專利名稱：一種復(fù)合分子及其制備方法和藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種復(fù)合分子及其制備方法和藥物組合物。
背景技術(shù)：
干擾RNA (RNAi，或siRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種抑制基因表達(dá)的小RNA。siRNA的主要作用機制是通過其反義RNA與靶基因的mRNA發(fā)生同源互補而抑制靶基因的表達(dá)。由于siRNA能夠特異地抑制靶基因的表達(dá)，所以它在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。但是外源siRNA的穩(wěn)定性差，血液容留時間短，細(xì)胞和組織通透性(penetration)差，這幾方面嚴(yán)重阻礙了外源siRNA抑制靶基因表達(dá)的應(yīng)用。siRNA的穩(wěn)定性差不是由于其在雙鏈形式下被降解，而是由于在雙鏈-單鏈的雜交-解旋平衡中(亦稱雙鏈核酸的“呼吸”)，其單鏈形式被RNase降解而導(dǎo)致快速失衡，造成雙鏈siRNA快速解旋降解。根據(jù)以上原理，許多研究人員力圖通過對siRNA進(jìn)行修飾而使其雙鏈不易解旋，進(jìn)而改善其穩(wěn)定性并提高其血液容留時間。例如WO 2004/015075公開了 "An interfering hairpin RNA having the structure X. sub. l-L-X. sub. 2, wherein X.sub.1 and X. sub. 2 are nucleotide sequences having sufficient complementarity to one another to form a double-stranded stem hybrid and Lisa loop region comprising a non—nucleotide linker molecule, wherein at least a portion of one of the nucleotide sequences located within the double-stranded stem is complementary to a sequence of said target RNA”，即兩條 siRNA鏈各自的一端用非核酸分子連接形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的siRNA，其中所述非核酸分子選自“polyethers，polyamines, polyesters, polyphosphodiesters, alkylenes, attachments, bioconjugates, chromophores, reporter groups, dye labeled RNAs, and non-naturalIy occurring nucleotide analogues or combinations thereof，，。W02009/074076 公開了一種干擾革巴基因表達(dá)的復(fù)合分子，該復(fù)合分子含有兩條至少80%互補的siRNA鏈X1和的5’端與的3’端通過非核酸分子L1連接，&的5’端與&的3’端通過非核酸分子L2連接。所述非核酸連接分子L1和非核酸連接分子L2可以為具有羧基、氨基或巰基的寡肽、聚酯、聚醚、烷烴、烯烴、炔烴和人工合成核酸類似物中的一種。其它種類的雙鏈核酸，如雙鏈DNA和除siRNA之外的其它雙鏈RNA也存在穩(wěn)定性差，血液容留時間短的問題。但是，包括WO 2004/015075和WO 2009/074076在內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)都沒有公開通過巰
基與馬來酰胺酸甲酯的邁克爾加成反應(yīng)來對雙鏈核酸進(jìn)行修飾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供了一種穩(wěn)定性好且血液容留時間長的復(fù)合分子及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，通過巰基與馬來酰胺酸甲酯或馬來酰亞胺的邁克爾加成反應(yīng)，可成功實現(xiàn)核酸的單雙端交聯(lián)，修飾交聯(lián)后的核酸的穩(wěn)定性得到改善，從而延長血液容留時間。本發(fā)明提供了一種復(fù)合分子，該復(fù)合分子含有兩條至少80%互補的核酸鏈X1和 X2, &的5’端與&的3’端通過連接基團(tuán)L1連接和/或&的5’端與&的3’端通過連接基團(tuán)L2連接，其特征在于，所述連接基團(tuán)L1和L2各自獨立地如式1所示-RfS-Ii2-S-R3-式1在式1中，R1和民各自獨立地表示碳原子數(shù)為1-20的任選取代的亞烷基；&如式2、式3或式8所示
