chǎn)生時，可以按照以下方法肯定地細胞外分泌，Paulson等人的方法[J. Biol. Chem. , 264,17619 (1989) 1、Lowe 等人的方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,8227 (1989) ,Genes Develop. ,4,1288(1990)], 特開平No. 336963/93和特開平No. 823021/94等中描述的方法。也就是說，目的抗體分子可以通過以下步驟肯定地從宿主細胞中向細胞外分泌 用基因重組技術將編碼抗體分子和編碼適合抗體分子表達的信號肽的DNA插入表達載體中，引導表達載體進入宿主細胞，然后表達抗體分子。此外，按照特開平No. 227075/90中描述的方法，采用使用二氫葉酸還原酶基因的基因擴增系統(tǒng)，可以增加產(chǎn)量。而且，也可以應用基因?qū)氲膭游飩€體(轉(zhuǎn)基因非人動物)或植物個體(轉(zhuǎn)基因植物)產(chǎn)生抗體組合物，這些個體是通過導入了基因的動物或植物細胞的再分化而構建的。當轉(zhuǎn)化體是動物個體或植物個體時，抗體組合物可以按照通常的方法生產(chǎn)，通過飼養(yǎng)或栽培而生產(chǎn)和聚積抗體組合物，然后從動物或植物個體中回收抗體組合物。用動物個體產(chǎn)生抗體組合物的步驟的實例包括，在動物中生產(chǎn)目的抗體組合物的方法，所述動物是按照已知的方法[American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996) ；Bio/Technology, 9,830 (1991)]，通過導入基因而構建的。在動物個體情況下，抗體組合物的產(chǎn)生可以通過，飼養(yǎng)其中導入了編碼抗體分子的DNA的轉(zhuǎn)基因非人動物，從而在動物內(nèi)產(chǎn)生和聚積抗體組合物，然后從動物中回收抗體組合物。抗體組合物產(chǎn)生和聚積的動物部位的實例包括動物的乳汁(特開昭 No. 309192/88)和卵。作為在此情況中使用的啟動子，可以使用任何啟動子，只要它可以在動物中起作用。優(yōu)選的實例包括哺乳動物腺細胞特異的啟動子如α酪蛋白啟動子、β酪蛋白啟動子、β乳球蛋白啟動子、乳清酸性蛋白啟動子等。用植物個體產(chǎn)生抗體組合物的步驟的實例包括，通過栽培轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生抗體組合物的方法，所述的轉(zhuǎn)基因植物中通過已知的方法導入了編碼抗體分子的DNA[TissUe Culture,20 (1994) ；Tissue Culture,21 (1995) ；Trends in Biotechnology, J_5, 45 (1997)]，以便在植物中產(chǎn)生和聚積抗體組合物，然后從植物中回收抗體組合物。關于由其中導入了抗體分子編碼基因的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的抗體組合物的純化，例如， 當抗體組合物以溶解狀態(tài)在細胞內(nèi)表達時，通過離心回收培養(yǎng)后的細胞，在緩沖水溶液中懸浮，然后用超聲振蕩器、French壓榨機、Manton Gaulin勻漿器、dynomill、或類似儀器破壞以獲得無細胞提取物?？贵w組合物的純化產(chǎn)物可以從無細胞提取物離心獲得的上清中獲得，通過采用通常的酶分離純化技術如溶劑提??；鹽析；用硫酸銨等脫鹽；用有機溶劑沉淀；采用如二乙氨乙基(DEAE)-瓊脂糖凝膠、DIAION HPA-75 (由Mitsubishi Chemical生產(chǎn))等樹脂的陰離子交換層析；采用如S-瓊脂糖凝膠FF (由Wmrmacia生產(chǎn))等樹脂的陽離子交換層析；采用如丁基-瓊脂糖凝膠、苯基-瓊脂糖凝膠等樹脂的疏水層析；采用分子篩的凝膠過濾；親和層析；色譜聚焦；如等電子聚焦等的電泳；和類似的可以單獨或聯(lián)合使用的技術。此外，當抗體組合物通過形成不溶體在細胞內(nèi)表達時，細胞以同樣的方式被回收、 破壞和離心，抗體組合物的不溶體作為沉淀餾分被回收?；厥盏目贵w組合物不溶體用蛋白變性劑溶解。通過稀釋或滲析溶解的溶液使抗體組合物成為正常的三維結(jié)構，然后通過相同的分離純化方法獲得抗體組合物的純化產(chǎn)物。當抗體組合物在細胞外分泌時，抗體組合物或其衍生物可以從培養(yǎng)上清中回收。 即，通過如離心或類似技術處理培養(yǎng)物以獲得可溶性餾分，通過相同的分離純化方法可以從可溶性餾分中獲得抗體組合物的純化制劑。這樣獲得的抗體組合物的實例包括抗體、抗體片段、含抗體Fc區(qū)的融合蛋白，等。作為獲得抗體組合物的實例，產(chǎn)生人源化抗體組合物的步驟在下面詳細描述，但其它抗體組合物也可以采用與該方法相似的方式獲得。(1)表達人源化抗體的載體構建表達人源化抗體的載體是動物細胞表達載體，其中插入了人抗體重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)C區(qū)的編碼基因，它是通過將人抗體H鏈和L鏈C區(qū)的每一個編碼基因克隆進動物細胞表達載體中而構建的。人抗體的C區(qū)可以是任何人抗體的H鏈和L鏈。實例包括屬于人抗體H鏈IgGl亞類的C區(qū)(下文被稱作“hCYl”)、屬于人抗體L鏈中K類的C區(qū)(下文被稱作“hCK ”)寸。作為編碼人抗體H鏈和L鏈C區(qū)的基因，可以使用含外顯子和內(nèi)含子的染色體 DNA，或也可以使用cDNA。作為動物細胞表達載體，可以使用任何載體，只要編碼人抗體C區(qū)的基因可以插入其中并在其中表達。實例包括 PAGE107 [Cytotechnology，1，133 (1990) ]、pAGE103 [J. Biochem.，101，1307 (1987) 1、pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984) ], pKCR[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78,1527 (1981) ], pSGl β d2~4 [Cytotechnology, 4,173 (1990)]等。在動物細胞表達載體中的啟動子和增強子的實例包括，SV40早期啟動子和增強子[J. Biochem.，皿， 1307(1987)]、Moloney小鼠白血病病毒長末端重復區(qū)(LTR)啟動子[Biochem. Biophys. Res. Commun.，149,960 (1987) 1、免疫球蛋白 H 鏈啟動子[Cell, 41,479 (1985)]和增強子 [Cell, 33, 717 (1983)]等。人源化抗體表達載體可以是兩種形式之一或者編碼抗體H鏈和L鏈的基因位于不同的載體上，或者兩個基因位于同一個載體上(串聯(lián)型)。關于構建人源化抗體表達載體的容易性，導入動物細胞的容易性，和抗體H鏈和L鏈在動物細胞中表達量的平衡，串聯(lián)型人源化抗體表達載體是更優(yōu)選的[J. Immunol. Methods, 167，271 (1994)]。構建的人源化抗體表達載體可被用于在動物細胞中表達人嵌合抗體和人CDR-移植的抗體。
(2)編碼抗體V區(qū)的cDNA的制備，該抗體來自動物而非人編碼抗體H鏈和L鏈V區(qū)的cDNA可以用下面的方式獲得，該抗體來自非人的動物， 如小鼠抗體。通過從產(chǎn)生目的小鼠抗體的雜交瘤細胞中提取mRNA而合成cDNA。合成的cDNA被克隆進如噬菌體或質(zhì)粒的載體中以獲得cDNA文庫。采用現(xiàn)有的小鼠抗體C區(qū)部分或V區(qū)部分作為探針，從此文庫中分離每個重組噬菌體或重組質(zhì)粒，所述的重組噬菌體或重組質(zhì)粒含有編碼H鏈V區(qū)和編碼L鏈V區(qū)的cDNA。測定了重組噬菌體或重組質(zhì)粒上目的小鼠抗體H鏈和L鏈V區(qū)的全核苷酸序列，并從核苷酸序列推導了 H鏈和L鏈V區(qū)的全氨基酸序列。作為非人的動物，可以使用任何動物如小鼠、大鼠、倉鼠、兔或類似動物，只要可以從中產(chǎn)生雜交瘤。從雜交瘤細胞中制備總RNA的方法的實例包括，硫氰酸胍-三氟醋酸銫法 [Methods in Enzymology, 154, 3 (1987) 1等，從總RNA中制備mRNA的方法的實例包括固定化寡脫氧胸苷酸(oligo (dT))的纖維素柱法[分子克隆，第二版]等。此外，從雜交瘤細胞中制備mRNA的試劑盒的實例包括i^ast Track mRNA分離試劑盒Qnvitrogen制造)、Quick Prep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制造)等。合成cDNA和制備cDNA文庫的方法的實例包括，通常的方法(分子克隆，第二版， 分子生物學現(xiàn)代方法，增補1-34)、采用市售試劑盒的方法，如Superscript 、cDNA合成和質(zhì)?？寺〉馁|(zhì)粒系統(tǒng)(GIBC0BRL制造)或ZAP-cDNA合成試劑盒(Mratagene制造)等。在制備cDNA文庫中，其中插入了 cDNA的載體可以是任何載體，只要它可以被插入，所述的cDNA是采用從雜交瘤中提取的mRNA作為模板而合成的。實例包括ZAP Express[Strategies,5,58 (1992)]> pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research, 11,9494(1989)]、λ zapll (Stratagene 制造)、λ gtlO 和 λ gtll [DNA 克隆，實踐方法，I, 49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech 制造)、λ ExCell、pT7T3 18U(Pharmacia 制造)、 pcD2 [Mol. Cell. Biol.，3, 280 (1983) ]、pUC18 [Gene, 33,103 (1985)]等。作為其中導入了從噬菌體或質(zhì)粒載體構建的cDNA文庫的大腸桿菌，可以使用任何大腸桿菌，只要該cDNA文庫可以被導入、表達并維持。實例包括XLl-Blue MRF， [Strategies, 5, 81 (1992) ] , C600 [Genetics, 39_, 440 (1954) ] , Y1088 禾口 Y1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J. Mol. Biol.，166 1(1983) ]、K802[J. Mol. Biol.， 16,188 (1966) ]、JM105 [Gene, 38 275 (1985)]等。作為從cDNA文庫中選擇編碼抗體H鏈和L鏈V區(qū)的cDNA克隆的方法，可以使用采用同位素或熒光標記探針的集落雜交或噬菌斑雜交(分子克隆，第二版)，所述的抗體是動物而非人的。編碼H鏈和L鏈V區(qū)的cDNA也可以通過制備引物，并以從mRNA或cDNA文庫合成的cDNA為模板進行聚合酶鏈反應(下文被稱作“PCR”;分子克隆，第二版；分子生物學現(xiàn)代方法，增補1-34)而制備。cDNA的核苷酸序列可以通過以下步驟測定用合適的限制酶消化選擇的cDNA，將其片斷克隆進質(zhì)粒中如pBluescript SK(-) (Mratagene制造)或類似質(zhì)粒，進行通常所用的核苷酸序列分析方法的反應如Sanger等人的雙脫氧法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 5463 (1977)]或類似方法，然后用自動核苷酸序列分析儀如A. L. F. DNA測序儀(Pharmacia制造)或類似儀器分析克隆。通過從測定的核苷酸序列推導H鏈和L鏈V區(qū)的全氨基酸序列，并將其與已知抗體的H鏈和L鏈V區(qū)全氨基酸序列進行比較，可以確認獲得的cDNA 是否編碼含分泌信號序列的抗體H鏈和L鏈V區(qū)的全氨基酸序列[免疫學關注的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dep. Health and Human krvices(1991)]。