專利名稱：抗體配制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明致力于包含抗體的配制劑。
背景技術(shù)：
在過(guò)去幾年里，生物技術(shù)的進(jìn)步使之可能使用重組DNA技術(shù)來(lái)生產(chǎn)多種蛋白質(zhì)， 供藥物應(yīng)用。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)比傳統(tǒng)的有機(jī)和無(wú)機(jī)藥物更大且更復(fù)雜(例如在復(fù)雜的三維機(jī)構(gòu)之外還擁有多種官能團(tuán))，所以此類蛋白質(zhì)的配制劑提出了特殊問(wèn)題。為了使蛋白質(zhì)維持生物學(xué)活性，配制劑必須至少使蛋白質(zhì)氨基酸的核心序列的構(gòu)象完整性保持完整，同時(shí)保護(hù)蛋白質(zhì)的多種官能團(tuán)免于降解。蛋白質(zhì)的降解途徑可涉及化學(xué)不穩(wěn)定性(例如任何涉及通過(guò)鍵形成或切割來(lái)修飾蛋白質(zhì)，產(chǎn)生新化學(xué)實(shí)體的過(guò)程)或物理不穩(wěn)定性(例如蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化)?；瘜W(xué)不穩(wěn)定性可源自脫酰胺、外消旋、水解、氧化、β消除或二硫化物交換。物理不穩(wěn)定性可源自例如變性、聚集、沉淀或吸附。三種最常見的蛋白質(zhì)降解途徑為蛋白質(zhì)聚集、脫酰胺和氧化。Cleland et al Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4) :307-377(1993)。用于藥物應(yīng)用的蛋白質(zhì)包括抗體。對(duì)治療有用的抗體的一個(gè)例子為結(jié)合氧化型 LDL的抗體。本領(lǐng)域需要適合治療用途的穩(wěn)定的包含抗體(諸如抗oxLDL抗體)的含水藥物配制劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供配制劑，其包含治療有效量的抗體、維持pH在約4. 5至約6. 5的范圍中的緩沖液、和任選的表面活性劑。在某些實(shí)施方案中，該配制劑在約2-8°C的溫度穩(wěn)定至少12個(gè)月。典型地，這產(chǎn)生含水配制劑，供使用，例如在藥物應(yīng)用中。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該配制劑為穩(wěn)定的含水配制劑。在某些實(shí)施方案中，該配制劑為穩(wěn)定的含水藥物配制劑。本文中至少部分涉及pH4. 5至6. 5的組氨酸和精氨酸組合作為對(duì)配制單克隆抗體，尤其是對(duì)聚集易感的全長(zhǎng)抗體特別有用的緩沖液的鑒定。該配制劑延遲其中的抗體產(chǎn)品的降解。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該組氨酸和精氨酸緩沖液為PH 5.0至6.0的組氨酸-乙酸鹽和精氨酸-乙酸鹽緩沖液。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該組氨酸和精氨酸緩沖液為PH 4. 5至6. 5的組氨酸-琥珀酸鹽和精氨酸-琥珀酸鹽緩沖液。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該配制劑為無(wú)菌的。本文中的緩沖液的配制劑具有4. 5至6. 5的pH，例如pH 5. 0至6. 0、pH 5. 25至 5. 75、或pH 5. 3至5. 6。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該配制劑具有5. 5或約5. 5的pH。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該配制劑具有5. 6或約5. 6的pH。如此，在一個(gè)方面，本發(fā)明關(guān)注這樣的配制劑，其在pH 4. 5至6. 5的組氨酸-乙酸鹽和精氨酸-乙酸鹽緩沖液中包含單克隆抗體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，它是例如穩(wěn)定的藥物配制劑。如此，在一個(gè)方面，本發(fā)明關(guān)注這樣的配制劑，其在pH 4. 5至6. 5的組氨酸-琥珀酸鹽和精氨酸-琥珀酸鹽緩沖液中包含單克隆抗體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，它是例如穩(wěn)定的藥物配制劑。在某些實(shí)施方案中，該緩沖液中的組氨酸乙酸鹽或組氨酸琥珀酸鹽濃度為約5mM 至約100mM。在某些實(shí)施方案中，該組氨酸乙酸鹽或組氨酸琥珀酸鹽濃度為約20mM。在某些實(shí)施方案中，該緩沖液中的精氨酸乙酸鹽或精氨酸琥珀酸鹽濃度為約50mM至約500mM。 在某些實(shí)施方案中，該精氨酸乙酸鹽或精氨酸琥珀酸鹽濃度為約150mM。本文中的配制劑可任選地包含表面活性劑。在某些實(shí)施方案中，該表面活性劑為聚山梨酯(例如聚山梨酯20)。在某些實(shí)施方案中，該表面活性劑濃度為0.0001%至約 1.0%。在某些實(shí)施方案中，該表面活性劑濃度為約0. 01 %至約0. 1 %。在一個(gè)實(shí)施方案中， 該表面活性劑濃度為0. 02%。該配制劑可任選地包含甲硫氨酸(例如在約5mg/ml或5mg/ ml的濃度)。該配制劑可任選地包含螯合劑，例如EDTA、EGTA、等。在某些實(shí)施方案中，該配制劑中的EDTA濃度為ImM EDTA。該配制劑典型地用于約10mg/ml至約250mg/ml的抗體濃度。在某些實(shí)施方案中， 該抗體濃度為約100mg/ml至250mg/ml。在某些實(shí)施方案中，該抗體濃度為約150mg/ml至約200mg/ml。在某些實(shí)施方案中，該抗體濃度為約25mg/ml至約200mg/ml。在另一個(gè)方面，本發(fā)明關(guān)注藥物配制劑，其包含(a)量為約lOmg/mL至約250mg/ mL的對(duì)脫酰胺或聚集易感的全長(zhǎng)IgGl抗體；(b)pH 4. 5至6. 5的組氨酸-乙酸鹽和精氨酸-乙酸鹽緩沖液；和(c)量為約0.01%至約0. 的聚山梨酯20。在另一個(gè)方面，本發(fā)明關(guān)注藥物配制劑，其包含(a)量為約lOmg/mL至約250mg/ mL的對(duì)聚集易感的全長(zhǎng)IgGl抗體；(b) pH 4. 5至6. 5的組氨酸-琥珀酸鹽和精氨酸-琥珀酸鹽緩沖液；和(c)量為約0. 01%至約0. 的聚山梨酯20。在某些實(shí)施方案中，該抗體為單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，該單克隆抗體為全長(zhǎng)抗體(例如IgGl、IgG4、等)。在某些實(shí)施方案中，該單克隆抗體為抗體片段(例如包含抗原結(jié)合區(qū)的)。例如，該抗體片段為Fab或F(ab' )2片段。在某些實(shí)施方案中，該單克隆抗體為人源化抗體。在某些實(shí)施方案中，該單克隆抗體對(duì)聚集易感。在某些實(shí)施方案中， 該抗體未進(jìn)行在先凍干。在某些實(shí)施方案中，該單克隆抗體結(jié)合ox-LDL。在又一個(gè)方面，本發(fā)明關(guān)注藥物配制劑，其在PH約4. 5至約6. 5的組氨酸和精氨酸緩沖液和表面活性劑中包含結(jié)合ox-LDL 的抗體。在某些實(shí)施方案中，該oxLDL抗體包含圖2的SEQ ID NO 3和4分別所示可變輕鏈氨基酸序列和可變重鏈氨基酸序列和任選的圖2的SEQ ID NO :6和7分別所示恒定區(qū)(H 和L)。在某些實(shí)施方案中，該抗oxLDL抗體包含由

圖1的核酸(SEQ ID NO=I和2)編碼的 VH 禾口 VL0本發(fā)明還涉及藥物配制劑，其包含量為約lOmg/mL至約200mg/mL的ox-LDL抗體、 組氨酸-乙酸鹽和精氨酸-乙酸鹽緩沖液、和聚山梨酯20，其中該配制劑的pH為約4. 5至約 6. 5。本發(fā)明還涉及藥物配制劑，其包含量為約lOmg/mL至約200mg/mL的ox-LDL抗體、組氨酸-琥珀酸鹽和精氨酸-琥珀酸鹽緩沖液、和聚山梨酯20，其中該配制劑的pH為約4. 5 至約6. 5。本發(fā)明還涉及制品，其包含裝有穩(wěn)定的含水藥物配制劑的容器，該穩(wěn)定的含水藥物配制劑包含治療有效量的抗體、維持PH在約4. 5至約6. 5的范圍中的緩沖液、和任選的表面活性劑。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該緩沖液為PH 5.0至6.0的組氨酸-乙酸鹽和精氨酸-乙酸鹽緩沖液。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該緩沖液為PH 5.0至6.0的組氨酸-琥珀酸鹽和精氨酸-琥珀酸鹽緩沖液。在某些實(shí)施方案中，該緩沖液的PH為5.5。在某些實(shí)施方案中，該緩沖液的PH為5.6。本發(fā)明還關(guān)注具有注射器可刺穿的塞子的管形瓶或罐(例如不銹鋼罐)，該管形瓶或罐內(nèi)部包含配制劑，任選冷凍形式的。在某些實(shí)施方案中，該管形瓶或罐為貯藏于約2-8°C。在某些實(shí)施方案中，該管形瓶為3cc、20cc或50cc管形瓶。此外，本發(fā)明提供制備藥物配制劑的方法，其包括(a)制備單克隆抗體配制劑； 并(b)評(píng)估該配制劑中的該單克隆抗體的物理穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、或生物學(xué)活性。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在含水藥物配制劑中穩(wěn)定抗體的方法，其通過(guò)組合治療有效量的抗體、維持PH在約4. 5至約6. 5的范圍中的緩沖液、和任選的表面活性劑來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該緩沖液為pH 4. 5至6. 5的組氨酸-乙酸鹽和精氨酸-乙酸鹽緩沖液。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該緩沖液為PH 4. 5至6. 5的組氨酸-琥珀酸鹽和精氨酸-琥珀酸鹽緩沖液。本發(fā)明還提供降低治療用單克隆抗體的聚集的方法，其包括在pH 4. 5至6. 5的組氨酸-乙酸鹽和精氨酸乙酸鹽緩沖液中配制該抗體。本發(fā)明還提供降低治療用單克隆抗體的聚集的方法，其包括在PH 4. 5至6. 5的組氨酸-琥珀酸鹽和精氨酸琥珀酸鹽緩沖液中配制該抗體。在本文中的配制劑和方法的某些實(shí)施方案中，該配制劑是穩(wěn)定的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該配制劑在約25°C貯藏時(shí)穩(wěn)定至少12個(gè)月。在一個(gè)實(shí)施方案中，該配制劑在約5°C 貯藏時(shí)穩(wěn)定至少12個(gè)月。在一個(gè)實(shí)施方案中，該配制劑在約-20°C貯藏時(shí)穩(wěn)定至少12個(gè)月。在一個(gè)實(shí)施方案中，該配制劑在約5°C貯藏時(shí)穩(wěn)定至少M(fèi)個(gè)月。在一個(gè)實(shí)施方案中，該配制劑在約-20°C貯藏時(shí)穩(wěn)定至少M(fèi)個(gè)月。在本文中的配制劑和方法的某些實(shí)施方案中，該配制劑供靜脈內(nèi)(IV)、皮下(SQ) 或肌肉內(nèi)(IM)施用。在一個(gè)例子中，該配制劑供IV施用且該抗體濃度為約10mg/ml至約 250mg/ml。在另一個(gè)例子中，該配制劑供SQ施用且該抗體濃度為約80mg/ml至約250mg/ ml ο另外，本發(fā)明關(guān)注在受試者中治療疾病或病癥的方法，其包括以有效治療該疾病或病癥的量將該配制劑施用于受試者。在又一個(gè)方面，本發(fā)明關(guān)注治療哺乳動(dòng)物的方法，其包括將治療有效量的本文中公開的含水藥物配制劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該哺乳動(dòng)物具有需要用該配制劑中的抗體治療的病癥。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供在受試者中治療動(dòng)脈粥樣硬化的方法，其包括以有效治療動(dòng)脈粥樣硬化的量將藥物配制劑施用于該受試者。在該抗體結(jié)合ox-LDL的情況中，要治療的病癥的例子包括動(dòng)脈粥樣硬化。本發(fā)明的這些和其它方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)是顯然的。
附圖簡(jiǎn)述圖1圖示編碼抗oxLDL抗體的可變重鏈和可變輕鏈的核酸序列。圖2圖示抗oxLDL抗體的H和L可變重鏈和可變輕鏈和恒定區(qū)的氨基酸序列。圖3圖示通過(guò)icIEF獲得的，抗oxLDL抗體的電荷變體，作為實(shí)施例1的pH研究中的PH的函數(shù)。圖顯示TO時(shí)(菱形)和于40°C溫育4周后(正方形)的數(shù)據(jù)。圖4圖示抗oxLDL抗體的大小變體，作為40°C時(shí)的pH的函數(shù)。圖顯示TO (菱形)、 一周(正方形)、兩周(三角形)、和四周(圓形)時(shí)的數(shù)據(jù)(PH研究)。圖5圖示CE-SDS UV (未還原)數(shù)據(jù)，顯示于40°C溫育4周的抗oxLDL抗體的百分比主峰(賦形劑研究)。圖6圖示ELISA結(jié)合數(shù)據(jù)，顯示于40°C溫育4周的抗oxLDL抗體樣品。圖7A和B圖示㈧使用SEC獲得的，不同濃度的抗oxLDL抗體的百分比聚集物， 和⑶使用icIEF獲得的，不同濃度的抗oxLDL抗體的百分比酸性峰。圖8圖示使用SEC獲得的，在各種氧化劑下抗oxLDL抗體的百分比聚集物。發(fā)明詳述I.定義在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于特定組合物或生物學(xué)系統(tǒng)，它們當(dāng)然可以有所變化。還應(yīng)理解本文中所使用的術(shù)語(yǔ)僅出于描述特定實(shí)施方案的目的，并非意圖對(duì)其進(jìn)行限制。如本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該” 包括復(fù)數(shù)所指物，除非另有明確說(shuō)明。如此，例如，提及“一個(gè)/種分子”任選包括兩個(gè)/種或更多個(gè)/種此類分子的組合，諸如此類。術(shù)語(yǔ)“藥物配制劑”指如下形式的制備物，使得容許活性組分的生物學(xué)活性有效， 且不含別的對(duì)會(huì)施用配制劑的受試者有不可接受的毒性的成分。此類配制劑是無(wú)菌的?！八帉W(xué)可接受”賦形劑(媒介、添加劑)為那些可合理施用于受試哺乳動(dòng)物以提供有效劑量的所采用的活性組分?！盁o(wú)菌”配制劑沒(méi)有活菌或者沒(méi)有或基本上沒(méi)有所有活的微生物及其孢子。在本文中，“冷凍”配制劑為一種處于0°C以下的溫度的。一般地，冷凍配制劑不是冷凍干燥的，也未進(jìn)行在先或后續(xù)凍干。在某些實(shí)施方案中，冷凍配制劑包含供貯藏的冷凍藥物物質(zhì)(在不銹鋼罐中)或冷凍藥物產(chǎn)品(在最終管形瓶構(gòu)造中)?！胺€(wěn)定”配制劑為一種其中的蛋白質(zhì)在貯藏后基本上保留其物理穩(wěn)定性和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物學(xué)活性的。優(yōu)選地，配制劑在貯藏后基本上保留其物理和化學(xué)穩(wěn)定性， 以及其生物學(xué)活性。貯藏期一般基于配制劑的預(yù)定架存期來(lái)選擇。多種用于測(cè)量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分析技術(shù)是本領(lǐng)域可得的且綜述于例如P印tide and Protein Drug Delivery, 247-301,Vincent Lee Ed. ,Marcel Dekker,Inc.，New York,N. Y. ,Pubs. (1991)及 Jones， A. Adv. Drug Delivery Rev. 10 J9-90 (1993)。可測(cè)量在預(yù)定溫度貯藏預(yù)定時(shí)間段后的穩(wěn)定性。在某些實(shí)施方案中，配制劑于約40°C穩(wěn)定至少約2-4周，和/或于約5°C穩(wěn)定至少3個(gè)月，和/或于約5°C穩(wěn)定至少6個(gè)月，和/或于約5°C穩(wěn)定至少12個(gè)月，和/或于約-20°C穩(wěn)定至少3個(gè)月或至少1年。在某些實(shí)施方案中，配制劑于約25°C穩(wěn)定至少6個(gè)月和/或于約25°C穩(wěn)定12個(gè)月，和/或于約5°C穩(wěn)定6個(gè)月，和/或于約5°C穩(wěn)定12個(gè)月，和/或于約-20°C穩(wěn)定至少6個(gè)月，和/或于約-20°C穩(wěn)定至少12個(gè)月，和/或于5°C或_20°C穩(wěn)定至
7少2年。在某些實(shí)施方案中，配制劑在冷凍(至例如-70°C )和融化配制劑后(例如在1、2 或3個(gè)循環(huán)的冷凍和融化后)穩(wěn)定?？梢远喾N不同方式定性和/或定量評(píng)估穩(wěn)定性，包括評(píng)估聚集(例如使用大小排阻層析、通過(guò)測(cè)量濁度、和/或通過(guò)視覺(jué)檢查)；使用陽(yáng)離子交換層析、圖像毛細(xì)管等電聚焦(icIEF)或毛細(xì)管區(qū)帶電泳評(píng)估電荷異質(zhì)性；氨基末端或羧基末端序列分析；質(zhì)譜分析；SDS-PAGE分析以比較還原型(reduced)和完整抗體；肽圖(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；評(píng)估抗體的生物學(xué)活性或抗原結(jié)合功能；等。不穩(wěn)定性可涉及下述一項(xiàng)或多項(xiàng)聚集，脫酰胺(例如Asn脫酰胺)，氧化(例如Met氧化)，異構(gòu)化(例如 Asp異構(gòu)化)，修剪/水解/片段化(例如鉸鏈區(qū)片段化)，琥珀酰亞胺形成，不配對(duì)的半胱氨酸，N端延伸，C端加工，糖基化差異，等。若在視覺(jué)檢查顏色和/或澄清度時(shí)，或根據(jù)UV光散射或大小排阻層析的測(cè)量，蛋白質(zhì)顯示很少的聚集、沉淀和/或變性或沒(méi)有上述跡象的話，則它在藥物配制劑中“保留其物理穩(wěn)定性”。若在給定時(shí)間的化學(xué)穩(wěn)定性使得蛋白質(zhì)被認(rèn)定為仍然保留其生物學(xué)活性，如下文定義的，則蛋白質(zhì)在藥物配制劑中“保留其化學(xué)穩(wěn)定性”?；瘜W(xué)穩(wěn)定性可通過(guò)檢測(cè)和定量蛋白質(zhì)的化學(xué)改變形式來(lái)評(píng)估?；瘜W(xué)改變可涉及大小修飾(例如修剪)，這可使用例如大小排阻層析、SDS-PAGE和/或基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜術(shù)(MALDI/TOF MS)來(lái)評(píng)估。其它類型的化學(xué)改變包括電荷改變(例如因脫酰胺而發(fā)生的)，其可通過(guò)例如離子交換層析或icIEF來(lái)評(píng)估。若抗體在給定時(shí)間的生物學(xué)活性在制備藥物配制劑時(shí)的生物學(xué)活性的約10%之內(nèi)(在測(cè)定法的誤差之內(nèi))，如在例如抗原結(jié)合測(cè)定法中測(cè)定的，則抗體在藥物配制劑中 “保留其生物學(xué)活性”。本文中下文詳述了用于抗體的其它“生物學(xué)活性”測(cè)定法。在本文中，單克隆抗體的“生物學(xué)活性”指抗體結(jié)合抗原的能力。它可進(jìn)一步包括抗體結(jié)合抗原并導(dǎo)致可測(cè)量的生物學(xué)應(yīng)答，其可在體外或在體內(nèi)測(cè)量。此類活性可以是拮抗性的或激動(dòng)性的。“脫酰胺”單克隆抗體在本文中為它的一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺殘基已被衍生物成例如天冬氨酸或異天冬氨酸的單克隆抗體。“對(duì)脫酰胺易感的”抗體為包含一個(gè)或多個(gè)發(fā)現(xiàn)傾向于脫酰胺的殘基的抗體。“對(duì)聚集易感的”抗體為發(fā)現(xiàn)與其它抗體分子聚集(尤其在冷凍和/或攪動(dòng)時(shí))的抗體。“對(duì)片段化易感的”抗體為發(fā)現(xiàn)被切割成兩個(gè)或更多個(gè)片段(例如在其鉸鏈區(qū)處) 的抗體。“降低脫酰胺、聚集、或片段化”意圖相當(dāng)于在不同PH或在不同緩沖液中配制的單克隆抗體，阻止或降低脫酰胺、聚集、或片段化的量。配制的抗體優(yōu)選基本上純的且希望基本上同質(zhì)的(例如沒(méi)有污染性蛋白質(zhì)等)。 “基本上純的”抗體表示基于組合物的總重量，組合物包含以重量計(jì)至少約90%、優(yōu)選以重量計(jì)至少約95%的抗體?！盎旧贤|(zhì)的”抗體表示基于組合物的總重量，組合物包含以重量計(jì)至少約99%的抗體?！暗葟垺北硎靖信d趣的配制劑與人血液具有基本上相同的滲透壓。等張配制劑一般會(huì)具有約250至350m0sm的滲透壓。等張性可使用例如蒸氣壓或冰凍型滲透壓計(jì)來(lái)測(cè)量。
