專利名稱:一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法
技術領域:
本發(fā)明涉及醫(yī)藥化工領域,具體為一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和 蟲草多糖的方法。
背景技術:
北冬蟲夏草(北蟲草),又名蛹蟲草(Cordyc印s militaris),屬子囊菌亞門、麥角 菌科、蟲草屬,是一種珍貴的藥用菌。近年來,由于天然冬蟲夏草(Cordyc印s sinensis)需 求不斷增長,有限的資源日益枯竭,目前尚未人工規(guī)?;耘?。于是人們開始培育生產(chǎn)周期 短,與天然冬蟲夏草有相似醫(yī)療保健功效的北冬蟲夏草滿足消費需求,替代天然冬蟲夏草 的不足,為人工規(guī)?;嘤谋倍x夏草的發(fā)展提供了廣闊的市場和良好的發(fā)展機遇。蟲草素和蟲草多糖是天然冬蟲夏草、人工培育北冬蟲夏草中重要的生理活性成 份,大量的藥理學試驗結果表明,蟲草素具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、免疫調節(jié)、清除自由基、 減肥、提高性功能等作用;蟲草多糖能促進淋巴細胞轉化,提高血清IgG抗體含量和機體的 免疫功能,增強機體自身抗癌抑癌的能力,兩者均表現(xiàn)出良好的臨床應用前景。人工培育的北冬蟲夏草培養(yǎng)基中含有蟲草素、蟲草多糖等生理活性成份,從殘余 培養(yǎng)基中提取蟲草素、蟲草多糖等保健食品或醫(yī)藥中間體,將能變廢為寶,提高企業(yè)經(jīng)濟效益。目前,據(jù)國內外公開報道的有關北冬蟲夏草或其培養(yǎng)基中蟲草素和多糖的提取專 利文獻,提取技術都是單一成份分步提取,即使大規(guī)模生產(chǎn),往往需要多套設備系統(tǒng)進行非 連續(xù)性提取,分離步驟多,投資大,生產(chǎn)成本高。比如,有些專利中利用離子交換樹脂分步提 取,樹脂再生時需用大量的酸堿等化學試劑,對大規(guī)模生產(chǎn)的設備要求較高,并且?guī)韽U氣 廢水,造成環(huán)境污染。另外,有些專利中報道采用大孔樹脂,但是不能同時提取蟲草素和蟲 草多糖。
發(fā)明內容
本發(fā)明旨在提供一種從北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基中同時提取蟲草素和蟲草多 糖的方法。一種從北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基中同時提取蟲草素和蟲草多糖的方法,是利用 提取劑對北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基中的蟲草素和蟲草多糖進行提取,同時使提取液流經(jīng) 大孔樹脂后再次對北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基進行提?。粚⑽皆诖罂讟渲系南x草素和 蟲草多糖洗脫下來,洗脫液濃縮干燥后得到的產(chǎn)品中含有蟲草素和蟲草多糖。具體包括如下步驟
(1)將北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基粉碎后置于容器內,用提取劑對北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基進行提??;提取液流出后用大孔樹脂進行吸附,然后流回裝有北冬蟲夏草固體培 養(yǎng)基殘基的容器循環(huán)提??;提取時間為10 20hr ;大孔樹脂為非極性樹脂,可以用H-01、 H-IO或H-20樹脂,優(yōu)選為H-20樹脂;
北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基、提取劑和大孔樹脂的用量比為Ikg 1 20L 0. 3 0. 5L ;優(yōu)選為Ikg 2 IOL 0. 3 0. 5L ;提取劑為水;
(2)用洗脫劑洗脫大孔樹脂,得到洗脫液;洗脫速度為0.5 2BV/hr ; 北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基與洗脫劑的用量比為Ikg :1 2L ; 洗脫劑優(yōu)選為10 50%體積濃度的乙醇水溶液;
(3)取洗脫液濃縮和干燥,得到含有蟲草素和蟲草多糖的固體。步驟(1)中,將粉碎的北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基過10 20mm篩。步驟(1)中,裝有北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基的容器上部出水口連接到裝有大孔 樹脂的吸附柱的底部入水口,吸附柱上部出水口接到流到裝有北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基 的容器底部的入水口,提取液的流動方向為容器底部入水口——容器上部出水口——吸 附柱底部入水口——吸附柱上部水口——容器底部入水口。步驟(3)中所述的濃縮和干燥方法為將洗脫液濃縮至比重為1. 05 1. 1,在 80 IOCTC下加熱烘干,或-50 -io°c下低溫冷凍干燥,或者真空低溫干燥;真空低溫干 燥的條件為真空度一 0. 09 一 0. IMpa,溫度范圍30 50°C。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術中蟲草素和蟲草多糖提取技術的不足,能從北冬蟲夏草固 體培養(yǎng)基殘基中同時提取蟲草素和蟲草多糖,變廢為寶;所得產(chǎn)品活性成分含量高;以水 為提取劑,所涉及的工藝和設備簡單,可實現(xiàn)在常溫下連續(xù)動態(tài)地提取和吸附分離。所用樹 脂不需經(jīng)過酸堿再生可以重復使用,降低投資和運行成本,環(huán)保節(jié)能,適合大規(guī)模工業(yè)化生 產(chǎn)。而且北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中生理活性成份蟲草素和蟲草多糖的提取得率高,產(chǎn)品中 蟲草素含量可達15 35%,蟲草多糖含量10 35%。
