專利名稱：用于定量生物樣品中dna的改良方法
用于定量生物樣品中DNA的改良方法背景本發(fā)明涉及定量生物樣品中對命名為Btll的轉(zhuǎn)基因玉米事件為獨特的核酸的改良方法并且涉及在開展所述方法中有用的組合物。隨著實施關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物植物的規(guī)定，例如歐盟委員會(EC)第1139/98號規(guī)定、 EC第49/2000號規(guī)定和EC第50/2000號規(guī)定，需要精確測量來自轉(zhuǎn)基因物種中的DNA的水平，其中所述的DNA可能存在于例如用于食物的谷類中。因為歐盟委員會常務(wù)委員會在 1999年制定的用于標(biāo)記的閾值是1%，故檢測并定量來自這些轉(zhuǎn)基因植物的DNA的分析方法已經(jīng)特別受到眾多關(guān)注?？梢酝ㄟ^任何熟知的核酸檢測方法，包括但不限于使用多核苷酸引物的熱擴增法 (聚合酶鏈反應(yīng)(PCR))或使用核酸探針的DNA雜交法，檢測轉(zhuǎn)基因的存在。一般而言，為簡化和統(tǒng)一在檢測已用于轉(zhuǎn)化多個植物品種的特定DNA構(gòu)建體中使用的試劑和方法學(xué)，這些檢測方法通常側(cè)重于頻繁所用的遺傳元件，例如，啟動子、終止子和標(biāo)記基因，因為對于許多DNA構(gòu)建體而言編碼序列區(qū)是可互換的。因此，此類方法可能無法用于區(qū)分僅就編碼序列而言不同的構(gòu)建體。此外，此類方法可能無法用于區(qū)分不同的轉(zhuǎn)基因事件，尤其使用相同 DNA構(gòu)建體所產(chǎn)生的那些轉(zhuǎn)基因事件。為區(qū)別轉(zhuǎn)基因事件，已經(jīng)開發(fā)了事件特異性PCR方法。異源DNA構(gòu)建體插入植物的基因組中產(chǎn)生在整合的DNA序列與植物基因組序列之間的單一事件特異性接點。已經(jīng)開發(fā)用于轉(zhuǎn)基因事件的事件特異性定量PCR(qPCR)方法，包括用于Btll的一種事件特異性定量PCR方法。可能限制此類方法應(yīng)用的因素可以包括，例如，初始DNA濃度的影響、管理機構(gòu)制定的標(biāo)準(zhǔn)、引物和PCR方案的選擇、樣品與樣品的重復(fù)性、不同實驗室之間的重現(xiàn)性和低水平檢測與高靈敏度的閾值。出于前述原因，對于改善定量檢測生物樣品中來自Btll轉(zhuǎn)基因玉米事件的核酸存在需求。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及命名為Btll的轉(zhuǎn)化玉米(玉蜀黍(Zea mays))事件，其包含兩個異源表達盒，一個異源表達盒包含cryIAb編碼序列，所述的cryIAb編碼序列編碼對Btll玉米植物賦予抗蟲性的CrylAb殺蟲蛋白，并且另一個異源表達盒包含pat編碼序列，所述的pat 編碼序列編碼對Btll玉米植物賦予草銨膦除草劑抗性的PAT蛋白。Btll事件的產(chǎn)生在其內(nèi)容因而通過引用方式并入的美國專利號6，114，608中描述。這兩個表達盒插在第8號染色體長臂上的15cM區(qū)域內(nèi)，接近第117位置并且處于側(cè)翼分布有兩個公用標(biāo)記ZIB3和 UMC 150a的間隔內(nèi)。本發(fā)明提供用于生物樣品中相對于內(nèi)源性玉米(Zea mays)adhl基因定量檢測 Btll-特異性DNA的組合物和改良方法。這種對BtllDNA在例如包含Btll谷粒和非Btll 谷粒的玉米?；旌衔镏械亩炕谠O(shè)計旨在檢測Btll中5'連接序列的引物對和探針。在本發(fā)明的一個方面，提供一種定量包含玉米核酸的生物樣品中事件BtllDNA的方法，其中該方法包括(a)使所述生物樣品與包含由SEQ ID NO :1組成的第一引物和由SEQ
3ID NO :2組成的第二引物的第一對引物和包含SEQ ID NO :3的熒光染料標(biāo)記探針接觸，其中在具有來自事件Btll玉米的基因組DNA的核酸擴增反應(yīng)中使用時，所述第一對引物產(chǎn)生包含SEQ ID NO 4的第一擴增子并且其中所述第一擴增子用于確定事件Btll ； (b)使所述生物樣品與包含由SEQ ID NO :5組成的第一引物和由SEQ ID NO :6組成的第二引物的第二對引物和包含SEQ ID NO :7的第二熒光染料標(biāo)記探針接觸，其中在具有玉米基因組DNA的核酸擴增反應(yīng)中使用時，所述第二對引物產(chǎn)生包含SEQ ID NO :8的第二擴增子，并且其中所述第二擴增子指示玉米adhl基因的存在；(c)提供能夠進行定量實時PCR的核酸擴增反應(yīng)條件和PCR儀；(d)使用(a)和(b)的引物和探針進行定量實時PCR，因而產(chǎn)生所述的第一擴增子和所述的第二擴增子；(e)當(dāng)?shù)谝粩U增子和第二擴增子由所述PCR儀產(chǎn)生時，同時檢測它們；并且(f)與所述第二擴增子比較計算所述第一擴增子的相對量，因而第一擴增子的量指示BtllDNA在生物樣品中的量。