如本文中使用的，“緩沖液”指通過(guò)其酸-堿配合成分的作用來(lái)抵抗PH變化的緩沖溶液。本發(fā)明的緩沖液具有在約4. 5至約7. 0、或約4. 5至約6. 5、或約5. 0至約6. 0的范圍中的pH，或具有約5.5的pH或具有5. 5的pH，或具有約5.6的pH或具有5. 6的pH。 會(huì)控制pH在此范圍中的緩沖液的例子包括乙酸鹽、琥珀酸鹽、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽、甘氨酰甘氨酸和其它有機(jī)酸緩沖液。“組氨酸緩沖液”為包含組氨酸離子的緩沖液。組氨酸緩沖液的例子包括組氨酸氯化物、組氨酸乙酸鹽、組氨酸磷酸鹽、組氨酸硫酸鹽、組氨酸琥珀酸鹽、等。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中實(shí)施例中鑒定的組氨酸緩沖液發(fā)現(xiàn)是組氨酸乙酸鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，組氨酸乙酸鹽緩沖液通過(guò)用乙酸(液體)滴定L-組氨酸(游離堿，固體)來(lái)制備。在某些實(shí)施方案中，組氨酸緩沖液或組氨酸-乙酸鹽緩沖液處于PH 4.5至6.5。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液具有PH 5.5。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中實(shí)施例中鑒定的組氨酸緩沖液發(fā)現(xiàn)是組氨酸琥珀酸鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，組氨酸-琥珀酸鹽緩沖液處于PH 4.5至6.5。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液具有PH 5.5。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液具有pH 5.6。“組氨酸精氨酸緩沖液”為包含組氨酸離子和精氨酸離子的緩沖液。組氨酸緩沖液的例子包括組氨酸氯化物-精氨酸氯化物、組氨酸乙酸鹽-精氨酸乙酸鹽、組氨酸磷酸鹽-精氨酸磷酸鹽、組氨酸硫酸鹽-精氨酸硫酸鹽、組氨酸琥珀酸鹽-精氨酸琥珀酸鹽、等。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文實(shí)施例中的組氨酸-精氨酸緩沖液為組氨酸乙酸鹽-精氨酸乙酸鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，組氨酸乙酸鹽緩沖液通過(guò)用乙酸(液體)滴定L-組氨酸(游離堿， 固體)和通過(guò)用乙酸(液體)滴定L-精氨酸(游離堿，固體)來(lái)制備。在一個(gè)實(shí)施方案中， 組氨酸-精氨酸緩沖液處于PH 4.5至6.5。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液具有pH 5.5。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中實(shí)施例中鑒定的組氨酸-精氨酸緩沖液發(fā)現(xiàn)為組氨酸琥珀酸鹽-精氨酸琥珀酸鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，組氨酸琥珀酸鹽-精氨酸琥珀酸鹽緩沖液處于PH 4.5 至6. 5。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液具有pH 5.5。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液具有pH 5.6。在本文中，“表面活性劑”指表面活性作用劑，優(yōu)選非離子型表面活性劑。本文中的表面活性劑的例子包括聚山梨酯(例如聚山梨酯20和聚山梨酯80) ；Poloxamer (例如 Poloxamer 188) ；Triton ；十二烷基硫酸鈉(SDQ ；月桂基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；月桂基_、 肉豆蔻基_、亞油基_、或硬脂酰基-磺基甜菜堿；月桂基_、肉豆蔻基_、亞油基_、或硬脂?；?肌氨酸；亞油基_、肉豆蔻基、或鯨蠟基-甜菜堿；月桂酰氨基丙基_、椰油酰氨基丙基_、亞油酰氨基丙基_、肉豆蔻酰氨基丙基_、棕櫚酰氨基丙基_、或異硬脂酰氨基丙基-甜菜堿(例如月桂酰氨基丙基)；肉豆蔻酰氨基丙基_、棕櫚酰氨基丙基_、或異硬脂酰氨基丙基-二甲胺；甲基椰油基?；撬徕c或甲基油基牛磺酸二鈉；和M0NAQUAT 系列(Mona Industries, Inc.，Paterson，N. J.)；聚乙二醇、聚丙二醇、及乙二醇和丙二醇共聚物(例如 PluroniCS、PF68等)；等。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中的表面活性劑為聚山梨酯20。在藥理學(xué)意義上，在本發(fā)明的語(yǔ)境中，抗體的“治療有效量”指有效預(yù)防或治療抗體可有效治療的病癥的量?！安“Y”為會(huì)受益于抗體處理的任何狀況。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動(dòng)物易患所討論病癥的病理狀況?！胺栏瘎睘槿缦碌幕衔?，其可任選地包括在配制劑中以本質(zhì)上降低其中的細(xì)菌作用，如此便于生產(chǎn)例如多次使用配制劑。潛在防腐劑的例子包括十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、氯己雙胺、苯扎氯銨(烴基苯甲基二甲基氯化銨的混合物，其中烴基是長(zhǎng)鏈化合物)、和芐索氯銨。其它類型的防腐劑包括芳香醇諸如酚、丁醇和苯甲醇，烴基對(duì)羥基苯甲酸酯諸如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯，鄰苯二酚，間苯二酚，環(huán)己醇，3-戊醇，和間甲酚。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中的防腐劑為苯甲醇?！岸嘣肌睘榫哂卸鄠€(gè)羥基的物質(zhì)，而且包括糖(還原和非還原糖)、糖醇和糖酸。 多元醇可任選地包括在配制劑中。在某些實(shí)施方案中，本文中的多元醇具有小于約600kD 的分子量(例如在約120至約400kD的范圍中)?！斑€原糖”為含有能還原金屬離子或與蛋白質(zhì)中的賴氨酸和其它氨基共價(jià)反應(yīng)的半縮醛基團(tuán)的糖，而“非含有糖”為不具有還原糖的這些特性的糖。還原糖的例子有果糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、 半乳糖和葡萄糖。非還原糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖和棉子糖。甘露醇、木糖醇、 赤蘚糖醇、蘇糖醇、山梨醇和甘油是糖醇的例子。至于糖酸，這些包括L-葡萄糖酸及其金屬鹽。在期望配制劑為凍融穩(wěn)定的情況中，多元醇優(yōu)選為在冷凍溫度(例如-20°C)不結(jié)晶的多元醇，使得它使配制劑中的抗體失穩(wěn)。在某些實(shí)施方案中，非還原糖諸如蔗糖和海藻糖是多元醇的例子，由于海藻糖的溶液穩(wěn)定性，優(yōu)選海藻糖勝過(guò)蔗糖。如本文中使用的，抗OxLDL抗體為結(jié)合LDL中的蛋白質(zhì)抗原(例如ApoB-100)的抗體。見例如 IEI-E3，LD0-D4, KTT-B8，和 2-D03 (例如在 W02004/030607 中)。ApoB-IOO 是作為人血清中膽固醇的主要載體的LDL的蛋白質(zhì)成分。LDL的氧化是其轉(zhuǎn)變成致動(dòng)脈粥樣硬化顆粒中的一個(gè)重要步驟，而且氧化修飾驅(qū)動(dòng)脂紋(即最早的可見的動(dòng)脈粥樣硬化損害)的初始形式。抗oxLDL抗體的一個(gè)例子是2_D03，它是針對(duì)氧化型LDL的完全人的單克隆IgGl 抗體。編碼抗體2D03的可變重鏈和可變輕鏈的核苷酸序列見圖1且分別為SEQ ID NO=I 和SEQ ID NO :2?？贵w2D03的可變重鏈和可變輕鏈的氨基酸序列見圖2且分別為SEQ ID NO :3禾口 SEQ ID NO :4。恒定區(qū)H和L分別為SEQ ID NO :6禾口 7，見圖2。2-D03還指至少具有 W02004/030607 圖 3 所示 VH 和 VL 序列(或 US20040202653 的 SEQ ID No. 27 和 28)和 W02007/025781表2中所列抗體的CDR序列的抗體?？筼xLDL抗體的生物學(xué)活性會(huì)結(jié)合οχ-LDL和任選地例如會(huì)抑制斑形成和防止動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生(例如如 khiopu et al. ,2004 ；WO 2004/030607 ；US 6，716，410 中的動(dòng)物模型中記載的)。其它活性包括在治療幾周后積極誘導(dǎo)主動(dòng)脈中已有的、已建立的動(dòng)脈粥樣硬化斑消退(例如W02007/025781)。動(dòng)脈粥樣硬化是一種多因素疾病，優(yōu)先在呈現(xiàn)生化風(fēng)險(xiǎn)因素的受試者中發(fā)生，所述生化風(fēng)險(xiǎn)因素包括吸煙、高血壓、糖尿病、高膽固醇血、升高的血漿低密度脂蛋白(LDL) 和甘油三酯、高纖維蛋白原血和高血糖。動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性病，引起大和中等大小的動(dòng)脈的最內(nèi)層(內(nèi)膜)增厚。它降低血流且可在由受影響血管供應(yīng)的器官中引起缺血和組織破壞。動(dòng)脈粥樣硬化損害在人類中在幾十年里發(fā)生，導(dǎo)致并發(fā)癥，諸如冠狀動(dòng)脈和腦缺血性和血栓栓塞性疾病和心肌和腦梗死。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的主因，包括急性心肌梗死、中風(fēng)和外周動(dòng)脈病。該病始于脂蛋白(主要是LDL)在血管的胞外基質(zhì)中的積累。這些LDL顆粒聚集并經(jīng)歷氧化修飾。氧化型LDL是有毒的且引起血管損傷。動(dòng)脈粥樣硬化在許多方面代表對(duì)此損傷的響應(yīng)， 包括炎癥和纖維化?！爸委煛敝钢委熜蕴幚砗皖A(yù)防性或防范性措施二者。需要治療的受試者包括早就患
10有病癥的受試者以及要預(yù)防病癥的受試者。用于治療目的的“哺乳動(dòng)物”指歸入哺乳類的任何動(dòng)物，包括人，家畜和牲畜，及動(dòng)物園動(dòng)物、體育運(yùn)動(dòng)用動(dòng)物、或?qū)櫸飫?dòng)物，諸如犬、馬、貓、牛等。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物為人。本文中術(shù)語(yǔ)“抗體”以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、 多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性?！胺蛛x的”抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指將會(huì)干擾該抗體的研究、診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在有些實(shí)施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)例如 Lowry法的測(cè)定，抗體重量超過(guò)95%，而在有些實(shí)施方案中，重量超過(guò)99%，(2)足以通過(guò)使用例如轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或C3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用例如考馬斯藍(lán)或銀染色，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備?！疤烊豢贵w”指通常由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈構(gòu)成的約 150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有一個(gè)可變域(Vh)，接著是多個(gè)恒定域。每條輕鏈在一端具有一個(gè)可變域(VJ，而另一端是一個(gè)恒定域。輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域排列在一起，而輕鏈的可變域與重鏈的可變域排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。術(shù)語(yǔ)“恒定域”指免疫球蛋白分子中的如下部分，其相對(duì)于免疫球蛋白的其它部分，即含有抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變域，具有更加保守的氨基酸序列。恒定域含有重鏈的CH1、CH2 和Ch3域(合成CH)及輕鏈的CHL (或CL)域?？贵w的“可變區(qū)”或“可變域”指抗體重鏈或輕鏈的氨基末端結(jié)構(gòu)域。重鏈的可變域可以稱為“VH”。輕鏈的可變域可以稱為“VL”。這些結(jié)構(gòu)域一般是抗體的最易變部分且包含抗原結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)“可變的”指可變域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變域。 它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區(qū)(HVR)的三個(gè)區(qū)段?？勺冇蛑懈痈叨缺Ｊ氐牟糠址Q作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個(gè)FR區(qū)，它們大多采取β-折疊片構(gòu)象，通過(guò)形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成β-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)HVR連接。 每條鏈中的HVR通過(guò)FR區(qū)非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的HVR —起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見 Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, H 5 fiji, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991))。 11 : ^^ 接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體在抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性中的參與。根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來(lái)自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(dá)(λ)。
如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)IgG “同種型”或“亞類”意指由其恒定區(qū)的化學(xué)和抗原特征定義的任何免疫球蛋白亞類。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作α、 δ、ε、γ和μ。不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的，一般性描述于例如 Abbas et al.，Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co.，2000)。 抗體可以是抗體與一種或多種其它蛋白質(zhì)或肽共價(jià)或非共價(jià)連接而形成的更大融合分子的一部分。 術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)抗體”和“完整抗體”在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體， 而非下文定義的抗體片段。該術(shù)語(yǔ)具體指重鏈包含F(xiàn)c區(qū)的抗體?！奥憧贵w(裸露的抗體)”為本發(fā)明目的指未偶聯(lián)細(xì)胞毒性模塊或放射性標(biāo)記物的抗體?！翱贵w片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，及一個(gè)剩余的“Fe”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F (ab' )2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原?！癋v”是包含完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙鏈Fv種類由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv(SCFV) 種類中，一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域可以通過(guò)柔性肽接頭共價(jià)相連接，使得輕鏈和重鏈可以在與雙鏈Fv種類類似的“二聚體”結(jié)構(gòu)中相結(jié)合。正是在這種構(gòu)造中，每個(gè)可變域的三個(gè)HVR相互作用而在二聚體表面上限定了一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)HVR —起賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變域(或是只包含對(duì)抗原特異性的三個(gè) HVR的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段包含重鏈和輕鏈可變域，而且還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域 (CHl)0Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基， 包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab' -SH是本文中對(duì)其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab' ) 2抗體片段最初是作為在Fab ‘片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。一般而言，scFv多肽在Vh與八結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)一步包含多肽接頭， 其使得scFv能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見例如Plilckthim，于 《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 編， Springer-Verlag, New York, 1994，第 269—315 頁(yè)。術(shù)語(yǔ)“雙抗體”指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，該片段在同一條多肽鏈 (Vh-Vl)中包含相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(\)。通過(guò)使用過(guò)短的接頭使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而CN 102414221 A
