專(zhuān)利名稱(chēng)：高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法以及新型重組蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高產(chǎn)重組蛋白的植物的貯藏器官的生產(chǎn)方法、以及肽酶抗性人胰高血 糖素樣肽-1 (GLP-I)的新型衍生物及其利用。本發(fā)明中，“重組蛋白”包含“重組肽和重組 蛋白”(以下表示為“重組蛋白”)。
背景技術(shù)：
利用基因工程技術(shù)的藥物、臨床檢查藥物、工業(yè)原料的生產(chǎn)已經(jīng)在實(shí)際的產(chǎn)業(yè)方 面成就了很大的貢獻(xiàn)，其中，以微生物或哺乳類(lèi)培養(yǎng)細(xì)胞為宿主的物質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)得到特別 廣泛應(yīng)用。但是，培養(yǎng)這些細(xì)胞時(shí)，必須有無(wú)菌環(huán)境完善的培養(yǎng)設(shè)備或培養(yǎng)基等，并且，不可 避免地要消耗石油能源，因此成本高。另外，使用哺乳類(lèi)細(xì)胞作為宿主，則不可避免會(huì)有對(duì) 人體有害的病毒混入的風(fēng)險(xiǎn)。因此，作為價(jià)廉、安全的物質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)，人們開(kāi)發(fā)了使用轉(zhuǎn)基因植物的物質(zhì)生產(chǎn)系 統(tǒng)，以此代替通過(guò)微生物或哺乳類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)進(jìn)行的物質(zhì)生產(chǎn)。例如，迄今為止已報(bào)道的 有生產(chǎn)生物降解性聚酯等高分子化合物(例如日本特開(kāi)2002-262886號(hào)公報(bào))、疫苗(例 如 G. Jaeger 等.，Eur. J. Biochem. 259，426，1999)或乳鐵蛋白(D. Chong 等.，Transgenic. Res. 9,71,2000)等蛋白、腦啡肽(日本特開(kāi)2000-106890號(hào)公報(bào))等肽的轉(zhuǎn)基因植物的制 備。作為轉(zhuǎn)基因植物，如果可以在該植物的可食用部分例如大豆或水稻的種子、蔬菜 的葉等生產(chǎn)對(duì)人體有益的功能性物質(zhì)，則無(wú)須經(jīng)過(guò)目標(biāo)物質(zhì)的提取步驟，即可直接經(jīng)口攝 入人體。并且如果是種子，還無(wú)需用冷藏裝置完備的設(shè)備進(jìn)行保存或運(yùn)輸，可在室溫下穩(wěn)定 地長(zhǎng)期保存。另外，提取目標(biāo)物質(zhì)時(shí)，種子與葉不同，幾乎沒(méi)有酚性物質(zhì)的混入，因此容易純 化。因此可以認(rèn)為種子是理想的生產(chǎn)目標(biāo)基因產(chǎn)物的器官，目前為止，已有例如制備生產(chǎn)大 豆球蛋白(T. Katsube 等·，Plant. Physiol. 120，1063，1999)等蛋白、(1, 3-1，4) - β -葡聚 糖酶(H. Horvath 等.,Proc. Nathl. Acad. Sci. USA.，97，1914，2000)等酶、腦啡肽(D. Chong 等·，Transgenic. Res. 9，71，2000)等肽的種子的報(bào)告。但是，通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物的物質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)與目前作為主流的微生物或哺乳類(lèi)細(xì)胞 培養(yǎng)系統(tǒng)比較，在具有上述優(yōu)異特性的另一面，也有產(chǎn)率低、特別是由植物貯藏器官進(jìn)行的 生產(chǎn)效率差的問(wèn)題。為解決該問(wèn)題，人們考慮了各種增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物中物質(zhì)生產(chǎn)能力的方 案。例如，為了改善貯藏其器官之一的種子的物質(zhì)生產(chǎn)能力，從提高導(dǎo)入的目標(biāo)基因的表 達(dá)或基因產(chǎn)物的蓄積的觀點(diǎn)考慮，人們將精力集中于以下的研究利用在種子中強(qiáng)烈表達(dá) 的種子貯藏蛋白的啟動(dòng)子(例如T.Katsube等·，Plant. Physiol. 120，1063，1999)、將該啟動(dòng)子同與之作用并使表達(dá)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合使用(例如D. Yang等.，Proc. Nathl. Acad. Sci. USA.，98，11438，2001)、插入5，非翻譯區(qū)(例如日本特開(kāi)2002-58492號(hào)公報(bào))、使基因 中的 C+G 含量最佳(H. Horvath 等.，Proc. Nathl. Acad. Sci. USA.，97，1914，2000)、向內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)附加核輸送信號(hào)(例如日本特開(kāi)2000-504567號(hào)公報(bào))等。還有報(bào)告指出使用缺失種 子貯藏蛋白的突變體作為導(dǎo)入外源基因的植物體，則外源基因產(chǎn)物在種子中的生產(chǎn)量提高 (日本特開(kāi)2002-58492號(hào)公報(bào))。但僅憑這些改良，不足以顯示種子中的物質(zhì)生產(chǎn)能力得 到了增強(qiáng)，人們希望開(kāi)發(fā)出新的方法。另一方面，已知GLP-I (胰高血糖素樣肽-1)是因攝取食物而由消化管分泌、在胰 臟中發(fā)揮功效，刺激糖依賴(lài)性胰島素的分泌的激素。II型糖尿病患者中，雖然可以保持對(duì) 該GLP-I的應(yīng)答性，但量不足。GLP-I制劑的開(kāi)發(fā)作為補(bǔ)充GLP-I的不足部分的胰島素分泌 促進(jìn)劑，有望應(yīng)用于糖尿病治療藥。但是，GLP-I的活性本體是GLP-I (7-36)的酰胺化物或 GLP-I (7-37)的多肽，如果口服攝取GLP-1，則在消化管內(nèi)被消化酶消化、分解，不能充分吸 收。因此，目前臨床上嘗試通過(guò)輸液進(jìn)行靜脈內(nèi)注射或皮下注射。并且有報(bào)道指出，GLP-I 也可被存在于血液中或組織中的二肽酰肽酶IV(DPP-IV)分解，活性半衰期只有1-2分鐘， 非常短，容易由腎臟排出，在血液中的半衰期在5分鐘以?xún)?nèi)，這些成為臨床應(yīng)用的瓶頸。因此人們研究開(kāi)發(fā)難以被分解、半衰期長(zhǎng)的GLP-I衍生物。例如有第8位氨基 酸置換衍生物(Diabetologia41，271-278，1998、Biochem40, 2860-2869, 2001)、N 末端和 C末端氨基酸的修飾產(chǎn)物(W09808871等)、將第34位置換為Arg并向第26位Lys導(dǎo)入 親油性基團(tuán)的衍生物(W00007617)、以及整個(gè)序列都有氨基酸置換的衍生物(W09943705、 W09111457)等。另外還進(jìn)行了皮下吸收緩慢的緩釋型注射劑，或者具有類(lèi)GLP-I激動(dòng)活 性、在血液中的半衰期長(zhǎng)、來(lái)自蜥蜴的合成Exendin-4的注射劑。但是這些都是注射劑，考 慮到患者的負(fù)擔(dān)，人們希望開(kāi)發(fā)由注射以外的途徑給藥的新型GLP-I衍生物。本發(fā)明的課題在于提供高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法、通過(guò)該方法 生產(chǎn)的高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官、以及肽酶抗性人胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)的新型 衍生物及其利用。S卩，為了增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的貯藏器官中的物質(zhì)生產(chǎn)，進(jìn)行了上述的各種嘗試。但 是，為了將生產(chǎn)可用作藥物等的重組蛋白的植物貯藏器官作為食物攝取，使其在體內(nèi)發(fā)揮 充分的功能，有必要開(kāi)發(fā)更高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，同時(shí)，由植物中提取 重組蛋白并加工成藥物或功能性食品時(shí)，可以在這些貯藏器官中高產(chǎn)重組蛋白，這在成本 方面是很重要的。因此，本發(fā)明的目的之一在于提供在轉(zhuǎn)基因植物中高產(chǎn)重組蛋白的貯藏 器官的新型生產(chǎn)方法。如果選擇GLP-I作為通過(guò)上述方法在植物貯藏器官中高產(chǎn)的重組蛋白，則只是象 平常飲食那樣攝取果實(shí)或米等，就有望獲得糖尿病的治療效果。但是，如上所述，該天然型 GLP-I在消化管內(nèi)被消化酶消化、分解，因此無(wú)法以口服的方式穩(wěn)定給藥，因此目前的現(xiàn)狀 是尚未有除注射以外的有效的給藥方式。因此，人們考慮如果通過(guò)一些方法使GLP-I不被 消化而通過(guò)胃，就可以在小腸被吸收了。不過(guò)，吸收時(shí)，GLP-I必須以單體的形式存在。此 時(shí)，天然型GLP-I也會(huì)被胰蛋白酶等酶分解而失活。并且，天然型GLP-I即使被吸收了，其后也會(huì)被二肽酰肽酶IV分解，作用無(wú)法持 續(xù)。因此，為了通過(guò)口服GLP-I來(lái)獲得藥理效果，必須設(shè)計(jì)一種通過(guò)氨基酸置換使其難以被胰蛋白酶或二肽酰肽酶IV分解、具有持續(xù)性活性的GLP-I衍生物。因此，本發(fā)明的另一目的在于提供對(duì)胰蛋白酶等消化酶具有抗性的可口服的新 型GLP-I衍生物，進(jìn)一步優(yōu)選同時(shí)對(duì)二肽酰肽酶IV具有抗性的新型GLP-I衍生物。由此即 可獲得在作為食物攝取時(shí)可被吸收、顯示藥理效果的GLP-I衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物中高產(chǎn)重組蛋白的貯藏器官的生產(chǎn)方法進(jìn)行了深入地 研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)構(gòu)建一種載體，將該載體導(dǎo)入細(xì)胞中，由該導(dǎo)入有基因的植物的細(xì)胞 再分化成轉(zhuǎn)化體，由該再分化的轉(zhuǎn)化體獲得貯藏器官，由此可以在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)高產(chǎn) 重組蛋白的貯藏器官，從而完成了本發(fā)明，其中所述載體含有在植物的貯藏器官中表達(dá)的 重組蛋白的基因、細(xì)胞分裂素相關(guān)基因、抗藥性基因和具有脫離能力的DNA因子，且細(xì)胞分 裂素相關(guān)基因和抗藥性基因存在于可與具有脫離能力的DNA因子聯(lián)動(dòng)的位置，在植物的貯 藏器官中表達(dá)的重組蛋白的基因存在于與具有脫離能力的DNA因子不聯(lián)動(dòng)的位置。