在另一個方面中，本發(fā)明提供了包含由SEQ ID NO :1組成的第一引物和由SEQ ID NO 2組成的第二引物的一對引物，其中在具有來自事件Btll玉米的基因組DNA的PCR中使用時，該對引物產(chǎn)生包含用于確定玉米事件Btll的SEQ ID NO 4的擴增子。在又一個方面，本發(fā)明提供由SEQ ID NO :3組成的多核苷酸探針，其中用熒光染料在5'和3’端標(biāo)記時，所述的多核苷酸探針用于檢測和定量Btll擴增子的RT-qPCR中。本發(fā)明的前述和其他方面將會因以下詳細(xì)描述變得更顯而易見。對序列表中序列的描述SEQ ID NO :1 是 Btll-5For 引物。SEQ ID NO :2 是 Btll_5Rev 引物。SEQ ID NO :3 是 Btll 探針。SEQ ID NO :4 是 BtllqPCR 擴增子。SEQ ID NO 5 是 Zmadhl-F 引物。SEQ ID NO 6 是 Zmadhl-R 引物。SEQ ID NO 7 是 Zmadhl-P 探針。SEQ ID NO 8 是 adhlqPCR 擴增子。發(fā)明詳述提供以下定義以更好定義本發(fā)明并引導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員實施本發(fā)明。除非另外說明，本文中所用的術(shù)語將根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)用法進行理解。分子生物學(xué)中常見術(shù)語的定義也可以在Rieger等人，《經(jīng)典遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)詞匯》(Glossary of Genetics :Classical and Molecular),第 5 版，Springer-Verlag :New York, 1994 中找至Ij0 本文中使用如37C. F. R. § 1. 822中所述的DNA堿基和氨基酸命名。PCR方法的“準(zhǔn)確度”意指在試驗結(jié)果和接受的參比值之間的接近程度?！皵U增效率”意指每個循環(huán)中以100%效率導(dǎo)致-3. 32理論斜率的擴增速率。反應(yīng)的效率可以由以下等式計算效率=[10 (-1/斜率)]-1。如本文中所用，術(shù)語〃擴增(amplified)“意指使用至少一個某核酸分子作為模板構(gòu)建該核酸分子的多個副本或與該核酸分子互補的多個副本。擴增體系包括，但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)體系、基于核酸序列的擴增(NASBA， Cangene, Mississauga, Ontario)、Q-Beta復(fù)制酶體系、基于轉(zhuǎn)錄的擴增體系(TAS)和鏈置換擴增(SDA)。見，例如，《診斷分子微生物學(xué)原理和應(yīng)用》(Diagnostic Molecular Microbiology =Principles and Applications), D. H. Persing 等人編著，美國微生物學(xué)會 (American Society for Microbiology), Washington, D. C. (1993)。擴增的產(chǎn)物命名為擴增子。線性系數(shù)(R2)，，是通過線性回歸分析所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)。如本文中所用的“動態(tài)范圍”意指BtllDNA濃度的范圍，在所述范圍內(nèi)本發(fā)明的方法以線性方式以可接受水平的準(zhǔn)確度和精密度進行。如本文中所用，術(shù)語轉(zhuǎn)基因"事件"指通過用異源DNA(例如，包括目的基因的表達盒)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織并使其再生而產(chǎn)生的重組植物。術(shù)語“事件”指包含該異源DNA 的原始轉(zhuǎn)化體和/或該轉(zhuǎn)化體的子代。