專利名稱：一種聚合物微球分離制備格爾德霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于エ業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種從發(fā)酵培養(yǎng)物中分離純化格爾德霉素的制備方法。
背景技術(shù)：
格爾德霉素(geldanamycin，GDM)于1970年被發(fā)現(xiàn)于吸水鏈霉菌(str印tomyces hygroscopicus)的發(fā)酵液中，屬^·苯酉昆安莎霄素類(benzoquinone ansamycins)。它的結(jié)構(gòu)特征是一個苯醌部分與ー個平面性大環(huán)安莎橋相連。具有抗原蟲、抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、 抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。早期被誤認(rèn)為是蛋白酪氨酸激酶抑制劑，然而隨著研究的深入，后來才發(fā)現(xiàn)GDM特異性作用于熱休克蛋白90 (Heat shock protein 90，HSP90) 的ATP結(jié)合位點(diǎn)，抑制其ATP酶活性。
Geldanamycin近年來熱休克蛋白作為藥物作用的靶目標(biāo)正逐漸成為腫瘤治療中最令人振奮的研究熱點(diǎn)之一。格爾德霉素可以通過特異性結(jié)合并抑制Hsp90的功能，刺激多種癌基因產(chǎn)物和重要周期調(diào)控蛋白的降解，細(xì)胞內(nèi)許多信號傳遞蛋白的正常功能均依賴于Hsp90，格爾德霉素就是通過干擾腫瘤細(xì)胞的Hsp90的正常功能，阻止Hsp90底物蛋白的活化，誘導(dǎo)細(xì)胞周期的阻斷，同時可以抑制病毒復(fù)制，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞和抗病毒的作用。格爾德霉素特異的作用靶點(diǎn)使其與其它抗腫瘤、抗病毒藥物不同，除了自身具有中等的抗腫瘤活性以外，在低濃度條件下，體外可以顯著提高順鉬、絲裂霉素C、多柔比星和阿糖胞苷的細(xì)胞毒性。GDM可以顯著增強(qiáng)順鉬和絲裂霉素C對小鼠肝癌H22的抑制作用， GDM和HSP90C-端抑制劑順鉬聯(lián)合應(yīng)用可協(xié)同抑制兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤和骨肉瘤，GDM和順鉬聯(lián)合應(yīng)用還可協(xié)同殺傷卵巣癌A2780cis細(xì)胞。自1970年發(fā)現(xiàn)格爾德霉素以來，眾多化學(xué)家合成了大量格爾德霉素的衍生物， 發(fā)現(xiàn)了ー些具有較高活性的衍生物。分析發(fā)現(xiàn)，格爾德霉素17位是最佳修飾位點(diǎn)，采用小分子烷基胺基取代甲氧基可以得到活性衍生物。目前，對兩個新的GDM衍生物17-AAG、 17-DMAG研究最多，正由美國、英國的幾家研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床II期試驗(yàn)，有望成為新的抗腫瘤藥物，格爾德霉素類必將在腫瘤治療領(lǐng)域展示出良好前景。美國專利US3595955A1公開的格爾德霉素制備エ藝，需要先使用ニ氯甲烷_正丁醇混合溶劑提取，再使用正丁醇進(jìn)行多次提取，濃縮后再用硅膠色譜柱進(jìn)行分離，正丁醇沸點(diǎn)高，在濃縮時極易導(dǎo)致格爾德霉素降解，而且步驟繁瑣，導(dǎo)致整體收率較低。美國專利 US2003186394A1公開的格爾德霉素制備エ藝，使用ニ氯甲烷提取、濃縮后，直接結(jié)晶、過濾， 經(jīng)異辛烷洗滌，干燥后得到終產(chǎn)品，步驟雖然簡便，但產(chǎn)品含量較低，相關(guān)物質(zhì)不能有效得到控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，得到高純度、高收率的格爾德霉素制備エ 藝。本發(fā)明首次采用聚合物微球分離純化發(fā)酵液粗提物，通過梯度解析，有效地去除了發(fā)酵代謝過程產(chǎn)生的雜質(zhì)，得到高含量的格爾德霉素精粉，含量大于98.5%，單雜小于1.0%， 總收率大于80%，適于エ業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)高純度格爾德霉素。