具體實施例方式用滾軸式不銹鋼刀片粉碎機將塊狀的北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基的殘基進行粉碎,主 軸轉速為400 600r/min,篩網(wǎng)孔徑為10 20mm,得到北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基顆粒。所得 產(chǎn)品中蟲草素和蟲草多糖的檢測方法為
蟲草素含量的測定(高效液相色譜法) (1)標準品溶液的配制
準確稱取2. 5毫克蟲草素標準品,用純凈水加熱溶解后定容到10毫升,冷卻至室溫備用。(2)色譜條件
C18色譜柱(150mm*4. 6mm);流動相為甲醇水=15 85 ;流速1. Oml/min ;柱溫40°C; 檢測波長258nm。(3)樣品含量測定
準確稱取0. 25克樣品,用純凈水加熱溶解后定容到25毫升,冷卻至室溫,搖勻, 4000rpm離心lOmin,上清液過0. 22 w m濾膜過濾,20 w L進樣,通過樣品與標準品的峰面積 來計算蟲草素的含量。
蟲草多糖含量的測定(苯酚_硫酸法) (1)標準品溶液的配制
準確稱取在105°c烘至恒重的葡聚糖20. OOmg,加水溶解并稀釋至100ml。搖勻備用, 此液濃度為200μ g/ml。(2)葡聚糖吸收常數(shù)的測定
準確吸取上述葡聚糖標準液0,0. 10,0. 20,0. 30,0. 40,0. 60,0. 80和1. OOml置于25ml 比色管中,葡聚糖的重量依次為0,20,40,60,80,120,160和200微克,各管補加水至 2. OOml,各管再準確加入5%苯酚液1. Oml,再在不斷搖動下,小心而緩慢的加入IOml硫 酸,立即置于沸水浴中加熱2分鐘,取出,冷卻至室溫后,用分光光度計在最大吸收波長處 (約483-485nm),以不加葡聚糖的空白溶液(即第一管)為參比液,使用Icm比色皿,測定 各管的吸光度,計算吸收常數(shù)。(3)樣品的測定
稱取已磨細過篩(40目或60目)的樣品粉末,約0. 25克,稱準至0. 0001克,置于 25ml容量瓶內,加入水約20ml,搖勻后置于沸水浴中加熱提取約1小時,并不時搖動瓶內 液體,當粉末不再浮上液面全部沉在瓶底時,即可停止加熱取出,冷至室溫,補加水至刻 度,搖勻。于離心機內離心不少于10分鐘(轉速為4000轉/分鐘)取上清液備用。吸取上述備用液,加入6倍的95%乙醇或5倍的無水乙醇,邊加邊搖,加蓋后, 冰箱內冷藏過夜,取出,離心20分鐘,轉速不少于4000轉/分鐘。小心棄去上清液,沉淀用 少量水溶解,轉移至另一 25ml容量瓶內,洗滌液也并入瓶內,再加水至刻度,搖勻備用。吸取上述溶液一定體積(吸取體積以使配制后的液體光吸收值介于0. 2-0. 8之間 為合適),補加水至2. 0ml,加入5%苯酚液1.0ml,搖勻后,在不斷搖動下,小心而緩慢的 加入硫酸10ml,立即置于沸水浴中加熱2分鐘,取出,冷至室溫后,用分光光度計進行 比色,空白試驗為參比值,使用Icm的比色皿.使用波長應為最大光吸收處的波長(約為 483-485nm),記下樣品測定液的光吸收值A,根據(jù)標準葡聚糖吸收常數(shù)計算樣品中蟲草多 糖的含量。實施例1
將250克粉碎好的北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基顆粒裝入兩端可封口的Φ 5. OX 40cm PVC管 中,裝填要均勻,不擠壓,用蓋子將PVC管蓋緊。用蠕動泵將2500ml飲用水從PVC管底端泵入,PVC管上端出來的水提液從下端流 入裝有100ml H-20大孔樹脂的玻璃柱(Φ2.5Χ50(:πι)中,玻璃柱上端的流出液繼續(xù)用蠕動 泵泵入PVC管底端,進行水循環(huán)提?。蝗鋭颖瞄_啟時間即提取時間為16小時。用400ml 30% (V/V)乙醇水溶液為洗脫劑,用高壓隔膜泵將洗脫劑泵入裝有大孔 樹脂的玻璃柱進行洗脫,流速為lBV/h。洗脫液用旋轉蒸發(fā)儀真空減壓濃縮,濃縮液比重為1. 05時停止?jié)饪s。濃縮液用 80 100°C熱風循環(huán)烘箱干燥,得干粉0.85克。干粉中蟲草素含量34.7%,蟲草多糖含量 15. 66%。實施例2
將250克粉碎好的北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基顆粒裝入兩端可封口的Φ 5. OX 40cm PVC管中,用蠕動泵將500ml飲用水從PVC管底端泵入,PVC管上端出來的水提液從下端流入裝有 100ml H-20大孔樹脂的玻璃柱(Φ 2. 5 X 50cm)中,玻璃柱上端的流出液繼續(xù)用蠕動泵泵入 PVC管底端,進行水循環(huán)提取,蠕動泵開啟時間即提取時間為16h。用400ml 10% (V/V)乙醇水溶液為洗脫劑,用高壓隔膜泵將洗脫劑泵入裝有大孔 樹脂的玻璃柱進行洗脫,流速為lBV/h。洗脫液用旋轉蒸發(fā)儀真空減壓濃縮,濃縮液比重為1.07時停止?jié)饪s。濃縮液 在-50 -10°C下低溫冷凍干燥,得干粉1. 24克。干粉中蟲草素含量24. 8%,蟲草多糖含 量 11. 29%。實施例3