(3)分析來自非人動物的抗體V區(qū)的氨基酸序列關于含分泌信號序列的抗體H鏈和L鏈V區(qū)的全氨基酸序列，分泌信號序列的長度和N-末端氨基酸序列可以被推導并分組，通過將其與已知抗體的H鏈和L鏈V區(qū)的氨基酸序列進行比較可以發(fā)現(xiàn)它們屬于哪個組[免疫學關注的蛋白序列，US Dep. Health and Human Services (1991)]。此外，每個⑶R的H鏈和L鏈V區(qū)的氨基酸序列也可以通過將其與已知抗體的H鏈和L鏈V區(qū)的氨基酸序列進行比較而被發(fā)現(xiàn)[免疫學關注的蛋白序列， US Dep. Health and Human Services (1991)]。(4)構建人嵌合抗體表達載體人嵌合抗體表達載體可以在3(1)項中構建的人源化抗體表達載體中，通過將編碼來自動物而非人類的抗體H鏈和L鏈V區(qū)的cDNA克隆進編碼人抗體C區(qū)H鏈和L鏈的基因的上游而構建。例如，人嵌合抗體表達載體可以通過將每個cDNA連接到合成DNA上而構建，所述的前者編碼來自動物而非人類的抗體H鏈和L鏈V區(qū)，后者含有來自動物而非人類的抗體H鏈和L鏈V區(qū)3’ -末端的核苷酸序列和人抗體H鏈和L鏈C區(qū)5’ -末端的核苷酸序列，而且在兩個末端都具有合適限制酶的識別序列，以及通過將它們克隆進編碼人抗體H鏈和L鏈C區(qū)的基因上游而構建，該基因包含在3 (1)項中所描述構建的人源化抗體表達載體中。(5)構建編碼人CDR-移植抗體V區(qū)的cDNA編碼人⑶R-移植抗體H鏈和L鏈V區(qū)的cDNA可以如下獲得。首先，選擇人抗體H 鏈和L鏈V區(qū)框架(下文被稱作“FR”)的氨基酸序列，以嫁接來自動物而非人類的抗體H 鏈和L鏈V區(qū)的CDR。作為人抗體H鏈和L鏈V區(qū)的FR的氨基酸序列，可以使用任何氨基酸序列，只要它們來自人抗體。實例包括在如ftOtein Data Bank等數(shù)據(jù)庫中登記的人抗體H鏈和L鏈V區(qū)的FR的氨基酸序列、在每個人抗體H鏈和L鏈V區(qū)的FR亞群中共同的氨基酸序列[免疫學關注的蛋白序列，US Dep. Health and Human Services (1991)]等。但為了產(chǎn)生具有有效活性的人CDR-移植抗體，優(yōu)選地選擇與來自動物而非人類的目的抗體H 鏈和L鏈V區(qū)的氨基酸序列具有盡可能高同源性(至少60%或以上)的氨基酸序列。其次，來自動物而非人類的目的抗體H鏈和L鏈V區(qū)的CDR的氨基酸序列被嫁接到所選擇的人抗體H鏈和L鏈V區(qū)的FR的氨基酸序列上，以設計人CDR-移植抗體H 鏈和L鏈V區(qū)的氨基酸序列。通過考慮抗體基因核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)的密碼子使用頻率將設計的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成DNA序列[免疫學關注的蛋白序列，US Dep. Health and Human Services (1991)],并設計編碼人⑶R-移植抗體H鏈和L鏈V區(qū)氨基酸序列的DNA序列。 根據(jù)設計的DNA序列，合成了具有大約100個堿基長度的數(shù)個合成DNA片段，并用它們進行 PCR0在此情況下，考慮到PCR的反應效率和可以合成的DNA的長度，優(yōu)選在每個H鏈和L 鏈中設計6個合成DNA。此外，通過引導合適限制酶的識別序列進入存在于兩個末端的合成DNA的5’ -末端，它們可以容易地克隆進3(1)項中構建的人源化抗體表達載體中。PCR后，擴增的產(chǎn)物被克隆進如pBluescript SK(-) (Stratagene制造)或類似物的質(zhì)粒中，并通過3 (2)項中的方法測定核苷酸序列，從而獲得了質(zhì)粒，質(zhì)粒具有的DNA序列編碼所需人CDR-移植抗體 H鏈和L鏈V區(qū)的氨基酸序列。
(6)構建人⑶R-移植抗體的表達載體人⑶R-移植抗體的表達載體可以在3(1)項中描述的人源化抗體表達載體中，通過將3 (5)項中構建的編碼人CDR-移植抗體H鏈和L鏈V區(qū)的cDNA克隆進編碼人抗體H 鏈和L鏈C區(qū)的基因的上游而構建。例如，通過引導合適限制酶的識別序列進入合成DNA 片段兩個末端的5’-末端可以構建人CDR-移植抗體表達載體，其中的合成DNA片段是進行 3(5)項中的PCR以構建人CDR-移植抗體H鏈和L鏈V區(qū)時所用的，因此它們在3(1)項中描述的人源化抗體表達載體中，以這種能夠以適合形式被表達的方式被克隆進編碼人抗體 H鏈和L鏈C區(qū)的基因的上游。(7)人源化抗體的穩(wěn)定產(chǎn)生通過將3(4)和(6)項中描述的人源化抗體表達載體引導入合適的動物細胞，可以獲得能夠穩(wěn)定產(chǎn)生人嵌合抗體和人CDR-移植抗體(下文都被稱作“人源化抗體”)的轉(zhuǎn)化體。引導人源化抗體表達載體進入動物細胞的方法的實例包括，電穿孔[特開平 No. 257891/90 ；Cytotechnology, 3,133 (1990)]等。作為其中導入人源化抗體表達載體的動物細胞，可以使用任何細胞，只要它是可以產(chǎn)生人源化抗體的動物細胞。實例包括小鼠骨髓瘤細胞如NSO細胞和SP2/0細胞、中國倉鼠卵巢細胞如CHO/ dhfr—細胞和CH0/DG44細胞、大鼠骨髓瘤如YB2/0細胞和IR983F細胞、來自敘利亞倉鼠腎的BHK細胞、人骨髓瘤細胞如Namalwa細胞等，且中國倉鼠卵巢細胞CH0/DG44細胞、大鼠骨髓瘤TO2/0細胞和5項中描述的本發(fā)明宿主細胞是優(yōu)選的。在導入人源化抗體表達載體后，可以用動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基選擇能夠穩(wěn)定產(chǎn)生人源化抗體的轉(zhuǎn)化體，按照特開昭No. 257891/90中公開的方法，培養(yǎng)基中含有如G418 硫酸鹽(下文被稱作“G418”;SIGMA制造)等的試劑。動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的實例包括 RPMI 1640 培養(yǎng)基(Nissui Pharmaceutical 制造)、GIT 培養(yǎng)基(Nihon Pharmaceutical 制造)、EX-CELL 302培養(yǎng)基(JRH制造)、IMDM培養(yǎng)基(GIBCO BRL制造)、雜交瘤-SFM培養(yǎng)基(GIBCO BRL制造)、通過在這些培養(yǎng)基中添加各種添加劑如胎牛血清(下文被稱作 “FBS”)而獲得的培養(yǎng)基等。通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化體，可以在培養(yǎng)上清中產(chǎn)生和聚積人源化抗體。培養(yǎng)上清中人源化抗體的表達水平和抗原結(jié)合活性，可以通過如酶聯(lián)免疫吸附試驗[下文被稱作“ELISA”;抗體實驗室指南，Cold Spring Harbor Laboratory, 14章(1998)，單克隆抗體原理和實踐，Academic PressLimited (1996)]或類似的方法測定。此外，按照特開平No. 257891/90中公開的方法，采用DHFR基因擴增系統(tǒng)可以增加由轉(zhuǎn)化體表達的人源化抗體的水平。采用蛋白A柱可以從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清中純化人源化抗體[抗體實驗室指南， Cold Spring Harbor Laboratory，8 章(1988)，單克隆抗體原理和實踐，Academic Press Limited(1996)]。此外，也可以應用蛋白純化通常所用的純化方法。例如，可以通過聯(lián)合凝膠過濾、離子交換層析和超濾進行純化。純化的人源化抗體的H鏈、L鏈或抗體分子整體的分子量可以被測定，通過例如聚丙烯酰胺凝膠電泳[下文被稱作“SDS-PAGE”;NatUre，^I， 680(1970)]、Western 印跡[抗體實驗室指南，Cold Spring Harbor Laboratory，12 章 (1988)，單克隆抗體原理和實踐，Academic Press Limited (1996)]或類似方法。因此，已經(jīng)描述了采用動物細胞作為宿主產(chǎn)生抗體組合物的方法，但如上所述，抗體組合物也可以由酵母、昆蟲細胞、植物細胞、動物個體或植物個體以在動物細胞上相同的方法產(chǎn)生。當宿主細胞具有天生的表達抗體分子的能力時，本發(fā)明的抗體組合物可以如下產(chǎn)生采用1項中描述的方法制備表達抗體分子的細胞，培養(yǎng)細胞然后從得到的培養(yǎng)物中純化目的抗體組合物。4.抗體組合物的活性評價作為純化抗體組合物的量、與抗體的結(jié)合活性和純化抗體組合物的效應子功能的檢測方法，可以使用單克隆抗體，抗體工程中描述的已知方法和類似的方法。作為實例，當抗體組合物是人源化抗體時，與抗原的結(jié)合活性和與抗原陽性的培養(yǎng)細胞系結(jié)合的活性可以通過以下方法測定，例如ELISA、免疫熒光法[Cancer Immunol. Immunother. ,36,373(1993)]等。對抗抗原陽性培養(yǎng)細胞系的細胞毒活性可以通過檢測 CDC 活性、ADCC 活性[Cancer Immunol. Immunother. ,36,373(1993)]等而評價。此外，抗體組合物在人類的安全性和治療效果可以采用相對接近人類的動物種屬的適當模型來評價，如食蟹猴(Macaca fascicularis)或類似者。5.與各種細胞中表達的抗體分子結(jié)合的糖鏈的分析可以按照分析糖蛋白之糖鏈結(jié)構的一般方法分析與各種細胞中表達的抗體分子結(jié)合的糖鏈結(jié)構。例如，與IgG分子結(jié)合的糖鏈含有中性糖如半乳糖、甘露糖、巖藻糖或類似糖，氨基糖如N-乙酰氨基葡萄糖或類似糖，以及酸性糖如唾液酸或類似物，并可以通過如糖鏈結(jié)構分析或采用糖成分分析、二維糖鏈圖譜等的類似方法而被分析。(1)中性糖和氨基糖成分的分析結(jié)合到抗體分子上的糖鏈成分可以通過以下方法分析，用如三氟乙酸或類似的酸進行糖鏈的酸解，以釋放中性糖或氨基糖，并測定組分的比例。實例包括采用糖成分分析儀(BioLC)的方法，由Dionex生產(chǎn)。BioLC是一個通過HPAEC-PAD(高能陰離子交換層析-脈沖電流測定)分析糖成分的裝置[J.Liq. Chromatogr.，6,1577(1983)]。還可以通過采用2-氨基吡啶的熒光標記方法分析組分比例。特別地，可以按照已知的方法計算組分比例[Agric. Biol. Chem.，55 (1)，283-284 (1991) 1，通過用2-氨基吡啶作用的熒光性標記酸解的樣本，然后通過HPLC分析組成。(2)分析糖鏈結(jié)構結(jié)合到抗體分子上的糖鏈結(jié)構可以通過二維糖鏈圖譜法進行分析[Anal. Biochem. ,171, 73 (1988)，生物化學實驗方法23-研究糖蛋白糖鏈的方法(Japan Scientific Societies Press)，由 Reiko Takahashi 編著(1989) ]。二維糖鏈圖譜法是推導糖鏈結(jié)構的方法，通過例如，分別由反相層析測繪糖鏈的保留時間或洗脫位置作為X軸，由正相層析測繪糖鏈的保留時間或洗脫位置作為Y軸，并將其與已知糖鏈的結(jié)果進行比較。
