專利名稱：預(yù)防與治療細(xì)胞增生失調(diào)疾病的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽，特別涉及一種可作為抗細(xì)胞增生失調(diào)疾病的預(yù)防與治療藥物的多肽。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的防癌或抗癌相關(guān)技術(shù)，是以預(yù)防性診斷技術(shù)或打疫苗為主，對(duì)于此類疾病的預(yù)防性醫(yī)療策略可分為(A)內(nèi)源性致癌診斷這部份包括年齡、遺傳、種族及性別等，其可供預(yù)防控制的因子較少，可用下列的技術(shù)來實(shí)施(i)癌癥基因篩檢對(duì)具有家族遺傳因素或高危人群，依其相關(guān)基因變異如BRCA-I和BRCA-2基因等作癌癥基因篩檢；(ii)癌癥預(yù)防性切除手術(shù)依據(jù)癌癥基因篩檢結(jié)果及參考其家族中罹癌的比率，在可能的病患部位作手術(shù)切除。(B)外源性致癌診斷(i)化學(xué)性毒物預(yù)防診斷化學(xué)性毒物，如香煙的多環(huán) 烴化合物、食品的黃曲毒素、食品附加劑的著色劑、調(diào)味劑及防腐劑，環(huán)境因子，如有機(jī)化學(xué)廢料、焦油、芳香族美容劑染料、農(nóng)藥類、殺蟲劑、生殖荷爾蒙、砷及水銀等。預(yù)防診斷層級(jí)可依癌癥發(fā)生時(shí)程介入時(shí)間的差異分為一級(jí)化學(xué)預(yù)防(primary chemo-prevention),即預(yù)防癌癥初生成，及二級(jí)化學(xué)預(yù)防(secondary chemo-prevention),即針對(duì)已摧癌但經(jīng)適當(dāng)治療，病情得已控制者。這些診斷后所使用的治療藥物如Vit A retinyl palmitate及ADT (5-[p-Methoxyphenyl]_l, 2-dithiole-3_thione)用于肺癌、維生素 A 酸用于頭頸癌、抗動(dòng)情激素藥物Tamoxifen用于乳癌及Sulindac用于大腸癌等；(ii)物理性預(yù)防診斷評(píng)估長(zhǎng)期性曝露在有放射線及紫外線照射的環(huán)境。(C)生物性致癌因子預(yù)防診斷病毒及生物性毒素(如黃曲毒素)和某些腫瘤的發(fā)生有直接相關(guān)性如肝癌與B型肝癌病毒、子宮頸癌與人類乳突病毒(HPV)，注意公共衛(wèi)生安全及安全性生活等為防治診斷的重點(diǎn)。(D)癌癥疫苗接種利用打疫苗的方式，使個(gè)體產(chǎn)生免疫力，阻斷癌癥發(fā)生如HPV疫苗(預(yù)防特定性別的HPV病毒感染)與B型肝炎疫苗(阻斷B型肝炎一肝硬化一肝癌三部曲)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的，在于提供一種預(yù)防與治療(chemo-prevention andchemo-therapy)細(xì)胞增生失調(diào)疾病的多肽。所謂抗細(xì)胞增生失調(diào)的藥物預(yù)防，定義為使用天然、合成或生物化學(xué)合成方式所生產(chǎn)的藥物，用以逆轉(zhuǎn)(reverse)、抑制(suppress)或防治(prevent)癌變的進(jìn)程(參見 Anne S. Tsao, MD ；Edward S. Kim, MD ；ffaun Ki Hong, MD ；CA Cancer J Clin 2004 ；54 :150-180)。為達(dá)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案。一種預(yù)防與治療細(xì)胞增生失調(diào)疾病的多肽，該多肽的氨基酸序列為NH2_Lys TrpLys Val Phe Lys Lys He Glu Lys-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He Glu Lys-Ala GlyPro-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He Glu Lys-COOH，使用于預(yù)防與治療可能發(fā)生細(xì)胞增生失調(diào)疾病的對(duì)象。進(jìn)一步地，該多肽具有兩個(gè)阿法螺旋以AGP三個(gè)氨基酸為轉(zhuǎn)折區(qū)形成U字形三維空間結(jié)構(gòu)，而顯現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞增生失調(diào)疾病防治與治療的功效。進(jìn)一步地，該多肽用于細(xì)胞增生失調(diào)的高危群體的早期罹病預(yù)防。進(jìn)一步地，該多肽用于罹病經(jīng)治療后的防治復(fù)發(fā)。進(jìn)一步地，該可能發(fā)生細(xì)胞增生失調(diào)疾病的對(duì)象為人體。進(jìn)一步地，該多肽使用于人體的給藥途徑包含經(jīng)皮下以及靜脈給藥。進(jìn)一步地，該多肽使用于人體的給藥頻率為每周5次，而每次給藥劑量為每公斤體重給予50毫克。進(jìn)一步地，該細(xì)胞增生失調(diào)疾病包含癌癥。
