專利名稱:抗α-胞襯蛋白多肽IgA抗體測(cè)定在干燥綜合征診斷中的應(yīng)用的制作方法
抗α-胞襯蛋白多肽IgA抗體測(cè)定在干燥綜合征診斷中的
應(yīng)用本發(fā)明涉及α-胞襯蛋白多肽作為抗原在檢測(cè)干燥綜合征及其它免疫疾病中的 應(yīng)用。
背景技術(shù):
干燥綜合征(Sjogren's Syndrome, SS)是一種以侵及淚腺和唾液腺等外分泌腺為 特征的全身性自身免疫疾病。該病最常見的臨床表現(xiàn)為眼干、口干,并可累及肺、腎臟、淋巴 系統(tǒng)、血管及肝臟等器官。此病無明顯的地區(qū)分布差異,可發(fā)生于任何年齡,以40-60歲, 特別是絕經(jīng)后的女性居多,男女之比為1 9。在我國(guó)的患病率為0.77%,在老年人群中 的患病率高達(dá)4%,全國(guó)有近1000萬患者。干燥綜合征可分為原發(fā)性干燥綜合征(Primary Sjogren,s syndrome)禾口繼發(fā)性干燥綜合征(Secondary Sjogren,s syndrome)兩類。該 病單獨(dú)發(fā)生時(shí),稱為原發(fā)性干燥綜合征;與其它診斷明確的自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎(rheumatoid arthritis,RA)、系統(tǒng)性紅斑狼疫(systemic lupus erythematosus, SLE) 等合并存在時(shí),稱為繼發(fā)性干燥綜合征。近年來,人們對(duì)干燥綜合征的病因及發(fā)病機(jī)理進(jìn)行了大量研究,但至今無突破性 進(jìn)展。目前在臨床上尚未發(fā)現(xiàn)理想的血清學(xué)診斷方法,除臨床癥狀外,主要靠唇腺活檢及 腮腺造影等有創(chuàng)檢查明確診斷,由于患者的醫(yī)從性差,常常延誤診斷,并喪失最佳的治療時(shí) 機(jī)。因此,尋找一種敏感性強(qiáng)、特異性高而又簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)方法,對(duì)干燥綜合征的早期診 斷及治療具有重要意義。為此,本發(fā)明人經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)了可以用于干燥綜合征早期診 斷的血清學(xué)特異性抗原多肽——α-胞襯蛋白多肽(為α-胞襯蛋白的抗原表位),該多肽 可以特異性的識(shí)別干燥綜合征患者血清中IgA型的特異性抗體——抗IgA型α-胞襯蛋白 多肽抗體,該抗體可通過一些較為簡(jiǎn)便的免疫學(xué)檢測(cè)方法(如酶聯(lián)免疫吸附法)檢測(cè)出 來。并且具有很高的敏感性和特異性。發(fā)明_既述本發(fā)明的目的之一是提供能夠有效檢測(cè)干燥綜合征的特異性抗原——α -胞襯蛋 白多肽。本發(fā)明的另一目的是提供所述的α-胞襯蛋白多肽在診斷干燥綜合征中的用途。最后,本發(fā)明提供了一種改良的ELISA方法利用所述的α _胞襯蛋白多肽作為抗 原用于檢測(cè)干燥綜合征。本發(fā)明所用術(shù)語“ α -胞襯蛋白多肽”指具有共同序列RQKLEDSYRFXFFRDEEL(即A rg-Gln-Lys-Leu-Glu-Asp-Ser-Tyr-Arg-Phe-X-Phe-Phe-Arg-Asp-Glu-Glu-Leu)的氨基酸 或多肽。X可以為Gly (甘氨酸)、Ala (丙氨酸)、Val (纈氨酸)、Leu (亮氨酸)、IIe (異亮 氨酸)、Phe (苯丙氨酸)、Trp (色氨酸)、Tyr (酪氨酸)、Asp (天冬氨酸)、His (組氨酸)、 Asn (天冬酰胺)、Glu (谷氨酸)、Lys (賴氨酸)、Gln (谷氨酰胺)、Met (甲硫氨酸)、Arg (精 氨酸)、Ser (絲氨酸)、Thr (蘇氨酸)、Cys (半胱氨酸)、Pro (脯氨酸)。F0drin(又稱胞襯蛋白)最早在神經(jīng)細(xì)胞的胞漿內(nèi)被發(fā)現(xiàn),主要聚集在神經(jīng)細(xì)胞