特別地，抗體經(jīng)過胼解作用，從抗體中釋放出糖鏈，釋放的糖鏈可以接受用2-氨基吡啶(下文被稱作“PA”)的熒光標記[J. Biochem.，迎，197 (1984)]，然后通過凝膠過濾從過剩的PA-處理試劑中分離糖鏈，進行反相層析。此后，分離糖鏈的每個峰進行正相層析。 通過在二維糖鏈圖譜上測繪此結(jié)果并將其與標準糖鏈(Takara Shuzo制造)的測繪點或文獻[Anal. Biochem. ,171,73(1988)]進行比較，可以推導出糖鏈結(jié)構。由二維糖鏈圖譜法推導的結(jié)構可以通過進一步進行質(zhì)譜分析，如每個糖鏈的 MALDI-TOF-MS或類似者，而被證實。6.識別抗體分子糖鏈結(jié)構的免疫學測定法抗體分子包括抗體組合物，抗體組合物中與抗體Fc區(qū)結(jié)合的糖鏈在結(jié)構上是不同的。其中巖藻糖不在糖鏈還原端結(jié)合到N-乙酰氨基葡萄糖上的糖鏈占結(jié)合到抗體組合物還原端Fc功能區(qū)的N-糖苷連接糖鏈總復合體的比率為20%或以上的抗體組合物具有高 ADCC活性。采用6項中描述的、分析抗體分子中糖鏈結(jié)構的方法可以鑒定抗體組合物。此外，還可以通過采用凝集素的免疫學檢測方法鑒定。按照已知的免疫學檢測方法，通過采用凝集素的免疫學檢測方法，可以確定抗體分子的糖鏈結(jié)構，如Western印跡、IRA(放射免疫測定)、VIA(病毒免疫測定)、EIA(酶免疫測定)、FIA(熒光免疫測定)、MIA(金屬免疫測定)等，被描述在以下文獻中單克隆抗體原理和應用，ffiley-Liss, Inc. (1955)；免疫分析，第三版，Igakushoin(1987)；酶抗體方法，修訂版，Gakusai Kikaku (1985)；等。標記凝集素，它識別包含在抗體組合物中的抗體分子的糖鏈結(jié)構，標記的凝集素與作為樣本的抗體組合物進行反應。然后，測定標記的凝集素與抗體分子的復合體的量。用于鑒定抗體分子糖鏈結(jié)構的凝集素的實例包括，WGA(來自T. vulgaris的麥胚 11^ )、；0 A ( Jfeg C. ensiformis 白勺 cocanavalin A)、RIC( : 自 R. . communis 白勺_ 素)、L-PHA(來自P. vulgaris的白細胞凝集素)、LCA(來自L. culinaris的扁豆凝集素)、 PSA(來自P. sativum的晶狀體凝集素)、AAL (Aleuria aurantia凝集素)、ACL (尾穗莧凝集素)、BPL (羊蹄甲凝集素)、DSL (曼陀羅凝集素)、DBA (二花扁豆凝集素)、EBL (接骨木干凝集素)、ECL (雞冠刺桐凝集素)、EEL (衛(wèi)茅eoropaeus凝集素)、GNL(雪花蓮凝集素)、 GSL(Griffonia simplicifolia 凝集素)、HPA(Helix pomatia 凝集素)、HHL(朱頂紅雜交種凝集素)、JaCalin、LTL(翅莢百脈根凝集素)、LEL(番茄凝集素)、MAL(朝鮮槐凝集素)、 MPL (桑橙黃酮(Maclura pomifera)植物凝集素)、NPL (黃水仙凝集素)、PNA (花生凝集素)、E-PHA (菜豆紅細胞凝集素)、PTL (四棱豆凝集素)、RCA (蓖麻凝集素)、STL (馬鈴薯凝集素)、SJA (槐樹凝集素)、SBA (大豆凝集素)、UEA (荊豆凝集素)、VVL (長柔毛野豌豆凝集素)和WFA (多花紫藤凝集素)。優(yōu)選的使用特異性識別N-糖苷連接的糖鏈復合體中，巖藻糖在糖鏈還原端與 N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈結(jié)構的凝集素。實例包括兵豆凝集素LCA(來自兵豆(Lens culinaris)的結(jié)晶體凝集素)、豌豆凝集素PSA (來自Pisun sativum的豌豆凝集素)、蠶豆植物凝集素VFA(來自蠶豆(Vicia faba)的凝集素)和Aleuria aurantia凝集素AAL(來自 Aleuria aurantia 凝集素)。7.本發(fā)明抗體分子的應用本發(fā)明的抗體組合物具有高抗體依賴細胞介導的細胞毒活性。具有高抗體依賴細
42胞介導的細胞毒活性的抗體用于預防和治療多種疾病包括癌癥，炎癥疾病，免疫疾病如自身免疫病、過敏癥和類似疾病，循環(huán)器官疾病和病毒或細菌感染。在癌癥即惡性腫瘤情況下，癌細胞生長。一般的抗腫瘤藥物抑制癌細胞的生長。 相反，具有高抗體依賴細胞介導的細胞毒活性的抗體以其細胞殺傷作用，可以通過損傷癌細胞而治療癌癥，因此，它作為治療藥物比一般的抗腫瘤藥物更有效。目前，在癌癥治療藥中，抗體藥物本身的抗腫瘤作用是不充分的，所以已進行與化療聯(lián)合的治療[Science，·， 1197(1998)]。如果通過本發(fā)明本身的抗體組合物發(fā)現(xiàn)了更有效的抗腫瘤作用，對化療的依賴將會下降，并且副作用將會減少。在免疫疾病如炎癥疾病、自身免疫病、過敏癥和類似疾病中，疾病的體內(nèi)反應是由免疫細胞釋放的介導分子誘導的，所以通過用抗體消除免疫細胞可以抑制過敏反應，所述抗體具有高抗體依賴細胞介導的細胞毒活性。循環(huán)器官疾病的實例包括動脈硬化和類似疾病。目前動脈硬化用氣囊導管治療， 但在用具有高抗體依賴細胞介導的細胞毒活性的抗體治療后，通過抑制血管網(wǎng)中動脈細胞的生長，可以預防和治療動脈硬化疾病。用抗體通過抑制受病毒或細菌感染的細胞的增殖，可以預防和治療多種疾病包括病毒和細菌感染，所述抗體具有高抗體依賴細胞介導的細胞毒活性。下面描述了識別腫瘤相關抗原的抗體、識別過敏或炎癥相關抗原的抗體、識別循環(huán)器官疾病相關抗原的抗體和識別病毒或細菌感染相關抗原的抗體實例。識別腫瘤相關抗原的抗體實例包括抗⑶2抗體(Ohta等人，Anticancer Res.， 12，331-336，1993)、抗 GD3 抗體(Ohta 等人，Cancer Immunol. Immunother. ,36,260-266, 1993)、抗 GM2 抗體(Nakamura 等人，Cancer Res. ,54,1511-1516，1994)、抗 HER2 抗體 (Carter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,4285-4289,1992),抗 CD52 抗體(Carter 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,4285-4289,1992)、抗 MAGE 抗體(Jungbluth 等人， British J. Cancer,迎，493-497，2000)、抗 HM 1. 24 抗體(Ono 等人，Molecular Immunol., 巡，387-395，1999)、抗甲狀旁腺激素相關蛋白(PTHrP)抗體(Ogata等人，Cancer,88 2909-2911，2000)、抗堿性成纖維細胞生長因子抗體和抗FGF8抗體(Matsuzaki等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA，巡，9911-9915，1989)、抗堿性成纖維細胞生長因子受體抗體和抗FGF8受體抗體(Kuo等人，J. Biol. Chem.，265，16455-16463，1990)、抗胰島素樣生長因子抗體(Yao等人，J. Neurosci. Res.，迎，647-659，1995)、抗胰島素樣生長因子受體抗體 (Yao 等人，J. Neurosci. Res.，迎，M7-659,1995)、抗 PMSA 抗體(Murphy 等人，J. Urology， 160，2396-2401，1998)、抗血管內(nèi)皮細胞生長因子抗體(Presta等人，Cancer Res.， 近，4593-4599，1997)、抗血管內(nèi)皮細胞生長因子受體抗體(Kanno等人，Oncogene, 19, 2138-2146,2000)和類似抗體。識別過敏或炎癥相關抗原的抗體實例包括抗白介素6抗體(Abrams等人， Immunol. Rev. ,U-24，1992)、抗白介素 6 受體抗體(Sato 等人，Molecular Immunol.， 31,371-381,1994)、抗白介素 5 抗體(Abrams 等人，Immunol. Rev. , 127,5-24,1992)、抗白介素5受體抗體和抗白介素4抗體(Biord等人，Cytokine, 3, 562-567,1991)、抗腫瘤壞死因子抗體CTempest等人，Hybridoma，！^，183-190，1994)、抗腫瘤壞死因子受體抗體(Amrani 等人，Molecular Pharmacol.，巡，237-245，2000)，抗 CCR4 抗體(Campbell 等人，Nature，400,776-780,1999)、抗趨化因子抗體(Peri 等人，J. Immuno. Meth. , 174,249-257,1994)、 抗趨化因子受體抗體(Wu等人，J. Exp. Med. ,186,1373-1381,1997)等。識別循環(huán)器官疾病相關抗原的抗體實例包括抗GpIIb/IIIa抗體(Co等人，J. Immunol. ,152,2968-2976, 1994)、抗血小板衍生生長因子抗體(Ferns等人，Science, 253,1129-1132,1991)、抗血小板衍生生長因子受體抗體(Shulman等人，J. Biol. Chem. ,272,17400-17404,1997)和抗凝血因子抗體(Peter 等人，Circulation, 101,1158-1164, 2000)和類似抗體。識別病毒或細菌感染相關抗原的抗體實例包括抗gpl20抗體(Tugarinov等人， Structure, 8, 385-395, 2000) > 抗 CD4 抗體 Gchulze-Koops 等人，J. Rheumatology，距， 2065-2076，1998)、抗 CCR4 抗體和抗 Vero 毒素抗體(Karnali 等人，J. Clin. Microbiol.， 37,396-399,1999)和類似抗體。這些抗體可以從公共組織獲得如ATCC (The American Type Culture Collection)、物理和化學研究院的RIKEN基因庫、生物科學和人類技術國家研究院、工業(yè)科學和技術代理處(目前叫國際專利生物保藏處，高級工業(yè)科學與技術國家研究院)等，或來自私人試劑銷售公司如 Dainippon Pharmaceuticals & D SYSTEMS,PharMingen,Cosmo Bio、Funakoshi 等。含有本發(fā)明抗體組合物的藥物可以作為治療劑單獨使用，但通常地，優(yōu)選通過制藥技術領域熟知的合適方法，將其與至少一種藥學可接受的載體混合，以由此產(chǎn)生的藥物制劑提供。選擇在治療中最有效的給藥途徑是需要的。實例包括口服和腸外給藥如口腔、氣管、直腸、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或類似途徑。在抗體制劑中，靜脈內(nèi)用藥是優(yōu)選的。劑型包括噴霧劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、膏劑、貼片寸。適合于口服的藥物制劑實例包括乳劑、糖漿劑、膠囊劑、片劑、粉劑、顆粒劑等。如乳劑和糖漿劑的液體制劑可以用以下物質(zhì)作為添加劑生產(chǎn)7K ；糖類如蔗糖、 山梨醇、果糖等；乙二醇類如聚乙二醇、丙二醇等；油類如芝麻油、橄欖油、大豆油等；防腐劑如P-羥基苯甲酸酯等；香料類如草莓香料、薄荷油等；和類似物。膠囊劑、片劑、粉劑、顆粒劑和類似制劑可以用以下物質(zhì)作為添加劑生產(chǎn)填充劑如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖等；崩解劑如淀粉、藻酸鈉等；潤滑劑如硬脂酸鎂、滑石粉等； 粘合劑如聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等；表面活性劑如脂肪酸酯等；增塑劑如甘油等； 和類似物。適合于腸外給藥的藥物制劑實例包括注射劑、栓劑、噴霧劑和類似劑型。注射劑可以用載體制備，如鹽溶液、葡萄糖溶液、它們的混合溶液或類似物。此外， 粉狀的注射劑可以用通常的方法并在其中添加氯化鈉，通過凍干抗體組合物而制備。制備栓劑所用的載體可以是如可可油脂、氫化油脂、羧酸或類似物。此外，噴霧劑可以用這種抗體組合物或載體制備，所述的載體不刺激患者的口腔或氣道粘膜，并通過將其分散成精細的顆粒而促進抗體組合物的吸收。載體的實例包括乳糖、甘油和類似物。根據(jù)抗體組合物和載體的特性，有可能生產(chǎn)如氣溶膠、干粉等的藥物制劑。此外，作為口服制劑添加劑舉例的成分也可以添加到腸外制劑中。
盡管臨床劑量或用藥頻度依療效的目的、給藥的方法、治療周期、年齡、體重等而不同，但通常為每天每個成年人10μ g/kg至20mg/kg。此外，作為抗體組合物抗各種腫瘤細胞的抗腫瘤作用的檢測方法，體外試驗包括 CDC活性檢測法、ADCC活性檢測法和類似方法，體內(nèi)試驗包括在如小鼠等的實驗動物中，應用腫瘤系統(tǒng)的抗腫瘤試驗，和類似試驗。CDC活性(補體依賴性細胞毒作用)和ADCC活性(抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用)檢測和抗腫瘤試驗可以按照以下文獻中描述的方法進行，Cancer Immunology Immunotherapy, 36, 373 (1993) ；Cancer Research, 1511 (1994)；等。本發(fā)明將根據(jù)實施例在下面詳細描述；但是，實施例只是簡單的舉例說明，本發(fā)明的范疇并不限于此。附圖簡述

