專利名稱：一種重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用重組蛋白TNFR2-FC-IL-lra用于治療骨性關(guān)節(jié)炎疾病。
背景技術(shù)：
骨性關(guān)節(jié)炎(osteo arthrosis, OA)從關(guān)節(jié)軟骨起病，影響整個(gè)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，包括軟骨下骨、韌帶、滑膜、關(guān)節(jié)囊及關(guān)節(jié)外肌肉，最終因關(guān)節(jié)軟骨全部脫失而導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失的一種疾病。骨性關(guān)節(jié)炎是世界上最常見的關(guān)節(jié)病，隨年齡增大，患病率迅速上升，大于65歲人群中50%以上有骨性關(guān)節(jié)炎的X線片表現(xiàn)。骨性關(guān)節(jié)炎是老年人關(guān)節(jié)疼痛和致殘的主要原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，骨性關(guān)節(jié)炎在女性患病率中占第四位，在男性患病率中占第八位，我國60歲以上者膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率高達(dá)49%。該疾病所導(dǎo)致的疼痛、關(guān)節(jié)功能障礙，嚴(yán)重降低了中老年人的生活質(zhì)量，且增加了患者的醫(yī)療費(fèi)用，因而備受重視。骨性關(guān)節(jié)炎又稱退行性關(guān)節(jié)炎，是由于關(guān)節(jié)組織發(fā)生了一系列生化變化，導(dǎo)致其組織正常降解與生成紊亂。近年來的研究表明，這些變化歸因于一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。 當(dāng)關(guān)節(jié)內(nèi)存在炎性損傷時(shí)，會(huì)引起滑膜炎，繼而刺激滑膜和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，如白介素-1( IL-1)，腫瘤壞死因子-a ( T NF-α)，一氧化氮(N0)，這些細(xì)胞因子會(huì)促使基質(zhì)金屬蛋白酶(matr ix metallo proteinases, MMPs)和纖維蛋白溶酶原激活物(PA)增多，從而作用在關(guān)節(jié)軟骨上，使之被破壞，繼發(fā)性地引起膠原合成增多、軟骨細(xì)胞增殖以及前列腺素(PG)合成增多。而以上這三種改變都可由一些細(xì)胞因子如胰島素樣生長因子(IGF-1)，轉(zhuǎn)化生長因-β ( TGF-β)通過一系列途徑引起。這些細(xì)胞因子相互調(diào)控， 形成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，參與著OA軟骨的損傷與修復(fù)。在分解代謝層面，MMP的合成增加，而其抑制物和細(xì)胞外基質(zhì)成分因炎性介質(zhì)(如IL-1，IL-17, IL-18, T NF- α )而減少。另一方面，合成性細(xì)胞因子IGF-1，轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)可刺激細(xì)胞外基質(zhì)的合成?，F(xiàn)就選擇其中幾種主要的細(xì)胞因子作一綜述。Wood等在1983年首先報(bào)道了關(guān)節(jié)滑液中有IL-I存在，并且隨之發(fā)現(xiàn)了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑液中可檢測到高水平的IL-1。IL-I通過誘導(dǎo)MMP基因表達(dá)從而刺激軟骨細(xì)胞和骨膜產(chǎn)生MMPs，而MMPs是參與關(guān)節(jié)組織損傷的主要因素，可以促進(jìn)骨基質(zhì)的降解，抑制軟骨細(xì)胞合成具有透明軟骨特性的蛋白聚糖和II型膠原促進(jìn)生成有纖維母細(xì)胞特性的I型膠原，從而使軟骨細(xì)胞變性，引起軟骨缺損和軟骨的生物力學(xué)改變。 IL-I還可以促進(jìn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖和骨吸收，參與骨質(zhì)增生和軟骨下骨囊形變的形成；刺激軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞產(chǎn)生N0，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡；促進(jìn)軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞產(chǎn)生PGE2，參與炎癥反應(yīng)。IL-I β刺激產(chǎn)生的MMP和PGE2還可促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞合成I型膠原，增加OA滑液中纖維素的含量。IL-I協(xié)同TNF-α還可促進(jìn)血漿酶原激活物的產(chǎn)生。引起軟骨基質(zhì)破壞和滑液微晶體的產(chǎn)生，加重關(guān)節(jié)滑膜的炎癥反應(yīng)。TNF- α來源于巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等。