3和淋巴細(xì)胞的漿膜下,與漿膜平行呈板狀分布。它是真核細(xì)胞膜骨架的主要組成部分,類似 圓柱體結(jié)構(gòu),含有α和β兩個(gè)亞單位。前者的分子量為240KD,后者為235KD。α、β亞 單位以邊對(duì)邊的形式形成異二聚體,其間以二硫鍵相連。這種異二聚體進(jìn)一步以尾對(duì)尾的 形式形成四聯(lián)體,并與肌鈣蛋白相連,成為膜骨架的基本結(jié)構(gòu),參與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)及維持細(xì)胞 的連接和形態(tài),可能與周圍神經(jīng),腦,腎臟,肝臟及全身性自身免疫病的發(fā)生有關(guān)⑴。1997年日本德島大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Haneji等人從干燥綜合征模型NFS/sld小鼠的腮 腺組織中分離出一種分子量為120kD的抗原,并發(fā)現(xiàn)該抗原在干燥綜合征患者的唇腺組織 中有大量表達(dá),而在正常人中并未檢出;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)該抗原能夠刺激干燥綜合征患者外周 血中的T淋巴細(xì)胞增殖;為了鑒定該抗原,Haneji等人將其氨基端的序列進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果發(fā) 現(xiàn)該抗原即為非紅細(xì)胞膜譜蛋白(nonerythroid α-spectrin) α -胞襯蛋白。該小組人員 繼而用基因工程的方法,用GST融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了帶有編碼α-胞襯蛋白氨基端序 列cDNA的融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)——pGEX-2T/JS-l,(JS-1為編碼α -胞襯蛋白氨基端序列的 堿基序列,該段序列共1784個(gè)堿基),該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的α-胞襯蛋白融合蛋白分子量 約為97.4kD。將純化出的α-胞襯蛋白融合蛋白做為抗原,用免疫印跡(Western blot) 的方法檢測(cè)了 43例原發(fā)性干燥綜合征(pSS)、8例繼發(fā)干燥綜合征、21例系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (SLE)、14例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者和15例正常獻(xiàn)血者,結(jié)果顯示該蛋白在原發(fā)性干燥綜 合征中的陽性率為95.3%,繼發(fā)干燥綜合征中為50%,而在SLE、RA和正常人中未檢測(cè)到該 抗體⑵。然而,Watanabc等人的用重組的98kD的α -胞襯蛋白做為抗原,用Western blot 的方法在不同疾病中檢測(cè)的陽性率為原發(fā)性干燥綜合征78% (7/9),LE繼發(fā)SS:60% (9/15),LE 7% (3/44)⑶。Witte等人用ELISA的方法,將重組的93kD的α -胞襯蛋白做為 抗原檢測(cè)出的原發(fā)干燥綜合征患者陽性率為55% (47/85),SLE繼發(fā)SS的為40% (6/15), RA 繼發(fā) SS 的為 43% (3/7),RA 為 41. 6% (5/12),SLE 為 20% (1/50),正常人組為 1. 9% (3/160)⑷?;谝陨涎芯?,本發(fā)明人經(jīng)過序列分析及對(duì)抗原多肽的篩選,發(fā)現(xiàn)α-胞襯蛋白 中有一段氨基酸,序列與鼠非紅細(xì)胞膜譜蛋白序列同源,同時(shí)該序列中具有四個(gè)保守或較 保守的氨基酸,可能與該蛋白的抗原特性有關(guān),并在干燥綜合征的發(fā)病中發(fā)揮重要作用,該 序列為 RQKLEDSYRFXFFRDEEL (即 Arg-Gln-Lys-Leu-Glu-Asp-Ser-Tyr-Arg-Phe-X-Phe-Phe -Arg-Asp-Glu-Glu-Leu),稱為α-胞襯蛋白多肽⑸。本發(fā)明人利用戊二醛偶聯(lián)法將α-胞 襯蛋白多肽連接于牛血清白蛋白BSA形成BSA-G- α -胞襯蛋白多肽復(fù)合物,將該復(fù)合物作 為抗原,用ELISA的方法檢測(cè)干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及正常人血清中 的IgA型的α-胞襯蛋白多肽抗體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該多肽對(duì)干燥綜合征的診斷具有較高的敏感 性和特異性,可以用于干燥綜合征的診斷,從而達(dá)到通過血清學(xué)的方法診斷干燥綜合征的 目的,為干燥綜合征的臨床診斷提供客觀的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。本發(fā)明的抗IgA型的α-胞襯蛋白多肽的檢測(cè)可通過多種方法(例如酶聯(lián)免疫 吸附法、免疫印跡法、金標(biāo)記法等)對(duì)干燥綜合征患者進(jìn)行檢測(cè),其檢測(cè)方法為本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的。本發(fā)明所述的α-胞襯蛋白多肽可以通過多種方法得到,例如固相合成法、基因 工程表達(dá)純化法等。