圖1顯示了 5個純化的抗⑶3嵌合抗體(使用的梯度凝膠從4至15% ) SDS-PAGE 的電泳圖譜。圖IA和圖IB分別顯示了在非還原條件下和還原條件下的電泳結(jié)果。泳道1至 7分別顯示了高分子量標記物、YB2/0-GD3嵌合抗體、CH0/DG44-GD3嵌合抗體、SP2/0-GD3 嵌合抗體、NS0-GD3嵌合抗體(30 、NS0-GD3嵌合抗體(GIT)和低分子量標記物的電泳圖
■i並曰O圖2顯示了 5個純化的抗⑶3嵌合抗體與⑶3結(jié)合的活性，通過改變抗體濃度來測定。縱坐標和橫坐標分別顯示了與GD3的結(jié)合活性和抗體濃度?！ī枴ǎ?〃，“ □〃，〃■“和〃 Δ"分別顯示了 YB2/0-GD3嵌合抗體、CHO/ DG44-GD3嵌合抗體、SP2/0-GD3嵌合抗體、NS0-GD3嵌合抗體(30 和NS0-GD3嵌合抗體 (GIT)的活性。圖3顯示了 5個純化的抗⑶3嵌合抗體對人黑素瘤細胞系G-361的ADCC活性。 縱坐標和橫坐標分別顯示了細胞毒活性和抗體濃度?！ī枴ǎ?〃，“ □〃，“ ■“ 和〃 Δ"分別顯示了 YB2/0-GD3嵌合抗體、CH0/DG44-GD3嵌合抗體、SP2/0-GD3嵌合抗體、 NS0-GD3嵌合抗體(302)和NS0-GD3嵌合抗體(GIT)的活性。圖4顯示了 3個純化抗hIL_5R α⑶R移植抗體SDS-PAGE的電泳圖譜(使用的凝膠梯度從4至15% )。圖4Α和圖4Β分別顯示了在非還原條件下和還原條件下進行電泳的結(jié)果。泳道1至5分別顯示了高分子量標記物、YB2/0-hIL-5R⑶R抗體、CH0/d-hIL_5R⑶R 抗體、NS0-hIL-5R⑶R抗體和低分子量標記物的電泳圖譜。圖5顯示了 3個純化的抗hIL_5Ra⑶R移植抗體結(jié)合hIL_5Ra的活性，通過改變抗體濃度來測定。縱坐標和橫坐標分別顯示了與hIL_5Ra的結(jié)合活性和抗體濃度。"O" , “ “和〃 □”分別顯示了 YB2/0-hIL-5R CDR 抗體、CH0/d-hIL_5R CDR 抗體和NS0-hIL-5RCDR抗體的活性。圖6顯示了 3個純化抗hIL_5R α⑶R移植抗體對表達IL-5R的小鼠T細胞系CTLL-2(h5R)的ADCC活性?？v坐標和橫坐標分別顯示了細胞毒活性和抗體濃度。"O" , “ “和〃 □”分別顯示了 YB2/0-hIL-5R CDR 抗體、CH0/d-hIL_5R CDR 抗體和NS0-hIL-5R CDR抗體的活性。圖7顯示了 3個純化的抗hIL_5Ra⑶R移植抗體在hIL_5誘導的嗜酸性粒細胞增加faseicularis獼猴模型中的抑制活性?？v坐標和橫坐標顯示了外周血中嗜酸性粒細胞的數(shù)目和天數(shù)(給予抗體和hIL-5的天數(shù)定義為0天)。丨‘101和102"、丨‘301,302 和303"、“ 401，402和403〃和〃 501，502和503 〃分別顯示了在未給予抗體組、給予 YB2/0-hIL-5R CDR 抗體組、給予 CH0/d-hIL_5R CDR 抗體組和給予 NS0_hIL_5R CDR 抗體組的結(jié)果。圖8顯示了 PA處理的糖鏈()反相HPLC洗脫液的洗脫圖譜(左側(cè))，和用α-L-巖藻糖苷酶作用于PA處理的糖鏈、然后通過反相HPLC進行分析所獲得的洗脫圖譜(右側(cè))， YB2/0產(chǎn)生的純化抗hIL_5R α⑶R移植抗體(圖8A)和NSO產(chǎn)生的純化抗hIL_5R α⑶R移植抗體(圖8B)?？v坐標和橫坐標分別顯示了相對熒光強度和洗脫時間。圖9顯示了通過從CHO/d細胞中產(chǎn)生的純化抗hIL_5Ra⑶R移植抗體制備PA處理的糖鏈并通過反相HPLC分析所獲得的洗脫圖譜?？v坐標和橫坐標分別顯示了相對熒光強度和洗脫時間。在圖10中，圖IOA顯示了未吸收餾分和一部分吸收餾分的⑶3結(jié)合活性，通過改變抗體濃度來測定。縱坐標和橫坐標分別顯示了與⑶3的結(jié)合活性和抗體濃度?！癌? 和" “分別顯示了未吸收餾分和一部分吸收餾分。圖IOB顯示了未吸收餾分和吸收餾分對人黑素瘤細胞系G-361的ADCC活性?？v坐標和橫坐標分別顯示了細胞毒活性和抗體濃度?！癌枴ê汀? “分別顯示了未吸收餾分和一部分吸收餾分。圖11顯示了采用反相HPLC通過分析從未吸收餾分和一部分吸收餾分中制備的PA 處理的糖鏈所獲得的洗脫圖譜。圖IlA和圖IlB分別顯示了未吸收餾分的洗脫圖譜和一部分吸收餾分的洗脫圖譜?？v坐標和橫坐標分別顯示了相對熒光強度和洗脫時間。圖12顯示了從6種抗⑶3嵌合抗體中制備的PA處理糖鏈的洗脫圖譜(圖12A至圖12F)，通過反相HPLC分析而獲得。縱坐標和橫坐標分別顯示了相對熒光強度和洗脫時間。圖13顯示了含有不同比例無a-1，6-巖藻糖的糖鏈的6種抗⑶3嵌合抗體的⑶3 結(jié)合活性，通過改變抗體濃度測定?？v坐標和橫坐標分別顯示了與GD3的結(jié)合活性和抗體濃度。“ 〃，“ □〃，“ ■〃，“ Δ"，“ ▲“和〃 X"分別顯示了抗⑶3嵌合抗體 (50 % )、抗⑶3嵌合抗體(45 % )、抗⑶3嵌合抗體( % )、抗⑶3嵌合抗體( % )、抗⑶3 嵌合抗體(13% )和抗GD3嵌合抗體(7% )的活性。圖14顯示了含有不同比例無a-1，6-巖藻糖的糖鏈的6種抗⑶3嵌合抗體對人黑素瘤細胞系G-361的ADCC活性，使用供體A的效應細胞?？v坐標和橫坐標分別顯示了細胞毒活性和抗體濃度?！?〃，“ □〃，“ ■〃，〃 Δ"，‘‘ ▲“和〃 X"分別顯示了抗 ⑶3嵌合抗體(50% )、抗⑶3嵌合抗體(45% )、抗⑶3嵌合抗體( % )、抗⑶3嵌合抗體 ( %)、抗⑶3嵌合抗體(13%)和抗⑶3嵌合抗體(7%)的活性。圖15顯示了含有不同比例無a-1，6-巖藻糖的糖鏈的6種抗⑶3嵌合抗體對人黑素瘤細胞系G-361的ADCC活性，使用供體B的效應細胞?？v坐標和橫坐標分別顯示了細胞毒活性和抗體濃度?！?〃，“ □〃，“ ■〃，〃 Δ"，‘‘ ▲“和〃 X"分別顯示了抗 ⑶3嵌合抗體(50% )、抗⑶3嵌合抗體(45% )、抗⑶3嵌合抗體( % )、抗⑶3嵌合抗體 ( %)、抗⑶3嵌合抗體(13%)和抗⑶3嵌合抗體(7%)的活性。圖16顯示了從6種抗⑶3嵌合抗體中制備的PA處理糖鏈的洗脫圖譜，通過使用反相HPLC分析獲得?？v坐標和橫坐標分別顯示了相對的熒光強度和洗脫時間。
圖17顯示了具有不同比例無0-1，6_巖藻糖糖鏈的6種抗0^4嵌合抗體的0^4 結(jié)合活性，通過改變抗體濃度測定?？v坐標和橫坐標分別顯示了與CCR4的結(jié)合活性和抗體濃度?！啊觥?，“ □〃，“ ▲〃，〃 Δ"，“ ·"和〃〇〃分別顯示了抗CCR4嵌合抗體 (46% )、抗CCR4嵌合抗體(39%)、抗CCR4嵌合抗體(27% )、抗CCR4嵌合抗體(18%)、抗 CCR4嵌合抗體(9% )和抗CCR4嵌合抗體(8% )的活性。圖18顯示了具有不同比例無α-1，6_巖藻糖糖鏈的抗CCR4嵌合抗體對CCR4/ EL-4細胞的ADCC活性，使用供體A的效應細胞?？v坐標和橫坐標分別顯示了細胞毒活性和抗體濃度。〃■“，〃 □〃，〃▲“，〃 Δ"，‘‘ “和〃〇〃分別顯示了抗CCR4嵌合抗體(46%)、抗CCR4嵌合抗體(39%)、抗CCR4嵌合抗體(27% )、抗CCR4嵌合抗體(18%)、 抗CCR4嵌合抗體(9% )和抗CCR4嵌合抗體(8% )的活性。圖19顯示了具有不同比例無α-1，6_巖藻糖糖鏈的抗CCR4嵌合抗體對CCR4/ EL-4細胞的ADCC活性，使用供體B的效應細胞。縱坐標和橫坐標分別顯示了細胞毒活性和抗體濃度。〃■“，〃 □〃，〃▲“，〃 Δ"，‘‘ “和〃〇〃分別顯示了抗CCR4嵌合抗體(46%)、抗CCR4嵌合抗體(39%)、抗CCR4嵌合抗體(27% )、抗CCR4嵌合抗體(18%)、 抗CCR4嵌合抗體(9% )和抗CCR4嵌合抗體(8% )的活性。圖 20 顯示了質(zhì)粒 CHFT8-pCR2. 1 和 YBFT8_pCR2. 1 的構建。圖21顯示了質(zhì)粒CHAc-pBS和YBAc-pBS的構建。圖 22 顯示了質(zhì)粒 CHFT8d-pCR2. 1 和 YBFT8d_pCR2. 1 的構建。圖 23 顯示了質(zhì)粒 CHAcd-pBS 和 YBAcd-pBS 的構建。圖M顯示了在每個宿主細胞中采用競爭RT-PCR測定FUT8轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的結(jié)果。 當大鼠FUT8序列用作標準和內(nèi)參照時，可顯示在每個宿主細胞系中的FUT8轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量。“■“和"□“分別顯示了當CHO細胞系和TO2/0細胞系用作宿主細胞時的結(jié)果。圖25顯示了質(zhì)粒mfFUT8_pCR2. 1的構建。圖26顯示了質(zhì)粒pBSmfFUT8的構建。圖27顯示了質(zhì)粒pAGEmfFUT8的構建。圖28顯示了采用競爭RT-PCR分析過度表達基因的細胞系中FUT8的表達水平的結(jié)果?？v坐標顯示了 FUT8轉(zhuǎn)錄量與肌動蛋白轉(zhuǎn)錄量的相對值。圖四顯示了從過度表達FUT8基因的細胞中純化的抗⑶3嵌合抗體對人黑素瘤細胞系G-361的ADCC活性?？v坐標和橫坐標分別顯示了細胞毒活性和抗體濃度。圖30顯示從導入了 mfFUT8_6和pAGEM9的細胞系產(chǎn)生的抗體中制備的PA處理糖鏈的洗脫圖譜，通過反相HPLC分析獲得。圖30A和圖30B分別顯示從導入了 mfFUT8_6 的細胞系產(chǎn)生的抗體中制備的PA處理糖鏈和導入了 pAGEM9的細胞系產(chǎn)生的抗體中制備的PA處理糖鏈的洗脫圖譜。縱坐標和橫坐標分別顯示了相對熒光強度和洗脫時間。圖31顯示了從Here印tin中制備的PA處理糖鏈的洗脫圖譜，通過反相HPLC分析獲得?？v坐標和橫坐標分別顯示了相對熒光強度和洗脫時間。圖32顯示了質(zhì)粒CHfFUT8_pCR2. 1的構建。圖33顯示了質(zhì)粒ploxPPuro的構建。圖；34顯示了質(zhì)粒pK0FUT8gE2_l的構建。圖35顯示了質(zhì)粒pK0FUT8gE2_2的構建。
圖36顯示了質(zhì)粒pscFUT8gE2_3的構建。圖37顯示了質(zhì)粒pK0FUT8gE2_3的構建。圖38顯示了質(zhì)粒pK0FUT8gE2_4的構建。圖39顯示了質(zhì)粒pK0FUT8gE2_5的構建。圖40顯示了質(zhì)粒pKOFUTSRiro的構建。圖41顯示了 1號AFUT82-46_1和1號AFUT82-46作為α _1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因斷裂的CHO細胞系的基因組Southern分析的結(jié)果。圖42顯示了從FUT8等位基因斷裂細胞系中純化的抗CCR4嵌合抗體的ADCC活性?？v坐標和橫坐標顯示了細胞毒活性和抗體濃度。，“▲“和"■“分別顯示了從產(chǎn)生抗CCR4嵌合抗體的CHO細胞5-03中獲得的純化抗體和從1號AFUT82_46_1中獲得的純化抗體的活性。圖43顯示了凝集素抗性細胞系產(chǎn)生的抗CCR4人嵌合抗體的ADCC活性。縱坐標和橫坐標顯示了細胞毒活性和抗體濃度?！啊酢?，“ ■〃，“ “和〃 ▲“分別顯示了細胞株 5-03、CH0/CCR4-LCA、CH0/CCR4-AAL 和 CH0/CCR4-PHA 產(chǎn)生的抗體的活性。圖44顯示了凝集素抗性細胞系產(chǎn)生的抗CCR4人嵌合抗體的ADCC活性?？v坐標和橫坐標分別顯示了細胞毒活性和抗體濃度?！啊酢埃?Δ"和〃 “分別顯示了 YB2/0 (KM2760#58-35-16) ,5-03 和 CH0/CCR4-LCA 產(chǎn)生的抗體活性。圖45顯示了從純化的抗CCR4人嵌合抗體中制備的PA處理糖鏈的洗脫圖譜，通過反相HPLC分析獲得。縱坐標和橫坐標分別顯示了相對熒光強度和洗脫時間。圖45A、 圖45B、圖45C和圖45D分別顯示了對細胞株5_03產(chǎn)生的抗體、CH0/CCR4-LCA產(chǎn)生的抗體、 CH0/CCR4-AAL產(chǎn)生的抗體和CH0/CCR4-PHA產(chǎn)生的抗體的分析結(jié)果。圖46顯示了構建來自CHO細胞的GMD表達載體的第一步(總共6步)。圖47顯示了構建來自CHO細胞的GMD表達載體的第二步(總共6步)。圖48顯示了構建來自CHO細胞的GMD表達載體的第三步(總共6步)。圖49顯示了構建來自CHO細胞的GMD表達載體的第四步(總共6步)。圖50顯示了構建來自CHO細胞的GMD表達載體的第五步(總共6步)。圖51顯示了構建來自CHO細胞的GMD表達載體的第六步(總共6步)。圖52顯示了表達GMD的CH0/CCR4-LCA對LCA凝集素的抗性。將不加入LCA凝集素的培養(yǎng)細胞的那一組的存活率定義為100%，測定兩次。在圖表中，“249"顯示導入了表達載體PAGE249的CH0/CCR4-LCA對LCA凝集素的存活率。GMD顯示導入了 GMD表達載體 PAGE249GMD 的 CH0/CCR4-LCA 對 LCA 凝集素的抗性。圖53顯示了表達GMD的CH0/CCR4-LCA細胞系產(chǎn)生的抗CCR4嵌合抗體的ADCC活性?？v坐標和橫坐標分別顯示了細胞毒活性和抗體濃度。圖M顯示了質(zhì)粒CHO-GMD的生產(chǎn)步驟，其中克隆34_2的5’末端引入到來自CHO 細胞的GMD cDNA克隆22-8的5，末端。圖55顯示了從表達GMD基因的CH0/CCR4-LCA中純化的抗CCR4人嵌合抗體中制備的PA處理糖鏈的洗脫圖譜，通過反相HPLC分析獲得?？v坐標和橫坐標分別顯示了相對熒光強度和洗脫時間。實施例1