本發(fā)明還將該高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法應(yīng)用于已知的刺激糖依 賴(lài)性胰島素分泌的激素，GLP-I，制備該GLP-I的衍生物，由此提供不會(huì)被消化酶等消化、分 解，并且在血漿中穩(wěn)定的GLP-I衍生物。即，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在含有GLP-I (7-36)或者在其 氨基酸序列的基礎(chǔ)上有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換和/或附加的序列、且具有GLP-I活性 的肽中、第26位被置換為谷胺酰胺、第34位被置換為天冬酰胺或天冬氨酸的GLP-I衍生物 可保持與天然型GLP-I同等程度的活性，對(duì)胰蛋白酶等消化酶具有抗性，可由小腸吸收。還 發(fā)現(xiàn)再通過(guò)將第8位的丙氨酸變更為絲氨酸或甘氨酸，還可獲得對(duì)二肽酰肽酶IV的抗性， 在血漿中穩(wěn)定，從而完成了本發(fā)明。另外，以往講肽口服給藥時(shí)，在胃中會(huì)被胰蛋白酶分解， 因此肽是不可以口服的。但是，本發(fā)明由植物貯藏器官生產(chǎn)，因此可獲得胰蛋白酶抗性，可 以口服給藥。附圖簡(jiǎn)述

圖1是表示本發(fā)明的實(shí)施例中，在制備pGlbGLP130Hm的方案中，由pTL7到 PGlbGLP的制備過(guò)程的圖。圖2是表示本發(fā)明的實(shí)施例中，在制備pGlbGLP130Hm的方案中，由pUC18和 PNPI130到pNPI130PUC的制備過(guò)程的圖。圖3是表示本發(fā)明的實(shí)施例中，在制備pGlbGLP130Hm的方案中，由pNPI140和 PNPI130PUC到pNPI130Hm的制備過(guò)程的圖。圖4是本發(fā)明的實(shí)施例中，表示由pGlbGLP和pNPI 130Hm到pGlbGLP130Hm的制備， 同時(shí)表示pGlbGLP130Hm的限制酶切圖譜的圖。圖5是表示本發(fā)明的實(shí)施例中，由實(shí)施例1和比較例1得到的水稻成熟種子中 GLP-I衍生物融合蛋白的蓄積水平的圖。圖6是表示本發(fā)明的實(shí)施例中，以往的載體pGlbGLP-Hm的限制酶切圖譜的圖。圖7是表示本發(fā)明的實(shí)施例中，根據(jù)實(shí)施例2所示的方法，測(cè)定比較制備例1的 GLP-I (7-36酰胺)(天然型GLP-1)、比較制備例2的[Ser8J-GLP-I (7-36酰胺)、比較制備 例 3 的[Gly8] -GLP-I (7-36 酰胺)、和制備例 1 的[Gln26jAsn34] -GLP-I (7-36 酰胺)的環(huán) AMP 產(chǎn)生活性的結(jié)果的圖。
圖8是本發(fā)明的實(shí)施例中，根據(jù)實(shí)施例3所示的方法，將[Gln26， Asn34J-GLP-I (7-36酰胺)進(jìn)行胰蛋白酶處理，對(duì)經(jīng)胰蛋白酶處理的和未經(jīng)處理的情況下比 較環(huán)AMP產(chǎn)生活性的濃度依賴(lài)性的圖。圖9是本發(fā)明的實(shí)施例中，根據(jù)實(shí)施例4所示的方法，使用來(lái)自由實(shí)施例1得 到的水稻成熟種子的白米及其粉末的GLP-I衍生物、比較制備例1的GLP-I (7-36酰胺) (天然型 GLP-1)、制備例 2 的[Ser8，Gln26, Asp34]-GLP-I (7-36)、制備例 3 的[Ser8，Gln26, Asn34J-GLP-I (7_36)，進(jìn)行對(duì)胰蛋白酶的穩(wěn)定性比較的圖。圖10是表示本發(fā)明的實(shí)施例中，根據(jù)實(shí)施例5所示的方法，由水稻成熟種子提取 融合蛋白[Ser8，Gln26，Asp34]-GLP-I (7_36)，該提取組分的胰蛋白酶處理時(shí)間與環(huán)AMP產(chǎn)生 活性的關(guān)系的圖。圖11是本發(fā)明的實(shí)施例中，根據(jù)實(shí)施例6所示的方法，使用比較制備例1的 GLP-I (7-36 酰胺)(天然型 GLP-1)、制備例 2 的[Ser8，Gln26, Asp34]-GLP-I (7-36)、制備例 3的[Ser8，Gln26，Asn34]-GLP-I (7-36)進(jìn)行胰蛋白酶抗性的比較的圖。圖12是本發(fā)明的實(shí)施例中，根據(jù)實(shí)施例7所示的方法，使用比較制備例1的 GLP-I (7-36 酰胺)(天然型 GLP-1)、制備例 2 的[Ser8，Gln26, Asp34]-GLP-I (7-36)、制備例 3 的[Ser8, Gln26, Asn34J-GLP-I (7-36)進(jìn)行 DPP-IV 抗性的比較的圖。圖13是本發(fā)明的實(shí)施例中，根據(jù)實(shí)施例8所示的方法，使用比較制備例1的 GLP-I (7-36 酰胺)(天然型 GLP-1)、制備例 2 的[Ser8，Gln26, Asp34]-GLP-I (7-36)、制備例 3的[Ser8，Gln26，Asn34]-GLP-I (7-36)進(jìn)行胰島素分泌促進(jìn)活性比較的圖。圖14是本發(fā)明的實(shí)施例中，根據(jù)實(shí)施例9所示的方法，在使用比較制備例1的 GLP-I (7-36 酰胺)(天然型 GLP-1)、制備例 2 的[Ser8，Gln26, Asp34]-GLP-I (7-36)、制備例 3的[Ser8，Gln26，Asn34]-GLP-I (7-36)進(jìn)行小鼠經(jīng)口糖負(fù)荷試驗(yàn)中降血糖效果比較的圖中， 以圖15中0至120分鐘血糖值變動(dòng)圖表曲線(xiàn)下面積表示血糖值變化量。圖15是本發(fā)明的實(shí)施例中，根據(jù)實(shí)施例9所示的方法，在使用比較制備例1的 GLP-I (7-36 酰胺)(天然型 GLP-1)、制備例 2 的[Ser8，Gln26, Asp34]-GLP-I (7-36)、制備例 3的[Ser8，Gln26，Asn34]-GLP-I (7-36)進(jìn)行小鼠經(jīng)口糖負(fù)荷試驗(yàn)中降血糖效果比較的圖中， 表示0至120分鐘血糖值隨時(shí)間的變化。天然型=GLPl (7-36酰胺)；34N:[Ser8, Gln26, Asn34]-GLP-1 (7-36) ；34D :[Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-1 (7-36) ；5 5yg/kg 皮下施用； 20 ZOyg/kg皮下施用。實(shí)施發(fā)明的最佳方式[高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)]本發(fā)明是高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，包含以下步驟(A)構(gòu)建一 種載體，將該載體導(dǎo)入細(xì)胞中的步驟，其中所述載體含有在植物的貯藏器官中表達(dá)的重組 蛋白的基因、細(xì)胞分裂素相關(guān)基因、抗藥性基因和具有脫離能力的DNA因子，且細(xì)胞分裂素 相關(guān)基因和抗藥性基因存在于與具有脫離機(jī)能的DNA因子聯(lián)動(dòng)的位置，在植物貯藏器官中 表達(dá)的重組蛋白的基因存在于與具有脫離機(jī)能的DNA因子不聯(lián)動(dòng)的位置；(B)將通過(guò)上述 (A)導(dǎo)入了載體的植物細(xì)胞在添加藥物的培養(yǎng)基和不添加藥物的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，由此 再分化為轉(zhuǎn)化體的步驟；(C)從通過(guò)上述(B)再分化的轉(zhuǎn)化體中獲得植物貯藏器官的步驟。 以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
(對(duì)象植物)本發(fā)明中用于植物貯藏器官的生產(chǎn)的對(duì)象植物只要可形成貯藏器官即可，并沒(méi)有 特別限定，雙子葉植物的代表性例子有煙草、菜籽、大豆等，單子葉植物的代表性例子有 水稻、玉米、大麥、小麥等谷類(lèi)或蘆筍等。另外，本發(fā)明中對(duì)高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官并 沒(méi)有特別限定，代表性的有果實(shí)、塊根、塊莖、種子等。(所使用的基因)本發(fā)明所使用的基因可通過(guò)cDNA或基因組DNA的克隆獲得。另外，如果預(yù)先知道 該DNA序列，則也可以化學(xué)合成。即使不清楚DNA序列，如果知道氨基酸序列，也可以化學(xué) 合成由氨基酸序列推定的DNA序列。本發(fā)明中，基因可以根據(jù)需要將表達(dá)所必需的啟動(dòng)子和/或終止子的序列、還有 使基因產(chǎn)物高效輸送到貯藏器官的信號(hào)序列連接使用。這些啟動(dòng)子、終止子和信號(hào)序列只 要可在植物中發(fā)揮功能即可，可以沒(méi)有特別限制地使用。例如，可以使用花椰菜花葉病毒的 35S啟動(dòng)子(J.T. Odell等.，Nature (London)，313，810，1985)、胭脂氨酸合成酶的啟動(dòng)子 (W. H. R. Langridge 等.，Plant Cell Rep. ,4,355,1985)等作為所述啟動(dòng)子。并且，如果使 用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，還可以控制基因表達(dá)。所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子目前有很多是已知的。例如與化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)而誘導(dǎo)的啟動(dòng) 子有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶I系基因的啟動(dòng)子(日本特開(kāi)平5-268965號(hào)公報(bào))、谷胱甘 肽-S-轉(zhuǎn)移酶II系基因的啟動(dòng)子(國(guó)際公開(kāi)W093/01294號(hào)公報(bào)),Tet阻抑物融合型花椰 菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(C. Gatz等.，Mol. Gen. Genet.，227，229，1991)、Lac操縱子/阻抑物 系啟動(dòng)子(R. J.Wilde 等.，The EMBO Journal，11，1251，1992)、alcR/alcA 系啟動(dòng)子(國(guó)際 公開(kāi)W094/03619號(hào)公報(bào))、糖皮質(zhì)激素系啟動(dòng)子(青山卓史、蛋白核酸酶、41 =2559,1996), par 系啟動(dòng)子(T. Sakai 等.