圖1.首先利用戊二醛偶聯(lián)法將α-胞襯蛋白多肽連接于牛血清白蛋白BSA,形成 BSA-G- α -胞襯蛋白多肽復(fù)合物,將該復(fù)合物作為抗原包被于酶聯(lián)免疫吸附微孔板上,與待 測(cè)血清一起孵育,如果血清中存在的抗α-胞襯蛋白多肽抗體,該抗體就會(huì)與包被的固相 抗原結(jié)合,形成抗原_抗體復(fù)合物。將未結(jié)合的抗體及其它成分沖洗干凈后,加入辣根過氧 化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人IgA抗體(IgA-HRP) —起孵育,此時(shí)IgA-HRP就會(huì)與抗原-抗 體復(fù)合物結(jié)合,形成抗原_抗體_酶標(biāo)抗體復(fù)合物,洗去未結(jié)合的成分,洗板5次后加入TMB 顯色液,37°C反應(yīng)15分鐘后加入IM H2SO4終止,若血清中含有抗α-胞襯蛋白多肽IgA抗 體,則會(huì)顯出特定的顏色,且抗體滴度越高顏色越深。加終止液后,酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處 測(cè)定標(biāo)本的OD值。圖2.由圖可見α _胞襯蛋白多肽-IgA抗體在原發(fā)性和繼發(fā)性干燥綜合征中的陽 性率均明顯高于SLE、RA及正常對(duì)照(P均< 0. 05或< 0. 01)。
實(shí)施例 實(shí)施例1 α -胞襯蛋白多肽IgA抗體陽性率在干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性 紅斑狼瘡及正常人的比較本研究用ELISA方法檢測(cè)了 α -胞襯蛋白多肽抗體在干燥綜合征(SS)、類風(fēng)濕關(guān) 節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)及正常人的陽性率(表1,圖2)。應(yīng)用u檢驗(yàn)比較各組數(shù) 據(jù),結(jié)果顯示,α -胞襯蛋白多肽抗體在原發(fā)和繼發(fā)性干燥綜合征的陽性率顯著高于類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和正常人,P值均<0.05。原發(fā)和繼發(fā)性干燥綜合征的α-胞襯蛋 白多肽抗體的陽性率相近,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而α-胞襯蛋白多肽抗體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡和 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的陽性率顯著高于正常人(P < 0. 05)。表1抗α F-IgA抗體在不同疾病的陽性率
病例數(shù)
權(quán)利要求
α 胞襯蛋白(α Fodrin)多肽,其序列為RQKLEDSYRFQFFQRDAEEL(即Arg Gln Lys Leu Glu Asp Ser Tyr Arg Phe Gln Phe Phe Gln Arg Asp Ala Glu Glu Leu)的多肽。
2.權(quán)利要求1中的α-胞襯蛋白多肽在制備干燥綜合征診斷試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一條α-胞襯蛋白多肽及其類似物用于干燥綜合征的診斷。這種多肽抗原的IgA型抗體,在干燥綜合征得診斷中具有很高的敏感性和特異性。
文檔編號(hào)C07K7/08GK101974074SQ20101050369
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者何菁, 李英妮, 栗占國(guó) 申請(qǐng)人:北京大學(xué)人民醫(yī)院