抗神經(jīng)節(jié)苷脂⑶3人嵌合抗體的產(chǎn)生1.為抗神經(jīng)節(jié)苷脂⑶3人嵌合抗體構建串聯(lián)的表達載體pChiLHGM4采用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo制造)，通過連接含有L鏈cDNA的大約4. 03kb 片段和含G418抗性基因和剪接信號的大約3. 40kb片段構建質(zhì)粒pChi641LGM40，前者通過用限制性酶MluI (Takara Shuzo制造)和Ml I (Takara Shuzo制造)消化L鏈表達載體、 抗神經(jīng)節(jié)苷脂GD3人嵌合抗體(下文被稱作“抗GD3嵌合抗體”)的pChi641LGM4而獲得 [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)]，后者通過使用限制性酶 MluI (Takara Shuzo 制造) 和Mil (Takara Shuzo制造)消化動物細胞表達載體pAGE107獲得[Cytotechnology，1 133 (1990)]，然后用連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HBlOl (分子克隆，第二版)。下一步，含有L鏈cDNA的大約5. 68kb片段與含有H鏈cDNA的大約8. 40kb片段采用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo制造)連接在一起，前者是通過用限制性酶ClaI (Takara Shuzo制造)消化所構建的質(zhì)粒pChi641LGM40，采用DNA鈍化試劑盒(Takara Shuzo制造) 使其末端鈍化，并進一步用MluI (Takara Shuzo制造)消化獲得，后者是通過用限制性酶， XhoI (Takara Shuzo制造)消化抗⑶3嵌合抗體H鏈表達載體，pChi641HGM4 [J. Immunol. Methods, 167,271 (1994)]，采用DNA鈍化試劑盒(Takara Shuzo制造)使其鈍化，并進一步用MluI (Takara Shuzo制造)消化獲得，然后用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HBlOl (分子克隆， 第二版)，從而構建一個抗⑶3嵌合抗體的串聯(lián)表達載體pChi641LHGM4。2.制備穩(wěn)定產(chǎn)生抗⑶3嵌合抗體的細胞如下所述，采用實施例1第1項中構建的抗GD3嵌合抗體串聯(lián)表達載體 pChi641LHGM4，制備能夠穩(wěn)定生產(chǎn)抗⑶3嵌合抗體的細胞。(1)采用大鼠骨髓瘤YB2/0細胞制備產(chǎn)生抗體的細胞在將5μ g抗⑶3嵌合抗體表達載體pChi641LHGM4通過電穿孔[Cytotechnology， 3^133(1990)]引入 4X106 大鼠骨髓瘤 TO2/0 細胞中[ATCC CRL-1662，J. V. Kilmarin 等人， J. Cell. Biol.，93，576-582 (1982) 1 后，細胞懸在 40ml RPMI640-FBS (10)(含有 10% FBS 的RPMI640培養(yǎng)基(GIBCO BRL制造))中，并以200 μ 1/孔分配至96孔平板(Sumitomo Bakelite制造)中。在5% (X)2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)M小時后，加入G418至濃度為0. 5mg/ ml，，然后培養(yǎng)1至2周。從培養(yǎng)孔中回收培養(yǎng)上清液，其中顯示418抗性的轉(zhuǎn)化體集落已形成，并觀察到集落的生長，通過在實施例1中第3項中顯示的ELISA法測定上清液中抗GD3 嵌合抗體的抗原結(jié)合活性。就在孔中的轉(zhuǎn)化體而言，其中可在培養(yǎng)上清液中觀察到抗GD3嵌合抗體的產(chǎn)生， 為了采用DHFA基因擴增系統(tǒng)增加抗體產(chǎn)生的量，每個轉(zhuǎn)化體都懸浮在含有0. 5mg/ml G418 和50nM DHFR抑制劑，氨甲喋呤(下文被稱作“MTX”;SIGMA制造)的RPMI1640-FBS(10)培養(yǎng)基中達到1至2X IO5細胞/毫升的密度，懸液以2毫升的量分配至M孔板(Greiner制造)的每個孔中。顯示50nM MTX抗性的轉(zhuǎn)化體通過在5% CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)1至2周而被誘導。觀察到轉(zhuǎn)化體生長的孔中的培養(yǎng)上清液中抗GD3嵌合抗體的抗原結(jié)合活性通過在實施例1第3項中顯示的ELISA法來測定。就在培養(yǎng)上清液中觀察到產(chǎn)生抗GD3嵌合抗體的孔中的轉(zhuǎn)化體而言，MTX濃度增加至ΙΟΟηΜ，然后增加至200nM，通過上述同樣的方法可最終獲得能夠在含有0. 5mg/ml G418和200nM MTX的RPMI1640-FBS (10)培養(yǎng)基中生長，并產(chǎn)生大量抗GD3嵌合抗體的轉(zhuǎn)化體。在獲得的轉(zhuǎn)化體中，選擇合適的細胞系，并通過有限稀釋兩次制成單細胞(克隆)。也可采用實施例9中顯示的確定α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的方法，選擇出產(chǎn)生相對小量轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細胞系，用作合適的細胞系。所獲得的產(chǎn)生抗⑶3嵌合抗體的轉(zhuǎn)化細胞克隆7-9-51已經(jīng)在1999年4月5 日以FERM ΒΡ-6691存放在國家生物科學和人類技術研究所，工業(yè)科學和技術代理處中(Higashi 1-1-3，筑波大學，茨城，日本)(現(xiàn)名國際專利生物保藏處，國家高級工業(yè)科學和技術研究所 I(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi I-Chome Tsukuba-shi， Ibaraki-ken, Japan))。(2)采用CH0/DG44細胞制備產(chǎn)生抗體的細胞在將4μ g抗⑶3嵌合抗體表達載體pChi641LHGM4通過電穿孔[Cytotechnology， 3^133(1990)]引入 1. 6X 106CH0/DG44 細胞中[G. Urlaub 和 L. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,4216-4220 (1980)]后，細胞懸在 IOml IMDM-FBS(IO)[含有 10% FBS 和 IX 濃度的HT添加液(GIBCO BRL制造)的IMDM培養(yǎng)基(GIBCO BRL制造)]中，并以200 μ 1/孔分配至96孔平板(Iwaki Glass制造)中。在5% CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)M小時后，加入 G418至濃度為0. 5mg/ml，，然后培養(yǎng)1至2周。從培養(yǎng)孔中回收培養(yǎng)上清液，其中顯示G418 抗性的轉(zhuǎn)化體集落已形成，并觀察到集落的生長，通過在實施例1中第3項中顯示的ELISA 法測定上清液中抗GD3嵌合抗體的抗原結(jié)合活性。就在孔中的轉(zhuǎn)化體而言，其中可在培養(yǎng)上清液中觀察到抗GD3嵌合抗體的產(chǎn)生， 為了采用DHFA基因擴增系統(tǒng)增加抗體產(chǎn)生的量，每個都懸浮在含有0. 5mg/ml G418和IOnM MTX的IMDM-dFBS(lO)培養(yǎng)基[含有10%透析的胎牛血清(下文被稱作“dFBS” ;GIBC0 BRL制造)的IMDM培養(yǎng)基]中達到1至2 X IO5細胞/毫升的密度，懸液以0. 5毫升的量分配至24孔板(Iwaki Glass制造)的每個孔中。顯示IOnM MTX抗性的轉(zhuǎn)化體通過在5% CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)1至2周而被誘導。就觀察到生長的孔中的轉(zhuǎn)化體而言，MTX濃度增加至ΙΟΟηΜ，通過上述同樣的方法可最終獲得能夠在含有0. 5mg/ml G418和IOOnM MTX的 IMDM-dFBS(lO)培養(yǎng)基中生長，并產(chǎn)生大量抗GD3嵌合抗體的轉(zhuǎn)化體。在獲得的轉(zhuǎn)化體中， 選擇合適的細胞系，并通過有限稀釋兩次制成單細胞(克隆)。也可采用實施例9中顯示的確定α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的方法，選擇出產(chǎn)生相對小量轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細胞系，用作為合適的細胞系。(3)采用小鼠骨髓瘤NSO細胞制備產(chǎn)生抗體的細胞在將5μ g抗⑶3嵌合抗體表達載體pChi641LHGM4通過電穿孔[Cytotechnology， 3^133(1990)]引入4X IO6小鼠骨髓瘤NSO細胞中后，細胞懸在40ml EX-CELL302-FBS(10) [含有10% FBS和2mM L-谷氨酰胺(下文被稱作"L-Gln" ；GIBCO BRL制造)的EX-CELL 302培養(yǎng)基]中，并以200 μ 1/孔分配至96孔平板(Sumitomo Bakelite制造)中。在5% CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)M小時后，加入G418至濃度為0. 5mg/ml,，然后培養(yǎng)1至2周。從培養(yǎng)孔中回收培養(yǎng)上清液，其中顯示G418抗性的轉(zhuǎn)化體集落已形成，并觀察到集落的生長， 通過在實施例1中第3項中顯示的ELISA法測定上清液中抗GD3嵌合抗體的抗原結(jié)合活性。就在孔中的轉(zhuǎn)化體而言，其中可在培養(yǎng)上清液中觀察到抗GD3嵌合抗體的產(chǎn)生， 為了采用DHFA基因擴增系統(tǒng)增加抗體產(chǎn)生的量，每個都懸浮在含有0. 5mg/ml G418和50nM MTX 的 EX-CELL302-dFBS(10)培養(yǎng)基(含有 10 % dFBS 和 2mM L-Gln 的 EX-CELL302 培養(yǎng)基)中達到1至2X105細胞/毫升的密度，懸液以2毫升的量分配至對孔板(Greiner制造)的每個孔中。