，Plant CellPhysiol.，37，906，1996)等，在光條件下反應(yīng)而 誘導(dǎo)的有二磷酸核酮糖羧化酶小亞基基因(rbcS)的啟動(dòng)子(R.Fluhr等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，83，2358，1986)、果糖-1,6- 二磷酸酶基因的啟動(dòng)子(日本特表平7-501921 號(hào)公報(bào))、捕光性葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因的啟動(dòng)子(日本特開(kāi)平5-89號(hào)公報(bào))等，其它在 傷害、溫度等各種外部環(huán)境等下反應(yīng)而誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。如上所述，本發(fā)明的重組蛋白基因的啟動(dòng)子可以使用35S啟動(dòng)子等組成型表達(dá)的 啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，特別優(yōu)選可保證在生產(chǎn)重組蛋白基因的植物貯藏器官中表達(dá)的該 植物貯藏器官特異性啟動(dòng)子。這樣的在植物的特定組織或器官中促進(jìn)特異性表達(dá)的啟動(dòng)子 也是本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛已知的。例如，本發(fā)明中，所述啟動(dòng)子可以使用在水稻種子中使外 源基因表達(dá)的種子貯藏蛋白基因的啟動(dòng)子——球蛋白基因的啟動(dòng)子(M. Nakase等.，Plant Mol. Biol. ,33,513,1997)、谷蛋白基因的啟動(dòng)子(F. Takaiwa 等·，Plant Mol. Biol.，17， 875，1991)等。還可以使用在菜豆、蠶豆、豌豆等豆科作物，花生、芝麻、菜籽、棉籽、葵花籽、 紅花籽等糧油種子作物的種子中使外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子——大豆球蛋白基因的啟動(dòng)子、 夕7 工'J > 基因的啟動(dòng)子(J.Rodin 等.，Plant Mol. Biol.，20，559，1992)等各作物的 主要種子貯藏蛋白基因的啟動(dòng)子。另一方面，本發(fā)明中，終止子可以以胭脂氨酸合成酶的終止子(A. D印icker等.、 J. Mol. Appl. Gen.，1，561，1982)、章魚(yú)氨酸合成酶的終止子(J. Gielen 等·，EMBO J.，3， 835，1984)為代表，從DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的植物基因的終止子等中選擇使用。
本發(fā)明中，可導(dǎo)入植物的重組蛋白基因不僅是編碼對(duì)人或家畜等動(dòng)物的健康有 作用的功能性肽、藥物肽等的基因，也可以是編碼功能未知的任意的肽或蛋白的基因。例 如，本發(fā)明的實(shí)施例中就是將編碼GLP-I衍生物的基因?qū)胫参镏?，在植物的種子中生產(chǎn) GLP-I衍生物，可根據(jù)本發(fā)明的方法在植物的貯藏器官中生產(chǎn)的重組蛋白不僅限于GLP-I 或其衍生物，包括已經(jīng)作為藥物使用或開(kāi)發(fā)的各種肽或蛋白(S. Jowphson and R. Bishop， TIBTECH，6，218，1988)在內(nèi)，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的低膽固醇肽(例如日本特開(kāi)2001-114800號(hào)公 報(bào))、螨塵或花粉抗原的T細(xì)胞表位肽(例如美國(guó)專(zhuān)利6268491號(hào)、日本特開(kāi)平10-7700號(hào) 公報(bào)、日本特開(kāi)平10-259198號(hào)公報(bào)、日本特開(kāi)平10-506877號(hào)公報(bào)、日本特開(kāi)平11-9M97 號(hào)公報(bào)、日本特開(kāi)2000-327699號(hào)公報(bào))等各種肽或蛋白都可通過(guò)本發(fā)明的方法在植物貯 藏器官生產(chǎn)?？梢愿鶕?jù)其性質(zhì)和目的生產(chǎn)經(jīng)適當(dāng)修飾的上述肽。即，以GLP-I為例，除GLP-I 之外，本發(fā)明還可適用于含有GLP-I (7-36)或在其氨基酸序列的基礎(chǔ)上有1或多個(gè)氨基酸 缺失、置換和/或附加的序列、且具有GLP-I活性的肽，或者具有該肽的第沈位被谷氨酰 胺、第34位被天冬酰胺或天冬氨酸置換的氨基酸序列的GLP-I衍生物。本發(fā)明中，含有 GLP-I (7-36)或者在其氨基酸序列的基礎(chǔ)上有1或多個(gè)氨基酸缺失、置換和/或附加的序 列、且具有GLP-I活性的肽也適合為GLP-I (7-36)、GLP-I (7-37)或它們的C末端為酰胺化 物的GLP-I衍生物。本發(fā)明也適合將這些GLP-衍生物的第8位置換為絲氨酸或甘氨酸的 GLP-I衍生物和SEQ ID NO. 2的GLP-I衍生物。(導(dǎo)入的重組蛋白基因的構(gòu)建)本發(fā)明中，可以使用一種融合基因，該融合基因是通過(guò)將編碼這些重組蛋白的基 因(DNA序列)插入或置換到編碼原本在植物貯藏器官中表達(dá)的蛋白，例如種子貯藏蛋白， 的基因中編碼可變區(qū)的基因序列內(nèi)，其中所述植物貯藏器官是要通過(guò)本發(fā)明的方法高產(chǎn)重 組蛋白的貯藏器官，所述編碼區(qū)不會(huì)對(duì)原本在植物貯藏器官中表達(dá)的蛋白的蓄積量等不 會(huì)因此受到不良影響。例如實(shí)施例中，將編碼上述GLP-I衍生物的基因插入球蛋白基因中 編碼蛋白可變區(qū)的位置，形成融合基因使用。另外，此時(shí)，通過(guò)在重組蛋白基因和插入或置 換了該基因的、原本在植物貯藏器官中表達(dá)的貯藏蛋白基因的交界處設(shè)置酶切序列，可以 在提取所述融合基因的表達(dá)產(chǎn)物后，通過(guò)酶處理，切取目標(biāo)重組蛋白并純化。如果將要用胰 蛋白酶等消化酶處理的酶切序列設(shè)置于此，則在通過(guò)飲食攝取要由本發(fā)明的方法高產(chǎn)重組 蛋白的種子等植物貯藏器官后，目標(biāo)肽或蛋白在小腸中被切取，被體內(nèi)吸收，發(fā)揮各種生理 機(jī)能。種子貯藏蛋白是主要貯藏在種子中的蛋白，作為發(fā)芽所必需的營(yíng)養(yǎng)元素而發(fā)揮著 重要的作用(稻學(xué)大成第3卷、農(nóng)山漁村文化協(xié)會(huì))?？稍诒景l(fā)明中使用的種子貯藏蛋白基 因的種類(lèi)沒(méi)有特別限定，例如可以使用水稻球蛋白、谷蛋白、谷醇溶蛋白、擬南芥的2S白蛋 白(日本特開(kāi)2000-106890號(hào)公報(bào))等基因。重組蛋白基因的插入位置只要是不使原本種 子貯藏蛋白基因所編碼的蛋白的特性發(fā)生變化的可變區(qū)即可，并沒(méi)有特別限定。例如，本發(fā) 明的實(shí)施例中，是將編碼GLP-I衍生物的基因插入編碼水稻球蛋白第109號(hào)氨基酸部位的 位置。(導(dǎo)入載體的構(gòu)建)本發(fā)明中，通過(guò)構(gòu)建一種載體，對(duì)植物進(jìn)行基因?qū)搿Ｋ鲚d體中細(xì)胞分裂素相關(guān)基因和抗藥基因存在于與具有脫離能力的DNA因子聯(lián)動(dòng)的位置，并且上述重組蛋白基因存 在于與它們的不聯(lián)動(dòng)的位置上。這里，細(xì)胞分裂素相關(guān)基因是指具有促進(jìn)植物中細(xì)胞分裂或引起由植物的組織分 化定芽或不定芽等的功能、與細(xì)胞分裂素的生成等相關(guān)的基因。關(guān)于所述細(xì)胞分裂素相關(guān)基因，本發(fā)明中例如可以使用來(lái)自根癌農(nóng)桿菌的ipt基 因(A. C. Smigocki、L. D. Owens，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85，5131，1988)、來(lái)自紅球菌的 ipt基因、來(lái)自擬南芥的細(xì)胞分裂素合成酶基因、來(lái)自假單胞菌的ptz基因等的細(xì)胞分裂素 合成基因，除此之外，還有使惰性細(xì)胞分裂素活化的基因——來(lái)自大腸桿菌的葡糖醛 酸糖苷酶基因(Morten Joersbo and Finn Τ. Okkels, Plant Cell Reports 16,219-221, 1996)、被認(rèn)為是細(xì)胞分裂素受體基因的來(lái)自擬南芥的CKIl基因(Kakimoto T. Science 274,982-985,1996)等細(xì)胞分裂素相關(guān)基因的任意一種。本發(fā)明中，抗藥性基因是指使導(dǎo)入該基因的植物細(xì)胞具有抗生素抗性和農(nóng)藥抗性 的基因。所述抗生素抗性基因例如可以使用潮霉素抗性基因(HPT 潮霉素磷酸化酶基因)、 卡那霉素抗性基因(NPTII 新霉素磷酸化酶基因)等，農(nóng)藥抗性基因可以使用磺酰脲系抗 性基因(ALS 乙酰乳酸合成酶基因)等。具有脫離能力的DNA因子是指本身具有可從它們所存在并發(fā)揮功能的染色體DNA 等中脫離的能力的DNA序列。植物中，這樣的因子已知有存在于染色體DNA中的被稱(chēng)為轉(zhuǎn) 座子的因子，其結(jié)構(gòu)和功能以及其動(dòng)態(tài)已基本研究清楚。即，原則上轉(zhuǎn)座子發(fā)揮功能必須具 備兩個(gè)構(gòu)成要素，即由位于其內(nèi)部的基因表達(dá)、催化其本身的脫離或轉(zhuǎn)移的酶(轉(zhuǎn)移酶)， 以及也是存在于其內(nèi)部的末端區(qū)、該轉(zhuǎn)移酶與之結(jié)合并作用的DNA序列。通過(guò)這些功能，轉(zhuǎn) 座子由其所存在的染色體DNA上脫離，然后通常轉(zhuǎn)移至DNA上新的位置，但也有一定的概率 是不轉(zhuǎn)移而直接失去功能、消失等，因此，本發(fā)明就是利用這樣的轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移錯(cuò)誤。轉(zhuǎn)座子有所述自主性轉(zhuǎn)座子、即保持轉(zhuǎn)移酶和DNA結(jié)合序列兩個(gè)要素，由轉(zhuǎn)座子 內(nèi)部表達(dá)的轉(zhuǎn)移酶與存在于末端區(qū)的DNA序列結(jié)合并作用，由此可自主地從其存在的染色 體上脫離并轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)座子，除此之外，也有被稱(chēng)為非自主性轉(zhuǎn)座子的形式。該非自主性轉(zhuǎn) 座子是指雖然保持有轉(zhuǎn)移酶與之結(jié)合并作用的末端DNA序列，但內(nèi)部的轉(zhuǎn)移酶基因發(fā)生突 變，轉(zhuǎn)移酶不表達(dá)，因此不能自主地從染色體上脫離的轉(zhuǎn)座子。