產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體可以是二價(jià)的或雙特異性的。雙抗體更完整的記載于例如EP 404, 097 ；WO 1993/01161 ；Hudson et al. ,Nat. Med. 9 :129-134(2003)；及Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)。三抗體(Triabody)和四抗體 (tetrabody)也記載于 Hudson et al.，Nat. Med. 9 :129-134(2003)。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，例如構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的突變，例如天然存在的突變。如此，修飾語(yǔ)“單克隆”表明抗體不是分立的抗體的混合物的特征。在某些實(shí)施方案中，此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過(guò)包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過(guò)程得到的。例如，選擇過(guò)程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨(dú)特克隆。應(yīng)當(dāng)理解，所選擇的靶物結(jié)合序列可進(jìn)一步改變，例如為了提高對(duì)靶物的親和力、將靶物結(jié)合序列人源化、提高其在細(xì)胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等， 而且包含改變后的靶物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型的包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。在它們的特異性外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢(shì)在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語(yǔ)“單克隆”表明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過(guò)任何特定方法來(lái)生產(chǎn)抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過(guò)多種技術(shù)來(lái)生成，包括例如雜交瘤法(例如 Kohler and Milstein, Nature, 256 :495-97(1975) ；Hongo et al. , Hybridoma,14(3) :253-260(1995), Harlow et al. , Antibodies :A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 版 1988) ；Hammerling et al., 于Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y. , 1981)) > 重組DNA法(參見例如美國(guó)專利No. 4，816，567)、噬菌體展示技術(shù)(參見例如Clackson et al. , Nature 352:624-628(1991) ；Marks et al. , J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1992)； Sidhu et al.，J. Mol. Biol. 338 (2) :299-310(2004) ；Lee et al.，J. Mol. Biol. 340(5) 1073-1093(2004) ；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (34) :12467-12472(2004)； Lee etal.，J. Immunol. Methods 284 (1-2) 119-132 (2004))、及用于在具有部分或整個(gè)人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動(dòng)物中生成人或人樣抗體的技術(shù)(參見例如 WO 1998/24893 ；WO 1996/34096 ；WO 1996/33735 ；WO 1991/10741 ； Jakobovits et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993) ；Jakobovits et al., Nature 362:255-258(1993) ；Bruggemann et al. , Year inlmmuno. 7 :33 (1993)；美國(guó)專利 No. 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；和 5，661，016 ；Marks et al.，Bio/Technology 10 :779-783(1992) ；Lonberg et al.，Nature 368 :856-859(1994)； Morrison, Nature 368 :812-813(1994) ；Fishwild et al. , Nature Biotechnol. 14 845-851(1996) ；Neuberger, Nature Biotechnol. 14 :826(1996) ；Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 :65-93(1995))。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及
13此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(參見例如美國(guó)專利No. 4，816，567 ； Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)類化”抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)衍生自通過(guò)例如用感興趣抗原免疫獼猴而生成的抗體。非人(例如鼠)抗體的“人源化式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的HVR殘基用具有期望特異性、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、家兔、或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的HVR殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的FR殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒(méi)有找到的殘基。 可以進(jìn)行這些修飾來(lái)進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見例如Jones et al., Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann et al. ,Nature 332 :323-329(1988) ；^P Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。還可參見例如 Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 105-115 (1998) ；Harris, Biochem. Soc. Transactions23 1035-1038(1995) ；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5 :428-433(1994)；及美國(guó)專利 No. 6，982，321 和 7，087，409?！叭丝贵w”指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和/或使用本文所公開的用于生成人抗體的任何技術(shù)生成的抗體。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。人抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來(lái)生成，包括噬菌體展示文庫(kù)(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227 :381 (1991) ；Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 :581 (1991))。還可用于制備人單克隆抗體的是以下文獻(xiàn)中記載的方法Cole et al. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) ；Boerner et al.，J. Immunol. 147(1) :86-95 (1991)。還可參見 van Dijk and van de Winkel，Curr. Opin. Pharmacol.，5 :368-74 (2001)?？赏ㄟ^(guò)給已經(jīng)修飾以應(yīng)答抗原性刺激而生成人抗體但其內(nèi)源基因組已經(jīng)失能的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如經(jīng)過(guò)免疫的異種小鼠(xenomice)施用抗原來(lái)制備人抗體(參見例如6，075，181和6，150，584，關(guān)于XEN0M0USE 技術(shù))。還可參見例如Li et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 :；3557_3562 (2006)，關(guān)于經(jīng)人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)生成的人抗體?！拔锓N依賴性抗體”指對(duì)來(lái)自第一哺乳動(dòng)物物種的抗原的結(jié)合親和力強(qiáng)于對(duì)來(lái)自第二哺乳動(dòng)物物種的該抗原同系物的親和力的抗體。通常，物種依賴性抗體“特異性結(jié)合” 人抗原(例如結(jié)合親和力(Kd)數(shù)值不超過(guò)大約Ix 1(ΓΜ，優(yōu)選不超過(guò)大約Ix 10_8Μ，且優(yōu)選不超過(guò)大約Ix 10_9Μ)，但是對(duì)來(lái)自第二非人哺乳動(dòng)物物種的該抗原同系物的結(jié)合親和力比對(duì)人抗原的結(jié)合親和力弱至少大約50倍、或至少大約500倍、或至少大約1000倍。物種依賴性抗體可以是上文所定義的各種類型抗體中的任一種，但是優(yōu)選人源化抗體或人抗體。術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”、“HVR”或“HV”在用于本文時(shí)指抗體可變域中序列上高度可變和/ 或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個(gè)HVR:三個(gè)在VH中(Η1、Η2、Η3)，三個(gè)在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗體中，H3和L3展示這六個(gè)HVR的最大多樣性，而且認(rèn)為特別是H3在賦予抗體以精密特異性中發(fā)揮獨(dú)特作用。參見例如Xu et al. ,Immunity 13:
1437-45(2000) Johnson and ffu,T :Methods in Molecular Biology 248 :l-25(Lo, ed., Human Press, Totowa，NJ，2003)。事實(shí)上，僅由重鏈組成的天然存在camelid抗體在缺乏輕鏈時(shí)是有功能的且穩(wěn)定的。參見例如Hamers-Casterman et al. Nature363 :446_448， (1993) ；Sheriff et al. Nature Struct. Biol. 3 :733-736, (1996)。本文中使用且涵蓋許多HVR的敘述。Kabat互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)是以序列變異性為基石出的，而且是最常用的(Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothia 改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196 901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR與Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件的使用?！敖佑|” HVR是以對(duì)可獲得的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為基礎(chǔ)的。下文記錄了這些HVR中每一個(gè)的殘基。
環(huán)KabatAbMChothia接觸LlL24-L34L24-L34L26-L32L30-L36L2L50-L56L50-L56L50-L52L46-L55L3L89-L97L89-L97L91-L96L89-L96HlH31-H35BH26-H35BH26-H32H30-H35B(Kabat編號(hào))HlH31-H35H26-H35H26-H32H30-H35(Chothia 編號(hào))H2H50-H65H50-H58H53-H55H47-H58H3H95-H102H95-H102H96-H101H93-H101HVR 可包括如下“延伸的 HVR" :VL 中的 24-36 或 24-34 (Li)、46-56 或 50-56 (L2) 和 89-97 或 89-96 (L3)及 VH 中的 26-35 (Hl) ,50-65 或 49-65 (H2)和 93-102,94-102 或 95-102 (H3)。對(duì)于這些定義中的每一個(gè)，可變域殘基是依照Kabat等，見上文編號(hào)的。“框架”或“FR”殘基指可變域中除本文中所定義的HVR殘基外的那些殘基。術(shù)語(yǔ)“依照Kabat的可變域殘基編號(hào)方式”或“依照Kabat的氨基酸位置編號(hào)方式” 及其變化形式指Kabat et al.，見上文中的用于抗體重鏈可變域或輕鏈可變域編輯的編號(hào)系統(tǒng)。使用此編號(hào)系統(tǒng)，實(shí)際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸，對(duì)應(yīng)于可變域 FR或HVR的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包含H2殘基52后的單一氨基酸插入(依照 Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat為殘基82a、82b和 82c等)。給定抗體的Kabat殘基編號(hào)方式可通過(guò)將抗體序列與“標(biāo)準(zhǔn)” Kabat編號(hào)序列對(duì)比同源區(qū)來(lái)確定。Kabat編號(hào)系統(tǒng)一般在提及可變域中的殘基(大約是輕鏈殘基1-107和重鏈殘基 1-113)時(shí)使用(例如 Kabat et al. , Sequences of Immunological Interest. 5thEd.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。 “EU 編號(hào)系統(tǒng)”或“EU索引” 一般在提及免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的殘基時(shí)使用(例如Kabat et al.，見上文中報(bào)道的EU索引)?！叭鏚abat中的EU索引”指人IgG1EU抗體的殘基編號(hào)方式。表述“線性抗體”指^ipata 等(1995) Protein Eng, 8 (10) :1057-1062 中所描述的抗體。簡(jiǎn)言之，這些抗體包含一對(duì)串聯(lián)的Fd區(qū)段(Vh-ChI-Vh-ChI),該區(qū)段與互補(bǔ)的輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的，或者是單特異性的。在用于本文時(shí)，“文庫(kù)”或“庫(kù)”指眾多抗體或抗體片段序列(例如本發(fā)明的多肽)， 或者編碼這些序列的核酸，變異氨基酸組合方面不同的序列根據(jù)本發(fā)明方法導(dǎo)入這些序列?！笆删w展示”是一種將變體多肽作為與外殼蛋白至少一部分的融合蛋白展示在噬菌體(例如絲狀噬菌體)顆粒表面上的技術(shù)。噬菌體展示的效用在于能夠?qū)﹄S機(jī)化蛋白質(zhì)變體的大型文庫(kù)快速且高效分選那些能以高親和力與靶抗原結(jié)合的序列的實(shí)情。肽和蛋白質(zhì)文庫(kù)在噬菌體上的展示已經(jīng)用于對(duì)數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的多肽篩選那些具有特異性結(jié)合特性的多肽。多價(jià)噬菌體展示法已經(jīng)用于展示小隨機(jī)肽和小蛋白，其通過(guò)與絲狀噬菌體的基因 III 或基因 VIII 融合來(lái)實(shí)現(xiàn)。Wells and Lowman(1992)Curr. Opin. Struct. Biol. 3 355-362，及其中引用的參考文獻(xiàn)。在單價(jià)噬菌體展示中，將蛋白質(zhì)或肽文庫(kù)與基因III或其一部分融合，并在存在野生型基因III蛋白時(shí)以低水平表達(dá)，使得噬菌體顆粒展示一個(gè)拷貝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。親合效應(yīng)(avidity effect)相對(duì)于多價(jià)噬菌體得到了降低，使得分選基于內(nèi)在的配體親和力，而且使用噬菌粒載體，這簡(jiǎn)化了 DNA操作。Lowman and Wells(1991)Methods :A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216。“噬菌?！笔蔷哂屑?xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(例如ColEl)和一個(gè)拷貝的噬菌體基因區(qū)間的質(zhì)粒載體。噬菌粒可利用任何已知噬菌體，包括絲狀噬菌體和λ類噬菌體。質(zhì)粒一般也包含抗生素抗性的可選擇標(biāo)志物。克隆入這些載體的DNA區(qū)段可以像質(zhì)粒一起而擴(kuò)增。在給容納這些載體的細(xì)胞提供生成噬菌體顆粒所必需的所有基因時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)制模式變成滾環(huán)復(fù)制，以生成質(zhì)粒DNA的一條鏈的拷貝，并包裝噬菌體顆粒。噬菌?？尚纬筛腥拘曰蚍歉腥拘允删w顆粒。此術(shù)語(yǔ)包括這樣的噬菌粒，它們包含與異源多肽基因連接成基因融合物的噬菌體外殼蛋白基因或其片段，使得異源多肽展示在噬菌體顆粒的表面上。II.用于實(shí)施本發(fā)明的方法本文中的發(fā)明涉及包含抗體的配制劑。配制劑中的抗體使用本領(lǐng)域中用于生成抗體的可用技術(shù)來(lái)制備，下述各節(jié)更為詳細(xì)地描述了其例示性方法。典型地，配制劑是穩(wěn)定的含水配制劑。在某些實(shí)施方案中，它們是藥物配制劑。抗體針對(duì)感興趣抗原。優(yōu)選地，抗原是生物學(xué)重要多肽，而且對(duì)罹患病癥的哺乳動(dòng)物施用抗體可在該哺乳動(dòng)物中導(dǎo)致治療好處。然而，也涵蓋針對(duì)非多肽抗原的抗體。在抗原是多肽的情況中，它可以是跨膜分子(例如受體)或配體，例如諸如生長(zhǎng)因子。例示性抗原包括如下分子，諸如ox-LDL ；οχ-ΑροΒ100 ；腎素；生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體化激素；高血糖素；凝固因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子、和(馮)維勒布蘭德(von ffillebrand)氏因子；抗凝固因子，諸如蛋白C ；心房鈉尿因子；肺表面活性劑；纖溶酶原活化劑，諸如尿激酶或人尿型或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)；林蟾肽；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子-α和-β ；腦啡肽酶；RANTES(活化時(shí)受到調(diào)節(jié)，正常情況由T-細(xì)胞表達(dá)和分泌)； 人巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清清蛋白，諸如人血清清蛋白；穆勒(Muellerian)抑制性物質(zhì)；松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；松弛素原；小鼠促性腺素相關(guān)肽；微生物蛋白質(zhì)，諸如β -內(nèi)酰胺酶；DNA酶；IgE ；細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)，諸如CTLA-4 ；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) ；VEGFR受體，激素或生長(zhǎng)因子的受體；蛋白A或D ； 類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，諸如骨衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、-4、-5、 或-6 (ΝΤ-3、ΝΤ-4、ΝΤ-5、或ΝΤ-6)，或神經(jīng)生長(zhǎng)因子，諸如NGF- β ；血小板衍生生長(zhǎng)因子 (PDGF)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，諸如aFGF和bFGF;表皮生長(zhǎng)因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (TGF)，諸如 TGF- α 和 TGF- β，包括 TGF- β UTGF- β 2,TGF- β 3,TGF- β 4、或 TGF- β 5 ；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II (IGF-I和IGF-II) ；des (1-3) -IGF-I (腦IGF-I)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；⑶蛋白，諸如⑶3、⑶4、⑶8、⑶19和⑶20 ；紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)生成蛋白(BMP)；干擾素，諸如干擾素-α、_β、和-Y ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSFjP G-CSF ；白介素(IL)，例如IL-I至IL-10 ；超氧化物歧化酶；T-細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，諸如例如AIDS被膜的一部分；運(yùn)輸?shù)鞍祝粴w巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白，諸如⑶11a、⑶lib、⑶11c、⑶18、ICAM、VLA-4和VCAM ； 腫瘤相關(guān)抗原，諸如HER2、HER3或HER4受體；和任何上文所列多肽的片段。