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合分子，該復(fù)合分子含有兩條至少80%互補的核酸鏈&和)(2，X1的5’端與 &的3’端通過連接基團(tuán)L1連接和/或&的5’端與&的3’端通過連接基團(tuán)L2連接，其特征在于，所述連接基團(tuán)L1和L2各自獨立地如式1所示-R1-S-R2-S-R3-式1在式1中，R1和民各自獨立地表示碳原子數(shù)為1-20的任選取代的亞烷基；&如式2、式3或式8所示
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合分子，其中，R2如式3所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合分子，其中，R4表示碳原子數(shù)為1-20的亞烷基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的復(fù)合分子，其中，R4表示碳原子數(shù)為1-6的亞烷基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合分子，其中，R1和民各自獨立地表示碳原子數(shù)為1-10 的亞烷基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的復(fù)合分子，其中，核酸鏈\和\為DNA鏈或RNA鏈，核酸鏈&或\具有15-50個堿基。
7.復(fù)合分子的制備方法，該方法包括以下步驟(1)提供包括至少80%互補的第一修飾核酸鏈和第二修飾核酸鏈的雙鏈核酸，其中第一修飾核酸鏈的5’端具有基團(tuán)-R19-SH且第二修飾核酸鏈的3’端具有基團(tuán)-R2tl-SH,并且第二修飾核酸鏈的5’端具有基團(tuán)-I^21-SH且第一修飾核酸鏈的3’端具有基團(tuán)-R22-SH,其中，R19, R20, R21和Ii22各自獨立地表示碳原子數(shù)為1-20的任選取代的亞烷基；(2)提供式4、式5或式9所示的化合物；(3)將所述雙鏈核酸與式4、式5或式9所示的化合物進(jìn)行邁克爾加成反應(yīng)，
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其中，在步驟C3)中，邁克爾加成反應(yīng)的條件包括 在堿性催化劑的存在下，在反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行，雙鏈核酸與式4或式5所示的化合物的摩爾比為1 500-2000，雙鏈核酸在反應(yīng)介質(zhì)中的濃度為20-200 μ mol/L，反應(yīng)溫度為10-60°C，反應(yīng)時間為1-10小時。
9.復(fù)合分子的制備方法，該方法包括以下步驟(1)提供至少80%互補的第一修飾核酸鏈和第二修飾核酸鏈，其中第一修飾核酸鏈的 5’端具有基團(tuán)-R19H21且第二修飾核酸鏈的3’端具有基團(tuán)-R2tl-S-Ii22,其中，R19和R2tl各自獨立地表示碳原子數(shù)為1-20的任選取代的亞烷基，Ii21和Ii22中的一者表示氫并且另一者如式6、式7、式10或式11所示；(2)將第一修飾核酸鏈和第二修飾核酸鏈進(jìn)行退火并進(jìn)行邁克爾加成反應(yīng)，
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其中，在步驟O)中，邁克爾加成反應(yīng)的條件包括在堿性催化劑的存在下，在反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行，第一修飾核酸鏈和第二修飾核酸鏈中的任一者在反應(yīng)介質(zhì)中的濃度為20-200ymol/L，反應(yīng)溫度為10_60°C，反應(yīng)時間為1_10小時。
11.一種藥物組合物，該藥物組合物含有權(quán)利要求1-6中的任意一項所述的復(fù)合分子作為活性成分。
全文摘要
提供了一種穩(wěn)定性好且血液容留時間長的復(fù)合分子及其制備方法和應(yīng)用。所述復(fù)合分子含有兩條至少80％互補的核酸鏈X1和X2，X1的5’端與X2的3’端通過連接基團(tuán)L1連接和/或X2的5’端與X1的3’端通過連接基團(tuán)L2連接。本發(fā)明提供的復(fù)合分子的兩條核酸鏈X1和X2的5’端和/或3’端通過如式1所示的連接基團(tuán)連接，因此核酸鏈不容易解旋降解，從而大大地改善了核酸的穩(wěn)定性和血液容留時間。所述復(fù)合分子施用后，在細(xì)胞內(nèi)，利用細(xì)胞內(nèi)存在的Dicer酶釋放復(fù)合分子中被鎖定的核酸，從而釋放的雙鏈核酸發(fā)揮其作用，例如siRNA對靶基因的表達(dá)進(jìn)行抑制。
文檔編號C07H1/00GK102453066SQ201010518070
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月19日
發(fā)明者席真, 曹力強 申請人:南開大學(xué), 昆山市工業(yè)技術(shù)研究院小核酸生物技術(shù)研究所有限責(zé)任公司