不過(guò)，如果由自主性轉(zhuǎn)座子 或者獨(dú)立存在的轉(zhuǎn)移酶基因提供轉(zhuǎn)移酶，則非自主性轉(zhuǎn)座子與自主性轉(zhuǎn)座子顯示同樣的動(dòng) 態(tài)。自主性轉(zhuǎn)座子有由玉米分離出的Ac和Spm等(A. Gieri and H. Saedler, Plant Mol. Biol.，19，39，1992)。尤其Ac，可用限制酶Sau3A從玉米染色體中切取wx_m7基因座 而獲得(U. Behrens等·，Mol. Gen. Genet. 194，346，1984)，是植物轉(zhuǎn)座子中對(duì)其的分析最有 進(jìn)展的自主性轉(zhuǎn)座子，其DNA序列也得到闡明(M. Muller-Neumann等·，Mol. Gen. Genet.， 198，19，1984)，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地獲得，適合作為本發(fā)明所使用的DNA因子。 另外，非自主性轉(zhuǎn)座子分別是Ac、Spm的內(nèi)部區(qū)域有缺失的因子，以Ds、dSpm為代表(H. -P. Doring and P. Starlinger, Ann. Rev. Genet. 20，175，1986)，除玉米之外，還已知從金魚(yú)草、 牽牛等很多植物中分離得到(例如Y. Inagaki等.，Plant Cell，6，375，1994).由很多例子得知，這些轉(zhuǎn)座子在被導(dǎo)入到與其來(lái)源植物不同的種類(lèi)植物的染色體 中時(shí)，可以發(fā)揮其能力進(jìn)行脫離、轉(zhuǎn)移(例如B. Baker等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,4844,1986)。本發(fā)明中，使用自主性、非自主性轉(zhuǎn)座子均可。使用非自主性轉(zhuǎn)座子時(shí)，還需 要將由自主性轉(zhuǎn)座子等中獲得或合成的轉(zhuǎn)移酶基因?qū)肫渲?，這種情況下，可以將其與該 非自主性轉(zhuǎn)座子一起共同整合導(dǎo)入到本發(fā)明的載體中，也可以完全分別地導(dǎo)入。已知存在于植物以外的具有脫離能力的DNA因子有來(lái)自位點(diǎn)特異性重組體系的 因子。該位點(diǎn)特異性重組體系包含以下兩個(gè)要素具有特征性DNA序列的重組位點(diǎn)(相當(dāng) 于本發(fā)明的具有脫離能力的DNA因子)，以及與該DNA序列特異性結(jié)合、當(dāng)存在2個(gè)或以上 該序列時(shí)催化其序列間重組的酶；該DNA序列在同一 DNA分子上朝同一方向以一定的間隔 存在于兩處位置時(shí)，夾在它們之間的區(qū)從該DNA分子(質(zhì)粒、染色體)上脫離；該序列朝相 對(duì)的方向存在于兩處位置時(shí)，該區(qū)域顯示反轉(zhuǎn)的動(dòng)態(tài)。本發(fā)明是利用該前者的脫離作用。 已知編碼重組酶的基因無(wú)需存在于與重組位點(diǎn)相同的DNA分子上，只要存在于與其相同的 細(xì)胞中并表達(dá)，即可發(fā)生該DNA序列間的脫離、反轉(zhuǎn)(N. L. Craig, Annu. Rev. Genet.，22，77， 1988)。目前，位點(diǎn)特異性重組體系已知有從噬菌體、細(xì)菌(例如大腸桿菌)、酵母等微生 Cre/lox R/RS FLP eer fim % (N. L. Craig, Annu. Rev. Genet. ,22,
17,1988中有概述)，但在高等生物中尚未知其存在。不過(guò)正如國(guó)際公開(kāi)W093/01283號(hào)公 報(bào)中的來(lái)自Pl噬菌體的Cre/lox系用作導(dǎo)入植物的基因?qū)胼d體那樣，由上述微生物分離 的位點(diǎn)特異性重組體系在導(dǎo)入植物等與其來(lái)源生物種類(lèi)不同的生物種類(lèi)時(shí)，也可獲得與其 原本的生物體內(nèi)的舉動(dòng)相同的舉動(dòng)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將重組酶插入酵母(接合酵 母)的位點(diǎn)特異性重組體系 R/RS 系(H. Matsuzaki 等.，J. Bacteriology, 172，610，1990) 的重組位點(diǎn)之間來(lái)應(yīng)用，已有報(bào)告指出該R/RS系在高等植物中也可保持其本來(lái)的功能 (H. Onouchi 等·，Nucleic Acid Res.，19，6373，1991)。本發(fā)明中，插入細(xì)胞分裂素相關(guān)基因和抗藥基因的位置只要是與具有脫離能力的 DNA因子一起，使其可脫離的位置即可。例如使用自主性轉(zhuǎn)座子作為具有脫離能力的DNA因 子時(shí)，可以將其插入到轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子區(qū)上游、該轉(zhuǎn)移酶基因所結(jié)合的末端區(qū)的下游 的不影響轉(zhuǎn)座子脫離的位置。使用R/RS系時(shí)，任何在被重組位點(diǎn)夾持的區(qū)域內(nèi)，且不阻礙 重組酶的表達(dá)的位置均可插入。(構(gòu)建的載體向植物細(xì)胞的導(dǎo)入)本發(fā)明中，將這樣構(gòu)建的載體導(dǎo)入植物細(xì)胞。如上述(對(duì)象植物)項(xiàng)所述，導(dǎo)入該 載體的植物只要是形成貯藏器官的植物即可，沒(méi)有特別限定，例如如果是單子葉植物，則有 以水稻、玉米、大麥、小麥等谷類(lèi)或蘆筍等為代表的植物，如果是雙子葉植物，則有以煙草、 菜籽、大豆等為代表的植物。構(gòu)建的載體向植物細(xì)胞的導(dǎo)入也可以使用公知的方法進(jìn)行。例 如除經(jīng)由農(nóng)桿菌屬細(xì)菌的方法之外，還可以使用電穿孔法、聚乙二醇法、基因槍法等公知的 任意方法，但并不限于此。例如，使用本發(fā)明的方法向水稻中導(dǎo)入重組蛋白基因時(shí)，可以?xún)?yōu)選使用日本特許 第3141084號(hào)公報(bào)所記載的方法。此時(shí)，播種水稻種子并使其發(fā)芽的播種培養(yǎng)基例如可使 用 N6C12 培養(yǎng)基(N6 無(wú)機(jī)鹽類(lèi)以及維生素類(lèi)(Chu C. C.，1978，Proc. Symp.，Plant Tissue Culture, SiencePress Peking, pp. 43-50)、30g/L 蔗糖、2. 8g/L 脯氨酸、0. 3g/L 酪蛋白氨基 酸、lmg/L 2，4-D、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠)等。但是，對(duì)上述培養(yǎng)基組成并沒(méi)有特別限定，可 以通過(guò)改變其組成物的種類(lèi)、濃度來(lái)實(shí)施本發(fā)明。
(轉(zhuǎn)化體的再分化)由導(dǎo)入了重組蛋白基因的植物細(xì)胞或組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的再分化時(shí)，可以將基因?qū)?入處理后的細(xì)胞或組織在添加藥物的培養(yǎng)基和不添加藥物的培養(yǎng)基中，采用公知的方法進(jìn) 行培養(yǎng)。本發(fā)明中，轉(zhuǎn)化體是指定芽、不定芽、不定根等植物組織或小植株。例如，根據(jù)本發(fā)明，將重組蛋白基因?qū)胨静@得轉(zhuǎn)化體時(shí)，如上所述，使用構(gòu) 建的載體，根據(jù)日本特許第3141084號(hào)公報(bào)記載的方法進(jìn)行基因?qū)胩幚?，由處理后發(fā)芽 的種子切取水稻盾片組織，將該盾片組織例如在添加藥物的培養(yǎng)基N6C12TCH25培養(yǎng)基 (N6無(wú)機(jī)鹽類(lèi)和維生素類(lèi)、30g/L蔗糖、2. 8g/L脯氨酸、0. 3g/L酪蛋白氨基酸、2mg/L2，4-D、 500mg/L羧芐青霉素、25mg/L潮霉素、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠)培養(yǎng)1周，再在添加藥物的培 養(yǎng)基N6C14TCH25培養(yǎng)基(N6無(wú)機(jī)鹽類(lèi)和維生素類(lèi)、30g/L蔗糖、2. 8g/L脯氨酸、0. 3g/L酪 蛋白氨基酸、細(xì)g/L2，4-D、500mg/L羧芐青霉素、25mg/L潮霉素、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠)培 養(yǎng)1周，再用未添加藥物的培養(yǎng)基MSRC培養(yǎng)基(MS無(wú)機(jī)鹽類(lèi)和維生素類(lèi)(MurashigeJ. and Skoog，F(xiàn).，1962,Physiol. Plant.，15,473)、30g/L 蔗糖、30g/L 山梨醇、2g/L 酪蛋白氨基酸、 500mg/L羧芐青霉素、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠)中培養(yǎng)，可得到作為芽或小植株的轉(zhuǎn)化體。當(dāng) 然，上述例舉的培養(yǎng)條件不是絕對(duì)的，可以根據(jù)需要改變培養(yǎng)基的組成、濃度，或者添加各 種植物激素或藥物，改變培養(yǎng)時(shí)間。含藥物的培養(yǎng)基使用添加與抗藥性基因?qū)?yīng)的藥物的培養(yǎng)基，其中所述抗藥性基 因整合到如上構(gòu)建的用于基因?qū)氲妮d體中。例如將潮霉素抗性基因整合到該載體中時(shí)， 可以使用添加有潮霉素的培養(yǎng)基，將磺酰脲系抗性基因整合到該載體中時(shí)，可以使用添加 有磺酰脲系農(nóng)藥的培養(yǎng)基。(植物貯藏器官的獲得)本發(fā)明中，植物貯藏器官可以如下獲得如上述，由導(dǎo)入了重組蛋白基因的植物細(xì) 胞或組織再分化為轉(zhuǎn)化體，然后采用公知的方法培育該轉(zhuǎn)化體。例如，該轉(zhuǎn)化體為不定芽 時(shí)，可通過(guò)公知的方法進(jìn)行生根處理，再生植株，培育該植株，使其結(jié)籽，即可收獲高產(chǎn)重組 蛋白的植物成熟種子等貯藏器官。不定芽的生根可以采用在MS瓊脂培養(yǎng)基上插植不定芽 等方法進(jìn)行。另外，轉(zhuǎn)化體以小植株的形式獲得時(shí)，即使不進(jìn)行生根處理也可以得到轉(zhuǎn)基因 植物。并且利用塊根或塊莖等作為植物貯藏器官時(shí)，可以通過(guò)公知的方法，無(wú)須經(jīng)過(guò)植株的 再生過(guò)程，使這些組織分化，即可由所得轉(zhuǎn)化體獲得。(GLP-1 類(lèi)的生產(chǎn))本發(fā)明中，采用高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法提供GLP-I類(lèi)。