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所涵蓋的抗體的分子靶包括OX-LDL。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中的抗體為一種結(jié)合人ox-LDL的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中的抗體為一種結(jié)合人ox-ApoB100的抗體。A.配制劑的制備在制備感興趣抗體之后(例如用于生產(chǎn)可如本文所述配制的抗體的技術(shù)會(huì)在下文中詳述且是本領(lǐng)域已知的)，制備包含它的藥物配制劑。在某些實(shí)施方案中，要配制的抗體未進(jìn)行在先凍干，而且本文中的感興趣配制劑是含水配制劑。在某些實(shí)施方案中，抗體為全長(zhǎng)抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，配制劑中的抗體為抗體片段，諸如F (ab' )2，在該情況中可能需要解決全長(zhǎng)抗體可能不會(huì)發(fā)生的問(wèn)題(諸如將抗體修剪成Fab)?？紤]例如施用的期望劑量體積和模式來(lái)決定配制劑中存在的抗體的治療有效量。約0. lmg/mL至約250mg/mL、或約10mg/mL至約200mg/mL或約50mg/mL至約175mg/mL是配制劑中的例示性抗體濃度。制備在pH緩沖溶液中包含抗體的含水配制劑。本發(fā)明的緩沖液具有在約4. 5至約6. 5的范圍中的pH。在某些實(shí)施方案中，pH在pH 5. O至6. O的范圍中，或在pH 5. 25至 5. 75的范圍中，或在pH 5. 3至5. 6的范圍中。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，配制劑具有5. 5 或約5.5的pH?？刂苝H在此范圍內(nèi)的緩沖液的例子包括乙酸鹽(例如組氨酸乙酸鹽、精氨酸乙酸鹽、乙酸鈉)、琥珀酸鹽(諸如組氨酸琥珀酸鹽、精氨酸琥珀酸鹽、琥珀酸鈉)、葡萄糖酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸緩沖液及其組合。緩沖液濃度可以為約ImM至約600mM，取決于例如配制劑的緩沖液和期望等張性。在某些實(shí)施方案中，含有約5mM至IOOmM濃度的組氨酸和50mM至500mM濃度的精氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液為pH 5. 5的組氨酸乙酸鹽(約20mM)_精氨酸乙酸鹽(約150mM)。在某些實(shí)施方案中，該緩沖液為pH 5. 5的組氨酸琥珀酸鹽(約20mM)-精氨酸琥珀酸鹽(約150mM)。
可任選地將表面活性劑添加至抗體配制劑。例示性表面活性劑包括非離子型表面活性劑，諸如聚山梨酯(例如聚山梨酯20、80等)或Poloxamer類(例如Poloxamer 188)。 所添加的表面活性劑的量使得它降低所配制的抗體的聚集和/或使配制劑中的顆粒形成降至最低和/或降低吸附。例如，配制劑中存在的表面活性劑的量可以為約0. 001%至約 0.5%,優(yōu)選約0. 005 %至約0. 2 %且優(yōu)選約0. 01 %至約0. 1 %。在一個(gè)實(shí)施方案中，配制劑不包含表面活性劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，配制劑含有上文所述藥劑(例如抗體、緩沖液、和/或表面活性劑)且基本上沒(méi)有一種或多種防腐劑，諸如苯甲醇、酚、間甲酚、氯丁醇和芐索氯銨。在一個(gè)實(shí)施方案中，配制劑不包含防腐劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，配制劑中可包括防腐劑，特別是配制劑為多劑配制劑的情況。防腐劑的濃度可以在約0. 至約2%，優(yōu)選約0. 5%至約
的范圍中。配制劑中可包括一種或多種其它藥學(xué)可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，諸如那些在 Remington' s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Oso 1,A. Ed. (1980)中記載的，只要它們對(duì)配制劑的期望特征沒(méi)有不利影響?？山邮茌d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)接受者是無(wú)毒的，而且包括別的緩沖劑；共溶劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；螯合劑，諸如EDTA ；金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；生物可降解聚合物， 諸如聚酯；和/或成鹽反荷離子。雖然本文中對(duì)螯合劑的各種描述常常集中于EDTA，但是要領(lǐng)會(huì)其它金屬離子螯合劑也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。金屬離子螯合劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，而且包括但不必然限于氨基聚羧酸酯、EDTA (乙二胺四乙酸)、EGTA (乙二醇-二( β -氨基乙基醚)-N，N，N'， N'-四乙酸)、ΝΤΑ (氮川三乙酸),EDDS (乙二胺二琥珀酸鹽)、PDTA (1，3-丙二胺四乙酸)、 DTPA(二乙撐三胺五乙酸)、ADA( β -丙氨酸二乙酸)、MGCA(甲基甘氨酸二乙酸)、等。另外，本文中的一些實(shí)施方案包含膦酸鹽/膦酸螯合劑。在某些實(shí)施方案中，配制劑含有甲硫氨酸。本文中的配制劑還可含有超過(guò)一種對(duì)所治療的特定適應(yīng)證必需的蛋白質(zhì)，優(yōu)選那些具有互補(bǔ)活性的、對(duì)其它蛋白質(zhì)沒(méi)有不利影響的。例如，在抗體是抗oxLDL抗體的情況中，可將它與另一藥劑(例如3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A(HMG-CoA)還原酶的抑制劑，例如他汀類)組合。可與抗oxLDL抗體組合的分子的例子包括但不限于例如阿 ft Χftk tT (atorvastatin) > H 5^ftktT (cerivastatin) > M ftk tT (fluvastatin) > 伐他汀(Iovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、普伐他汀(provastatin)、羅蘇伐他汀 (rosuvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、等。合適地，此類蛋白質(zhì)以對(duì)預(yù)定目的有效的量組合存在。典型地，為口服施用配制他汀。要用于體內(nèi)施用的配制劑應(yīng)當(dāng)是無(wú)菌的。這容易通過(guò)在制備配制劑之前或之后經(jīng)由無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。B.配制劑的施用依照已知方法將配制劑施用于需要用抗體治療的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人，諸如靜脈內(nèi)施用，作為推注(bolus)或通過(guò)一段時(shí)間里的連續(xù)輸注，通過(guò)肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、表面、或吸入路徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)靜脈內(nèi)施用將配制劑施用于哺乳動(dòng)物。為了此類目的，可例如使用注射器或經(jīng)IV線注射配制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)皮下施用將配制劑施用于哺乳動(dòng)物。
抗體的適宜劑量(“治療有效量”)將取決于例如要治療的狀況、狀況的嚴(yán)重性和過(guò)程、施用抗體是為了預(yù)防還是治療目的、先前的療法、患者的臨床史和對(duì)抗體的響應(yīng)、所使用的抗體的類型、和主治內(nèi)科醫(yī)師的判斷。將抗體以一次或在一系列治療中合適地施用于患者，而且可在診斷后的任何時(shí)間施用于患者?？勺鳛槲ㄒ恢委熁蚺c在治療所討論的狀況中有用的其它藥物或療法聯(lián)合施用抗體。作為一般建議，所施用的抗體的治療有效量會(huì)在約0. 1至約50mg/kg患者體重的范圍中，無(wú)論是通過(guò)一次或多次施用，所使用的抗體的典型范圍為約0. 3至約20mg/kg、或約0. 3至約15mg/kg、或約0. 3至約25mg/kg或約0. 3至約30mg/kg，例如每日、或例如每周、 或例如每?jī)稍率┯?。然而，其它劑量方案也是有用的。此療法的進(jìn)展容易通過(guò)常規(guī)技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，配制劑的施用是抗oxLDL抗體配制劑。動(dòng)脈壁中的大部分膽固醇沉積衍生自LDL。LDL是人血清中膽固醇的主要載體，而且LDL的氧化是其轉(zhuǎn)變成致動(dòng)脈粥樣硬化顆粒的一個(gè)必要步驟。對(duì)作為動(dòng)脈粥樣硬化的所有階段的特征的炎性過(guò)程的激活和調(diào)節(jié)可以與針對(duì)氧化型LDL的免疫應(yīng)答關(guān)聯(lián)起來(lái)。動(dòng)脈粥樣硬化是急性Ml、 中風(fēng)和外周動(dòng)脈病的主要原因。在抗oxLDL抗體的情況中，可施用治療有效量的抗體以治療動(dòng)脈粥樣硬化。例如，抗oxLDL抗體可用于高風(fēng)險(xiǎn)患者中心血管事件的二級(jí)預(yù)防和/或降低動(dòng)脈粥樣硬化的致命風(fēng)險(xiǎn)。由動(dòng)脈壁中的致動(dòng)脈粥樣硬化沉積物直接引起的這些心血管事件包括但不限于急性心肌梗死(Ml)、中風(fēng)和外周動(dòng)脈病。抗oxLDL抗體還可用于其它活性。例如，抗oxLDL抗體顯示出抑制斑形成和阻止動(dòng)脈粥樣硬化損害發(fā)生(例如如khiopu et al.，2004 ；W02004/030607 ；US 6，716，410中所述)，且在治療幾周后積極誘導(dǎo)主動(dòng)脈中已有的、已建立的動(dòng)脈粥樣硬化斑消退(例如W02007/025781)。C.抗體制備⑴抗原制備可溶性抗原或其片段(任選偶聯(lián)有其它分子的)可作為免疫原用于生成抗體。對(duì)于跨膜分子，諸如受體，它們的片段(例如受體的胞外結(jié)構(gòu)域)可用作免疫原。或者，表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞可用作免疫原。此類細(xì)胞可衍生自天然來(lái)源(例如癌細(xì)胞系)，或者可以是經(jīng)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化而表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞。對(duì)于制備抗體有用的其它抗原及其形式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)是顯而易見的。(ii)某些基于抗體的方法多克隆抗體優(yōu)選通過(guò)在動(dòng)物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑來(lái)生成。使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來(lái)酰亞胺苯甲?；腔牾啺孵?通過(guò)半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N = C = NR，其中R和R1是不同的烴基，將相關(guān)抗原與在待免疫物種中有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的，例如匙孔i威血藍(lán)蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。通過(guò)將例如100 μ g或5 μ g蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和并將該溶液皮內(nèi)注射于多個(gè)部位，將動(dòng)物針對(duì)抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物進(jìn)行免疫。一個(gè)月后，通過(guò)多個(gè)部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中初始量1/5-1/10 的肽或偶聯(lián)物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。7-14天后，采集動(dòng)物的血液，并測(cè)定血清的抗體滴度。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滴度達(dá)到平臺(tái)(plateau)。優(yōu)選的是，將動(dòng)物用相同抗原但與不同蛋白質(zhì)和/或通過(guò)不同交聯(lián)劑偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。偶聯(lián)物還可在重組細(xì)胞培養(yǎng)中作為蛋白質(zhì)融合物來(lái)制備。同樣，適當(dāng)使用凝聚劑諸如明礬來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。本發(fā)明的單克隆抗體可使用雜交瘤方法來(lái)生成，其首先記載于Kohler et al.，Nature, 256 :495 (1975)，并進(jìn)一步記載于例如 Hongo et al.，Hybridoma, 14 (3) 253-260(1995),Harlow et al. ,Antibodies :A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed. 1988) ；Hammerling et al., in :Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier，N. Y.，1981)，和 Ni，Xiandai Mianyixue,26(4) 沈5力68 (2006)，關(guān)于人-人雜交瘤。別的方法包括那些記載于例如U. S. Pat. No. 7，189，826 的，其關(guān)于自雜交瘤細(xì)胞系生成單克隆人天然IgM抗體。人雜交瘤技術(shù)(三元雜交瘤 (Trioma)技術(shù))記載于 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3) 927-937 (2005)禾口 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3) :185-91(2005) 關(guān)于各種雜交瘤技術(shù)，參見例如US 2006/258841 ；US 2006/183887 (完全人的抗體)；US 2006/059575 ；US 2005/287149 ；US 2005/100546 ；US2005/026229 ；和 U.S. Pat. Nos. 7，078，492和7，153，507。一種使用雜交瘤方法來(lái)生成單克隆抗體的例示性方案記載如下。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫小鼠或其它適宜宿主動(dòng)物(諸如倉(cāng)鼠)以引發(fā)生成或能夠生成會(huì)特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)的抗體的淋巴細(xì)胞。通過(guò)多次皮下(sc)或腹膜內(nèi) (ip)注射本發(fā)明的多肽或其片段和佐劑諸如單磷脂酰脂質(zhì)A(MPL)/海藻糖二棒分枝菌酸酯(TDM) (Ribi Immunochem. Research，he.，Hamilton，MT)，在動(dòng)物中生成抗體。本發(fā)明的多肽(例如抗原)或其片段可使用本領(lǐng)域公知方法來(lái)制備，諸如重組方法，其中一些在本文中有進(jìn)一步描述。對(duì)來(lái)自經(jīng)免疫動(dòng)物的血清測(cè)定抗抗原抗體，并任選施用加強(qiáng)免疫。自生成抗抗原抗體的動(dòng)物分離淋巴細(xì)胞?；蛘?，在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞° 參見例如 Goding, Monoclonal Antibodies principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)?？墒褂酶咝诤?、支持選定地抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定地高水平生成抗體、且對(duì)培養(yǎng)基諸如HAT培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細(xì)胞。例示性的骨髓瘤細(xì)胞包括但不限于鼠骨髓瘤細(xì)胞，諸如那些衍生自M0PC-21和MPC-Il小鼠腫瘤(可得自索爾克 (Salk)研究所細(xì)胞分發(fā)中心，San Diego, California USA)的，及 SP-2 或 X63_Ag8_653 細(xì)胞(可得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，RockvillhMaryland USA)的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也記載用于生成人單克隆抗體(Kozbor，J. Immunol. , 133 :3001(1984)； Brodeur et al. , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York,1987))。將如此制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，例如含有抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的一種或多種物質(zhì)的培養(yǎng)基。例如，若親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的會(huì)含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長(zhǎng)。優(yōu)選地，使用無(wú)血清雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法來(lái)降低動(dòng)物衍生血清的使用，諸如胎牛血清，如記載于例如Even et al. , Trends in Biotechnology,24(3),105-108(2006)