下面對本發(fā)明進(jìn)行具體描述在本發(fā)明方法中，通過過濾格爾德霉素發(fā)酵液，得到固形發(fā)酵培養(yǎng)物，在發(fā)酵培養(yǎng)物中加入極性溶劑攪拌浸提，經(jīng)過濾、濃縮、再過濾，得到格爾德霉素粗提物，粗提物用極性溶劑溶解后上樣至聚合物微球?qū)游鲋?，使用水與極性溶劑的混合液梯度解析，收集格爾德霉素洗脫液，經(jīng)濃縮、過濾、干燥，得到高含量格爾德霉素精粉。本發(fā)明所得格爾德霉素可供藥品使用，格爾德霉素含量可達(dá)98. 5%以上，單雜小于1%，樣品回收率大于80%。具體地，本發(fā)明涉及一種聚合物微球分離制備格爾德霉素的方法，包括下述步驟1)在常溫條件下對格爾德霉素發(fā)酵液進(jìn)行固液分離，得到固形發(fā)酵培養(yǎng)物；2)發(fā)酵培養(yǎng)物中加入極性溶劑攪拌浸提，浸提完成后進(jìn)行固液分離，得到格爾德霉素浸提液；3)減壓濃縮浸提液至極性溶劑所占比例小于30% ；4)對濃縮液進(jìn)行固液分離，得格爾德霉素固形粗提物；5)將格爾德霉素粗提物用極性溶劑溶解，注入聚合物微球?qū)游鲋?)使用極性溶劑與水的混合液進(jìn)行梯度洗脫，收集格爾德霉素洗脫液；7)減壓濃縮格爾德霉素洗脫液至極性溶劑所占比例小于30%。8)對濃縮后的洗脫液進(jìn)行固液分離，減壓干燥，得格爾德霉素精粉。其中步驟1)、4)、8)中的固液分離可為抽濾、壓濾、離心，固形發(fā)酵培養(yǎng)物為菌絲體。步驟2)中對固形發(fā)酵培養(yǎng)物的單次浸提時間為20-180min，優(yōu)選60-90min，浸提次數(shù)為1-3次，單次浸提溶劑與發(fā)酵液的體積比為0. 1-2. 0，優(yōu)選0. 4-1. 0。步驟2)、5)、6)所述的極性溶劑為甲醇或乙醇、異丙醇、丙酮中的ー種，優(yōu)選甲醇、 乙醇，各步驟使用的極性溶劑可不相同。步驟幻中使用的聚合物微球是采用聚苯乙烯、聚丙烯酸酯及其衍生物制備的，優(yōu)選氨基化聚苯乙烯微球、磺酸化聚苯乙烯微球及羧基化聚苯乙烯微球。步驟6)中梯度洗脫的極性溶劑所占比例可為0-100%，優(yōu)選50-85%。本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)1.使用聚合物微球?qū)诱?，大幅度提高了產(chǎn)品純度，降低了相
4關(guān)物質(zhì)含量。2.收率高，全程總收率達(dá)到80%以上。3.エ藝簡潔，質(zhì)量可控，為生產(chǎn)藥用級原料提供了更加安全的技術(shù)保障。


附圖1 格爾德霉素精粉HPLC檢測圖譜
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例僅用于闡述實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明所使用的格爾德霉素發(fā)酵液均為華北制藥集團(tuán)新藥研發(fā)有限責(zé)任公司用微生物培養(yǎng)手段得到的。聚合物微球?yàn)樘K州納微科技公司生產(chǎn)，乙醇、甲醇等試劑均為市售。本發(fā)明使用的高效液相色譜儀為996型檢測器，515泵(Waters公司)。實(shí)施例1 取格爾德霉素發(fā)酵液10. 0L,發(fā)酵單位2. llg/L,真空抽濾，得到2. 03kg菌絲體。在菌絲體中加入6L濃度為95%的乙醇，常溫攪拌1小時后真空抽濾，收集濾液。40°C下將濾液減壓濃縮至乙醇濃度小于5%，冷卻至20°C，真空抽濾，得格爾德霉素粗提物43. 2g，加入無水乙醇64. 8mL溶解，注入長度50cm，直徑為5. 5cm,PSA30型聚合物微球裝量為IOOOml的層析柱，使用65%濃度乙醇作為流動相洗滌20min，75%濃度乙醇作為流動相洗滌至格爾德霉素洗脫完畢，流速為1500mL/h，根據(jù)HPLC檢測結(jié)果收集洗脫液，40°C減壓濃縮洗脫液至乙醇濃度為5%，冷卻至20°C，過濾得到格爾德霉素濕粉，將格爾德霉素濕粉在45°C下真空干燥，直至水分小于5%。最后得到17. 6g淺黃色格爾德霉素精粉，收率為82. 43%。精粉HPLC含量為98. 82%，其中最大單雜< 1.0%。其HPLC檢測圖譜參見附圖1。實(shí)施例2取格爾德霉素發(fā)酵液5. 0L,發(fā)酵單位2. 23g/L，真空抽濾，得到1. 13kg菌絲體。