顯示50nM MTX抗性的轉(zhuǎn)化體通過在5% CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)1至2周而被誘導。觀察到轉(zhuǎn)化體生長的孔中的培養(yǎng)上清液中抗GD3嵌合抗體的抗原結(jié)合活性通過在實施例1第3項中顯示的ELISA法來測定。就在培養(yǎng)上清液中觀察到抗GD3嵌合抗體產(chǎn)生的孔中的轉(zhuǎn)化體而言，MTX濃度增加至ΙΟΟηΜ，然后增加至200nM，通過上述同樣的方法可最終獲得能夠在含有0. 5mg/ml G418和200nM MTX的EX-CELL302_d FBS(IO)培養(yǎng)基中生長， 并產(chǎn)生大量抗GD3嵌合抗體的轉(zhuǎn)化體。在獲得的轉(zhuǎn)化體中，選擇合適的細胞系，并通過有限稀釋兩次制成單細胞(克隆)。也可采用實施例9中顯示的確定α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的方法，選擇出產(chǎn)生相對小量轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細胞系，用作為合適的細胞系。3.檢測抗體與⑶3的結(jié)合活性(ELISA)抗體與⑶3的結(jié)合活性如下所述測定。在含有10 μ g 二棕櫚酰磷脂酰膽堿(SIGMA制造)和5 μ g膽固醇(SIGMA制造) 的2ml乙醇溶液中，溶解4nmol⑶3。為進行ELISA，96孔板(Greiner制造)的每孔中分配 20 μ 1溶液(終濃度40pmol/孔)，然后空氣干燥，加入含1 %牛血清白蛋白(下文被稱作 “BSA”;SIGMA制造)的PBS (下文被稱作“ 1 % BSA-PBS")，100 μ 1/孔，然后在室溫下反應1 小時以阻斷殘余的活性基團。去除BSA-PBS后，轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清液或人嵌合抗體的稀釋溶液以50 μ 1/孔分配，在室溫下反應1小時。反應后，每孔用含0. 05% Tween 20 (Wako Pure Chemical Industries 制造)的 PBS (下文被稱作“Tween-PBS”)沖洗，以 50 μ 1/ 孔加入用1%BSA-PBS稀釋3，000倍的過氧化物酶標記的羊抗人18601 & L)抗體溶液(American Qualex制造)作為二抗溶液，然后在室溫下反應1小時。在反應及隨后用Tween-PBS沖洗后，ABTS底物溶液[溶液的制備通過將0. 55g 2，2’ -吖嗪-二(3-乙苯噻唑啉-6-磺酸) 銨鹽溶解在1升0. IM檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.2)中，并在使用前向溶液中加入1 μ 1/ml過氧化氫(此后使用同樣的溶液)]以50 μ 1/孔加入顯色，然后測定415nm處的吸收度(此后指 “0D415，，)。4.抗⑶3嵌合抗體的純化(1)來自TO2/0細胞的生產(chǎn)抗體細胞的培養(yǎng)和抗體的純化在實施例1的第2(1)項中獲得的生產(chǎn)抗GD3嵌合抗體的轉(zhuǎn)化細胞克隆懸浮在含有0. 2% BSA，200nM MTX和IOOnM三碘甲腺原氨酸(此后稱為“T3” ；SIGMA制造)的雜交瘤-SFM培養(yǎng)基中達到3X105細胞/毫升的密度，并采用2.0升容積的旋動瓶(Iwaki Glass 制造)中在50rpm的速率下攪拌培養(yǎng)。在溫控室內(nèi)37°C下培養(yǎng)10天，收獲培養(yǎng)上清液。采用印-A^ioprocessing制造)柱根據(jù)制造廠商的說明書從培養(yǎng)上清液中純化抗⑶3 嵌合抗體。純化的抗GD3嵌合抗體命名為YB2/0-GD3嵌合抗體。(2)來自CH0/DG44細胞的生產(chǎn)抗體細胞的培養(yǎng)和抗體的純化在實施例1的第2(2)項中獲得的生產(chǎn)抗GD3嵌合抗體的轉(zhuǎn)化細胞克隆懸浮在含有3mM L-Gln、0. 5%脂肪酸濃縮溶液(此后指“CDLC”;GIBC0 BRL制造)和0. 3% Pluronic F68(此后指“PF68” ；GIBCO BRL制造)的EX-CELL302培養(yǎng)基中達到IXlO6細胞/毫升的密度，并在175mm2培養(yǎng)皿(Greiner制造)中加入50ml懸液。在37°C下5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后，收獲培養(yǎng)上清液。采用印-A^ioprocessing制造)柱根據(jù)制造廠商的說明書從培養(yǎng)上清液中純化抗GD3嵌合抗體。純化的抗GD3嵌合抗體命名為CH0/DG44-GD3嵌合抗體。(3)來自NSO細胞的生產(chǎn)抗體細胞的培養(yǎng)和抗體的純化在實施例1的第2(3)項中獲得的生產(chǎn)抗GD3嵌合抗體的轉(zhuǎn)化細胞克隆懸浮在含有 2mM L-Gln, 0. 5%mg/ml G418，200nM MTX和 1 % FBS 的 EX-CELL302 培養(yǎng)基中達到 1 X IO6 細胞/毫升的密度，并在175mm2培養(yǎng)皿(Greiner制造)中加入懸液。在37°C下5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后，收獲培養(yǎng)上清液。采用印-A^ioprocessing制造)柱根據(jù)制造廠商的說明書從培養(yǎng)上清液中純化抗GD3嵌合抗體。純化的抗GD3嵌合抗體命名為NS0-GD3 嵌合抗體(302)。轉(zhuǎn)化細胞克隆也懸浮在含有0. 5mg/ml G418和200nM MTX的GIT培養(yǎng)基中，達到 3X IO5細胞/毫升的密度，并在175mm2培養(yǎng)皿(Greiner制造)中加入懸液。在37°C下5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天后，收獲培養(yǎng)上清液。采用印-A^ioprocessing制造)柱根據(jù)制造廠商的說明書從培養(yǎng)上清液中純化抗GD3嵌合抗體。純化的抗GD3嵌合抗體命名為 NS0-GD3 嵌合抗體(GIT)。(4)來自SP2/0細胞的生產(chǎn)抗體細胞的培養(yǎng)和抗體的純化在日本已公開的未審查專利申請?zhí)?04989/93(EP 533199)中所描述的產(chǎn)生抗 GD3嵌合抗體的細胞克隆(KM-871 (FERM BP-3512))懸浮在含有0. 5mg/ml G418和200nM MTX的GIT培養(yǎng)基中，達到3X IO5細胞/毫升的密度，并在175mm2培養(yǎng)皿(Greiner 制造)中加入懸液。在37°C下5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8天后，收獲培養(yǎng)上清液。采用
印-A^ioprocessing制造)柱根據(jù)制造廠商的說明書從培養(yǎng)上清液中純化抗⑶3嵌合抗體。純化的抗⑶3嵌合抗體命名為SP2/0-GD3嵌合抗體。5.純化的抗⑶3嵌合抗體的分析根據(jù)一種已知的方法[Nature, 227,680 (1970) ]，4 μ g5種在實施例1第4項中獲得的從相應的動物細胞中產(chǎn)生和純化的抗GD3嵌合抗體的每一種，經(jīng)過SDS-PAGE以分析分子量和純化度。結(jié)果在圖1中顯示。如圖1所示，在每個純化的抗GD3嵌合抗體中，在非還原條件下發(fā)現(xiàn)一條分子量大約為150千道爾頓(此后稱為“Kd”)的條帶，在還原條件下發(fā)現(xiàn)兩條大約50Kd和大約25Kd的條帶。分子量與從抗體的H鏈和L鏈的cDNA核苷酸序列中推算出來的分子量是一致的(H鏈大約49Kd，L鏈大約2!3Kd，整個分子大約144Kd)， 也與報道的一致，報道說IgG抗體的分子量在非還原條件下大約為150Kd，在還原條件下由于分子中二硫鍵(此后稱為“S-S鍵”)的切斷降解為分子量為大約50Kd的H鏈和分子量為大約 25Kd 的 L 鏈[抗體實驗室指南，Cold Spring Harbor Laboratory，第 14 章(1998)； 單克隆抗體原理和實踐，Academic Press Limited(1996)]，因此證明可以表達每一個抗 GD3嵌合抗體，并作為具有正確結(jié)構的抗體分子被純化。實施例2抗⑶3嵌合抗體的活性評定1.抗⑶3嵌合抗體與⑶3的結(jié)合活性(ELISA)在實施例1的第4項中5種純化抗⑶3嵌合抗體與⑶3 (Snow Brand Milk Products制造)的結(jié)合活性通過實施例1中第3項中顯示的ELISA法測定。圖2顯示了通過改變所添加抗GD3嵌合抗體的濃度所測定的結(jié)合活性的檢測結(jié)果。如在圖2中所顯示的，5種抗GD3嵌合抗體顯示了與GD3幾乎相同的結(jié)合活性。該結(jié)果顯示這些抗體的抗原結(jié)合活性是不變的，不依賴于產(chǎn)生抗體的細胞和培養(yǎng)方法。從NS0-GD3嵌合抗體(302)與 NS0-GD3嵌合抗體(GIT)的比較中也表明，抗原結(jié)合活性是不變的，不依賴于在培養(yǎng)中使用
的培養(yǎng)基。2.抗⑶3嵌合抗體的體外細胞毒活性(ADCC活性)為了評定在實施例1的第4項中獲得的5種純化的抗GD3嵌合抗體的體外細胞毒活性，根據(jù)下面的方法檢測ADCC活性。(1)制備靶細胞懸液采用RPMI1640-FBS(10)培養(yǎng)基培養(yǎng)人黑素瘤培養(yǎng)細胞系G_361 (ATCC CRL 1似4)，制備IX IO6細胞，細胞通過與3. 7MBq當量的放射性物質(zhì)Na251Cr0437°C作用1小時進行放射性同位素標記。反應后，細胞在它們的RPMI1640-FBS (10)培養(yǎng)基懸液中沖洗3次，并離心，重新懸浮在培養(yǎng)基中，然后在4°C在冰中孵育30分鐘，對放射性物質(zhì)進行自發(fā)分解。 離心后，沉淀物通過加入5毫升RPMI1640-FBS(10)培養(yǎng)基后調(diào)整為2 X IO5細胞/毫升，并用作靶細胞懸液。(2)制備效應細胞懸液從一個健康的人中收集50毫升靜脈血，輕輕的與0.5ml肝素鈉(Takeda Pharmaceutical制造)混合?；旌衔镫x心采用Lymphopr印(Nycomed Pharma AS制造)根據(jù)制造廠商的說明書分離出單核細胞層。用RPMI1640-FBS(10)培養(yǎng)基沖洗離心三次后，得到的沉淀物用培養(yǎng)基重新懸起，達到2 X IO6細胞/毫升的密度，并作為效應細胞懸液。(3)檢測 ADCC 活性在96孔U形底平板O^lcon制造)的每個孔中，加入50 μ 1上面(1)制備的靶細胞懸液(IXlO4細胞/孔)。下一步，加入上面( 制備的效應細胞懸液100 μ K2 X IO5細胞/孔，效應細胞與靶細胞的比例為20 1)。隨后，加入每種抗GD3嵌合抗體，達到終濃度0.0025至2.5yg/ml，接著在37°C反應4小時。反應后，離心平板，使用Y -計數(shù)測定上清液中51Cr的量。通過同樣的操作方法僅使用培養(yǎng)基而不是效應細胞懸液和抗體溶液，并測定上清液中51Cr的量，計算自發(fā)釋放的51Cr量。通過同樣的操作方法僅使用培養(yǎng)基而不是抗體溶液，加入IN鹽酸而不是效應細胞懸液，并測定上清液中51Cr的量，計算總共釋放的 51Cr量。從下面的公式(II)計算ADCC活性
樣品上清液中51Cr-自發(fā)釋放的51Cr
ADCC 活性( )= - xlOO (II)
總共釋放的51Cr-自發(fā)釋放的51Cr結(jié)果在圖3中顯示。如在圖3中所顯示的，在5種抗⑶3嵌合抗體中，TB2/0-GD3 嵌合抗體顯示最大的ADCC活性，然后的順序是SP2/0-GD3嵌合抗體，NS0-GD3嵌合抗體和CH0-GD3嵌合抗體。發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)中采用不同培養(yǎng)基制備的NS0-GD3嵌合抗體(302)和 NS0-GD3嵌合抗體(GIT)在ADCC活性方面沒有差異。上面的結(jié)果顯示了抗體的ADCC活性根據(jù)在生產(chǎn)過程中使用的動物的種類變化很大。就其機制而言，因為它們的抗原結(jié)合活性是相同的，可以考慮這是由于在與抗體Fc區(qū)結(jié)合的結(jié)構上的差異所導致的。實施例3抗人白介素5受體α鏈人⑶R移植抗體的制備