作為提高雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)力的工具的寡肽記載于Franek，Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)。具體地，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基富含某些氨基酸(丙氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、脯氨酸)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物級(jí)分，而且可通過(guò)由3-6個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的合成寡肽來(lái)顯著遏制凋亡。所述肽以毫摩爾或更高濃度存在?？蓪?duì)雜交瘤細(xì)胞正在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)液測(cè)定結(jié)合本發(fā)明抗原的單克隆抗體的生成?？赏ㄟ^(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合測(cè)定法，諸如放射免疫測(cè)定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過(guò)例如katchard分析來(lái)測(cè)定。參見例如Munson等，Anal. Biochem. 107 220(1980)。在鑒定得到生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后， 該克隆可通過(guò)有限稀釋規(guī)程進(jìn)行亞克隆并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(參見例如Goding， supra)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可以在動(dòng)物中作為腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)免疫球蛋白純化規(guī)程，諸如例如蛋白A-kpharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)液、腹水或血清適當(dāng)分開。一種用于自雜交瘤細(xì)胞分離蛋白質(zhì)的規(guī)程記載于US 2005/176122和U. S. Pat. No. 6，919，436。該方法包括在結(jié)合過(guò)程中最低限度地使用鹽，諸如易溶鹽，而且優(yōu)選還在洗脫過(guò)程中使用少量的有機(jī)溶劑。(iii)某些文庫(kù)篩選方法本發(fā)明的抗體可以通過(guò)使用組合庫(kù)篩選具有期望活性的抗體來(lái)生成。例如，本領(lǐng)域知道用于構(gòu)建噬菌體展示庫(kù)及對(duì)此類文庫(kù)篩選具有期望的結(jié)合特性的抗體的多種方法。此類方法一般記載于 Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178 1-37(0，Brien et al.，ed.，Human Press, Totowa, NJ, 2001)。例如，一種產(chǎn)生感興趣抗體的方法是經(jīng)由使用如Lee et al.，J. Mol. Biol. (2004),340(5) 1073-93中所描述的噬菌體抗體文庫(kù)。原則上，通過(guò)篩選噬菌體文庫(kù)來(lái)選擇合成的抗體克隆，所述噬菌體文庫(kù)含有展示融合至噬菌體外殼蛋白的各種抗體可變區(qū)(Fv)片段的噬菌體。通過(guò)針對(duì)所需抗原的親和層析來(lái)淘選此類噬菌體文庫(kù)。表達(dá)能夠結(jié)合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，從而與文庫(kù)中不結(jié)合的克隆分開。然后將結(jié)合的克隆從抗原上洗脫，而且可以通過(guò)額外的抗原吸附/洗脫循環(huán)進(jìn)一步富集。本發(fā)明的任何抗體可以如下獲得，即設(shè)計(jì)合適的抗原篩選規(guī)程來(lái)選擇感興趣的噬菌體克隆，接著使用來(lái)自感興趣的噬菌體克隆的Fv序列和Kabat等， Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，NIH Pub1ication91-3242, Bethesda MD(1991)，卷1_3中記載的合適的恒定區(qū)(Fe)序列來(lái)構(gòu)建全長(zhǎng)抗體克隆。在某些實(shí)施方案中，抗體的抗原結(jié)合域由兩個(gè)約110個(gè)氨基酸的可變(V)區(qū)形成， 分別來(lái)自輕鏈(VL)和重鏈(VH)，都呈現(xiàn)三個(gè)高變環(huán)(HVR)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?？勺冇蚩梢怨δ苄缘恼故驹谑删w上，或是作為單鏈Fv(SCFV)片段(其中VH和VL通過(guò)短的、柔性的接頭共價(jià)相連)，或者作為Fab片段(其中它們各自與恒定域融合且非共價(jià)相互作用)， 如 Winter 等，Ann. Rev. Immunol. , 12 :433-455(1994)所述。在用于本文時(shí)，編碼 scFv 的噬菌體克隆和編碼Fab的噬菌體克隆統(tǒng)稱為“Fv噬菌體克隆”或“Fv克隆”。VH和VL基因的全集可以通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分開克隆，并在噬菌體文庫(kù)中隨機(jī)重組，然后可以搜索抗原結(jié)合克隆，如Winter等，Ann. Rev. Immunol. , 12 433-455 (1994)所述。來(lái)自經(jīng)免疫來(lái)源的文庫(kù)提供對(duì)免疫原有高親和力的抗體，無(wú)需構(gòu)建雜交瘤?；蛘撸梢钥寺∥疵庖叩娜?，用于為廣泛的非自身的及自身的抗原提供單一人抗體來(lái)源，無(wú)需任何免疫，如Griffins等，EMBO J，12 :725-734(199 所述。最后，未免疫的文庫(kù)還可以以合成方式來(lái)構(gòu)建，即從干細(xì)胞克隆未重排的V基因區(qū)段，并使用包含隨機(jī)序列的PCR引物來(lái)編碼高度可變的⑶R3區(qū)及用來(lái)在體外實(shí)現(xiàn)重排，如Hoogenboom和Winter， J. Mol. Biol.，227 :381-388 (1992)所述。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)與次要外殼蛋白pill融合，使用絲狀噬菌體來(lái)展示抗體片段?？贵w片段可以展示為單鏈Fv片段，其中VH與VL結(jié)構(gòu)域通過(guò)柔性多肽間隔物在同一多肽鏈上相連，例如如Marks等，J. Mol. Biol.，222 =581-597 (1991)所述，或者展示為Fab 片段，其中一條鏈與PlII融合，另一條鏈分泌入細(xì)菌宿主細(xì)胞周質(zhì)，在此裝配Fab-外殼蛋白結(jié)構(gòu)，其通過(guò)替換一些野生型外殼蛋白而展示在噬菌體表面上，例如如Hoogenboom等， Nucl. Acids Res.，19 :4133-4137(1991)所述。一般而言，從收獲自人或動(dòng)物的免疫細(xì)胞獲得編碼抗體基因片段的核酸。如果希望文庫(kù)偏向抗抗原克隆，那么可以給受試者免疫接種抗原以產(chǎn)生抗體應(yīng)答，并回收脾細(xì)胞和/或循環(huán)B細(xì)胞或其它外周血淋巴細(xì)胞(PBL)用于文庫(kù)構(gòu)建。在一個(gè)實(shí)施方案中，如下得到了偏向抗抗原克隆的人抗體基因片段文庫(kù)，即在攜帶功能性人免疫球蛋白基因陣列(且缺乏功能性內(nèi)源抗體生成系統(tǒng))的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生抗抗原抗體應(yīng)答，使得抗原免疫接種產(chǎn)生生成針對(duì)抗原的人抗體的B細(xì)胞。生成人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的生成在下文中有描述?？梢匀缦芦@得抗抗原反應(yīng)性細(xì)胞群的進(jìn)一步富集，即使用合適的篩選規(guī)程來(lái)分離表達(dá)抗原特異性膜結(jié)合抗體的B細(xì)胞，例如通過(guò)使用抗原親和層析進(jìn)行的細(xì)胞分離或者細(xì)胞對(duì)熒光染料標(biāo)記的抗原的吸附及后續(xù)的熒光激活細(xì)胞分選(flow-activated cell sorting, FACS)?；蛘?，來(lái)自未免疫供體的脾細(xì)胞和/或B細(xì)胞或其它PBL的使用提供了可能的抗體全集的更佳展現(xiàn)，而且還容許使用抗原在其中沒(méi)有抗原性的任何動(dòng)物(人或非人的)物種構(gòu)建抗體文庫(kù)。對(duì)于構(gòu)建體外摻入抗體基因的文庫(kù)，從受試者收獲干細(xì)胞以提供編碼未重排抗體基因區(qū)段的核酸。可以從多種動(dòng)物物種(諸如人、小鼠、大鼠、兔類、luprine、犬、 貓、豬、牛、馬和禽類物種等)獲得感興趣的免疫細(xì)胞。從感興趣的細(xì)胞回收編碼抗體可變基因區(qū)段(包括VH和VL區(qū)段)的核酸并擴(kuò)增。就重排的VH和VL基因文庫(kù)而言，可以如下獲得所需DNA，即從淋巴細(xì)胞分離基因組DNA 或mRNA，接著用與重排的VH和VL基因的5'和3'末端匹配的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)，如 Orlandi 等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，86 :3833-3837 (1989)所述，由此構(gòu)建多樣性V基因全集供表達(dá)?？梢詮腸DNA和基因組DNA擴(kuò)增V基因，反向引物位于編碼成熟V 結(jié)構(gòu)域的外顯子的5'末端，正向引物基于J區(qū)段內(nèi)部，如Orlandi等(1989)和Ward等， Nature, 341 :544-546(1989)所述。然而，為了從cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，反向引物還可基于前導(dǎo)外顯子內(nèi)，如Jones等，Biotechnol.，9 :88-89(1991)所述，正向引物基于恒定區(qū)內(nèi)，如Sastry ^,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86 :5728-5732(1989)所述。為了使互補(bǔ)性最大化，引物中可以摻入簡(jiǎn)并性，如Orlandi等(1989)或&iStry等(1989)所述。在某些實(shí)施方案中，如下將文庫(kù)多樣性最大化，即使用靶向每個(gè)V基因家族的PCR引物來(lái)擴(kuò)增免疫細(xì)胞核酸樣品中存在的所有可獲得的VH和VL重排，例如如Marks等，J. Mol. Biol.，222 :581-597 (1991) 的方法中所述或Orum等，Nucleic Acids Res. ,21 :4491-4498(1993)的方法中所述。為了將所擴(kuò)增的DNA克隆入表達(dá)載體，可以在PCR引物的一端引入罕見的限制性位點(diǎn)作為標(biāo)簽， 如Orlandi等(1989)所述，或者用帶標(biāo)簽的引物進(jìn)行進(jìn)一步的PCR擴(kuò)增，如Clackson等， Nature，352 :624-628(1991)所述。合成重排的V基因全集可以在體外從V基因區(qū)段衍生。大多數(shù)人VH基因區(qū)段已經(jīng)克隆和測(cè)序 CTomlinson 等，J. Mol. Biol.，227 :776-798 (1992))，并定位(Matsuda 等， Nature Genet.，3 :88-94 (1993))；這些克隆的區(qū)段(包括Hl和H2環(huán)的所有主要構(gòu)造)可用于生成多樣性VH基因全集，用到編碼序列和長(zhǎng)度多樣性的H3環(huán)的PCR引物，如Hoogenboom 和Winter，J. Mol. Biol.，227 :381-388(1992)所述。VH全集還可如下生成，所有序列多樣性集中于單一長(zhǎng)度的長(zhǎng) H3 環(huán)，如 Barbas 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :4457-4461 (1992) 所述。人Vk和νλ區(qū)段已經(jīng)克隆和測(cè)序(Williams和Winter，Eur. J. Immunol.，23 1456-1461 (1993))，而且可用于生成合成輕鏈全集?；谝幌盗蠽H和VL折疊結(jié)構(gòu)及L3和 H3長(zhǎng)度的合成V基因全集將編碼具有可觀結(jié)構(gòu)多樣性的抗體。擴(kuò)增編碼V基因的DNA后， 依照 Hoogenboom 和 Winter，J. Mol. Biol.，227 :381-388(1992)的方法，可以在體外重排種系V基因區(qū)段?？贵w片段全集可以如下構(gòu)建，即以數(shù)種方式將VH與VL基因全集聯(lián)合在一起。 可以在不同載體中創(chuàng)建各個(gè)全集，并在體外重組載體，例如如Hogrefe等，Gene, 128 119-126(1993)所述，或者在體內(nèi)通過(guò)組合感染來(lái)重組載體，例如Waterhouse等，Nucl. Acids Res.，21 :2265-2266(1993)中記載的IoxP系統(tǒng)。體內(nèi)重組方法利用Fab片段的雙鏈性質(zhì)來(lái)克服因大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率施加的庫(kù)容量限制。分開克隆未免疫的VH和VL全集， 一個(gè)克隆入噬菌粒，另一個(gè)克隆入噬菌體載體。然后通過(guò)用噬菌體感染含噬菌粒的細(xì)菌使得每個(gè)細(xì)胞包含一種不同組合來(lái)聯(lián)合兩個(gè)文庫(kù)，庫(kù)容量只受細(xì)胞存在數(shù)的限制(約IO12個(gè)克隆)。兩種載體都包含體內(nèi)重組信號(hào)，使得VH與VL基因重組到單一復(fù)制子上，并共包裝成噬菌體病毒粒。這些巨型文庫(kù)提供了大量的具有優(yōu)良親和力OV1為約I(T8M)的多樣性抗體?；蛘撸梢詫⑷蜇灴寺∪胪惠d體，例如如Barbas等，Proc. Natl. Acad. ki. USA, 88 :7978-7982 (1991)所述，或者通過(guò)PCR裝配到一起，然后克隆，例如如Clackson等， Nature, 352 =624-628(1991)所述。PCR裝配還可用于將VH和VL DNA與編碼柔性肽間隔物的DNA連接以形成單鏈Fv(SCFV)全集。在另一種技術(shù)中，“細(xì)胞內(nèi)PCR裝配”用于通過(guò)PCR 在淋巴細(xì)胞內(nèi)聯(lián)合VH與VL基因，然后克隆所連接基因的全集，如Embleton等，Nucl. Acids Res. ,20 :3831-3837(1992)所述。未免疫文庫(kù)(天然的或合成的)生成的抗體可具有中等親和力OV1為約 IO6-KrtT1)，但還可以如下在體外模擬親和力成熟，即構(gòu)建次生文庫(kù)并再次選擇，如Winter 等(1994)，見上文所述。例如，在 Hawkins 等，J. Mol. Biol.，226 :889-896(1992)的方法或 Gram 等，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89 :3576-3580(1992)的方法中，使用易錯(cuò)聚合酶在體外隨機(jī)引入突變(Leung等，Techniquea :11-15(1989))。另外，可以通過(guò)隨機(jī)突變一個(gè)或多個(gè)CDR來(lái)進(jìn)行親和力成熟，例如在選定的個(gè)別Fv克隆中使用攜帶跨越感興趣CDR的隨機(jī)序列的引物進(jìn)行PCR并篩選更高親和力的克隆。WO 9607754(公布于1996年3月14日)記載了用于在免疫球蛋白輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)中誘導(dǎo)誘變以創(chuàng)建輕鏈基因文庫(kù)的方法。另一種高效方法是將通過(guò)噬菌體展示選出的VH或VL結(jié)構(gòu)域與得自未免疫供體的天然存在V 結(jié)構(gòu)域變體全集重組，并在數(shù)輪鏈改組中篩選更高親和力，如Marks等，Biotechnol. ,10 779-783(1992)所述。此技術(shù)容許生成親和力約IOl或小于10_9M的抗體和抗體片段。文庫(kù)的篩選可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，抗原可用于包被吸附板的孔，在附著至吸附板的宿主細(xì)胞上表達(dá)，或用于細(xì)胞分選，或者偶聯(lián)至生物素以用鏈霉親合素包被的珠捕捉，或者用于淘選噬菌體展示庫(kù)的任何其它方法。在適于至少部分噬菌體顆粒結(jié)合吸附劑的條件下，使噬菌體文庫(kù)樣品接觸固定化的抗原。正常情況下，選擇包括PH、離子強(qiáng)度、溫度等等的條件來(lái)模擬生理學(xué)條件。結(jié)合至固相的噬菌體進(jìn)行清洗，然后用酸洗脫，例如如Barbas等，Proc. Natl. Acad. Sci USA,88 7978-7982(1991)所述，或者用堿洗脫，例如如 Marks 等，J. Mol. Biol.，222 :581-597(1991) 所述，或者通過(guò)抗原競(jìng)爭(zhēng)洗脫，例如在與Clackson等，Nature, 352 =624-628(1991)的抗原競(jìng)爭(zhēng)法類似的規(guī)程中。噬菌體在單輪選擇中可以富集20-1，000倍。此外，富集的噬菌體可以在細(xì)菌培養(yǎng)物中進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行更多輪選擇。選擇的效率取決于許多因素，包括清洗過(guò)程中解離的動(dòng)力學(xué)，及單個(gè)噬菌體上的多個(gè)抗體片段是否能同時(shí)結(jié)合抗原。具有較快解離動(dòng)力學(xué)(和弱結(jié)合親和力)的抗體可以通過(guò)使用短時(shí)間的清洗、多價(jià)噬菌體展示、及固相中的高抗原包被密度來(lái)保留。高密度不僅通過(guò)多價(jià)相互作用而穩(wěn)定了噬菌體，而且有利于已解離的噬菌體的再結(jié)合。具有較慢解離動(dòng)力學(xué)(和強(qiáng)結(jié)合親和力)的抗體的選擇可以通過(guò)使用長(zhǎng)時(shí)間的清洗和單價(jià)噬菌體展示 (如Bass等，Proteins, 8 =309-314(1990)和WO 92/09690所述)及低抗原包被密度(如 Marks 等，Biotechnol.，10 :779-783 (1992)所述)來(lái)促進(jìn)。有可能在對(duì)抗原具有不同親和力的噬菌體抗體之間進(jìn)行選擇，甚至是親和力略有差異的。然而，選定抗體的隨機(jī)突變(例如如有些親和力成熟技術(shù)中所進(jìn)行的)有可能產(chǎn)生許多突變體，多數(shù)結(jié)合抗原，少數(shù)具有更高的親和力。通過(guò)限制抗原，罕見的高親和力噬菌體能競(jìng)爭(zhēng)勝出。為了保留所有較高親和力的突變體，可以將噬菌體與過(guò)量的生物素化抗原一起溫育，但是生物素化抗原的濃度以摩爾計(jì)低于抗原的目標(biāo)摩爾親和常數(shù)。然后可以用鏈霉親合素包被的順磁珠捕捉高親和力的結(jié)合噬菌體。此類“平衡捕捉”容許依照結(jié)合親和力來(lái)選擇抗體，其靈敏性容許從大大過(guò)量的低親和力噬菌體中分離出親和力只有原值 2倍的突變體克隆。還可以操作用于清洗結(jié)合至固相的噬菌體的條件來(lái)進(jìn)行基于解離動(dòng)力學(xué)的區(qū)分?？箍乖寺】梢曰诨钚赃M(jìn)行選擇。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合天然表達(dá)抗原的活細(xì)胞或結(jié)合游離漂浮抗原或附著于其它細(xì)胞結(jié)構(gòu)的抗原的抗抗原抗體。對(duì)應(yīng)于此類抗抗原抗體的Fv克隆可以如下選出(1)如上所述從噬菌體文庫(kù)分離抗抗原克隆， 并任選通過(guò)在合適的細(xì)菌宿主中培養(yǎng)所分離的噬菌體克隆群來(lái)擴(kuò)增該群體；(2)選出分別想要阻斷和不阻斷其活性的第二蛋白質(zhì)和抗原；(3)使抗抗原噬菌體克隆吸附至固定化的抗原；(4)使用過(guò)量的第二蛋白質(zhì)來(lái)洗脫任何不想要的、識(shí)別抗原結(jié)合決定簇(其與第二蛋白質(zhì)的結(jié)合決定簇交疊或共享)的克??；并(5)洗脫在步驟(4)后仍然吸附的克隆。任選的是，具有期望的阻斷/不阻斷特性的克隆可以通過(guò)一次或多次重復(fù)本文所述選擇規(guī)程來(lái)進(jìn)一步富集。