進(jìn)一步地，該癌癥包含肺癌。進(jìn)一步地，該可能發(fā)生細(xì)胞增生失調(diào)疾病的對(duì)象為選自由腫瘤患者、生活于空氣高度污染地區(qū)者、抽煙者以及吸二手煙者所組成的群組。由此可知，本發(fā)明提供一種預(yù)防與治療細(xì)胞增生失調(diào)疾病的多肽，該多肽的氨基酸序列為NH2_Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He Glu Lys-Lys Trp Lys ValPhe Lys LysHe Glu Lys-Ala Gly Pro-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He GluLys-COOH,且使用于予頁防與治療可能發(fā)生細(xì)胞增生失調(diào)疾病的對(duì)象。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的多肽，包含Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He Glu Lys以及Ala Gly Pro的氨基酸序列，其序列結(jié)構(gòu)可數(shù)學(xué)化地表示為AMl+AM2+AlaGly Pro+AM3 ;當(dāng)中 AMl = AM2 = AM3 = Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He GluLys0 該多妝序列是以 AlaGly Pro三個(gè)氨基酸片段來銜接(AM1+AM2)及AM3 (注AM1，AM2及AM3可為不同的組成設(shè)計(jì))。將AMI、AM2及AM3設(shè)置成全相同的目的(親水性區(qū)三重復(fù)的結(jié)構(gòu)模式)，是要形成一個(gè)可與癌細(xì)胞表面組成(大部分為硫酸肝素)鍵結(jié)的區(qū)段并能以EKKWKV的形式出現(xiàn)，以便與硫酸肝素能形成鍵結(jié)的模式XBBXBX吻合，此處B代表堿性的氨基酸，而X表示任意一種其他種氨基酸(參見 I. Capila and R. J. Linhardt,Heparin-protein interactions,Angew. Chem. Int. Ed Engl. 2002 ；41 :391)。如此設(shè)計(jì)，可使本多肽藥物不但具有與癌細(xì)胞表面較大的親和力且總電荷數(shù)能提高至+12。該高正電荷數(shù)對(duì)帶有負(fù)電荷的癌細(xì)胞膜表面，其結(jié)合能力就可大為增強(qiáng)?；旧?，該多肽在水溶液中并無結(jié)構(gòu)(即所謂的無規(guī)卷曲)，在其遇到如細(xì)胞膜的極性環(huán)境時(shí)，才會(huì)形成兩個(gè)阿爾法螺旋形(a-helix)以AGP(即Ala GlyPro)為轉(zhuǎn)折區(qū)的三維空間結(jié)構(gòu)。這種U字形的結(jié)構(gòu)，可讓該多肽靈活地切入細(xì)胞膜且動(dòng)態(tài)地與不同層次的細(xì)胞表面作用，而迅速瓦解細(xì)胞。此外，該多肽對(duì)于增生失調(diào)細(xì)胞具有高度選擇性，其水解癌細(xì)胞的能力大于正常細(xì)胞；此外，本發(fā)明所要求的抗細(xì)胞增生失調(diào)的作用，在預(yù)防與治療性的給藥及能夠發(fā)揮藥效作用的藥物濃度范圍內(nèi)(含高劑量使用)，不會(huì)引起生物不良反應(yīng)或明顯的藥物副作用。本發(fā)明所公開的多肽，其抗細(xì)胞增生失調(diào)的特點(diǎn)、所衍生的作為癌癥預(yù)防與治療藥物的優(yōu)點(diǎn)，以及本發(fā)明的目的可通過以下具體實(shí)施方式