1.制備穩(wěn)定產(chǎn)生抗人白介素5受體α鏈人CDR移植抗體的細胞(1)采用大鼠骨髓瘤ΥΒ2/0細胞制備產(chǎn)生抗體的細胞使用在W097/103M中所描述的抗人白介素5受體α鏈人⑶R移植抗體(此后稱為“抗hIL-5R α⑶R移植抗體”)表達載體，pKANTEX1259HV3LV0,如下所述制備能夠穩(wěn)定產(chǎn)生抗hIL_5R α⑶R移植抗體的細胞。在將5 μ g抗hIL_5Ra CDR移植抗體表達載體pKANTEX1259HV3LV0通過電穿孔 [Cytotechnology, 3^133 (1990)]引入4X IO6大鼠骨髓瘤YB2/0細胞中后，細胞懸在40ml RPMI640-FBS(10)中，并以 200 μ 1/孔分配至 96 孔平板(Sumitomo Bakelite 制造)中。在 5% CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)M小時后，加入G418至濃度為0. 5mg/ml，，然后培養(yǎng)1至2周。 從培養(yǎng)孔中收集培養(yǎng)上清液，其中顯示G418抗性的轉(zhuǎn)化體集落已形成，并觀察到集落的生長，通過在實施例3中第2項中顯示的ELISA法測定上清液中抗hIL-5Ra⑶R移植抗體的抗原結(jié)合活性。就在孔中的轉(zhuǎn)化體而言，其中可在培養(yǎng)上清液中觀察到抗hIL_5R α CDR移植抗體的產(chǎn)生，為了采用DHFA基因擴增系統(tǒng)增加抗體產(chǎn)生的量，每個都懸浮在含有0. 5mg/ml G418禾口 50nM MTX的RPMI1640-FBS (10)培養(yǎng)基中達到1至2 X IO5細胞/毫升的密度，懸液以2毫升的量分配至M孔板(Greiner制造)的每個孔中。顯示50nM MTX抗性的轉(zhuǎn)化體通過在5% CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)1至2周而被誘導。觀察到轉(zhuǎn)化體生長的孔中的培養(yǎng)上清液中抗hIL_5R α⑶R移植抗體的抗原結(jié)合活性通過在實施例3第2項中顯示的ELISA法來測定。就可在培養(yǎng)上清液中觀察到抗hIL-5Ra CDR移植抗體產(chǎn)生的孔中的轉(zhuǎn)化體而言，MTX濃度增加至ΙΟΟηΜ，然后增加至200nM，通過上述同樣的方法可最終獲得能夠在含有0. 5mg/ml G418和200nM MTX的RPMI1640-FBS (10)培養(yǎng)基中生長，并產(chǎn)生大量抗hIL_5R α CDR移植抗體的轉(zhuǎn)化體。在獲得的轉(zhuǎn)化體中，選擇合適的細胞系，并通過有限稀釋兩次制成單細胞(克隆)。也可采用實施例9中顯示的確定α-1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的方法，選擇出產(chǎn)生相對小量轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細胞系，用作為合適的細胞系。所獲得的產(chǎn)生抗hIL-5RaCDR 移植抗體的轉(zhuǎn)化細胞克隆No. 3已經(jīng)在1999年4月5日以FERM BP-6690存放在國家生物科學和人類技術研究所，工業(yè)科學和技術代理處中(Higashi 1-1-3，筑波大學，茨城，日本) (現(xiàn)名國際專利生物保藏處，國家高級工業(yè)科學和技術研究院(AIST Tsukuba Central 6， 1-1, Higashi I-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan))。(2)使用CHO/dhfr—細胞制備產(chǎn)生抗體的細胞在將4μ g在WO 97/10354描述的抗hIL_5Ra CDR移植抗體表達載體 PKANTEX1259HV3LV0 通過電穿孔[Cytotechnology，1133 (1990)]弓丨入 1.6X106CH0/ dhff細胞中后，細胞懸在10ml IMDM-FBS(IO)中，并以200 μ 1/孔分配至96孔平板(Iwaki Glass制造)中。在5% 0)2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)M小時后，加入G418至濃度為0. 5mg/ ml，，然后培養(yǎng)1至2周。從每個孔中收集培養(yǎng)上清液，其中顯示G418抗性的轉(zhuǎn)化體集落已形成，并觀察到集落的生長，通過在實施例3中第2項中顯示的ELISA法測定上清液中抗 hIL_5R α⑶R移植抗體的抗原結(jié)合活性。就在孔中的轉(zhuǎn)化體而言，其中可在培養(yǎng)上清液中觀察到抗hIL-5Ra CDR移植抗體的產(chǎn)生，為了采用DHFA基因擴增系統(tǒng)增加抗體產(chǎn)生的量，每個轉(zhuǎn)化體都懸浮在含有0. 5mg/ ml G418和IOnM MTX的IMDM_dFBS (10)培養(yǎng)基中達到1至2 X IO5細胞/毫升的密度，懸液以0.5毫升的量分配至M孔板(Iwaki Glass制造)的每個孔中。顯示IOnM MTX抗性的轉(zhuǎn)化體通過在5% CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)1至2周而被誘導。就觀察到生長的孔中的轉(zhuǎn)化體而言，MTX濃度增加至ΙΟΟηΜ，然后增加至500nM，通過上述同樣的方法可最終獲得能夠在含有 0. 5mg/mlG418 和 500nM MTX 的 IMDM-dFBS (10)培養(yǎng)基中生長，并產(chǎn)生大量抗 hIL_5Ra CDR 移植抗體的轉(zhuǎn)化體。在獲得的轉(zhuǎn)化體中，選擇合適的細胞系，并通過有限稀釋兩次制成單細胞(克隆)。也可采用實施例9中顯示的確定a-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的方法，選擇出產(chǎn)生相對小量轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細胞系，用作為合適的細胞系。
(3)采用小鼠骨髓瘤NSO細胞制備產(chǎn)生抗體的細胞 根據(jù)Yarranton等人的方法制備抗hIL_5R α⑶R移植抗體表達載體[BIO/ TECHNOLOGY, 10,169 (1992) 1,并使用在 TO 97/10354 中描述的抗 hIL_5R a CDR 移植抗體表達載體pKANTEX1259HV3LV0上的抗體H鏈cDNA和L鏈cDNA，NSO細胞被轉(zhuǎn)化獲得能夠產(chǎn)生大量抗hIL_5Ra CDR移植抗體的轉(zhuǎn)化體。在獲得的轉(zhuǎn)化體中，選擇合適的細胞系，并通過有限稀釋兩次制成單細胞(克隆)。也可采用實施例9中顯示的確定a-l，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的方法，選擇出產(chǎn)生相對小量轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細胞系，用作為合適的細胞系。2.檢測抗體與hIL_5Ra的結(jié)合活性(ELISA)抗體與hIL_5Ra的結(jié)合活性如下所述測定。通過用PBS稀釋在W097/103M中所述的抗hIL_5R α小鼠抗體KM1257制備溶液， 達到10 μ g/ml的濃度，50 μ 1得到的溶液加入至進行ELISA的96孔板的每個孔中(Greiner 制造)，然后在4°C反應20小時。反應后，BSA-PBS以100 μ 1/孔加入，然后在室溫下反應1小時以阻斷殘余的活性基團。去除BSA-PBS后，用BSA-PBS稀釋W097/103M 中所描述的可溶性hIL-5Ra制備濃度為0. 5 μ g/ml的溶液，以50 μ 1/孔加入到每孔中， 然后在4V反應20小時。反應后，每孔用含Tween-PBS沖洗，以50 μ 1/孔加入用轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清液或純化的人CDR移植抗體的稀釋溶液，在室溫下反應2小時。反應后，每孔用 Tween-PBS沖洗，以50 μ 1/孔加入10A BSA-PBS稀釋3，000倍的過氧化物酶標記的羊抗人 IgG (H & L)抗體溶液(American Qualex制造)作為第二抗體溶液，然后在室溫下反應1小時。反應后，隨后用Tween-PBS沖洗，ABTS底物溶液以50 μ 1/孔加入顯色，然后在0D415測定吸收度。3.抗hIL_5Ra CDR移植抗體的純化(1)來自TO2/0細胞的生產(chǎn)抗體的細胞的培養(yǎng)和抗體的純化在實施例3的第1 (1)項中獲得的生產(chǎn)抗hIL_5Ra⑶R移植抗體的轉(zhuǎn)化細胞克隆懸浮在含有0. 5mg/ml和200nM MTX的GIT培養(yǎng)基中達到3 X IO5細胞/毫升的密度，并以 200ml加入至175mm2培養(yǎng)皿中(Greiner制造)。在5% (X)2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)8天后，收集培養(yǎng)上清液。采用離子交換層析和凝膠過濾法從培養(yǎng)上清液純化抗hIL_5R a CDR移植抗體。純化的抗hIL-5R a CDR移植抗體命名為TO2/0-hIL_5R CDR抗體。(2)來自CH0/dhfr_的生產(chǎn)抗體細胞的培養(yǎng)和抗體的純化在實施例3的第1 (2)項中獲得的生產(chǎn)抗hIL_5Ra⑶R移植抗體的轉(zhuǎn)化細胞克隆懸浮在含有3mM G-Lln，0. 5CDLC和0. 3 % PF68的EX-CELL302培養(yǎng)基中，達到3 X IO5細胞/ 毫升的密度，并以采用4. 0升容積旋動瓶(Iwaki Glass制造)在IOOrpm的速率振搖培養(yǎng)。 在37°C溫控室內(nèi)培養(yǎng)10天后，收集培養(yǎng)上清液。采用離子交換層析和凝膠過濾法從培養(yǎng)上清液純化抗hIL_5Ra⑶R移植抗體。純化的抗hIL_5R α⑶R移植抗體命名為CH0/d-hIL_5R CDR抗體。(3)來自NSO細胞的生產(chǎn)抗體細胞的培養(yǎng)和抗體的純化在實施例3的第1 (3)項中獲得的生產(chǎn)抗hIL_5Ra⑶R移植抗體的轉(zhuǎn)化細胞克隆根據(jù)Yarranton等人[BI0/TECHN0L0GY，1169 (1992)]的方法進行培養(yǎng)，然后收集培養(yǎng)上清液。采用離子交換層析和凝膠過濾法從培養(yǎng)上清液純化抗hIL_5R α CDR移植抗體。純化的抗hIL-5R α CDR移植抗體命名為NS0_hIL_5R CDR抗體。4.純化的抗hIL_5Ra⑶R移植抗體的分析根據(jù)已知的方法[Nature，絲Ζ，680(1970)]，4μ g 5種在實施例3第3項中獲得的從每種動物細胞中產(chǎn)生和純化的抗hIL_5R α⑶R移植抗體的每一種，經(jīng)過SDS-PAGE以分析分子量和純化度。結(jié)果在圖4中顯示。如圖4所示，在每個純化的抗hIL_5R α⑶R移植抗體中，在非還原條件下發(fā)現(xiàn)一條分子量大約為150Kd的條帶，在還原條件下發(fā)現(xiàn)兩條大約 50Kd和大約25Kd的條帶。分子量與從抗體的H鏈和L鏈的cDNA核苷酸序列中推算出來的分子量是一致的(H鏈大約49Kd，L鏈大約2!3Kd，整個分子大約144Kd)，也與報道的一致，報道說IgG抗體的分子量在非還原條件下大約為150Kd，在還原條件下由于分子中二硫鍵(此后稱為“S-S鍵”)的切斷降解為分子量為大約50Kd的H鏈和分子量為大約25Kd的 L鏈[抗體實驗室指南，Cold Spring Harbor Laboratory，第14章(1998)；單克隆抗體 原理和實踐，Academic Press Limited (1996)]，因此證明可以表達每一個抗hIL_5R α CDR 移植抗體，并作為具有正確結(jié)構的抗體分子被純化。