編碼本發(fā)明雜交瘤衍生單克隆抗體或噬菌體展示Fv克隆的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程分離和測(cè)序(例如通過(guò)使用設(shè)計(jì)成自雜交瘤或噬菌體DNA模板特異性擴(kuò)增感興趣的重鏈和輕鏈編碼區(qū)的寡核苷酸引物)。一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入原本不生成免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞，諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得所需單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述性論文包括Skerra等，Curr. Opinion in Immunol.，5 :256(1993)及 Pluckthun，Immunol. Revs, 130 :151(1992)。編碼本發(fā)明Fv克隆的DNA可以聯(lián)合編碼重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)的已知DNA序列 (例如適宜的DNA序列可得自Kabat等，見上文)以形成編碼全長(zhǎng)或部分長(zhǎng)度重鏈和/或輕鏈的克隆。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，任何同種型的恒定區(qū)都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE 恒定區(qū)，而且此類恒定區(qū)可以得自任何人或動(dòng)物物種。衍生自一種動(dòng)物(諸如人)物種的可變域DNA，然后與另一動(dòng)物物種的恒定區(qū)DNA融合以形成“雜合的”全長(zhǎng)重鏈和/或輕鏈的編碼序列的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“雜合”抗體的定義中。在某些實(shí)施方案中，衍生自人可變DNA的Fv克隆與人恒定區(qū)DNA融合以形成全長(zhǎng)或部分長(zhǎng)度人重鏈和/或輕鏈的編碼序列。還可以修飾編碼衍生自本發(fā)明雜交瘤的抗抗原抗體的DNA，例如通過(guò)替代，即用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列替換衍生自雜交瘤克隆的同源鼠序列(例如如Morrison等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855(1984)中的方法)?？梢赃M(jìn)一步修飾編碼雜交瘤或Fv克隆衍生抗體或片段的DNA，通過(guò)共價(jià)連接免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽的整個(gè)或部分編碼序列?？梢砸栽摲绞街苽渚哂斜景l(fā)明的Fv克隆或雜交瘤克隆衍生抗體的結(jié)合特異性的“嵌合”或“雜合”抗體。(iv)人源化抗體和人抗體本領(lǐng)域知道用于人源化非人抗體的多種方法。例如，人源化抗體具有一個(gè)或多個(gè)從非人來(lái)源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱為“輸入”殘基，它們通常取自 “輸入”可變區(qū)。基本上可遵循Winter及其同事的方法進(jìn)行人源化(Jones et al. ,Nature, 321 :522-525(1986) ；Riechmann et al. ,Nature, 332 :323-327(1988) ；Verhoeyen et al.， Science, 239 :1534-1536 (1988))，即用嚙齒類CDR或CDR序列替代人抗體的對(duì)應(yīng)序列。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利4，816，567)，其中顯著少于完整的人可變區(qū)用非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是如下人抗體，其中有些CDR殘基和可能的有些FR殘基用嚙齒類抗體類似位點(diǎn)的殘基替代。用于制備人源化抗體的人輕鏈和重鏈可變區(qū)的選擇對(duì)于降低抗原性是非常重要的。依照所謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體的可變區(qū)序列對(duì)已知人可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)進(jìn)行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架 (FR) (Sims et al. , J. Immunol. ,151 :2296(1993) ；Chothia et al. , J. Mol.Biol. ,196 901(1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞類(subgroup)的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter et al. ,Proc. Natl. Acad Sci. USA,89 :4285(1992) ；Presta et al. , J. Immno1.，151 :2623(1993))。更為重要的是抗體在人源化后保留對(duì)抗原的高親和力和其它有利的生物學(xué)特性。 為了達(dá)到此目的，依照該方法的一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)使用親本序列和人源化序列的三維模
25型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的過(guò)程來(lái)制備人源化抗體。通常可獲得免疫球蛋白三維模型，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。通過(guò)檢查這些顯示圖像能分析殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可以從受體序列和輸入序列中選出FR殘基并組合，從而得到期望的抗體特征，諸如對(duì)靶抗原的親和力升高。一般而言，高變區(qū)殘基直接且最實(shí)質(zhì)的涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。本發(fā)明的人抗體可以通過(guò)如上所述聯(lián)合選自人衍生噬菌體展示庫(kù)的Fv克隆可變域序列與已知的人恒定域序列來(lái)構(gòu)建?；蛘?，可以通過(guò)雜交瘤方法來(lái)生成本發(fā)明的人單克隆抗體。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系已有記載，例如 Kozbor J. Immunol.，133 :3001(1984) ；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc.，New York，1987)；及 Boerner et al.，J. Immunol.，147 :86 (1991).例如，有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在抗原攻擊后生成人抗體。參見例如Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :2551 (1993) Jakobovits et al. , Nature, 362 255-258(1993) ；Bruggermann etal. , Year in Immuno. ,7 :33(1993)；及 Duchosal et al. Nature 355 :258(1992)。基因改組也可用于在體外自非人(例如嚙齒類)抗體衍生人抗體，其中人抗體具有與起始非人抗體相似的親和力和特異性。依照此方法，它也稱為“表位印記”(印itope imprinting)，如本文所述通過(guò)噬菌體展示技術(shù)得到的非人抗體片段的重鏈或輕鏈可變區(qū)用人V結(jié)構(gòu)域基因全集替換，產(chǎn)生非人鏈-人鏈scFv或Fab嵌合物群。用抗原進(jìn)行的選擇導(dǎo)致非人鏈/人鏈嵌合scFv或Fab的分離，其中人鏈在一級(jí)噬菌體展示克隆中消除相應(yīng)的非人鏈后恢復(fù)了抗原結(jié)合位點(diǎn)，即表位決定(印記，imprint)人鏈配偶體的選擇。在重復(fù)該過(guò)程以替換剩余非人鏈時(shí)，得到人抗體(參見PCT WO 93/06213，公開于1993年4月1 日)。與傳統(tǒng)的通過(guò)CDR移植進(jìn)行的非人抗體的人源化不同，此技術(shù)提供完全人的抗體，它們不含非人起源的FR或CDR殘基。(ν)抗體片段抗體片段可以通過(guò)傳統(tǒng)手段來(lái)生成，諸如酶促消化，或者通過(guò)重組技術(shù)來(lái)生成。在某些情況中，使用抗體片段，而不是完整抗體有優(yōu)勢(shì)。片段的較小尺寸容許快速清除，而且可導(dǎo)致更易于到達(dá)某些組織。某些抗體片段的綜述參見Hudson等O003)Nat.Med.9: U9-134。已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過(guò)蛋白水解消化完整抗體來(lái)衍生這些片段(參見例如 Morimoto 等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107—117(1992)；及 Brennan 等，Science 229 :81(1985)) 然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片段。Fab、Fv和scFv抗體片段都可在大腸桿菌中表達(dá)和由大腸桿菌分泌，如此容許容易地生成大量的這些片段?？蓮纳衔挠懻摰氖删w抗體庫(kù)中分離抗體片段?；蛘?，可直接從大腸桿菌回收Fab' -SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab' )2片段
26(Carter等，Bio/Technology 10 163-167 (1992)) 0依照另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離F(ab' )2片段。包含補(bǔ)救受體結(jié)合表位殘基、具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期的 Fab和F(ab' )2片段記載于美國(guó)專利No. 5，869，046。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對(duì)于熟練從業(yè)人員會(huì)是顯而易見的。在某些實(shí)施方案中，抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185 ；美國(guó)專利No. 5，571，894 ；及5，587，458。Fv和scFv是具有完整結(jié)合位點(diǎn)、缺少恒定區(qū)的唯一類型；如此，它們可能適于在體內(nèi)使用時(shí)降低非特異性結(jié)合?？蓸?gòu)建scFv融合蛋白以生成效應(yīng)器蛋白質(zhì)在scFv的氨基或羧基末端的融合。參見Antibody Engineering, Borrebaeck編，見上文。抗體片段還可以是“線性抗體”，例如如美國(guó)專利No. 5，641，870中所記載的。此類線性抗體可以是單特異性的或雙特異性的。(vi)多特異性抗體多特異性抗體具有對(duì)至少兩種不同表位的結(jié)合特異性，其中所述表位通常來(lái)自不同抗原。盡管此類分子通常只結(jié)合兩種不同表位(即雙特異性抗體，BsAb)，但是此表述在用于本文時(shí)涵蓋具有額外特異性的抗體，諸如三特異性抗體?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab‘ )2雙特異性抗體)。用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)基于兩對(duì)免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein等， Nature, 305 =537-539 (1983)) 0由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過(guò)親和層析步驟進(jìn)行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。類似的規(guī)程披露于 W093/08^9 及 Traunecker 等，EMBO J.，10 :3655-3659 (1991)。依照一種不同的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。優(yōu)選的是，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域進(jìn)行融合。通常在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)。 將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時(shí)，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體中，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時(shí)提供所期望的最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時(shí)或在該比例沒(méi)有特別意義時(shí)，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個(gè)表達(dá)載體。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個(gè)臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個(gè)雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑， 因此發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)便于將期望的雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露于W094/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情參見例如Suresh等， Methods in Enzymology,121 :210 (1986)。依照W096/27011中記載的另一種方法，可改造一對(duì)抗體分子間的界面，以將從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大化。一種界面包含抗體恒定域的至少部分CH3 結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過(guò)將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸) 替換，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈相同或相似大小的補(bǔ)償性“空腔”。這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機(jī)制。雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可以將異源偶聯(lián)物中的一種抗體與親合素偶聯(lián)，而將另一種抗體與生物素偶聯(lián)。此類抗體已經(jīng)建議用于例如將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利No. 4，676，980)和用于治療HIV感染 (TO 91/00360, WO 92/200373，和EP 03089)。異源偶聯(lián)抗體可以使用任何方便的交聯(lián)方法來(lái)制備。合適的交聯(lián)劑連同許多交聯(lián)技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，而且披露于美國(guó)專利 No. 4，676，980。文獻(xiàn)中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來(lái)制備雙特異性抗體。Brerman等，Science，2 =81(1985)記載了通過(guò)蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab' )2片段的規(guī)程。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原， 以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab'片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸郊姿狨?TNB)衍生物。然后將Fab' -TNB衍生物之一通過(guò)巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成 Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab' -TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最新的進(jìn)展便于從大腸桿菌直接回收Fab' -SH片段，這些片段可化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。也可以從大腸桿菌直接回收Fab' -SH片段，而且可以將這些片段化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby等，J. Exp. Med.，175 :217-225 (1992)記載了完全人源化的雙特異性抗體F(ab' )2分子的生成。由大腸桿菌分開分泌每種Fab'片段，并在體外進(jìn)行定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。還記載了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny等，J. Immunol.，148(5) 1547-1553(1992)。將來(lái)自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過(guò)基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA,90 6444-6448(1993)記載的“雙抗體”技術(shù)提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機(jī)制。該片段包含通過(guò)接頭相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(VJ，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因此，迫使一個(gè)片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)片段上的互補(bǔ)八和Vh結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了通過(guò)使用單鏈Fv(sFv) 二聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber等，J. Immunol.，152 :5368 (1994)。設(shè)想了具有超過(guò)兩個(gè)效價(jià)的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tuft等， J. Immunol.，147 :60(1991)。(vii)單域抗體在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是單域抗體(single-domain antibody) 0單域抗體是包含抗體的整個(gè)或部分重鏈可變域或者整個(gè)或部分輕鏈可變域的單一多肽鏈。在某些實(shí)施方案中，單域抗體是人單域抗體(Domantis，Inc.，ffaltham, MA ；參見例如美國(guó)專利 No. 6，248, 516B1)。在一個(gè)實(shí)施方案中，單域抗體由抗體的整個(gè)或部分重鏈可變域組成。(viii)抗體變體在有些實(shí)施方案中，涵蓋本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進(jìn)抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性?？贵w的氨基酸序列變體可以是通過(guò)將適宜的變化引入編碼抗體的核苷酸序列或通過(guò)肽合成制備的。此類修飾包括例如抗體氨基酸序列內(nèi)的殘基刪除和/或插入和/或替代。可進(jìn)行任何刪除、插入和替代組合以獲得最終的構(gòu)建物， 倘若最終的構(gòu)建物具有期望的特征?？稍谥苽湫蛄袝r(shí)將氨基酸改變引入受試抗體的氨基酸序列。(ix)抗體衍生物可進(jìn)一步修飾本發(fā)明的抗體以包含本領(lǐng)域知道的且易于獲得的額外非蛋白質(zhì)性質(zhì)模塊。在某些實(shí)施方案中，適于抗體衍生化的模塊是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊環(huán)、聚-1，3，6-三P惡烷、乙烯/馬來(lái)酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或隨機(jī)共聚物)、右旋糖苷或聚(η-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。由于其在水中的穩(wěn)定性，聚乙二醇丙醛在生產(chǎn)中可能具有優(yōu)勢(shì)。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附著于抗體的聚合物數(shù)目可以變化，而且如果附著了超過(guò)一個(gè)聚合物，那么它們可以是相同或不同的分子。一般而言，可根據(jù)下列考慮來(lái)確定用于衍生化的聚合物的數(shù)目和/或類型，包括但不限于待改進(jìn)抗體的具體特性或功能、抗體衍生物是否將用于指定條件下的治療等。(χ)載體、宿主細(xì)胞、和重組方法也可以使用重組方法來(lái)生成抗體。為了重組生產(chǎn)抗抗原抗體，分離編碼抗體的核酸，并將其插入可復(fù)制載體，用于進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)。可使用常規(guī)規(guī)程容易的分離編碼抗體的DNA并測(cè)序(例如通過(guò)使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)?？衫迷S多載體。載體構(gòu)件通常包括但不限于下列一種或多種信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)志基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子、和轉(zhuǎn)錄終止序列。