在菌絲體中加入2L濃度為99%的甲醇，常溫攪拌2小時后真空抽濾，收集濾液，濾餅中加入 IL濃度為99%的甲醇，常溫攪拌2小時后真空抽濾，合并過濾液。40°C下將濾液減壓濃縮至甲醇濃度小于5%，冷卻至20°C，真空抽濾，得格爾德霉素粗提物21. 6g，加入甲醇30mL 溶解，注入長度50cm，直徑為5. 5cm, PS30型聚合物微球裝量為500ml的層析柱，使用70% 濃度甲醇作為流動相洗滌20min，85%濃度甲醇作為流動相洗滌至格爾德霉素洗脫完畢，流速為750mL/h，根據(jù)HPLC檢測結(jié)果收集洗脫液，40°C減壓濃縮洗脫液至甲醇濃度小于5%， 冷卻至20°C，過濾得到格爾德霉素濕粉，將格爾德霉素濕粉在45°C下真空干燥，直至水分小于5%。最后得到9. 37g淺黃色格爾德霉素精粉，收率為83. 06%。精粉HPLC含量為 98. 85%，其中最大單雜< 1. 0%o實(shí)施例3取格爾德霉素發(fā)酵液5. 0L，發(fā)酵單位2.ぬg/L，3200轉(zhuǎn)/分鐘離心，傾去上清液，得到1. 35kg菌絲體。在菌絲體中加入3L濃度為99%的甲醇，40°C攪拌1小時后真空抽濾， 收集濾液。40°C下將濾液減壓濃縮至甲醇濃度小于5%，冷卻至20°C，真空抽濾，得格爾德霉素粗提物22. 4g，加入甲醇30mL溶解，注入長度25cm，直徑為5. 5cm, PS30型聚合物微球裝量為500ml的層析柱，使用70%濃度甲醇作為流動相洗滌20min，85%濃度甲醇作為流動相洗滌至格爾德霉素洗脫完畢，流速為750mL/h，根據(jù)HPLC檢測結(jié)果收集洗脫液，40°C減壓濃縮洗脫液至甲醇濃度小于5%，冷卻至20°C，過濾得到格爾德霉素濕粉，將格爾德霉素濕粉在45°C下真空干燥，直至水分小于5%。最后得到9. 65g淺黃色格爾德霉素精粉，收率為 85.37%。精粉HPLC含量為98. 65%，其中最大單雜< 1.0%。
權(quán)利要求
1.一種聚合物微球分離制備格爾德霉素的方法，其特征在于該方法包括下述步驟1)在常溫條件下對格爾德霉素發(fā)酵液進(jìn)行固液分離，得到固形發(fā)酵培養(yǎng)物；2)發(fā)酵培養(yǎng)物中加入極性溶劑攪拌浸提，浸提完成后進(jìn)行固液分離，得到格爾德霉素浸提液；3)減壓濃縮浸提液至極性溶劑所占比例小于30%；4)對濃縮液進(jìn)行固液分離，得格爾德霉素固形粗提物；5)將格爾德霉素粗提物用極性溶劑溶解，注入聚合物微球?qū)游鲋?)使用極性溶劑與水的混合液進(jìn)行梯度洗脫，收集格爾德霉素洗脫液；7)減壓濃縮格爾德霉素洗脫液至極性溶劑所占比例小于30%。8)對濃縮后的洗脫液進(jìn)行固液分離，減壓干燥，得格爾德霉素精粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)所述的浸提時間為20-180min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2、所述的浸提次數(shù)為1-3次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2、所述的單次浸提溶劑與發(fā)酵液的體積比為0. 1-2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟幻、5)、6)所述的極性溶劑為甲醇或乙醇、異丙醇、丙酮中的ー種，各步驟使用的極性溶劑可不相同。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟幻所述聚合物微球是采用聚苯乙烯或聚丙烯酸酯及其衍生物制備的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟6)所述梯度洗脫中極性溶劑所占比例可為0-100%。
全文摘要
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種從發(fā)酵培養(yǎng)物中使用聚合物微球分離純化格爾德霉素的制備方法。
文檔編號C07D225/06GK102584704SQ20111000067
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者張麗, 張金娟, 張雪霞, 李寧, 李曉露, 林旸, 林毅, 王健, 王海燕, 王秀捧 申請人:華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司