已知 GLP-I是刺激糖依賴(lài)性胰島素分泌的激素，因此GLP-I (7-36)是具有His-Ala-Glu-Gly-Thr -Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly- Arg所示序列的肽。本發(fā)明中，將編碼該GLP-1 (7-36)氨基酸序列 的基因，或者編碼含有在GLP-I (7-36)氨基酸序列的基礎(chǔ)上有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換 和/或附加的序列、且具有GLP-I活性的肽的基因作為上述重組蛋白，整合到本發(fā)明中所構(gòu) 建的載體中，使該基因表達(dá)，生產(chǎn)GLP-I類(lèi)。(GLP-1 衍生物)如上所述，本發(fā)明提供GLP-I類(lèi)的生產(chǎn)方法，同時(shí)制備該GLP-I的衍生物，提供不 被消化酶等消化、分解，并且在血漿中穩(wěn)定的GLP-I的衍生物。本發(fā)明的衍生物是在含有GLP-I (7-36)或者在其氨基酸序列的基礎(chǔ)上有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換和/或附加的序 列、且具有GLP-I活性的肽中，第沈位被谷氨酰胺置換，第34位被天冬酰胺或天冬氨酸置 換，該GLP-I衍生物可保持與天然型GLP-I同等程度的胰島素分泌促進(jìn)活性，且對(duì)胰蛋白酶 等消化酶具有抗性，由此變?yōu)榭捎尚∧c吸收。進(jìn)一步通過(guò)將第8位的丙氨酸變更為絲氨酸 或甘氨酸，還可獲得對(duì)二肽酰肽酶IV的抗性，可變?yōu)樵谘獫{中也穩(wěn)定。S卩，本發(fā)明的GLP-I衍生物是在含有GLP-I (7-36)或者在其氨基酸序列的基礎(chǔ)上 有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換和/或附加的序列、且具有GLP-I活性的肽中、第沈位被 谷氨酰胺置換，第34位被天冬酰胺或天冬氨酸置換的產(chǎn)物，這里，含有GLP-I (7-36)或者 在其氨基酸序列的基礎(chǔ)上有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換和/或附加的序列、且具有GLP-I 活性的肽也包含GLP-I前體、類(lèi)似物、以及它們的C末端酰胺化物，優(yōu)選GLP-I (7-36)、 GLP-I (7-37)或它們的末端酰胺化物。特別優(yōu)選本發(fā)明的GLP-I衍生物將第8位置換成絲 氨酸或甘氨酸。二肽酰肽酶IV是識(shí)別多肽鏈由N末端開(kāi)始的第2個(gè)脯氨酸或丙氨酸，并水 解其羧基一側(cè)的酶。這里，優(yōu)選本發(fā)明的GLP-I衍生物將第8位的丙氨酸變更為絲氨酸或 甘氨酸。該第8位置換物可保持與天然型GLP-I同等程度的活性，在血漿中也穩(wěn)定。如上所述，本發(fā)明所使用的GLP-I (7-36)是具有以下的氨基酸序列的肽=His-Ala -Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg,第 8 位改變?yōu)榻z氨酸的[Ser8]表示第 2 個(gè)(相 當(dāng)于第8位)的Ala變換為義！·。本發(fā)明的GLP-I衍生物可以通過(guò)化學(xué)合成或基因重組技 術(shù)制備。即，多肽的化學(xué)合成原理是本領(lǐng)域所周知的，可將以下的本領(lǐng)域的常規(guī)教材作為 參考Dugas H.禾口 Penney C, Bioorganic Chemistry, 1981, Springer-Verlag, New York, pp. 54-92、Merrifields JM, Chem. Soc，85，2149，1962、Stewart 禾口 Young， Solid Phase Peptide Synthesis, pp. 24-66，F(xiàn)reeman (San Francisco, 1969)。例如可使用 430A 肽合成 儀(PE-Applied Biosystems Inc，850 Lincoln Center Drive, Foster City CA94404)禾口 由PE-Applied Biosystems提供的循環(huán)合成儀，通過(guò)固相方法合成本發(fā)明的肽。Boc氨基酸 及其它試劑可由PE-Applied Biosystems以及其它試劑供應(yīng)商購(gòu)買(mǎi)。通過(guò)基因重組技術(shù)進(jìn)行的本發(fā)明的GLP-I衍生物的生產(chǎn)可以全合成GLP-I衍生物 的DNA、或使用編碼更大的天然胰高血糖素的DNA經(jīng)修飾得到的基因進(jìn)行。合成基因的構(gòu)建 方法是本領(lǐng)域所周知的，可參照Brown等著的Methods in Enzymology, Academic Press, NY,第 68 卷 109-151 頁(yè)。對(duì)于本發(fā)明的GLP-I衍生物的生產(chǎn)所使用的DNA，除上述之外，還可以在提高表達(dá) 量、使產(chǎn)物在宿主內(nèi)穩(wěn)定蓄積方面，在生產(chǎn)后容易純化方面，或者在生產(chǎn)融合蛋白并容易地 切取GLP-I衍生物等方面多加考慮。例如，與β-半乳糖苷酶、β-內(nèi)酰胺酶、A蛋白、TrpE 等蛋白的基因連接，生產(chǎn)融合蛋白的方法就是其中之一。這些情況下，例如生產(chǎn)后為了以單 體的形式獲得GLP-I衍生物，可以在各基因之間加入與氨基酸的甲硫氨酸對(duì)應(yīng)的基因，進(jìn) 行溴化氰處理。此時(shí)，C末端為Hse (高絲氨酸)。本發(fā)明中有的GLP-I衍生物中，只在C末 端具有精氨酸，通過(guò)精氨酰內(nèi)肽酶的酶處理，可得到GLP-I衍生物的單體。編碼上述GLP-I衍生物的基因可以通過(guò)公知的基因工程技術(shù)導(dǎo)入植物以外的細(xì) 胞中表達(dá)，由此可生產(chǎn)GLP-I衍生物。這種情況下，使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切核酸酶，將編碼GLP-I衍生物的基因插入適當(dāng)?shù)闹亟MDNA表達(dá)載體。構(gòu)建了 GLP-I衍生物的表達(dá)載體 后，使用該載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。宿主細(xì)胞可以使用真核細(xì)胞或原核細(xì)胞的任意細(xì) 胞。載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域所周知的，通常可參照Molecular Cloning ； A Laboratory Manual, Cold Springs HarborLaboratory Press, NY, Vol. 1-3,1989。此 時(shí)，為實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的有效的轉(zhuǎn)錄，可以將其與啟動(dòng)子-操縱子區(qū)功能性結(jié)合。可在原核 細(xì)胞和真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化中使用的各種表達(dá)載體是周知的，可參照！"he PromegaBiological Research Products Catalogue禾口The Stratagene CloningSystems Catalogue。本發(fā)明的 GLP-I衍生物的生產(chǎn)可以利用以廣泛采用的微生物和哺乳類(lèi)培養(yǎng)細(xì)胞為宿主的物質(zhì)生產(chǎn)系 統(tǒng)。另外，也可以利用采用上述的轉(zhuǎn)基因植物的物質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)作為價(jià)廉、安全的物質(zhì)生產(chǎn)系 統(tǒng)。[本發(fā)明的GLP-I衍生物的利用]本發(fā)明所生產(chǎn)的GLP-I衍生物可以以植物種子等貯藏器官的形式，或者純化、分 離制成制劑的形式，或者以添加該成分的飲料食品的形式攝取并利用。以制劑的形式利用 時(shí)，可以將含有GLP-I衍生物的成分與制劑可接受的載體、稀釋劑、賦型劑或吸收促進(jìn)劑組 合，制成制劑，用作藥物組合物。本發(fā)明的GLP-I衍生物對(duì)于與GLP-I有關(guān)的各種疾病有效， 例如，可用于胰島素非依賴(lài)性慢性糖尿病的處置、胰島素依賴(lài)性慢性糖尿病的處置、肥胖的 處置或者抑制食欲。
(實(shí)施例)以下給出實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明。但本發(fā)明并不受下述事實(shí)例的限定。以下的 實(shí)施例中，如無(wú)特別說(shuō)明，更詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)操作均根據(jù)分子生物學(xué)的方法，按照Molecular Cloning (Sambrook等.，1989)或制造商的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。[實(shí)施例1]I.質(zhì)粒 pGlbGLP130Hm 的制備將用限制酶EcoRI和ke 83871切取的水稻球蛋白啟動(dòng)子、SEQ IDN0. 1所示 的編碼[Ser8、Gin26、Asp34]-GLP-I (7-36酰胺)的基因插入到可變區(qū)(第109號(hào)氨基酸 部位)得到的水稻球蛋白基因、以及胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化信號(hào)所連接的基因片段 插入至Ij pTL7 (H. Ebinuma 等· ，Molecular Methods of Plant Analysis, 22 :95,2002)的 EcoRI-Sse8387I限制酶切位點(diǎn)之間，得到質(zhì)粒pGlbGLP。如SEQ ID N0. 2所示，[Ser8Xln26, Asp34I-GLP-I (7-36)是含有GLP-I的7_36號(hào)的氨基酸，其中第8位被絲氨酸置換，第沈位 被谷氨酰胺置換，第34位被天冬酰胺置換的衍生物，插入到水稻球蛋白基因中時(shí)，其N(xiāo)末端 一側(cè)附加有賴(lài)氨酸殘基(AAG)。另一方面，用限制酶KpnI酶切質(zhì)粒pUC18的KpnI限制酶切位點(diǎn)，通過(guò)T4聚合酶 形成平滑末端，然后再結(jié)合，得到質(zhì)粒PUC18 Δ kpnl。用限制酶ke8387I從質(zhì)粒pNPI 130 (日 本特開(kāi)平9-154580號(hào)公報(bào))酶切酵母的位點(diǎn)特異性重組體系的重組序列Rs所夾持的區(qū) 域，將其插入上述pUC18AkpnI的ke8387I限制酶切位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pNPI130PUC。用限制酶ΚρηΙ，從質(zhì)粒pNPI140(日本特開(kāi)平9-154580號(hào)公報(bào))中酶切CaMV35S 啟動(dòng)子、Hm(潮霉素抗性)基因和胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化信號(hào)所連接的基因片段，插入 PNPI130PUC的KpnI限制酶切位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pNPI130Hm。