(a)信號(hào)序列構(gòu)件本發(fā)明的抗體不僅可以直接重組生產(chǎn)，而且可以作為與異源多肽的融合多肽，所述異源多肽優(yōu)選是成熟蛋白質(zhì)或多肽的N-末端處的信號(hào)序列或具有特異性切割位點(diǎn)的其它多肽。所選擇的異源信號(hào)序列優(yōu)選是受到宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(例如受到信號(hào)肽酶切割)的。對(duì)于不識(shí)別和加工天然抗體信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，所述信號(hào)序列用例如選自堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列的原核信號(hào)序列取代。為了酵母分泌，天然信號(hào)序列可以用例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、α因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母屬和克魯維氏酵母屬α因子前導(dǎo)序列)、酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、白色假絲酵母葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)序列、或WO 90/13646中記載的信號(hào)取代。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可以利用哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒分泌前導(dǎo)序列，例如單純皰疹gD信號(hào)。(b)復(fù)制起點(diǎn)表達(dá)和克隆載體都包含能夠使載體在一種或多種所選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。通常，在克隆載體中，這種序列是能夠使載體不依賴于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，包括復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列。眾所周知多種細(xì)菌、酵母和病毒的此類序列。來(lái)自質(zhì)粒PBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2μ質(zhì)粒起點(diǎn)適合于酵母，而各種病毒起點(diǎn)(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。一般而言，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點(diǎn)構(gòu)件(SV40起點(diǎn)的使用通?？赡苤皇且?yàn)樗缙趩?dòng)子)。(c)選擇基因構(gòu)件表達(dá)和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標(biāo)志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(zhì)(a)賦予抗生素或其它毒素抗性，例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四環(huán)素；(b) 補(bǔ)足營(yíng)養(yǎng)缺陷；或(c)提供不能由復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個(gè)實(shí)例利用藥物來(lái)阻滯宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。用異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞生成賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)，因而幸免于選擇方案。此類顯性選擇的實(shí)例使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)志的另一個(gè)例子是能夠鑒定有能力攝取抗體編碼核酸的細(xì)胞的選擇標(biāo)志，諸如DHFR、谷氨酰胺合酶(GS)、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II優(yōu)選靈長(zhǎng)類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。例如，通過(guò)將轉(zhuǎn)化子在含有甲氨蝶呤(Mtx) (DHFR的一種競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)鑒定經(jīng)DHFR基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在這些條件下，DHFR基因與任何其它共轉(zhuǎn)化的核酸一起擴(kuò)增。可使用內(nèi)源DHFR活性缺陷的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系(例如ATCC CRL-9096)?；蛘撸ㄟ^(guò)將轉(zhuǎn)化子在含有L-甲硫氨酸亞砜亞胺(Msx) (L-methionine sulfoximine) (GS的一種抑制劑)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)鑒定經(jīng)GS基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在這些條件下，GS基因與任何其它共轉(zhuǎn)化的核酸一起擴(kuò)增。可以與上文描述的DHFR選擇/擴(kuò)增系統(tǒng)組合地使用GS選擇/擴(kuò)增系統(tǒng)。或者，可以通過(guò)在含有針對(duì)選擇標(biāo)志的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素、或G418的培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)選擇經(jīng)編碼感興趣抗體、野生型DHFR基因、和另一種選擇標(biāo)志諸如氨基糖苷3 ’ -磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(特別是包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)。參閱美國(guó)專利4，965，199。適用于酵母的選擇基因?yàn)榇嬖谟诮湍纲|(zhì)粒YRp7中的trpl基因(Minchcomb et al. , Nature 282:39(1979))。trpl基因?yàn)槿狈υ谏彼嶂猩L(zhǎng)能力的酵母突變株，例如 ATCC No. 44076 或 PEP4-1 提供了選擇標(biāo)志。Jones，Genetics 85:12(1977).酵母宿主細(xì)胞基因組中存在trpl損害隨之提供了用于通過(guò)在不存在色氨酸下生長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類似的，用攜帶Leu2基因的已知質(zhì)粒補(bǔ)足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20，622或 38，626)。此外，衍生自1.6μπι環(huán)狀質(zhì)粒pKDl的載體可用于轉(zhuǎn)化克魯維氏酵母屬酵母?；蛘?，報(bào)導(dǎo)了用于在乳酸克魯維氏酵母中大規(guī)模生產(chǎn)重組小牛凝乳酶的表達(dá)系統(tǒng)。Van den Berg, Bio/Technology 8:135(1990)。還披露了適用于通過(guò)克魯維氏酵母屬的工業(yè)菌株分泌成熟重組人血清清蛋白的穩(wěn)定多拷貝表達(dá)載體。Fleer et al. , Bio/Technology 9 968-975(1991)。(d)啟動(dòng)子構(gòu)件表達(dá)和克隆載體一般包含受到宿主生物體識(shí)別的啟動(dòng)子，而且它與編碼抗體的核酸可操作連接。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括PhoA啟動(dòng)子、β -內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、堿性磷酸酶啟動(dòng)子、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、和雜合啟動(dòng)子諸如tac啟動(dòng)子。然而，其它已知的細(xì)菌啟動(dòng)子也是合適的。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子還將包含與編碼抗體的DNA可操作連接的 Shine-Dalgarno (S. D.)序列。已知真核細(xì)胞的啟動(dòng)子序列。事實(shí)上，所有真核基因都具有富含AT區(qū)，它位于起始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)上游大約25至30個(gè)堿基處。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游70至80個(gè)堿基處找到的另一種序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3'端是 AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添加聚腺苷酸尾的信號(hào)。所有這些序列合適地插入真核表達(dá)載體。適用于酵母宿主的啟動(dòng)子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。作為具有通過(guò)生長(zhǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)點(diǎn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的其它酵母啟動(dòng)子是醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子區(qū)。適用于酵母表達(dá)的載體和啟動(dòng)子進(jìn)一步記載于EP 73，657。酵母增強(qiáng)子也可以有利的與酵母啟動(dòng)子一起使用。抗體在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中自載體的轉(zhuǎn)錄可通過(guò)例如從病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒幻、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒、猿猴病毒40(SV40)基因組，或從異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子，及從熱休克啟動(dòng)子獲得的啟動(dòng)子來(lái)控制，倘若此類啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子，該片段還包含SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)。方便的以HindIIIE限制性片段的形式獲得人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子。美國(guó)專利No. 4，419，446中披露了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)DNA的系統(tǒng)。美國(guó)專利No. 4，601，978中記載了該系統(tǒng)的一種改良。關(guān)于在小鼠細(xì)胞中在來(lái)自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子的控制下表達(dá)人β -干擾素cDNA還可參見 Reyes et al. ,Nature 297 :598-601 (1982)?；蛘撸梢允褂脛谑先饬霾《鹃L(zhǎng)末端重復(fù)序列作為啟動(dòng)子。(e)增強(qiáng)子元件構(gòu)件常常通過(guò)將增強(qiáng)子序列插入載體來(lái)提高高等真核細(xì)胞對(duì)編碼本發(fā)明抗體的DNA 的轉(zhuǎn)錄。現(xiàn)在知道來(lái)自哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素) 的許多增強(qiáng)子序列。然而，通常使用來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。例子包括SV40復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的增強(qiáng)子(bp 100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、多瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的增強(qiáng)子、和腺病毒增強(qiáng)子。關(guān)于激活真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件還可參見Yaniv， Nature297 17-18(1982) 0可以將增強(qiáng)子剪接到載體中，位于抗體編碼序列的5'或3'位置，但是優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5'位點(diǎn)。(f)轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人或來(lái)自其它多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體還將包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類序列通?？梢詮恼婧嘶虿《綝NA或cDNA非翻譯區(qū)的5'端和偶爾的3'端獲得。這些區(qū)域包含在編碼抗體的mRNA的非翻譯部分中轉(zhuǎn)錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化區(qū)。參見WO 94/110 及其中披露的表達(dá)載體。(g)宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化適于克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的宿主細(xì)胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核細(xì)胞。適于此目的的原核生物包括真細(xì)菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物體， 例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬Escherichia)例如大腸埃希氏菌或大腸桿菌(E. coli)、 腸桿菌屬(EntercAacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬 (Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、 沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志賀氏菌屬 (Shigella)、以及芽孢桿菌屬(Bacilli)諸如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266, 710中披露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(I^eudomonas)諸如銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、和鏈霉菌屬 (Streptomyces)。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294 (ATCC31, 446)，盡管其它菌株諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31，537)和大腸桿菌W3110 (ATCC 27, 325)也是合適的。這些例子是例示性的，而不是限制性的?？梢栽诩?xì)菌中生產(chǎn)全長(zhǎng)抗體、抗體融合蛋白、和抗體片段，特別是在不需要糖基化和Fc效應(yīng)器功能時(shí)，諸如在將治療性抗體偶聯(lián)至自身在腫瘤細(xì)胞破壞方面顯示出效力的細(xì)胞毒劑(例如毒素)時(shí)。全長(zhǎng)抗體在循環(huán)中具有較長(zhǎng)的半衰期。大腸桿菌中的生成是較快的且較合算的。對(duì)于在細(xì)菌中表達(dá)抗體片段和多肽，參見例如U. S. 5，648，237 (Carter et. al.)，U. S. 5，789，199 (Joly et al.)，U. S. 5，840，523 (Simmons et al.)，其描述了使表達(dá)和分泌優(yōu)化的翻譯起始區(qū)(TII )和信號(hào)序列。還可參見Charlton，Methods in Molecular Biology，卷 248 (B. K. C. Lo，編，Humana Press, Totowa, NJ, 2003)，pp. 245-254，其描述了在大腸桿菌中表達(dá)抗體片段。表達(dá)后，可以在可溶性級(jí)分中自大腸桿菌細(xì)胞漿液分離抗體，并可以通過(guò)例如蛋白A或G柱(取決于同種型)來(lái)純化抗體。可以實(shí)施最終的純化，其類似于用于純化在例如CHO細(xì)胞中表達(dá)的抗體的工藝。在原核生物以外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)也是編碼抗體的載體的合適克隆或表達(dá)宿主。啤酒糖酵母或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通?？色@得許多其它屬、種和菌株且可用于本發(fā)明，諸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，諸如例如乳酸克魯維酵母(K. Iactis)、脆壁克魯維酵母 (K. fragilis) (ATCC 12，424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16，045)、威克克魯維酵母(K. wickeramii) (ATCC 24，178)、K. waltii (ATCC 56，500)、果蠅克魯維酵母 (K. drosophilarum) (ATCC 36，906)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans)和馬克思克魯維酵母(K. marxianus)；亞羅酵母屬(Yarrowia) (EP 402, 226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) (EP 183，070)；假絲酵母屬(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia) (EP 244,234)；粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)；許旺酵母屬 Gchwanniomyces)，諸如 Schwanniomyces occidentalis ；禾口絲狀真菌，i者如例如脈抱菌屬(Neurospora)、青霄屬 (Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、和曲霉屬(Aspergillus)宿主諸如構(gòu)巢曲霉 (A. nidulans)和黑曲霉(A. niger)。關(guān)于討論酵母和絲狀真菌用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的用途的綜述參見例如 Gerngross, Nat. Biotech. 22 :1409-1414(2004)?？蛇x擇如下的某些真菌和酵母株，其中糖基化途徑已經(jīng)“人源化”，導(dǎo)致具有部分或完全人的糖基化樣式的抗體的生成。參見例如Li et al. , Nat. Biotech. 24 210-215(2006)(記載了巴斯德畢赤氏酵母中糖基化途徑的人源化)；及Gerngross et al.，見上文。適于表達(dá)糖基化抗體的宿主細(xì)胞也衍生自多細(xì)胞生物體(無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物)。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲細(xì)胞。