術(shù)語“事件”也指通過轉(zhuǎn)化體與另一個玉米品系之間的有性遠(yuǎn)交產(chǎn)生的子代。甚至與輪回親本反復(fù)回交后，插入的DNA和來自轉(zhuǎn)化親本的側(cè)翼DNA存在于雜交子代中相同的染色體位置處。術(shù)語“事件”也指來自原始轉(zhuǎn)化體的包含所插入DNA和與插入DNA緊鄰的側(cè)翼基因組序列的DNA，其中預(yù)期所述的DNA轉(zhuǎn)移至子代， 所述子代因包括該插入DNA的一個親本系(例如，原始轉(zhuǎn)化體和因自交產(chǎn)生的子代)與不含所述插入DNA的親本系的有性雜交而接受包含目的轉(zhuǎn)基因的插入DNA。通常，植物組織的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生多個事件，其中每一者代表DNA構(gòu)建體插入植物細(xì)胞基因組中的不同位置?；谵D(zhuǎn)基因或其他想要特征的表達，選擇特定事件。因而，“事件Btll”、“Btll”或“Btll事件” 可以互換地使用。如本文中所用的"表達盒"意指能夠指導(dǎo)特定核苷酸序列在適宜宿主細(xì)胞中表達的核酸分子，其包含與目的核苷酸序列有效連接的啟動子，其中所述的目的核苷酸序列與終止信號有效連接。它一般還包含為正確翻譯該核苷酸序列所需的序列。表達盒也可以包含這類序列，它們是指導(dǎo)目的核苷酸序列表達時不必需的，但是因用于從表達載體移出該表達盒的便利限制性位點而存在。包含目的核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的，這意指該表達盒的組分至少之一相對于該表達盒的其他組分至少之一是異源的。表達盒也可以是一種表達盒，其天然地存在，但已經(jīng)以用于異源表達的重組形式獲得。然而，一般而言，表達盒相對于宿主是異源，即，該表達盒的特定核酸序列不天然存在于宿主細(xì)胞中并且必須已經(jīng)由本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞或該宿主細(xì)胞的祖先中。表達盒中核苷酸序列的表達可以處于組成型啟動子或處于僅在宿主細(xì)胞暴露于一些特定外部刺激時才啟動轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動子控制下。在多細(xì)胞生物(如植物)的情況下，啟動子也可以是針對特定組織、或器官或發(fā)育階段為特異的。當(dāng)轉(zhuǎn)化到植物中時，表達盒或其片段也可以稱作“插入的序列”或“插入序列”?！颉ㄊ窍薅ǖ膮^(qū)域，其位于基因組內(nèi)部并且除編碼序列之外，還可以包含負(fù)責(zé)控制表達也即轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼部分的其他(主要是調(diào)節(jié)性)核酸序列?；蛞部梢园渌?'和3'非翻譯序列和終止序列?？梢源嬖诘钠渌缡莾?nèi)含子?！爱愒?核酸序列是與導(dǎo)入該核酸序列的宿主細(xì)胞不天然結(jié)合的核酸序列，包括天然存在核酸序列的多個非天然存在副本?！皺z測限(L0D)”是樣品中可以可靠檢出，但不必然定量的DNA最低量或濃度。本發(fā)明方法的LOD將小于目標(biāo)濃度的二十分之一。本發(fā)明的方法將會在至少95%的時間以所述LOD檢測到BtllDNA的存在，從而確保彡5%假陰性結(jié)果。
“定量限(LOQ) ”是可以用可接受水平的精密度和準(zhǔn)確度可靠定量的樣品中 BtllDNA的最低量或濃度。本發(fā)明方法的LOQ將在RSDr彡25%的情況下小于目標(biāo)濃度值的十分之一。目標(biāo)濃度意圖作為與立法要求相關(guān)的閾值。“實用性”意指操作的便易性、實現(xiàn)的可行性和效率和/或本文中所述方法的相關(guān)單位成本(例如$/樣品)。如本文中所用的“引物”是分離的核酸，其通過核酸雜交與互補性靶DNA鏈復(fù)性以形成引物和靶DNA鏈之間的雜交體，并且隨后由聚合酶(如DNA聚合酶)沿靶DNA鏈延伸。 引物對或組可以用于核酸分子的擴增，例如，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或其他常規(guī)的核酸擴增方法。“探針”是與常規(guī)的可檢測標(biāo)記物或報道分子(如化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、放射性同位素、 配體或酶)連接的分離核酸。這種探針與自玉米事件Btll或常規(guī)玉米品系的DNA鏈互補。 