了解。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明基于以下實(shí)施例中所公開的試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一種抗細(xì)胞增生失調(diào)的多肽，該多妝的氨基酸序列為 NH2-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He Glu Lys-Lys Trp LysVal Phe Lys Lys He Glu Lys-Ala Gly Pro-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He GluLys-COOH，使用于預(yù)防與治療可能發(fā)生細(xì)胞增生失調(diào)疾病的對(duì)象，其序列結(jié)構(gòu)可數(shù)學(xué)化地表不為AM1+AM2+Ala Gly Pro+AM3 ;其中 AMl = AM2 = AM3 = Lys Trp Lys Val Phe LysLys He Glu Lys0該多肽可用于細(xì)胞增生失調(diào)的高危群體的早期罹病預(yù)防或罹病經(jīng)治療后的防治復(fù)發(fā)，用于人體的給藥途徑可選擇經(jīng)皮下或靜脈給藥，其中，該細(xì)胞增生失調(diào)疾病的對(duì)象包含腫瘤患者、生活于空氣高度污染地區(qū)者、抽煙者或吸二手煙者等，該細(xì)胞增生失調(diào)疾病包含癌癥，如肺癌。此外，該多肽對(duì)癌癥具有優(yōu)良的預(yù)防與治療效果，且即使在高頻率(每周5次)及高劑量(50mg/kg)使用下，也不會(huì)誘發(fā)生物不良反應(yīng)及產(chǎn)生明顯藥物副作用。實(shí)施例I本發(fā)明的多肽是采用被稱為“固態(tài)肽合成法”(solid-phase peptide synthesis ；由 Prof. R. B. Merrifield, Rockefeller University, USA ; 1984Nobel Laureate 所發(fā)明)的方法制造而成。這個(gè)方法的基本構(gòu)想是把活化的氨基酸經(jīng)耦合作用，共價(jià)結(jié)合在固體基質(zhì)樹脂(rasin)上即把所要合成的多肽依其序列，由N端(NH2端)起的第一個(gè)氨基酸 (Lys-I)開始耦合鍵結(jié)，然后依次鍵結(jié)(Trp-2、LyS-3、Val-4、Phe-5、LyS-6、LyS-7、Ile_8、
Glu-9,Lys-10........Glu-32)直至最后的Lys_33為止，將上述氨基酸一個(gè)個(gè)陸續(xù)接上后
形成肽，最后將合成完的肽自樹脂洗下，從而獲得所需要的肽。合成方法分為Boc與Fmoc兩種，這兩種方法是相似的，差別在于氨基酸N端的保護(hù)基不同而已。長(zhǎng)度為2至50個(gè)氨基酸的肽可使用該方法來合成，產(chǎn)量可達(dá)到數(shù)克(g)甚至公斤至公噸以上。本發(fā)明的多肽，其長(zhǎng)度為33個(gè)氨基酸，以該法來合成可得到純度相當(dāng)高的多肽(> 95% )。實(shí)施例2使用肺癌腫瘤球體的離體試驗(yàn)?zāi)Ｊ?，測(cè)試多肽在肺癌細(xì)胞(NCI-H460)形成團(tuán)塊(in vitro腫瘤形成模式)之前及之后，做預(yù)先式藥物給與，測(cè)定其對(duì)于癌細(xì)胞團(tuán)塊成長(zhǎng)的抑制效果。其實(shí)驗(yàn)方法參照Timmins et al, Angiogenesis 7 :97-103, 2004所公開的過程，簡(jiǎn)述如下將細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，待長(zhǎng)滿約70% -80%后，以胰蛋白酶將細(xì)胞與培養(yǎng)皿分離，轉(zhuǎn)置入離心管中離心，隨后計(jì)數(shù)細(xì)胞沉淀物數(shù)量，將每滴(其體積約為20 yl)中存在500個(gè)細(xì)胞的水滴，滴于培養(yǎng)皿上蓋后，以懸滴培養(yǎng)法的方式靜置，利用重力的吸引，讓細(xì)胞聚集形成腫瘤球體。該多肽的給藥方式可分為細(xì)胞懸吊后(未加藥物)、懸吊同時(shí)及懸吊前等方式給予。結(jié)果顯示未加藥物于腫瘤細(xì)胞，則腫瘤團(tuán)塊成形；加入藥物與讓腫瘤細(xì)胞成形同時(shí)進(jìn)行，則腫瘤團(tuán)塊成形但體積明顯縮?。粦业跚邦A(yù)先給予藥物后，再讓腫瘤細(xì)胞成形，則觀察到腫瘤團(tuán)塊并沒有形成。該in vitro實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的多肽具有優(yōu)異的抗肺癌細(xì)胞形成團(tuán)塊的效果。實(shí)施例3為評(píng)估本發(fā)明的多肽經(jīng)血液循環(huán)途徑(包含皮下或靜脈給藥途徑)是否對(duì)血液中的紅血球有細(xì)胞毒殺反應(yīng)，而進(jìn)行了紅血球毒殺測(cè)試，該試驗(yàn)成果請(qǐng)參考Wu et al.,Peptides 30，839-848，2009。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多肽的濃度小于25 y M時(shí)，對(duì)于紅血球幾乎無破壞能力，即使多肽濃度提高至200 u M，也僅對(duì)大約20%的紅血球造成破壞，該作用效果類似于臨床抗癌藥物Doxorubicin(Dox)。而其他類的肽如melittin,則在很低的濃度(<5uM)下，就會(huì)對(duì)約90%的紅血球造成破壞。由此顯示，本發(fā)明的多肽對(duì)紅血球的傷害性很低。