TNF- α和IL-I 一樣通過抑制軟骨基質(zhì)合成、誘導(dǎo)MMP產(chǎn)生而在OA的軟骨破壞中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)TNF-α能抑制軟骨降解。OA的軟骨細(xì)胞表達(dá)表達(dá)大量的p55TNF- α受體，后者能使OA軟骨對TNF- α刺激的敏感性增強(qiáng)。而且OA軟骨要比正常軟骨產(chǎn)生更多的TNF-α和TNF-α轉(zhuǎn)化酶(TACE) mRNA。由此推之，p55 TNF-α的抑制劑可以使TNF誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解減少。腫瘤壞死因子(TNF)是炎癥性和自身免疫疾病的重要致病因素，抗體Fc片段融合的可溶性蛋白TNFR2-FC (商品名為Enbrel)是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬的重大藥物。目前，針對TNF引起疾病的已上市藥物中Enbrel (Amgen公司)、Humira(ABT公司)和 Remicade (J&G公司)都具有治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬的作用，但三者的療效差異較大，Remicade還具有治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用。導(dǎo)致這樣治療效果差異的原因最主要在于幾種藥物的組織分布區(qū)域和濃度的差異。白細(xì)胞介素-1受體在炎癥區(qū)高表達(dá)和密集分布，白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑 (IL-lra，商品名為Kineret)不但和炎癥區(qū)的白細(xì)胞介素_1受體高親和力結(jié)合，還是治療各種炎癥疾病特別是關(guān)節(jié)炎的重要藥物。已知Kineret在炎癥治療方面優(yōu)于Enbrel，二者在藥物半衰期、組織分布等方面完全不同，其原因主要是Kineret的靶向作用要明顯優(yōu)于 Enbrel。藥物TNFR2_Fc和IL-Ira在氨基酸組成和結(jié)構(gòu)上存在一定的差異，二者分布在一起發(fā)揮作用的幾率小。因此開發(fā)出利用IL-Ira特異性將Enbrel分布到不同組織的靶向性藥物對于治療TNF和IL-I引起的不同組織中自身免疫疾病和炎癥性疾病，特別是骨性關(guān)節(jié)炎疾病，將具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于以上的在治療骨性關(guān)節(jié)炎中的局限性，本發(fā)明的目的是提供一種將TNFR2-FC 基因與IL-1 ra基因的重組TNFR2_Fc_IL-1 ra基因并構(gòu)建到GC_r i ch高效表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，并對表達(dá)的產(chǎn)物進(jìn)行分離純化和鑒定；通過對膝關(guān)節(jié)局部注射 TNFR2-Fc-IL-lra,在IL-Ira特異性作用下，將TNFR2_Fc分布到目標(biāo)組織，起到治療骨性關(guān)節(jié)炎疾病的效果。含目標(biāo)基因TNFR2-Fc-IL-lra的GC_rich高效表達(dá)載體的構(gòu)建方法是
用 Not I 和 EcoR I 雙酶切已有質(zhì)粒 pMH4-TNFR2-Fc-IL Ira 和載體 pMH3 (GC-rich 高表達(dá)載體)，65 °C熱失活內(nèi)切酶后，純化回收TFI目的片段和pMH3載體片段，30 μ 1連接體系用Τ4 DNA連接酶室溫放置2-3 h后，4 °C過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒酶切和測序驗(yàn)證連接是否正確。TNFR2-Fc-IL-lra蛋白的表達(dá)與藥效研究方法 1、CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染、篩選及評價(jià)
將構(gòu)建好的含目標(biāo)基因TNFR2-Fc-IL-lra高表達(dá)質(zhì)粒pMH3-TNFR2-Fc-IL_lra經(jīng)過線性化處理后，通過電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)染入CHO-KSD細(xì)胞中，高表達(dá)細(xì)胞株通過斑點(diǎn)印跡法 (dot-blot)或酶聯(lián)免疫法(ELISA)進(jìn)行篩選，經(jīng)三輪篩選獲得單一穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株，作為研究對象。將篩選的細(xì)胞株在無血清培養(yǎng)基BOOl (購自美國安普公司)中懸浮馴化，并在安普公司50L激流反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。用Not I和EcoR I雙酶切，獲得載體和目的基因片段，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。在高GC DNA含量的表達(dá)載體pMH3中，TNFR2-Fc-IL Ira在6小時(shí)內(nèi)表達(dá)量達(dá)到30mg/l，在對照載體pcDNA 3.1中表達(dá)量很低或不表達(dá)。