目標(biāo)質(zhì)粒如下獲得用限制酶ke8387I從該pNPI130Hm中酶切酵母的位點(diǎn)特異 性重組體系的重組序列Rs所夾持的區(qū)域，將其插入pGlbGLP的ke8387I限制酶切位點(diǎn)之 間。將所得質(zhì)粒命名為pGlbGLP130Hm，于2003年3月25日保藏在國(guó)際專(zhuān)利生物保藏機(jī)構(gòu)， 獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(TsukiAa Central 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), H ^1 ^ FERM BP—8343。 i亥 pGlbGLP130Hm中，作為在植物的貯藏器官中表達(dá)的重組蛋白基因，編碼[Ser8、Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)的基因以插入到水稻球蛋白基因的可變區(qū)(第109號(hào)氨基酸部位)的 形式存在，還具有細(xì)胞分裂素相關(guān)基因ipt基因、抗藥性基因——潮霉素抗性基因，并使用 酵母的位點(diǎn)特異性重組系R/RS系作為具有脫離能力的DNA因子。pGlbGLP130Hm的制備方案如圖1_4所示，該pGlbGLP130Hm中要整合到植物染色體 中的區(qū)(T-DNA區(qū))的限制酶切圖譜如圖4所示。圖1-4中，Glb-P表示水稻球蛋白基因的 啟動(dòng)子，GLP表示編碼[Ser8、Gin26、Asp34]-GLP-I (7-36)的基因，球蛋白表示水稻球蛋白基 因，T表示胭脂氨酸合成酶基因的聚腺苷酸化信號(hào)，Ia表示lacZ’基因的片段，35S-P表示 花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子，ipt表示ipt基因，圈T表示ipt基因本身的聚腺苷酸化信 號(hào)，Hm表示潮霉素抗性基因，R表示重組酶基因，方框圈起的三角形表示重組序列Rs及其序 列方向，RB和LB表示T-DNA區(qū)的邊界序列。II. pGlbGLP130Hm向農(nóng)桿菌的導(dǎo)入將根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株接種于IOmL YEB液體培養(yǎng)基(5g/L牛肉膏、lg/L酵母 膏、5g/L蛋白胨、5g/L蔗糖、2mM MgS04、22°C的pH為7. 2 (以下如無(wú)特別說(shuō)明，均為22°C下 的pH))，在培養(yǎng)，使0D630在0. 4-0. 6的范圍。以6900Xg、在4°C下將培養(yǎng)液離心10 分鐘，收集菌體，將菌體懸浮于20mlIOmM HEPES (pH 8.0)中，再次以6900 X g、在4°C離心 10分鐘，收集菌體，接著將該菌體懸浮于200 μ 1的YEB液體培養(yǎng)基中，將其作為質(zhì)粒導(dǎo)入菌 液。使用該質(zhì)粒導(dǎo)入菌液，如下進(jìn)行pGlbGLP130Hm向農(nóng)桿菌的導(dǎo)入。S卩，使用Gene Pulser II系統(tǒng)[BI0RAD制造]，在0. 5ml管中對(duì)將50 μ 1上述質(zhì)粒導(dǎo)入菌液和3μ 1 pGlbGLP130Hm混合的混合液進(jìn)行電穿孔，向經(jīng)電穿孔處理后的混合液中加入200 μ 1 YEB 液體培養(yǎng)基，在25°C振蕩1小時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)，然后將菌體接種于添加有50mg/L卡那霉素的 YEB瓊脂培養(yǎng)基(1. 5w/V%瓊脂，其它組成與上述相同)，在培養(yǎng)2天。再將所得菌落 轉(zhuǎn)移至YEB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，接著，通過(guò)堿法從該菌體中提取質(zhì)粒，可確認(rèn)這些菌是導(dǎo) 入有 pGlbGLP130Hm 的 EHA105 菌株，將其稱(chēng)為 EHA105 (pGlbGLP130Hm)。III.感染材料的制備使用水稻品種“日本晴”作為基因?qū)氲膶?duì)象，按照細(xì)胞工學(xué)別冊(cè)植物細(xì)胞工學(xué)系 列4模型植物的試驗(yàn)方案(93-98頁(yè))進(jìn)行該成熟種子的滅菌。將滅菌的成熟種子播種于 N6C12培養(yǎng)基(N6無(wú)機(jī)鹽類(lèi)以及維生素類(lèi)、30g/L蔗糖、2. 8g/L脯氨酸、0. 3g/L酪蛋白氨基 酸、lmg/L2，4-D、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠、pH = 5. 8)，用外科膠帶封住，在亮處培養(yǎng)，使其 發(fā)芽，制成通過(guò)農(nóng)桿菌EHA105 (pGlbGLP130Hm)進(jìn)行感染的材料。IV.通過(guò)農(nóng)桿菌EHA105(pGlbGLP130Hm)進(jìn)行水稻的轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化水稻的制備將在YEB瓊脂培養(yǎng)基(5g/L牛肉膏、lg/L酵母膏、5g/L蛋白胨、5g/L蔗糖、2mM MgS04、15g/L Bacto-agar)中培養(yǎng)的農(nóng)桿菌EHA105 (pGlbGLP130Hm)轉(zhuǎn)移到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基中，在25°C以ISOrpm培養(yǎng)過(guò)夜，然后以3000rpm離心20分鐘，收集菌體，懸浮于含有乙酰 丁香酮(10mg/L)的N6培養(yǎng)基(N6無(wú)機(jī)鹽類(lèi)以及維生素類(lèi)、30g/L蔗糖、2mg/L 2，4_D、pH = 5. 8)，使OD63tl = 0.15,制成感染用農(nóng)桿菌懸浮液。將III中制備的發(fā)芽種子裝入50ml管中，向其中注入上述感染用農(nóng)桿菌懸浮液， 浸泡種子。浸泡1. 5分鐘后，倒去農(nóng)桿菌懸浮液，將發(fā)芽的種子置于無(wú)菌濾紙上，吸去多余 的水分，然后播種于N6C12培養(yǎng)基(N6無(wú)機(jī)鹽類(lèi)以及維生素類(lèi)、30g/L蔗糖、2. 8g/L脯氨酸、 0.3g/L酪蛋白氨基酸、lmg/L 2，4-0、48/1脫乙酰吉蘭糖膠、？!1=5.2)，用外科膠帶封住， 在暗處共培養(yǎng)3天，再轉(zhuǎn)移到N6C12CH25培養(yǎng)基(N6無(wú)機(jī)鹽類(lèi)以及維生素類(lèi)、30g/L蔗 糖、2. 8g/L脯氨酸、0. 3g/L酪蛋白氨基酸、2mg/L 2，4_D、500mg/L羧芐青霉素、25mg/L潮霉 素、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠)，培養(yǎng)1周，然后從發(fā)芽種子的盾片組織中切取所發(fā)的芽。接著，將該盾片組織在N6C14TCH25培養(yǎng)基(N6無(wú)機(jī)鹽類(lèi)以及維生素類(lèi)、30g/L蔗 糖、2. 8g/L脯氨酸、0. 3g/L酪蛋白氨基酸、％ig/L2，4-D、500mg/L羧芐青霉素、25mg/L潮霉 素、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠)上培養(yǎng)1周，再在MSRC培養(yǎng)基(MS無(wú)機(jī)鹽類(lèi)以及維生素類(lèi)、30g/ L蔗糖、30g/L山梨醇、2g/L酪蛋白氨基酸、500mg/L羧芐青霉素、4g/L脫乙酰吉蘭糖膠)上 培養(yǎng)，在與EHA105(pGlbGLP130Hm)共培養(yǎng)后，在1個(gè)月至2個(gè)月之間再分化為芽或小植株。 再分化的芽或小植株移植到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到高約20cm的幼苗。使用Dneasy 96 PlantKit (QIAGEN制備)，從該幼苗中提取染色體DNA，通過(guò)PCR法確認(rèn)編碼[Ser8、Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)的基因的存在。此時(shí)，為了檢測(cè)插入到球蛋白基因的可變區(qū)的、編碼[Ser8、Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)的基因，PCR 引物使用 3-1 :5，-GGATCCATGGCTAGCAAGGTCGTC-3，(SE Q ID NO. 3)和 3-3:5，-GATCACTATCTCGTTGCATGCAACAC-3，(SEQ ID NO. 4)。使用瓊脂糖凝 膠電泳對(duì)所得PCR反應(yīng)產(chǎn)物(約700bp)進(jìn)行分析，確認(rèn)了染色體DNA中編碼[Ser8、Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)的基因的存在。結(jié)果表明，約3%的用于農(nóng)桿菌感染處理的水稻種子中導(dǎo)入了上述編碼[Ser8、 Gin26、Asp34]-GLP-I (7-36)的基因。這樣得到的、已確認(rèn)導(dǎo)入了編碼[Ser8、Gln26、ASp34]-GLP-I (7-36)的基因的水稻幼 苗的轉(zhuǎn)化體在土壤中馴化，在溫室中栽培、生長(zhǎng)，收獲成熟種子。V.蛋白分析用250μ1 含有 10% (ν/ν)甘油、0. 25% (w/v) SDS、5 % 2_ 巰基乙醇的 62. 5mM Tris-HCl (ρΗ6· 8)提取緩沖液，在100°C，將IV.中得到的IOmg成熟種子處理5分鐘，提取 這些種子的全部蛋白，將該提取液進(jìn)行SDS-PAGE。SDS-PAGE使用15% (w/v)聚丙烯酰胺 (丙烯酰胺N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺=30 0. 8)凝膠進(jìn)行。用分析軟件Image Gauge (富士寫(xiě)真膠片制造)對(duì)所得凝膠圖像進(jìn)行分析，對(duì)編碼 [Ser8、Gin26、Asp34]-GLP-I (7-36)的基因插入到球蛋白的可變區(qū)得到的融合蛋白的蓄積水 平進(jìn)行調(diào)查。結(jié)果如圖5所示。[比較例1]使用含有水稻球蛋白啟動(dòng)子、SEQ ID NO. 1所示的編碼[Ser8、Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)的基因插入到可變區(qū)的球蛋白基因、以及胭脂氨酸合成酶的聚腺苷酸 化信號(hào)所連接的基因片段的圖6記載的現(xiàn)有載體pGlbGLP-Hm，進(jìn)行對(duì)水稻成熟種子的基因?qū)?