本發(fā)明所公開的多肽，在對(duì)離體(in vitro)肺癌細(xì)胞增生具有明顯抑制作用、且不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞(含正常血液細(xì)胞)產(chǎn)生明顯藥物毒殺的情況下，本發(fā)明還用活體(invivo)肺癌異體移植模式(xenograft model)試驗(yàn),來驗(yàn)證該多肽在預(yù)先性給藥模式的動(dòng)物試驗(yàn)中對(duì)于肺癌腫瘤成長(zhǎng)的抑制效果。該動(dòng)物模型試驗(yàn)，是以免疫缺陷的裸鼠為對(duì)象，采用皮下注射(s. c.)方式作為藥物進(jìn)入動(dòng)物身體的途徑。試駘流稈在4只裸鼠(nude mice-NU/NU)的頸后側(cè)部位預(yù)先給予本發(fā)明多肽 周(一周5次給藥，每次50mg/kg)后，再以IX IO6數(shù)量的肺癌細(xì)胞(NCI-H460)注射于裸鼠的右側(cè)腹部皮下(Dayl ;該組定義為藥物試驗(yàn)組)，之后(Dayl至Day43)繼續(xù)以一周5次,每次50mg/kg的頻率給予藥物并持續(xù)觀察動(dòng)物體重與腫瘤組織的體積變化。另外，陰性對(duì)照組的4只裸鼠，與藥物試驗(yàn)組一樣，以PH7. 2 7. 4的生理鹽水預(yù)先給藥一周(皮下注射，5次/周)后，再以I X IO6數(shù)量的肺癌細(xì)胞注射于裸鼠的右側(cè)腹部皮下，之后(Dayl至Day43)繼續(xù)以每周5次的頻率給予生理鹽水并持續(xù)觀察動(dòng)物體重與腫瘤組織的體積變化。而陽性對(duì)照組 的4只裸鼠在Dayl以I X IO6數(shù)量的肺癌細(xì)胞注射于裸鼠的右側(cè)腹部皮下后，以小分子抗癌藥物Dox，在其腹部附近施以靜脈注射(每周一次，每次5mg/kg的劑量；具體方法參考FPastorino et. al. , Clin. Cancer Res. 14 (22) :7320-7329, 2008),并在 Day I 至 Day 43 持續(xù)觀察動(dòng)物體重與腫瘤組織的體積變化。與上述兩組不同的是，該陽性對(duì)照組在Dayl前并未預(yù)先給藥一周。以上三組(藥物試驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及陽性對(duì)照組)的動(dòng)物，均觀察至第43天(Day43)時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物剖檢，并記錄腫瘤組織的重量。試驗(yàn)結(jié)果表I及表2分別是本發(fā)明一實(shí)施例的裸鼠體重變化表以及裸鼠腫瘤組織體積變化表。結(jié)果顯示，三組動(dòng)物于試驗(yàn)前后的體重(見表I)及活動(dòng)力并無顯著的差異；但試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的腫瘤成長(zhǎng)(或大小)則有明顯的不同(見表2):腫瘤于注射肺癌細(xì)胞約22天(Day22)后開始出現(xiàn)皮下腫塊，陰性(生理鹽水，saline)與陽性(Dox)對(duì)照組的腫瘤體積隨時(shí)間的增長(zhǎng)而變大，而藥物試驗(yàn)組(多肽)則不然。計(jì)算陽性對(duì)照組(Dox)與藥物試驗(yàn)組(多肽)的腫瘤平均體積相對(duì)于陰性對(duì)照組(saline)的百分比[(test group/salinegroup) % ]，其最好效果分別達(dá)到陽性對(duì)照組52. 40 % (Day40)，藥物試驗(yàn)組13. 89 %(Day36)。至試驗(yàn)結(jié)束(Day43)，計(jì)算所得的各組腫瘤的平均體積相對(duì)于陰性對(duì)照組的百分比分別為83. 05% (陽性對(duì)照組)及19. 30% (藥物試驗(yàn)組)。因此，本發(fā)明多肽在預(yù)先給藥一周的動(dòng)物試驗(yàn)中，顯示其能有效抑制異體移植肺癌腫瘤的成長(zhǎng)。