Bt 11的DNA可以來自Bt 11玉米植物或來自包含源自Bt 11的DNA的樣品。本發(fā)明的探針包含與靶DNA序列特異性結(jié)合并且可以用來檢測這種靶DNA序列存在的脫氧核糖核酸或核糖核酸和聚酰胺及其他探針材料。引物和探針通常具有10和15個之間或更多個核苷酸長度。引物和探針也可以具有至少20個或更多個核苷酸長度，或至少25個核苷酸或更多，或至少30個或更多個核苷酸長度。此類引物和探針在高嚴(yán)格性雜交條件下與靶序列特異性雜交。本發(fā)明的引物和探針可以與靶序列具有完全的序列互補性，不過可以通過常規(guī)方法設(shè)計與靶序列不同并保持與靶序列雜交的能力的探針。如本文中所用，“重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDr) ”是在重復(fù)性條件下獲得的試驗結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差。“重復(fù)性條件”是這樣的條件，其中使用相同設(shè)備，由相同操作人員在相同的實驗室中對相同的測試項目用相同的方法在短間隔時間內(nèi)獲得試驗結(jié)果。如本文中所用，“重現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDR) ”是在重現(xiàn)性條件下獲得的試驗結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差?！爸噩F(xiàn)性條件”是這樣的條件，其中使用不同設(shè)備，由不同操作人員在不同的實驗室中對相同的測試項目用相同的方法獲得試驗結(jié)果。重現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差描述實驗室間變異。方法的“穩(wěn)健性”是該方法保持不受背離程序中所述實驗條件的微小但人為偏差所影響的能力的測度。方法的“特異性”指該方法與目的特征或分析物專門對應(yīng)的屬性。例如，實施例1 中所述PCR方法(其使用SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2中公開的引物)的特異性專門檢測 BtlIDNA。方法的“真實性”是從龐大系列試驗結(jié)果中獲得的平均值與接受的參比值之間的接近程度。真實性的量度一般以偏差百分?jǐn)?shù)表述。本發(fā)明的方法在整個動態(tài)范圍內(nèi)具有士 5%的真實性。如本文中所用，術(shù)語對Btll “獨特”特別意指作為事件Btll的特征或用于確定事件Btll。因此，對事件Btll獨特的核酸不存在于其他非Btll玉米植物中。本發(fā)明涉及用于生物樣品中相對于內(nèi)源性玉米adhl基因定量檢測Btll-特異性 DNA的組合物和改良方法。這種對BtllDNA在例如包含Btll谷粒和非Btll谷粒的玉米粒混合物中的定量基于設(shè)計旨在檢測Btll中5'連接序列的引物對和探針。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明包括一種定量包含玉米核酸的生物樣品中事件BtllDNA的方法，該方法包括(a)使所述生物樣品與包含由SEQID NO :1組成的第一引物和由SEQ ID NO :2組成的第二引物的第一對引物和包含SEQ ID NO :3的熒光染料標(biāo)記探針接觸，其中在具有來自事件Btll玉米的基因組DNA的核酸擴增反應(yīng)中使用時，所述第一對引物產(chǎn)生包含SEQ IDNO 4的第一擴增子并且其中所述第一擴增子用于確定事件Btll ； (b)使所述生物樣品與包含由SEQ ID NO :5組成的第一引物和由SEQ ID NO :6組成的第二引物的第二對引物和包含SEQ ID NO :7的第二熒光染料標(biāo)記探針接觸，其中在具有玉米基因組DNA的核酸擴增反應(yīng)中使用時，所述第二對引物產(chǎn)生包含SEQ ID NO :8的第二擴增子， 并且其中所述第二擴增子指示玉米adhl基因的存在；(c)提供能夠進行定量實時PCR的核酸擴增反應(yīng)條件和PCR儀；(d)使用(a)和(b)的引物和探針進行定量實時PCR，因而產(chǎn)生所述的第一擴增子和所述的第二擴增子；(e)當(dāng)?shù)谝粩U增子和第二擴增子由該PCR儀產(chǎn)生時，同時檢測它們；并且(f)與所述第二擴增子比較計算所述第一擴增子的相對量，因而第一擴增子的量指示BtllDNA在生物樣品中的量。在該實施方案的一個方面，該方法具有小于或等于0.08% BtllDNA濃度的定量限 (LOQ)。