在我們以前的研究中證實(shí)，非編碼的富含GC的DNA片段(包括內(nèi)含子)是一種超級“染色質(zhì)開放元件”，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用，認(rèn)為GC含量越高，基因的表達(dá)水平越高。而且對于分子量較大或者小肽很難在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，本研究中利用高GC含量的pMH3載體成功實(shí)現(xiàn)了大分子量TNFR2-FC-IL Ira蛋白QOOkDa)在CHO細(xì)胞中的高表達(dá)，為生物藥物的大規(guī)模生產(chǎn)提供了很好的條件。篩選的穩(wěn)定高表達(dá)克隆經(jīng)過懸浮馴化后，在安普公司獨(dú)有的激流式反應(yīng)器上進(jìn)行放大培養(yǎng)，在連續(xù)培養(yǎng)13天過程中，第5天細(xì)胞密度最大達(dá)到IXlO7 cells/ml ；隨著時(shí)間延長細(xì)胞密度逐漸下降，細(xì)胞活率降低，ELISA檢測TNFR2-FC-IL Ira融合蛋白的表達(dá)量逐漸增加，積累，第13天的表達(dá)量為176.8 mg/1。后期由于細(xì)胞活率的降低，影響產(chǎn)物的質(zhì)量，因此培養(yǎng)停止在此階段，收液，進(jìn)行產(chǎn)物的純化和鑒定。2、產(chǎn)物的分離純化和鑒定
大規(guī)模培養(yǎng)后的豐收液經(jīng)過4750 g/min,4 °C離心10 min，取上清，經(jīng)過0. 22 ym過濾后，進(jìn)行Mabselect (GE公司)親和層析，收集洗脫峰進(jìn)一步進(jìn)行S_s印harose陽離子交換層析(SP SFF)，收集活性峰進(jìn)行HPLC分析純化產(chǎn)物的純度。分離純化的產(chǎn)物經(jīng)過 SDS-PAGE/PAGE和Western印跡進(jìn)行鑒定驗(yàn)證。TFI細(xì)胞表達(dá)上清液經(jīng)過Mabse 1 ect親和層析后，蛋白純度約為86. 4%，主要雜蛋白為TFI的聚體形式(13.6%)；再經(jīng)過SP SFF陽離子交換層析后，去除聚體雜蛋白， SDS-PAGE結(jié)果顯示為單一條帶，與Western blot檢測結(jié)果相符，單體蛋白分子量約為100 kDa,分離純化的產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析，純度在99%以上。3、TNFR2-Fc-IL_lra的體內(nèi)組織分布和藥效
用131I標(biāo)記的方法對TNFR2-Fc-IL-lra和對照藥物TNFR2_Fc進(jìn)行標(biāo)記，以相同摩爾劑量靜脈注射入SD大白鼠體內(nèi)，研究二者不同時(shí)間內(nèi)在各個(gè)組織的分布情況，每個(gè)組織重復(fù) 5次。在患有前爪炎癥水腫的大白鼠體內(nèi)相同摩爾劑量皮下注射TNFR2-Fc-IL-lra和 TNFR2-FC后，測定體內(nèi)的血藥濃度，研究其對炎癥的治療作用。放射性同位素131-1標(biāo)記的TNFR2-FC在大白鼠體內(nèi)組織分布情況。放射性同位素131-1標(biāo)記的TNFR2-FC-IL Ira在大白鼠體內(nèi)組織分布情況。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TNFR2-Fc (Enbrel)主要分布于血液中，其它組織中分布很少，而TNFR2_Fc_IL Ira 與TNFR2-Fc (Enbrel)完全不同(PKa的差異)，分布在不同組織中，這其中主要原因是 IL-Ira特異性與不同組織中的IL-I結(jié)合，將TNFR2_Fc (Enbrel)靶向性帶到這些組織中。TNFR2-Fc-IL Ira和TNFR2_Fc在大白鼠體內(nèi)相同摩爾劑量皮下注射后，有效治療前爪炎癥水腫的血藥濃度測定結(jié)果，結(jié)果表明TNFR2-FC-IL Ira靜脈注射后在血液中分布遠(yuǎn)遠(yuǎn)比TNFR2-FC在血液中分布少，但藥效相當(dāng)，這在很大程度上減少了副作用。這些結(jié)果提示TNFR2-FC-IL Ira的IL Ira部分可能和結(jié)締組織，尤其是皮下結(jié)締組織結(jié)合，帶動(dòng) TNFR2-FC到結(jié)締組織起治療效果。這說明將TNFR2-FC與IL Ira融合在一起，克服了二者在氨基酸組成和結(jié)構(gòu)上差異導(dǎo)致的組織分布不同的弊端，實(shí)現(xiàn)了利用IL Ira靶向性的將 TNFR2-FC帶到不同組織中。同時(shí)，二者聯(lián)合使用可能有雙重阻斷的效果，將其融合在一起將形成聯(lián)合或協(xié)同效應(yīng)。
具體實(shí)施方式
應(yīng)當(dāng)理解，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。若無特別指明，實(shí)施例采用的方法為本領(lǐng)域通用技術(shù)。含目標(biāo)基因TNFR2-Fc-IL-lra的GC_rich高效表達(dá)載體的構(gòu)建方法是