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防與治療細(xì)胞增生失調(diào)疾病的多肽，其特征在于該多肽的氨基酸序列為NH2-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He Glu Lys-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He GluLys-Ala Gly Pro-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys He Glu Lys-COOH,使用于預(yù)防與治療可能發(fā)生細(xì)胞增生失調(diào)疾病的對(duì)象。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的預(yù)防與治療細(xì)胞增生失調(diào)疾病的多肽，其特征在于該多肽具有兩個(gè)阿法螺旋以AGP三個(gè)氨基酸為轉(zhuǎn)折區(qū)形成U字形三維空間結(jié)構(gòu)，而顯現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞增生失調(diào)疾病防治與治療的功效。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的預(yù)防與治療細(xì)胞增生失調(diào)疾病的多肽，其特征在于該多肽用于細(xì)胞增生失調(diào)的高危群體的早期罹病預(yù)防。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的預(yù)防與治療細(xì)胞增生失調(diào)疾病的多肽，其特征在于該多肽用于罹病經(jīng)治療后的防治復(fù)發(fā)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的預(yù)防與治療細(xì)胞增生失調(diào)疾病的多肽，其特征在于該可能發(fā) 生細(xì)胞增生失調(diào)疾病的對(duì)象為人體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)防與治療細(xì)胞增生失調(diào)疾病的多肽，其特征在于該多肽使用于人體的給藥途徑包含經(jīng)皮下以及靜脈給藥。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的預(yù)防與治療細(xì)胞增生失調(diào)疾病的多肽，其特征在于該多肽使用于人體的給藥頻率為每周5次，而每次給藥劑量為每公斤體重給予50毫克。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的預(yù)防與治療細(xì)胞增生失調(diào)疾病的多肽，其特征在于該細(xì)胞增生失調(diào)疾病包含癌癥。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的預(yù)防與治療細(xì)胞增生失調(diào)疾病的多肽，其特征在于該癌癥包 含肺癌。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的預(yù)防與治療細(xì)胞增生失調(diào)疾病的多肽，其特征在于該可能發(fā)生細(xì)胞增生失調(diào)疾病的對(duì)象為選自由腫瘤患者、生活于空氣高度污染地區(qū)者、抽煙者以及吸二手煙者所組成的群組。
全文摘要
一種預(yù)防與治療細(xì)胞增生失調(diào)疾病的多肽，該多肽的氨基酸序列為NH2-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys-Ala Gly Pro-Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys-COOH，使用于預(yù)防與治療可能發(fā)生細(xì)胞增生失調(diào)疾病的對(duì)象。具有該氨基酸序列的多肽可有效抑制肺癌腫瘤的成長(zhǎng)，且該多肽在高頻率給藥(每周5次)及高濃度(50mg/kg)使用下，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物不會(huì)造成藥物不良反應(yīng)或明顯的副作用。
文檔編號(hào)C07K14/00GK102746386SQ201110104738
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者陳惠民 申請(qǐng)人:陳惠民