在該實施方案的另一個方面，該方法具有小于或等于0. 04% BtllDNA濃度的檢測限(LOQ)。在該實施方案的又一個方面，該方法具有至少0. 99的平均線性系數(shù)(R2)。在該實施方案的再一個方面，該方法在0. 090%的BtllDNA濃度具有或更小的相對重現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDR)。在該實施方案的再一個方面，該方法在0. 090%的BtllDNA濃度具有17%或更小的相對重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDr)。在該實施方案的又一個方面，該方法在整個動態(tài)范圍內(nèi)具有士5%或更小的真實值。在另一個實施方案中中，本發(fā)明包括包含由SEQ ID NO 1組成的第一引物和由 SEQ ID NO :2組成的第二引物的一對引物，所述引物對在PCR中在生物樣品中存在玉米事件BtllDNA模板的情況下一起發(fā)揮作用以產(chǎn)生用于確定玉米事件Btll的擴增子。在該實施方案的一個方面，擴增子包含SEQ ID NO :4。在又一個實施方案中，本發(fā)明包括熒光染料標(biāo)記的探針，其包含SEQ IDNO :3。以下實施例僅意圖說明本發(fā)明的一個或多個優(yōu)選實施方案，并且不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1. Btll定量RT-qPCR方法開發(fā)本實施例描述了用于確定生物樣品中事件BtllDNA相對于總玉米DNA的相對量的改良Btll-特異性實時定量PCR(RT-qPCR)方法。TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA)測定法是在 PCR 反應(yīng)進展期間直接監(jiān)測PCR產(chǎn)物累積的RT-qPCR檢測技術(shù)。每個擴增循環(huán)期間TaqDNA聚合酶5 ‘至 3'外切核酸酶活性對靶特異性探針分子的降解導(dǎo)致熒光的累積。增加的熒光水平與PCR 產(chǎn)物的累積直接相關(guān)并且在每個擴增循環(huán)期間通過使用專用PCR儀器，例如，不限于，ABIPRISM 770 或 ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA)進行檢測。根據(jù)熒光超過背景以上特定水平的循環(huán)，循環(huán)閾值(Ct)由PCR儀自動賦予每份樣品。反應(yīng)開始時具有較高水平模板的樣品將會更快地擴增至可檢測的水平并且產(chǎn)生較低的 Ct0為將試樣中事件BtllDNA的量定量，使用校準(zhǔn)樣品的歸一化Δ Ct值來通過線性回歸計算參比曲線ACt-式。隨后測量未知樣品的歸一化ACt，并且借助計算出的回歸公式估計未知樣品中Btll事件DNA的相對量本文中所述的TaqMan 測定法可以用來精確地定量 BtllDNA相對于內(nèi)源性校準(zhǔn)物玉米基因的水平。因為內(nèi)源性校準(zhǔn)物序列相對于總玉米基因組DNA保持恒定，故Btll-特異性DNA相對于內(nèi)源性基因的相對水平的任何變動顯示拷貝數(shù)的差異。1. 1用于事件Btll玉米的事件特異性PCR體系基于涉及DNA插入物及其側(cè)翼5'和3'邊界序列的序列信息，測試從事件Btll 的插入物和因組DNA之間的兩個連接區(qū)衍生的PCR體系。在寡核苷酸設(shè)計軟件(Primer Express V2. 0)輔助下，設(shè)計針對5'邊界的三個探針和六條擴增引物，并且設(shè)計針對3‘ 邊界的一個探針和三條擴增引物。隨后實驗地測試這些引物和探針的全部可能組合。對Ct值、Δ Rn值、擴增曲線形狀和PCR效率的比較產(chǎn)生被選擇用于進一步優(yōu)化的一個引物對/探針組合。優(yōu)選的引物對和探針位于5'基因組-插入物接點處，其產(chǎn)生比3'接點引物更好的結(jié)果。正向引物位于基因組DNA中，反向引物的結(jié)合位點位于事件Btll插入物內(nèi)部，因而該探針跨越5'基因組-插入物接點。為特異性檢測事件BtllDNA，使用以下引物擴增與異源插入物DNA和在插入物5，端側(cè)翼存在的玉米基因組DNA重疊的68_bp核酸片段Btll-ev-fl 5' -TGTGTGGCCATTTATCATCGA-3，(SEQ ID NO 1)Btll-ev-r5 5' -CGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3‘ (SEQ ID NO 2)。