用 Not I 和 EcoR I 雙酶切已有質(zhì)粒 pMH4-TNFR2-Fc-IL Ira 和載體 pMH3 (GC-rich 高表達(dá)載體)，65 °C熱失活內(nèi)切酶后，純化回收TFI目的片段和pMH3載體片段，30 μ 1連接體系用Τ4 DNA連接酶室溫放置2-3 h后，4 °C過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒酶切和測序驗(yàn)證連接是否正確。TNFR2-Fc-IL-lra蛋白的表達(dá)與藥效研究方法 1、CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染、篩選及評價(jià)
將構(gòu)建好的含目標(biāo)基因TNFR2-Fc-IL-lra高表達(dá)質(zhì)粒pMH3-TNFR2-Fc-IL_lra經(jīng)過線性化處理后，通過電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)染入CHO-KSD細(xì)胞中，高表達(dá)細(xì)胞株通過斑點(diǎn)印跡法 (dot-blot)或酶聯(lián)免疫法(ELISA)進(jìn)行篩選，經(jīng)三輪篩選獲得單一穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株，作為研究對象。將篩選的細(xì)胞株在無血清培養(yǎng)基BOOl (購自美國安普公司)中懸浮馴化，并在安普公司50L激流反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。2、產(chǎn)物的分離純化和鑒定
大規(guī)模培養(yǎng)后的豐收液經(jīng)過4750 g/min,4 °C離心10 min，取上清，經(jīng)過0. 22 ym過濾后，進(jìn)行Mabselect (GE公司)親和層析，收集洗脫峰進(jìn)一步進(jìn)行S_s印harose陽離子交換層析(SP SFF)，收集活性峰進(jìn)行HPLC分析純化產(chǎn)物的純度。分離純化的產(chǎn)物經(jīng)過 SDS-PAGE/PAGE和Western印跡進(jìn)行鑒定驗(yàn)證。3、TNFR2-Fc-IL_lra的體內(nèi)組織分布和藥效
用131I標(biāo)記的方法對TNFR2-Fc-IL-lra和對照藥物TNFR2_Fc進(jìn)行標(biāo)記，以相同摩爾劑量靜脈注射入SD大白鼠體內(nèi)，研究二者不同時(shí)間內(nèi)在各個(gè)組織的分布情況，每個(gè)組織重復(fù) 5次。在患有前爪炎癥水腫的大白鼠體內(nèi)相同摩爾劑量皮下注射TNFR2-Fc-IL-lra和 TNFR2-FC后，測定體內(nèi)的血藥濃度，研究其對炎癥的治療作用。
權(quán)利要求
1. 一種重組蛋白TNFR2-Fc-IL-lra，其制備方法是1、將TNFR2-FC基因與IL-Ira基因重組成TNFR2-Fc-IL-lra基因，并將構(gòu)建到表達(dá)載體質(zhì)粒，將構(gòu)建好的含TNFR2-FC-IL-lra基因表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過線性化處理后，通過電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞中，經(jīng)篩選獲得單一穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，將篩選獲得的表達(dá)細(xì)胞株懸浮馴化培養(yǎng)；2、產(chǎn)物的分離純化和鑒定培養(yǎng)后的豐收液經(jīng)過4750 g/min,4 °C離心10 min，取上清，經(jīng)過0. 22 μ m過濾后，進(jìn)行Mabselect親和層析，收集洗脫峰進(jìn)一步進(jìn)行S-s印harose陽離子交換層析(SP SFF)，收集活性峰進(jìn)行HPLC分析純化產(chǎn)物的純度，獲得TNFR2-Fc-IL-lra蛋白。
2.根據(jù)專利要求1所述的重組蛋白TNFR2-Fc-IL-lra，其特征在于TNFR2-Fc-IL_lra 蛋白可用于治療骨性關(guān)節(jié)炎疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組蛋白TNFR2-Fc-IL-1ra，其制備方法是1、將TNFR2-Fc基因與IL-1ra基因重組成TNFR2-Fc-IL-1ra基因，并將構(gòu)建到表達(dá)載體質(zhì)粒，將構(gòu)建好的含TNFR2-Fc-IL-1ra基因表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過線性化處理后，通過電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞中，經(jīng)篩選獲得單一穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，將篩選獲得的表達(dá)細(xì)胞株懸浮馴化培養(yǎng)；2、產(chǎn)物的分離純化和鑒定培養(yǎng)后的豐收液經(jīng)過4750g/min，4℃離心10min，取上清，經(jīng)過0.22μm過濾后，進(jìn)行Mabselect親和層析，收集洗脫峰進(jìn)一步進(jìn)行S-sepharose陽離子交換層析(SPSFF)，收集活性峰進(jìn)行HPLC分析純化產(chǎn)物的純度，獲得TNFR2-Fc-IL-1ra蛋白。
文檔編號C07K1/18GK102277381SQ201110123520
公開日2011年12月14日 申請日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月13日
發(fā)明者惠覓宙 申請人:杭州安瑞普生物科技有限公司