實施例4抗hIL_5R α⑶R移植抗體的活性評定1.抗hIL_5R α CDR移植抗體與hIL_5R α的結(jié)合活性(ELISA)在實施例3的第3項中獲得的3種純化抗hIL_5R α⑶R移植抗體與hIL_5R α的結(jié)合活性通過實施例3中第2項中顯示的ELISA法測定。圖5顯示了通過改變所添加抗 hIL-5R α CDR移植抗體的濃度所測定的結(jié)合活性的檢測結(jié)果。如在圖5中所顯示的，3種抗 hIL_5Ra⑶R移植抗體顯示了與hIL_5Ra幾乎相同的結(jié)合活性。該結(jié)果顯示這些抗體的抗原結(jié)合活性是不變的，不依賴于產(chǎn)生抗體的動物細胞和培養(yǎng)方法，類似于實施例2中第1項的結(jié)果。2.抗hIL_5R α⑶R移植抗體的體外細胞毒活性(ADCC活性)為了評定在實施例3的第3項中獲得的3種純化的抗hIL_5R α⑶R移植抗體的體外細胞毒活性，根據(jù)下面的方法檢測ADCC活性。(1)制備靶細胞懸液采用RPMI1640_FBS(10)培養(yǎng)基培養(yǎng)WO 97/10354中描述的表達hIL_5R α鏈和 β鏈的小鼠T細胞系CTLL-2(h5R)至IX IO6細胞/0.5毫升的密度，細胞通過與3. 7MBq 當量的放射性物質(zhì)Na251CrO4于37°C作用1. 5小時進行放射性同位素標記。反應后，細胞在它們的RPMI1640-FBS(10)培養(yǎng)基懸液中沖洗3次，并離心，重新懸浮在培養(yǎng)基中，然后在4°C在冰中孵育30分鐘，對放射性物質(zhì)進行自發(fā)分解。離心后，沉淀物通過加入5毫升 RPMI1640-FBS(10)培養(yǎng)基后調(diào)整為2 X IO5細胞/毫升，并用作靶細胞懸液。(2)制備效應細胞懸液
從一個健康的人中收集50毫升靜脈血，輕輕的與0.5ml肝素鈉(Takeda Pharmaceutical 制造)混合。混合物離心采用 Polymorphpr印(Nycomed Pharma AS 制造) 根據(jù)制造廠商的說明書分離出單核細胞層。用RPMI1640-FBS(10)培養(yǎng)基沖洗離心三次后， 得到的細胞用培養(yǎng)基重新懸起，達到9 X IO6細胞/毫升的密度，并作為效應細胞懸液。(3)檢測 ADCC 活性在96孔U形底平板O^lcon制造)的每個孔中，加入上面(1) O制備的靶細胞懸液(IXio4細胞/孔)。下一步，加入上面⑵制備的效應細胞懸液100 μ 1(9X IO5細胞/ 孔，效應細胞與靶細胞的比例為90 1)。隨后，加入每種抗hIL-5Ra⑶R移植抗體，達到終濃度0.001至0. lyg/ml，接著在37°C反應4小時。反應后，離心平板，使用Y-計數(shù)測定上清液中51Cr的量。通過同樣的操作方法僅使用培養(yǎng)基而不是效應細胞懸液和抗體溶液， 并測定上清液中51Cr的量，計算自發(fā)釋放的51Cr量。通過同樣的操作方法僅使用培養(yǎng)基而不是抗體溶液，加入IN鹽酸而不是效應細胞懸液，并測定上清液中51Cr的量，計算總共釋放的51Cr量。從上面的公式(II)計算ADCC活性。結(jié)果在圖6中顯示。如在圖6中所顯示的，在3種抗hIL_5Ra⑶R移植抗體中， YB2/0-hIL-5R CDR抗體顯示最大的ADCC活性，然后的順序是CH0/d-hIL_5R CDR抗體， NS0-hIL-5R⑶R抗體。類似于實施例2第2項中的結(jié)果，上述結(jié)果顯示了抗體的ADCC活性根據(jù)在生產(chǎn)過程中使用的動物的種類變化很大。另外，因為YB2/0細胞所產(chǎn)生的抗體在兩種類型的人源化抗體的情況下均顯示了最大的ADCC活性，所以表明具有最大ADCC活性的抗體可采用YB2/0細胞來產(chǎn)生。3.抗hIL_5R a CDR移植抗體體內(nèi)活性的評定為了評定對實施例3的第3項所獲得的3種純化抗hIL_5R α⑶R移植抗體的體內(nèi)活性，根據(jù)下面的方法檢測在hIL-5-誘發(fā)的嗜酸性粒細胞增加的Macaca faseicularis模型中的抑制活性。在背部皮膚下將hIL-5 (制備方法見WO 97/10354)以1 μ g/kg的劑量給予Macaca faseicularis，第一天開始，每天一次，總共14次。在第0天給予hIL_5之前1小時，每個都以0. 3mg/kg的劑量經(jīng)靜脈給予抗hIL-5Ra⑶R移植抗體。未加入抗體的組作為對照組。 在給予抗體的組，每組中使用3個Macaca faseicularis動物(第301，第302，第303，第 401，第402，第403，第501，第502和第50 ，兩個動物(第101和第10 作為未加抗體組。在開始給藥前7天開始，直到給藥后42天，從隱靜脈或股靜脈周期性的收集大約1毫升血，測定Iyl外周血中的嗜酸性粒細胞數(shù)目。結(jié)果在圖7中顯示。如在圖7中顯示的， 在給予YB2/0-hIL-5R⑶R抗體的組中血中嗜酸性粒細胞增加完全被抑制。在另一方面，在給予CH0/d-hIL-5R CDR抗體的組中的一個動物中發(fā)現(xiàn)了完全的抑制活性，但在兩個動物中的抑制活性并不完全。在給予NS0-hIL-5R CDR抗體的組中，未發(fā)現(xiàn)完全的抑制活性，其效應不完全。上述的結(jié)果顯示了抗體的體內(nèi)活性根據(jù)用來生產(chǎn)它們的動物細胞變化很大。另夕卜，由于在抗hIL-5Ra CDR移植抗體的體內(nèi)活性程度與在實施例4的第2項中所述的ADCC 活性程度之間發(fā)現(xiàn)了正相關，因此表明ADCC活性程度對其活性表達是非常重要的?；谏鲜龅慕Y(jié)果，可以期望的是具有較大ADCC活性的抗體也可用于人類多種疾病的臨床領域。實施例5分析增強ADCC活性的糖鏈1.制備2-氨基吡啶標記的糖鏈(PA處理的糖鏈)本發(fā)明的人源化抗體是用鹽酸進行酸水解以去除唾液酸。在完全移除鹽酸后，通過胼解作用從蛋白質(zhì)上切除糖鏈[酶學方法，迎，263(198幻]。去除胼，通過添加水樣醋酸銨溶液和乙酸酐進行N-乙?；Ｔ趦龈珊?，用2-氨基吡啶進行熒光標記[J. Biochem.， 95,197 (1984) J0熒光標記的糖鏈(PA處理的糖鏈)采用Surperdex Peptide HR10/30柱 (Pharmacia制造)從雜質(zhì)中分離。糖鏈餾分采用離心濃縮機進行干燥，并作為純化的PA處理糖鏈。2.純化抗hIL_5R α⑶R移植抗體的PA處理糖鏈的反相HPLC分析根據(jù)實施例5的第1項中的方法，在實施例3中產(chǎn)生的多種抗hIL_5Ra⑶R移植抗體進行PA處理糖鏈的處理，通過CLC-ODS柱(Shimadzu制造)進行反相HPLC分析。向 PA處理糖鏈中加入過量的a-L-巖藻糖苷酶(來自牛腎，SIGMA制造)進行消化(37°C，15 小時)，然后用反相HPLC(圖8)分析產(chǎn)物。已證實的是天冬酰胺連接的糖鏈采用Takara Shuzo制造的PA處理糖鏈標準品洗脫30分鐘至80分鐘。通過a -L-巖藻糖苷酶的消化， 反相HPLC洗脫位置轉(zhuǎn)變(糖鏈洗脫48分鐘至78分鐘)的糖鏈比例可以計算。結(jié)果在表 1中顯示。表 1由TO2/0細胞產(chǎn)生的抗hIL_5R⑶R移植抗體的大約47%，和NSO細胞產(chǎn)生的抗 hIL-5R⑶R移植抗體的大約73%是糖鏈，其中巖藻糖的1號位置通過N-糖苷連接糖鏈的 α-鍵(此后稱為“具有a-1，6-巖藻糖的糖鏈”)與還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6號位置結(jié)合。因此，巖藻糖的1號位置不通過N-糖苷連接糖鏈的α-鍵(此后稱為“無a-1， 6-巖藻糖的糖鏈”)與還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6號位置結(jié)合的糖鏈比例，在TO2/0 細胞產(chǎn)生的抗體中較NSO細胞產(chǎn)生的抗體中要高。3.純化的抗hIL_5R α⑶R移植抗體單糖組合物的分析YB2/0細胞，NSO細胞和CHO/d細胞產(chǎn)生的抗hIL_5R α⑶R移植抗體糖鏈通過用三氟醋酸的酸水解作用被水解成單糖，采用BioLC(Dionex制造)進行單糖組合物的分析。在N-糖苷連接的糖鏈中，在復合體型N-糖苷連接糖鏈中的一個糖鏈中有3個甘露糖單位。通過甘露糖數(shù)目為3計算獲得的每個單糖的相對比例在表2中顯示。表2
產(chǎn)生抗體的細胞
a-1,6-巖藻糖連接的糖鏈(％)
YB2/0 NSO
47 7權利要求
1.一種產(chǎn)生抗體組合物的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)CHO細胞以便在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和積累抗體組合物；并從培養(yǎng)物中回收抗體組合物，所述CHO細胞中導入了編碼抗體分子的基因，它產(chǎn)生包括抗體分子的抗體組合物，所述的抗體分子具有結(jié)合至Fc區(qū)的N-糖苷連接的糖鏈復合體，其中在該組合物內(nèi)結(jié)合到Fc 區(qū)的N-糖苷連接的糖鏈總復合體中，巖藻糖沒有在糖鏈還原末端與N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比率是20%或更高，其中沒有與巖藻糖結(jié)合的糖鏈是N-糖苷連接的糖鏈復合體， 其中巖藻糖的1號位置不與N-乙酰氨基葡萄糖的6號位置在還原末端經(jīng)α -鍵連接，其中涉及GDP-巖藻糖合成的酶活性，和/或涉及糖鏈修飾的酶活性是下降的或消除的，在糖鏈修飾中，巖藻糖1號位置與N-乙酰氨基葡萄糖6號位置在N-糖苷連接的糖鏈復合體中在還原末端經(jīng)α -鍵連接，以及其中涉及⑶P-巖藻糖合成的酶是GMD (⑶P-甘露糖4，6_脫氫酶)，而涉及糖鏈修飾的酶是α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。
2.一種用根據(jù)權利要求1的方法產(chǎn)生的抗體組合物。
3.—種含CHO細胞產(chǎn)生的抗體分子的抗體組合物，抗體分子具有連接到Fc區(qū)的N-糖苷連接的糖鏈復合體，其中在結(jié)合到該組合物Fc區(qū)的N-糖苷連接糖鏈總復合體中，巖藻糖沒有在糖鏈還原端與N-乙酰氨基葡萄糖結(jié)合的糖鏈比率為20%或更高。
4.一種含有根據(jù)權利要求2或3的抗體組合物作為活性成分的藥物。
5.根據(jù)權利要求4的藥物，其中所述的藥物是預防藥物或下列疾病的治療藥物腫瘤、 變態(tài)反應、炎癥、自身免疫性疾病、循環(huán)器官疾病、病毒感染或細菌感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生抗體組合物的細胞，例如，用于各種疾病的具有較高抗體依賴細胞毒活性的抗體，具有抗體Fc功能區(qū)的抗體片段或融合蛋白；通過采用這些細胞產(chǎn)生抗體組合物的方法；抗體組合物；及其用途。在上面描述的抗體組合物中，巖藻糖不在糖鏈還原端結(jié)合到N-乙酰氨基葡萄糖上的糖鏈，與結(jié)合到Fc功能區(qū)的總N-糖苷連接糖鏈復合體的比率達到20％或更高。此外，提供了新的GDP-甘露糖4，6-脫氫酶、GDP-酮-6-脫氧甘露糖3，5-差向異構酶4-還原酶、GDP-β-L-巖藻糖焦磷酸化酶、α-1，6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶及編碼它們的DNA。
文檔編號C07K16/06GK102311986SQ201110136338
公開日2012年1月11日 申請日期2001年10月5日 優(yōu)先權日2000年10月6日
發(fā)明者中村和靖, 佐藤光男, 保坂繪美, 內(nèi)田和久, 山崎基生, 山根尚子, 山野和也, 新川豐英, 神田豐, 花井陳雄 申請人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會社