借助以下靶-特異性寡核苷酸探針在每個循環(huán)(實時)測量PCR產(chǎn)物Btll-ev-pl 5' -TTCCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGT-3‘ (SEQ IDNO 3)其中所述的寡核苷酸探針在其5’端以報道染料(熒光素(FAM))標(biāo)記，并且在其 3’端以猝滅染料(四甲基羅丹明(TAMRA))標(biāo)記。在具有Btll玉米DNA作為模板的反應(yīng)中使用這些引物產(chǎn)生了包含SEQID NO :4的擴增子，所述擴增子對事件Btll為獨特并且用于確定事件Btll。1. 2玉米-特異性參比PCR體系(Adhl)為相對地定量事件BtllDNA，使用擴增玉米(Zea mays)內(nèi)源性醇脫氫酶1基因(adhl) (Genbank登錄號AY691949)的135_bp片段的預(yù)存玉米-特異性參比PCR體系 (Hernandez等人2004. J. Agric. Food Chem. 52 :4632-4637)作為特異性檢測玉蜀黍序列的參比體系。該參比體系使用以下引物Zmadhl-F 5' -CGTCGTTTCCCATCTCTTCCT-3‘ (SEQ ID NO 5)Zmadhl-R 5' -CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3‘ (SEQ ID NO 6)借助以下靶-特異性寡核苷酸探針在每個循環(huán)(實時)測量PCR產(chǎn)物Zmadhl-P 5' -AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-3‘ (SEQ ID NO 7)其中所述的寡核苷酸探針在其5，端以VIC (Applied Biosystems,Foster City, CA)染料標(biāo)記，并且在其3’端以TAMRA標(biāo)記。
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在具有玉米DNA作為模板的反應(yīng)中使用這些引物產(chǎn)生了包含SEQ IDNO 8的擴增子，所述擴增子指示玉米adhl的存在。1.1校準(zhǔn)曲線的計算 校準(zhǔn)曲線由250ng玉米DNA總量中含有固定百分?jǐn)?shù)Bt 1IDNA的5份樣品組成。 BtlIDNA在標(biāo)準(zhǔn)樣品中的濃度從10%變動至0.08%。通過將校準(zhǔn)樣品的ACt值對相應(yīng) Btll%濃度的對數(shù)作圖產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線；校準(zhǔn)曲線(y = ax+b)的斜率(a)和截距(b)隨后用來基于雙盲樣品(blind sample)的歸一化Δ Ct值計算它們的平均Btll %含量。在TaqMan 反應(yīng)期間，伴隨ABI PRISM 7900HT儀的軟件通過熒光的累積檢測PCR 產(chǎn)物的累積。將相對于已建立基線水平(ΔΙ η)歸一化的熒光對循環(huán)數(shù)作圖。通過劃出貫穿反應(yīng)的任意截值(cutoff)獲得Ct值，從而該線穿過每個反應(yīng)的對數(shù)期。伴隨ABI PRISM 7900HT儀的序列檢測系統(tǒng)軟件提供循環(huán)數(shù)，其中在所述循環(huán)數(shù)上特定反應(yīng)的熒光(PCR產(chǎn)物)的累積與閾值(Ct)交叉。將FAM Ct(Btll)值與VIC Ct (adhl)值比較以相對于存在的總核酸水平歸一化每個反應(yīng)的FAM Ct值，以產(chǎn)生Δ Ct [ Δ Ct = Ct (FAM) -Ct (VIC)]。該計算除去由反應(yīng)中不相等的模板輸入所引起的任何變異。因為每基因組的內(nèi)源性玉米基因的拷貝數(shù)保持恒定，故Δ Ct的變化對應(yīng)于BtllDNA的量(或拷貝)的變化。通過未知樣品的ACt值與已知對照的ACt值比較，獲得Δ Δ Ct [Δ ACt = Δ Ct (未知)-Δ Ct (已知)]。 隨后可以使用Δ Δ Ct值，使用以下等式計算拷貝數(shù)拷貝數(shù)=2(Δ ACt)。1· 2實時PCR建立PCR在96孔反應(yīng)平板中實施。該方法是一種簡單體系，其中校準(zhǔn)物玉米adh內(nèi)源性測定法和靶Btll測定法在獨立的孔中同時進行。在兩個反應(yīng)管(一個反應(yīng)管用于Btll 體系和一個反應(yīng)管用于adhl體系)中，在冰上，以所列的順序添加表1和2中的組分(除之DNA外)以制備主混合物。