已經(jīng)鑒定了許多桿狀病毒株和變體及相應(yīng)的允許昆蟲宿主細(xì)胞，它們來(lái)自諸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、 埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅 (Drosophila melanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyx mori)等宿主。公眾可獲得多種病毒株用于轉(zhuǎn)染，例如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-I變體和家蠶Bombyx mori NPV的Bm-5株，而且此類病毒可依照本發(fā)明用作本文中的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。還可利用棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、浮萍(Lemnaceae)、苜蓿 (M. truncatula)、和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物作為宿主。參見例如美國(guó)專利No. 5，959，177 ； 6，040，498 ；6，420，548 ；7, 125,978 ；和6，417，429 (描述用于在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)抗體的 PLANTIB0DIESTM 技術(shù))?？墒褂眉棺祫?dòng)物細(xì)胞作為宿主，而且培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中脊椎動(dòng)物細(xì)胞的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)規(guī)程。有用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子是經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl系(C0S-7， ATCC CRL 1651)；人胚腎系093或?yàn)榱嗽趹腋∨囵B(yǎng)中生長(zhǎng)而亞克隆的293細(xì)胞，Graham et al.，J. Gen Virol. 36 :59(1977))；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞托利 (sertoli)細(xì)胞(TM4,Mather,Biol. Reprod. 23 :243-251(1980))；猴腎細(xì)胞(CVLATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細(xì)胞(MDCK, ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝細(xì)胞(BRL 3A, ATCC CRL1442)；人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2, HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51) ；TRI 細(xì)胞(Mather et al.，Annals N. Y. Acad. Sci. 383 :44-68(1982) ；MRC5 細(xì)胞；FS4 細(xì)胞；和人肝瘤系OfeP G2)。其它有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，包括DHFR-CHO 細(xì)胞(Urlaub et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216(1980))；和骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞系，諸如NSO和Sp2/0。關(guān)于適合于抗體生產(chǎn)的某些哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的綜述參閱例如 Yazaki and ffu,Methods in Molecular Biology，卷 248 (B. K. C. Lo，編，Humana Press, Totowa, NJ,2003)，pp. 255—268。用上文所述用于生產(chǎn)抗體的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)更改的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。(h)培養(yǎng)宿主細(xì)胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體的宿主細(xì)胞。商品化培養(yǎng)基諸如 Ham 氏 FlO(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、禾口 Dulbecco 氏改良的fegle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，可以使用下列文獻(xiàn)中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基:Ham et al.，Meth. Enz. 58 :44(1979) ；Barnes et al.，Anal. Biochem. 102 :255 (1980)；美國(guó)專利 No. 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；4，560, 655 ；或 5，122，469 ；WO 90/03430 ；WO 87/00195 ；或美國(guó)專利 Re. 30, 985。任何這些培養(yǎng)基可以根據(jù)需要補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(諸如胰島素、運(yùn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、 抗生素(諸如GENTAMYCIN 藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無(wú)機(jī)化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以適宜濃度包含本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何其它必需補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件(諸如溫度、PH等)就是先前為表達(dá)而選擇用于宿主細(xì)胞的，這對(duì)于普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。(xi)抗體的純化在使用重組技術(shù)時(shí)，可以在細(xì)胞內(nèi)、在周質(zhì)空間中生成抗體，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，那么作為第一步，通過(guò)例如離心或超濾除去宿主細(xì)胞或裂解片段的微粒碎片。Carter et al.，Bio/TechnologylO :163-167(1992)記載了用于分離分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間的抗體的規(guī)程。簡(jiǎn)單的說(shuō)，在存在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)時(shí)使細(xì)胞糊融化約30分鐘?？赏ㄟ^(guò)離心除去細(xì)胞碎片。如果將抗體分泌到培養(yǎng)基中，那么一般首先使用商品化蛋白質(zhì)濃縮濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon 超濾單元濃縮來(lái)自此類表達(dá)系統(tǒng)的上清液。在任何上述步驟中，可以包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF來(lái)抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素來(lái)防止外來(lái)污染物的生長(zhǎng)?？梢允褂美缌u磷灰石層析、疏水相互作用層析、凝膠電泳、透析和親和層析來(lái)純化由細(xì)胞制備的抗體組合物，其中親和層析是優(yōu)選的純化步驟之一。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人 Yl、Y2 或 Y 4 重鏈的抗體(Lindmark et al.，J. Immunol. Meth. 62 1—13 (1983))。 蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人Y 3 (Guss et al. ,EMBO J. 5 1567-1575 (1986))。親和配體所附著的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但是可以使用其它基質(zhì)。物理穩(wěn)定的基質(zhì)諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能夠獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時(shí)間。若抗體包含 G3 結(jié)構(gòu)域，則可使用 Bakerbond ABX11^Mg (J. T. Baker,Phillipsburg,NJ)進(jìn)行純化。根據(jù)待回收的抗體，也可使用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)，諸如離子交換柱上的分級(jí)、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的層析、肝素SEPHAR0SE 上的層析、陰離子或陽(yáng)離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸銨沉淀。一般而言，用于制備供研究、測(cè)試、和臨床中使用的抗體的各種方法學(xué)是本領(lǐng)域完善建立的，與上文所述方法學(xué)一致，和/或是本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為適合于特定的感興趣抗體的。D.選擇生物學(xué)活性抗體可對(duì)如上所述生成的抗體進(jìn)行一種或多種“生物學(xué)活性”測(cè)定法以選擇從治療觀點(diǎn)看具有有益特性的抗體?？蓪?duì)抗體篩選其結(jié)合生成它時(shí)所針對(duì)的抗原的能力。例如，抗 oxLDL抗體，如下文實(shí)施例所示，可在檢測(cè)結(jié)合MDA-ApoBlOO的能力的測(cè)定法中評(píng)估抗體的抗原結(jié)合特性。在某些實(shí)施方案中，可在檢測(cè)結(jié)合氧化型肽IEIGLEGKGFEPTLEALFGK(SEQ ID NO 5)的能力的測(cè)定法中評(píng)估抗體的抗原結(jié)合特性。也可對(duì)抗oxLDL抗體篩選那些在動(dòng)物模型中抑制斑形成和阻止動(dòng)脈粥樣硬化損害發(fā)生的(例如khiopu et al. ,2004 ；WO 2004/030607 ；US 6，716，410)。其它活性包括在治療幾周后積極誘導(dǎo)主動(dòng)脈中已有的、已建立的動(dòng)脈粥樣硬化斑消退(例如W02007/025781)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)例如飽和結(jié)合；ELISA ；和/或競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法(例如 RIA)來(lái)測(cè)定抗體的親和力。還有，可對(duì)抗體進(jìn)行其它生物學(xué)活性測(cè)定法，例如為了評(píng)估它作為治療劑的有效性。此類測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的且依賴于抗體的靶抗原和預(yù)定用途。為了篩選結(jié)合感興趣抗原上的特定表位的抗體(例如那些阻斷例如抗oxLDL抗體結(jié)合oxLDL的)，可實(shí)施常規(guī)交叉阻斷測(cè)定法，諸如Antibodies，A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow 禾口 David Lane (1988)中記載的?；蛘?，可實(shí)施表位作圖例如如Champe et al.，J. Biol. Chem. 270 :1388-1394(1995)所述來(lái)測(cè)定抗體是否結(jié)合感興趣表位。E.制品在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供制品，其包含裝有本發(fā)明含水藥物配制劑的容器，而且任選提供它的使用說(shuō)明。合適的容器包括例如瓶、管形瓶和注射器。容器可用各種材料制成，諸如玻璃或塑料。一種例示性的容器為3-20CC—次使用的玻璃管形瓶?；蛘撸?對(duì)于多劑配制劑，容器可以是3-lOOcc玻璃管形瓶。容器裝有配制劑，而且該容器上或關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽可指示使用說(shuō)明。制品可進(jìn)一步包括從商業(yè)和用戶立場(chǎng)看想要的其它材料，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和印有使用說(shuō)明的包裝插頁(yè)。通過(guò)參考下述實(shí)施例，會(huì)更加全面地理解本發(fā)明。然而，它們不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。通過(guò)述及將所有文獻(xiàn)和專利引用收入本文。認(rèn)為本說(shuō)明書足以使得本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。根據(jù)上述描述，在本文所示和所述之外對(duì)本發(fā)明的各種更改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)變得顯然，且落在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。通過(guò)述及將本文中引用的所有出版物、專利、和專利申請(qǐng)完整收入本文，用于所有目的。
實(shí)施例要理解，本文中描述的實(shí)施例和實(shí)施方案只是出于例示目的，而且根據(jù)它們，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)想到各種變更和變化，而且它們被包括在本申請(qǐng)的精神和范圍及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。實(shí)施例1 穩(wěn)定的抗oxLDL抗體液體配制劑，pH研究這些例子描述穩(wěn)定的液體配制劑的開發(fā)和穩(wěn)定性測(cè)試，該穩(wěn)定的液體配制劑以約 10mg/mL-200mg/mL的范圍中的蛋白質(zhì)濃度包含抗oxLDL抗體(具有圖2所示氨基酸序列的)。該抗體是自針對(duì)自人ApoB-100衍生的氧化型肽的重組抗體片段文庫(kù)稱作n-CoDeR 開發(fā)的(例如恥02/080954)。在多種由組氨酸、精氨酸、乙酸鹽、氯化鈉等組成、？!1范圍4.5 至6. 5的液體配制劑中研究了抗oxLDL抗體的穩(wěn)定性(聚集物配制劑、電荷變體、等)。通過(guò)數(shù)種測(cè)定法來(lái)監(jiān)測(cè)抗oxLDL抗體的穩(wěn)定性，包括UV (用于濃度和濁度)、大小排阻層析 (SEC)(用于大小變體分析)、成像毛細(xì)管等電聚焦(icIEF)(用于電荷變體分析)、和結(jié)合。 6個(gè)月的穩(wěn)定性測(cè)試后，我們的結(jié)果指示抗oxLDL抗體在含有精氨酸的緩沖液中在pH 4. 5 和pH 6. 5之間是穩(wěn)定的。使用Slide-a-Lyzer盒通過(guò)透析將抗oxLDL抗體配制入不同緩沖液以實(shí)現(xiàn)表1所列終濃度。用0. 22 μ m Sterifilp濾器單元將每種配制劑無(wú)菌過(guò)濾并無(wú)菌填充入經(jīng)高壓滅菌的管形瓶，塞上塞子，并用鋁翻蓋密封來(lái)密封。將樣品放置于-20 V、2-8 V、25 °C、30 V、 40°C，并將對(duì)照管形瓶放置于_70°C，并在選定溫度進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的穩(wěn)定性研究。表1 :pH配制劑條件
權(quán)利要求
1.一種配制劑，其在PH 4. 5至6. 5的組氨酸-精氨酸緩沖液中包含治療有效量的抗體。
2.權(quán)利要求1的配制劑，其中該緩沖液為pH5.0至6.0的組氨酸乙酸鹽-精氨酸乙酸鹽緩沖液，或其中該緩沖液為PH5. 0至6. 0的組氨酸琥珀酸鹽-精氨酸琥珀酸鹽緩沖液。
3.權(quán)利要求2的配制劑，其中該緩沖液中的組氨酸乙酸鹽或組氨酸琥珀酸鹽濃度為約 5mM 至約 lOOmM。
4.權(quán)利要求2的配制劑，其中組氨酸乙酸鹽或組氨酸琥珀酸鹽濃度為約20mM。
5.權(quán)利要求2的配制劑，其中該緩沖液中的精氨酸乙酸鹽或精氨酸琥珀酸鹽濃度在約 50mM至約500mM的范圍中。
6.權(quán)利要求2的配制劑，其中該精氨酸乙酸鹽或精氨酸琥珀酸鹽濃度為約150mM。
7.權(quán)利要求1的配制劑，其進(jìn)一步包含表面活性劑。
8.權(quán)利要求7的配制劑，其中該表面活性劑為聚山梨酯。
9.權(quán)利要求8的配制劑，其中該聚山梨酯為聚山梨酯20。
10.權(quán)利要求9的配制劑，其中該表面活性劑濃度為0.0001%至約1. 0%。
11.權(quán)利要求10的配制劑，其中該表面活性劑濃度為約0.01%至約0. 1%。
12.權(quán)利要求11的配制劑，其中該表面活性劑濃度為0.02%。
13.權(quán)利要求1的配制劑，其中該抗體濃度為約10mg/ml至約250mg/ml。
14.權(quán)利要求1的配制劑，其中該抗體濃度為約100mg/ml至250mg/ml。
15.權(quán)利要求1的配制劑，其中該抗體濃度為約150mg/ml至約200mg/ml。
16.權(quán)利要求1的配制劑，其中該抗體濃度為約25mg/ml至約200mg/ml。
17.權(quán)利要求1的配制劑，其中該抗體未進(jìn)行在先凍干。
18.權(quán)利要求1的配制劑，其進(jìn)一步包含甲硫氨酸。
19.權(quán)利要求18的配制劑，其中該甲硫氨酸濃度為5mg/ml。
20.權(quán)利要求1的配制劑，其進(jìn)一步包含EDTA。
21.權(quán)利要求20的配制劑，其中該EDTA濃度為ImMEDTA。
22.權(quán)利要求7的配制劑，其中該緩沖液為pH5. 5的20mM組氨酸乙酸鹽和150mM精氨酸乙酸鹽，該表面活性劑為量為約0.01-0. 1 % ν/ν的聚山梨酯，其中該配制劑在約2-8°C的溫度穩(wěn)定至少12個(gè)月或其中該緩沖液為pH 5. 5的20mM組氨酸琥珀酸鹽和 150mM精氨酸琥珀酸鹽，該表面活性劑為量為約0. 01-0. 1%ν/ν的聚山梨酯，其中該配制劑在約2-8°C的溫度穩(wěn)定至少12個(gè)月。
23.權(quán)利要求1的配制劑，其中該配制劑為藥物配制劑。
24.權(quán)利要求1的配制劑，其中該配制劑在約25°C貯藏時(shí)穩(wěn)定至少12個(gè)月或其中該配制劑在約5°C貯藏時(shí)穩(wěn)定至少12個(gè)月或其中該配制劑在約-20°C貯藏時(shí)穩(wěn)定至少12個(gè)月。
25.一種制品，其包含裝有如下含水藥物配制劑的容器，該含水藥物配制劑包含治療有效量的抗體、約PH5. 0至約6. 0的組氨酸乙酸鹽-精氨酸乙酸鹽緩沖液、和表面活性劑，或包含裝有如下含水藥物配制劑的容器，該含水藥物配制劑含治療有效量的抗體、約PH 5.0 至約6. 0的組氨酸琥珀酸鹽-精氨酸琥珀酸鹽緩沖液、和表面活性劑。
26.一種用于在含水藥物配制劑中穩(wěn)定抗體的方法，其通過(guò)組合治療有效量的抗體、約 PH 5. 0至約6. 0的組氨酸乙酸鹽-精氨酸乙酸鹽緩沖液、和表面活性劑來(lái)進(jìn)行，或通過(guò)組合治療有效量的抗體、約PH 5. 0至約6. 0的組氨酸琥珀酸鹽-精氨酸琥珀酸鹽緩沖液、和表面活性劑來(lái)進(jìn)行。
27.一種藥物配制劑，其包含(a)量為約10mg/mL至約250mg/mL的對(duì)脫酰胺或聚集易感的全長(zhǎng)IgGl抗體；(b)pH 5.0至6.0的組氨酸乙酸鹽-精氨酸乙酸鹽緩沖液；和(c)量為約0.01%至約0. 的聚山梨酯20。
28.一種藥物配制劑，其包含(a)量為約lOmg/mL至約250mg/mL的對(duì)脫酰胺或聚集易感的全長(zhǎng)IgGl抗體；(b)pH 5.0至6.0的組氨酸琥珀酸鹽-精氨酸琥珀酸鹽緩沖液；和(c) 量為約0.01%至約0. 的聚山梨酯20。
全文摘要
描述了一種配制劑，其包含治療有效量的任選未進(jìn)行在先凍干的抗體、維持pH在約4.5至約6.5的范圍中的緩沖液、和任選的表面活性劑，以及此類配制劑的用途。
文檔編號(hào)C07K16/00GK102414221SQ201080019441
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者O.伊休 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司