，除此之外，與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行基因?qū)?，再分化芽或小植株，由該芽或小植株?生植株，得到轉(zhuǎn)化水稻，收獲成熟種子，對(duì)該成熟種子進(jìn)行蛋白分析。結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，編碼[Ser8、Gln26、ASp34]-GLP-I (7-36)的基因插入到球蛋白的可變區(qū) 形成的融合蛋白在實(shí)施例1中所生產(chǎn)的水稻成熟種子中高蓄積，與比較例1相比較，最高顯 示約6倍的水平(圖5)。[實(shí)施例2]I. GLP-I衍生物的合成通過(guò)43(^型月太合成儀(PE-Applied Biosystems, Foster City，CA)進(jìn)行固相合 成，合成以下所示的GLP-I衍生物，通過(guò)HPLC純化，然后通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)合成品。使用純度為 95%或以上的合成品，用于體外和體內(nèi)試驗(yàn)。比較制備例1. GLP-I (7-36酰胺)(天然型GLP-1)比較制備例2. [Ser8] -GLP-I (7-36 酰胺)比較制備例3. [Gly8] -GLP-I (7-36 酰胺)制備例1. [Gin26、Asn34]-GLP-I (7-36 酰胺)(制備例1的非酰胺化物的氨基酸序列如SEQID NO. 5表示)制備例2. [Ser8、Gin26、Asp34] -GLP-1 (7-36)制備例3. [Ser8、Gin26、Asn34] -GLP-1 (7-36)(制備例3的氨基酸序列如SEQID NO. 6表示)II. GLP-1衍生物的環(huán)AMP產(chǎn)生活性根據(jù)已公開(kāi)的人GLP-I受體的 DNA序列(Graziano 等、Biochem Biophys Res Com, 196 :141-146,1993)構(gòu)建表達(dá)載體。用該載體轉(zhuǎn)化中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢SH0-K1細(xì)胞，得到表達(dá)人 GLP-I受體的重組CH0-K1細(xì)胞。將該人GLP-I受體表達(dá)細(xì)胞以1 X IO4細(xì)胞/ml/孔植入M 孔板中，3天后用于測(cè)定。測(cè)定方法是在GLP-I衍生物存在下，將上述細(xì)胞在緩沖液(PBS、5.6mM葡萄糖、 ImM異丁基甲基黃嘌呤、20 μ M Ro20-1724、0. 5%BSA、pH7. 4)中、在37°C孵育30分鐘。加 入ΙΟμΙ 5Ν鹽酸，停止孵育。通過(guò)cAMP-Screen 系統(tǒng)(Applied Biosystems制造)的酶 聯(lián)免疫測(cè)定對(duì)通過(guò)各種GLP-I衍生物與GLP-I受體的反應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)形成的環(huán)化AMP進(jìn)行測(cè) 定。圖7表示各種GLP-I衍生物的環(huán)AMP產(chǎn)生活性。該結(jié)果顯示[Ser8]-GLP-I (7-36 酰胺)、[Gly8] -GLP-I (7-36 酰胺)、[Gin26、 Asn34]-GLP-I (7-36酰胺)具有與天然型GLP-I同等的環(huán)AMP產(chǎn)生活性。[實(shí)施例3]對(duì)制備例1的Win26、Asn34]-GLP-I (7-36酰胺)進(jìn)行胰蛋白酶處理，然后與實(shí)施 例2同樣地進(jìn)行環(huán)AMP產(chǎn)生活性測(cè)定，調(diào)查胰蛋白酶抗性。即，將合成得到的上述GLP-I衍生物溶解于50mM碳酸氫銨溶液(pH 7. 8)，使?jié)舛?為500yg/ml。向100 μ 1該溶液中加入5 μ 1 500 μ g/ml胰蛋白酶溶液(Promega制備、 Cat.No. V5113)，在37°C反應(yīng)1小時(shí)。加入1200 μ 1 71. 5%的乙醇(終濃度65% )，使反應(yīng) 停止，在4°C、以15，OOOrpm離心5分鐘，回收上清，蒸發(fā)干燥。將干燥固化物溶解于蒸餾水 中，用于測(cè)定活性。
圖8表示胰蛋白酶處理前和處理后的Knn26、Asn34]-GLP-l (7-36酰胺)的活性與 濃度的相關(guān)性?？芍猍Gln26、ASn34]-GLP-l (7-36酰胺)在胰蛋白酶處理前和處理后活性沒(méi) 有差別，對(duì)胰蛋白酶具有抗性。[實(shí)施例4]研究水稻成熟種子中GLP-I衍生物對(duì)胰蛋白酶的穩(wěn)定性。使用實(shí)施例1中得到的水稻成熟種子制成的白米及其粉末，加入1. 9倍量的水，加 熱15分鐘，制成米飯。將米飯顆粒均勻壓碎，然后用蒸餾水稀釋5倍，制成樣品；將粉末直 接用蒸餾水稀釋5倍，制成樣品。另一方面，用2% BSA溶液將合成品GLP-I (7-36酰胺)、 [Ser8, Gin26、Asp34] -GLP-I (7-36)、[Ser8, Gin26、Asn34] -GLP-I (7-36)制成 10 μ g/ml 溶液， 制成樣品。以1/10的量向各樣品中加入含有7.6mg/ml胰蛋白酶的10倍濃度的人工胃液 (pHl. 2)，在 37°C 反應(yīng) 1 小時(shí)，然后用 NaOH 中和。對(duì)于 GLP-I (7-36 酰胺)、[Ser8, Gin26、 Asp34] -GLP-I (7-36)、[Ser8, Gin26、Asn34] -GLP-I (7-36)、以及對(duì)于來(lái)自米的樣品提取蛋白， 通過(guò)胰蛋白酶處理得到GLP-I單體，然后測(cè)定它們的環(huán)AMP產(chǎn)生活性。結(jié)果可知，合成的 GLP-I衍生物經(jīng)胰蛋白酶處理后完全失活，但米中則殘留有31-65%的GLP-I活性(圖9)。由以上可以斷定水稻成熟種子中含有的GLP-I衍生物不會(huì)被胰蛋白酶消化，可 通過(guò)胃到達(dá)小腸。[實(shí)施例5]通過(guò)0. 025M氫氧化鈉溶液，從實(shí)施例1得到的水稻成熟種子中提取[Ser8、Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)和球蛋白融合的蛋白，將其用50mM碳酸氫銨pH7. 8稀釋15倍。向該稀 釋液中加入6μ1 83 μ g/ml胰蛋白酶溶液(Promega制備、Cat.No. V5113)，在37°C反應(yīng)1、 2、4、6或20小時(shí)，然后加入1200 μ 171. 5%的乙醇(終濃度65% )，使反應(yīng)停止，在4°C、以 15，OOOrpm離心5分鐘，回收上清，蒸發(fā)干燥。將干燥固化物溶解于蒸餾水中，測(cè)定活性。圖10表示在水稻成熟種子中表達(dá)、作為融合蛋白得到的[Ser8、Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)的胰蛋白酶處理時(shí)間與活性的關(guān)系。胰蛋白酶處理伊始即顯現(xiàn)環(huán) AMP產(chǎn)生活性，與胰蛋白酶處理時(shí)間沒(méi)有關(guān)系，一直保持了該活性。由以上可知[Ser8、 Gin26、Asp34]-GLP-I (7-36)在水稻成熟種子中以具有活性的形式表達(dá)，且為胰蛋白酶抗 性。因此，可以推斷通過(guò)GLP-I衍生物的表達(dá)，水稻成熟種子中含有的[Ser8、Gln26、 Asp34I-GLP-I (7-36)可以不被胰蛋白酶分解而在小腸中被吸收。[實(shí)施例6]對(duì)[Ser8,Gin26、Asn34J-GLP-I (7-36)和[Ser8, Gin26、Asp34]-GLP-I (7-36)實(shí)施胰 蛋白酶處理后，與實(shí)施例2同樣地測(cè)定環(huán)AMP產(chǎn)生活性，由此研究胰蛋白酶抗性。即，將上述合成GLP-I衍生物用0. 2 %牛血清白蛋白溶液稀釋為10 μ g/ml，取8 μ 1 上述稀釋溶液，加入112 μ 1 50mM碳酸氫銨溶液(pH7. 8)和6 μ 183 μ g/ml胰蛋白酶溶液 (Promega制備、Cat. No. V5113)，在37°C反應(yīng)1小時(shí)，然后加入1200 μ 1 71. 5%的乙醇(終 濃度65% )，使反應(yīng)停止，在4°C、以15，OOOrpm離心5分鐘，回收上清，蒸發(fā)干燥。將干燥固 化物溶解于蒸餾水中，用于測(cè)定活性。圖11 表示 GLP-I (7-36 酰胺)、[Ser8, Gin26、Asn34] -GLP-I (7-36)和[Ser8, Gin26、 Asp34]-GLP-I (7-36)的胰蛋白酶處理時(shí)間與活性的變化。與天然型GLP-I (7_36酰胺)比較，可知[Ser8、Gin26、Asn34]-GLP-I (7-36)和[Ser8、Gin26、Asp34]-GLP-1 (7-36)不會(huì)因胰蛋 白酶處理而顯示活性變化，為胰蛋白酶抗性。[實(shí)施例7]研究本發(fā)明的GLP-I衍生物與天然型GLP-I比較，是否顯示顯著的DPP-IV抗性。 使用 5000pM GLP-I (7-36 酰胺)(天然型 GLP-1)、500pM [Ser8,Gln26,Asn34] -GLP-I (7-36)、 5000口] [561~8、611126、八8口34]-61^-1(7-36)，分別與4(^~口 1 的 DPP-IV (Sigma、D7052)混合， 在37°C反應(yīng)0、15、30、60分鐘，然后用2倍量的乙醇提取，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干燥固化。將所得 干燥固化物溶解于含1 % BSA的蒸餾水中，與GLP-I受體表述細(xì)胞作用，測(cè)定環(huán)AMP產(chǎn)生量。 圖12中，以未經(jīng)DPP-IV處理時(shí)的為100%，進(jìn)行環(huán)AMP產(chǎn)生活性比較。與GLP-I (7_36酰 胺)比較，[Ser8、Gin26、Asn34]-GLP-I (7-36)和[Ser8、Gin26、Asp34]-GLP-1 (7-36)可見(jiàn)明顯 的DPP-IV抗性。[實(shí)施例8]研究本發(fā)明的GLP-I衍生物的胰島素分泌促進(jìn)性。通過(guò)膠原酶從ICR小鼠的胰臟中取得朗格漢斯氏島細(xì)胞，在M孔板上每孔裝入 2-3個(gè)朗格漢斯氏島細(xì)胞。培養(yǎng)過(guò)夜。然后，加入溶解于含16. 7mM葡萄糖、0.2% BSA和 IOmM Hepes的Krebs-Ringer緩沖液的本發(fā)明的GLP-1衍生物，在37°C放置30分鐘，通過(guò) 酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒(〉〃 ^<制備)測(cè)定。在GLP-I (7-36 酰胺)、[Ser8、Gin26、Asp34]-GLP-1 (7-36)、[Ser8、Gin26、 Asn34]-GLP-I (7-36)的任意肽中，都可見(jiàn)用量相關(guān)性的胰島素分泌促進(jìn)活性。特別是在 [Ser8、Gin26、Asn34]-GLP-I (7-36)中可以高濃度顯示胰島素分泌促進(jìn)活性(圖13)。