2X Sigma Jumpstart即用型混合物以550 μ 1的IM MgCl2和 20μ 1的IOOOOx磺基羅丹明101補足。柔和混合并短暫離心。準(zhǔn)備好另外兩種反應(yīng)管，一種反應(yīng)管用于Btll，并且一種反應(yīng)管用于adhl主混合物、用于標(biāo)準(zhǔn)曲線DNA樣品、未知DNA 樣品和對照DNA樣品。添加正確量的主混合物(例如對于三個PCR重復(fù)，20x3 = 60 μ 1主混合物)至每只反應(yīng)管。添加表1和2中所示的正確量的DNA (例如對于三個PCR重復(fù)，5x3 =15μ 1 DNA)至每只反應(yīng)管。表1.用于玉米adhl參比體系的擴增反應(yīng)混合物中每個反應(yīng)孔的終體積/濃度。
權(quán)利要求
1.一種定量包含玉米核酸的生物樣品中事件BtllDNA的方法，該方法包括(a)使所述生物樣品與包含由SEQID NO 1組成的第一引物和由SEQID NO 2組成的第二引物的第一對引物和包含SEQ ID NO :3的熒光染料標(biāo)記探針接觸，其中在具有來自事件Btll玉米的基因組DNA的核酸擴增反應(yīng)中使用時，所述第一對引物產(chǎn)生包含SEQ ID NO 4的第一擴增子并且其中所述第一擴增子用于確定事件Btll ；(b)使所述生物樣品與包含由SEQID NO :5組成的第一引物和由SEQID NO :6組成的第二引物的第二對引物和包含SEQ ID NO :7的第二熒光染料標(biāo)記探針接觸，其中在具有玉米基因組DNA的核酸擴增反應(yīng)中使用時，所述第二對引物產(chǎn)生包含SEQ ID NO :8的第二擴增子，并且其中所述第二擴增子指示玉米adhl基因的存在；(c)提供能夠進行定量實時PCR的核酸擴增反應(yīng)條件和PCR儀；(d)使用(a)和(b)的引物和探針進行定量實時PCR，因而產(chǎn)生所述的第一擴增子和所述的第二擴增子；(e)當(dāng)所述第一擴增子和所述第二擴增子由所述PCR儀產(chǎn)生時，同時檢測它們；并且(f)與所述第二擴增子比較計算所述第一擴增子的相對量，因而所述第一擴增子的量指示BtllDNA在所述生物樣品中的量。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法具有小于或等于0.08% BtllDNA濃度的定量限(LOQ)。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法具有小于或等于0.04% BtllDNA濃度的檢測限(LOD)。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法具有至少0.99的平均線性系數(shù)(R2)。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法在0.090%的BtllDNA濃度具有或更小的相對重現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDR)。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法在0.090%的BtllDNA濃度具有17%或更小的相對重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDr)。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法在整個動態(tài)范圍內(nèi)具有士5%或更小的真實值。
8.包含由SEQID NO :1組成的第一引物和由SEQ ID NO :2組成的第二引物的一對引物，所述引物對在生物樣品中存在玉米事件BtllDNA模板的情況下一起發(fā)揮作用以產(chǎn)生用于確定玉米事件Btll的擴增子。
9.一種由SEQ ID NO 3組成的多核苷酸探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了定量生物樣品及其組合物中對命名為Bt11的轉(zhuǎn)基因玉米事件為獨特的核酸的改良方法。本發(fā)明還涉及在所述方法中使用的對事件Bt11為獨特的引物對。
文檔編號C07H21/02GK102482697SQ201080033479
公開日2012年5月30日 申請日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月18日
發(fā)明者H.哈特 申請人:先正達參股股份有限公司