[實(shí)施例9]研究口服糖負(fù)荷試驗(yàn)(OGTT)中通過(guò)皮下施用GLP-I衍生物產(chǎn)生的血糖降低效果。對(duì)一夜未進(jìn)食的小鼠口服施用lg/kg葡萄糖，立即背部皮下施用(5、20yg/kg) GLP-I (7-36 酰胺)、[Ser8、Gin26、Asn34]-GLP-I (7-36)或[Ser8, Gln26, Asp34]-GLP-I (7-36)。 對(duì)對(duì)照組施用生理鹽水。葡萄糖負(fù)荷前以及20、60、120分鐘后由眼下靜脈叢采血， 測(cè)定血糖值。GLP-I衍生物中，可見(jiàn)血糖上升的峰值有降低的趨勢(shì)，[Ser8、Gln26、 Asn34]-GLP-I (7-36)中則可見(jiàn)強(qiáng)烈的作用(圖14)。另外，該作用持續(xù)到施用后120分鐘 (圖15)。由此明確通過(guò)GLP-I肽的改變，在生物體內(nèi)血液中的穩(wěn)定性飛躍提高，可確保持 續(xù)性。產(chǎn)業(yè)實(shí)用性作為采用基因工程的價(jià)廉、安全且高效的物質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)，本發(fā)明可提供通過(guò)高產(chǎn) 重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法而得到的物質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以提 供顯著蓄積對(duì)增進(jìn)健康有作用的成分的食品。本發(fā)明的方法還可以作為生產(chǎn)可用作藥物、 工業(yè)原料的物質(zhì)的高附加值植物制備的基礎(chǔ)技術(shù)。本發(fā)明還包含通過(guò)本發(fā)明的方法制備GLP-1。其中所述GLP-I已知為通過(guò)食物攝 取、由消化管分泌、在胰臟中發(fā)揮作用的刺激糖依賴(lài)性胰島素分泌的激素。本發(fā)明中所提供的新型GLP-I衍生物具有以下優(yōu)異特性在利用并攝取時(shí)，針對(duì) 胰蛋白酶等消化酶的分解問(wèn)題，其具有對(duì)該酶的抗性；并且在攝取、吸收后，關(guān)于在血漿中 的穩(wěn)定性，針對(duì)二肽酰肽酶IV的分解問(wèn)題，其具有對(duì)該酶的抗性，有望作為藥物應(yīng)用。艮口，本發(fā)明的GLP-I衍生物在經(jīng)口攝取時(shí)可以表達(dá)藥效，例如根據(jù)本發(fā)明的方法，在植物的貯 藏器官中表達(dá)并經(jīng)口攝取時(shí)，不會(huì)被分解，可從小腸吸收，表達(dá)藥效。因此，本發(fā)明所提供的 GLP-I衍生物進(jìn)一步提高了 GLP-I的臨床應(yīng)用的可能性，對(duì)糖尿病患者和肥胖患者的QOL改 善發(fā)揮作用。
權(quán)利要求
1.高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中編碼含有 GLP-I (7-36)或者在其氨基酸序列的基礎(chǔ)上有1或多個(gè)氨基酸缺失、置換和/或附加的序 列、且具有GLP-I活性的肽中、第沈位置換為谷胺酰胺、第34位置換為天冬酰胺或天冬氨 酸的GLP-I衍生物的基因，用作在植物貯藏器官中表達(dá)的重組蛋白基因，該方法包含以下 步驟㈧、(B)和(C):(A)構(gòu)建一種載體，將該載體導(dǎo)入細(xì)胞中的步驟，其中所述載體含有在植物的貯藏器官 中表達(dá)的重組蛋白的基因、細(xì)胞分裂素相關(guān)基因、抗藥性基因和具有脫離能力的DNA因子， 且細(xì)胞分裂素相關(guān)基因和抗藥性基因存在于與具有脫離能力的DNA因子聯(lián)動(dòng)的位置，在植 物貯藏器官中表達(dá)的重組蛋白的基因存在于與具有脫離能力的DNA因子不聯(lián)動(dòng)的位置；(B)將通過(guò)上述步驟(A)導(dǎo)入了載體的植物細(xì)胞在添加藥物的培養(yǎng)基和不添加藥物的 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，由此再分化為轉(zhuǎn)化體的步驟；和(C)從通過(guò)上述步驟(B)再分化的轉(zhuǎn)化體中獲得植物貯藏器官的步驟。
2.權(quán)利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中編碼 GLP-I衍生物的基因是編碼氨基酸序列的第8位進(jìn)一步置換為絲氨酸或甘氨酸的GLP-I衍 生物的基因。
3.權(quán)利要求2的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中編碼 GLP-I衍生物的基因是序列表SEQ ID NO. 1所示的基因。
4.權(quán)利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中GLP-I 衍生物由序列表SEQ ID NO :2、5或6中所示的氨基酸序列組成。
5.權(quán)利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其包括在 由導(dǎo)入了載體的植物細(xì)胞再分化轉(zhuǎn)化體的過(guò)程中，將導(dǎo)入了載體的植物細(xì)胞在添加植物激 素的培養(yǎng)基和添加藥物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后在不添加植物激素的培養(yǎng)基和不添加藥物的 培養(yǎng)基上培養(yǎng)ο
6.權(quán)利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中編碼 GLP-I衍生物的基因處于該植物貯藏器官特異性啟動(dòng)子的控制下。
7.權(quán)利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中編碼 GLP-I衍生物的基因插入或置換到原本在該植物貯藏器官中表達(dá)的蛋白編碼基因中編碼蛋 白可變區(qū)的位置。
8.權(quán)利要求7的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中在編碼 GLP-I衍生物的基因和原本在植物貯藏器官中表達(dá)的蛋白編碼基因的交界處配置有編碼酶 切氨基酸序列的堿基序列，其中所述酶切氨基酸序列用于將該GLP-I衍生物從原本在植物 貯藏器官中表達(dá)的蛋白上切取分離。
9.權(quán)利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中植物貯 藏器官為種子。
10.權(quán)利要求9的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中其蛋白 的可變區(qū)待插入或待置換的原本在植物貯藏器官中表達(dá)的蛋白編碼基因是種子貯藏蛋白 基因。
11.權(quán)利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中細(xì)胞分 裂素相關(guān)基因是細(xì)胞分裂素合成基因。
12.權(quán)利要求11的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中細(xì)胞 分裂素合成基因是異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因。
13.權(quán)利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中抗藥性 基因是潮霉素抗性基因。
14.權(quán)利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中具有脫 離能力的DNA因子來(lái)自位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)或轉(zhuǎn)座子。
15.權(quán)利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中所述植 物為單子葉植物。
16.權(quán)利要求15的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法，其中所述 單子葉植物為水稻。
17.通過(guò)權(quán)利要求1的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官、或 生產(chǎn)該植物貯藏器官的轉(zhuǎn)基因植物。
18.權(quán)利要求1的高產(chǎn)GLP-I衍生物重組蛋白的植物貯藏器官的生產(chǎn)方法中使用的用 于將基因?qū)胫参锏闹亟M載體，其中編碼含有GLP-I (7-36)或者在其氨基酸序列的基礎(chǔ)上 有1或多個(gè)氨基酸缺失、置換和/或附加的序列、且具有GLP-I活性的肽中、第沈位置換為 谷胺酰胺、第34位置換為天冬酰胺或天冬氨酸的GLP-I衍生物的基因，用作在植物貯藏器 官中表達(dá)的重組蛋白基因；該重組載體含有編碼GLP-I衍生物的基因、細(xì)胞分裂素相關(guān)基 因、抗藥性基因和具有脫離能力的DNA因子，該基因已被導(dǎo)入載體中，其中細(xì)胞分裂素相關(guān) 基因和抗藥性基因存在于與具有脫離能力的DNA因子聯(lián)動(dòng)的位置、而在植物貯藏器官中表 達(dá)的重組蛋白的基因存在于與具有脫離能力的DNA因子不聯(lián)動(dòng)的位置。
19.權(quán)利要求18的用于將基因?qū)胫参锏妮d體，其中編碼GLP-I衍生物的基因是編碼 氨基酸序列的第8位進(jìn)一步置換為絲氨酸或甘氨酸的肽的基因。
20.權(quán)利要求19的用于將基因?qū)胫参锏妮d體，其中編碼GLP-I衍生物的基因是序列 表SEQ ID NO. 1所示的基因。
全文摘要
本發(fā)明提供在植物貯藏器官中高產(chǎn)重組蛋白的方法以及GLP-1衍生物。使用一種載體，通過(guò)轉(zhuǎn)化得到高產(chǎn)重組蛋白的植物貯藏器官。其中所述載體含有重組蛋白的基因、細(xì)胞分裂素相關(guān)基因、抗藥性基因以及具有脫離能力的DNA因子，且細(xì)胞分裂素相關(guān)基因和抗藥性基因存在于與具有脫離能力的DNA因子的聯(lián)動(dòng)的位置，在植物的貯藏器官中表達(dá)的重組蛋白存在于與具有脫離能力的DNA因子的不聯(lián)動(dòng)的位置。通過(guò)上述方法生產(chǎn)GLP-1，并提供對(duì)酶的分解作用穩(wěn)定的衍生物。
文檔編號(hào)C07K14/605GK102134577SQ20101027747
公開(kāi)日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2004年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月28日
發(fā)明者S·笠原, 杉田耕一, 海老沼宏安, 高巖文雄 申請(qǐng)人:日本制紙株式會(huì)社, 獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所