將24. 32公斤粉碎好的北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基顆粒裝入兩端可封口的Φ 30 X 60cm不 銹鋼桶中,裝填要均勻,不擠壓,用蓋子將桶蓋緊。用高壓隔膜泵將50升飲用水從不銹鋼桶底端泵入,不銹鋼桶上端出來的水提液 從下端流入裝有9升H-20大孔樹脂的不銹鋼柱(Φ IOX 120cm)中,不銹鋼柱上端的流出液 繼續(xù)用高壓隔膜泵泵入不銹鋼桶底端,進行水循環(huán)提取,高壓隔膜泵開啟時間即提取時間 為 16h。用30升20% (V/V)乙醇水溶液為洗脫劑,用高壓隔膜泵將洗脫劑泵入裝有大孔 樹脂的不銹鋼柱進行洗脫,流速為lBV/h。洗脫液用旋轉蒸發(fā)儀真空減壓濃縮,濃縮液比重為1. 07時停止?jié)饪s。濃縮液用 80 100°C熱風循環(huán)烘箱干燥,得干粉94. 7克。干粉中蟲草素含量18. 17%,蟲草多糖含量 32. 58%。實施例4
將24. 89公斤粉碎好的北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基顆粒裝入兩端可封口的Φ 30 X 60cm不 銹鋼桶中,裝填要均勻,不擠壓,用蓋子將桶蓋緊。用高壓隔膜泵將50升飲用水從不銹鋼桶底端泵入,不銹鋼桶上端出來的水提液 從下端流入裝有9升H-20大孔樹脂的不銹鋼柱(Φ IOX 120cm)中,不銹鋼柱上端的流出液 繼續(xù)用高壓隔膜泵泵入不銹鋼桶底端,進行水循環(huán)提取,高壓隔膜泵開啟時間即提取時間 為 16h。用30升50% (V/V)乙醇水溶液為洗脫劑,用高壓隔膜泵將洗脫劑泵入裝有大孔 樹脂的不銹鋼柱進行洗脫,流速lBV/h。洗脫液用旋轉蒸發(fā)儀真空減壓濃縮,濃縮液比重為1. 09時停止?jié)饪s。濃縮液在真空度一 0.09 一 0. IMpa,30 50°C條件下真空低溫干燥,得干粉 110. 65克。干粉中蟲草素含量28. 1%,蟲草多糖含量14.43%。
權利要求
一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法,其特征在于,包括如下步驟(1) 將北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基粉碎后置于容器內,用提取劑對北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基進行提??;提取劑流出后用大孔樹脂進行吸附,然后流回裝有北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基的容器循環(huán)提??;提取時間為10~20hr;北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基、提取劑和大孔樹脂的用量比為1kg1~20L0.3~0.5L;提取劑為水;(2) 用洗脫劑洗脫大孔樹脂,得到洗脫液;洗脫速度為0.5~2BV/hr;北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基與洗脫劑的用量比為1kg1~2L;洗脫劑為10~50%體積濃度的乙醇水溶液;(3) 取洗脫液濃縮和干燥,得到含有蟲草素和蟲草多糖的固體。
2.權利要求1所述一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法,其 特征在于,步驟(1)中,將粉碎的北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基過10 20mm篩。
3.權利要求1所述一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法,其 特征在于,步驟(1)中,裝有北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基的容器上部出水口連接到裝有大孔 樹脂的吸附柱的底部入水口,吸附柱上部出水口接到流到裝有北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基 的容器底部的入水口,提取液的流動方向為容器底部口——容器上部出水口——吸附柱 底部入水口——吸附柱上部出水口——容器底部入水口。
4.權利要求1所述一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法, 其特征在于,步驟(1)中,北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基、提取劑和大孔樹脂的用量比為Ikg 2 IOL 0. 3 0. 5L。
5.權利要求1所述一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法,其 特征在于,步驟(1)中,所述的大孔樹脂為非極性大孔樹脂。
6.權利要求1所述一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法,其 特征在于,步驟(1)中,所述的大孔樹脂為H-20型、H-Ol型或H-IO型大孔樹脂。
7.權利要求1所述一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法, 其特征在于,步驟(3)中所述的濃縮和干燥方法為將洗脫液濃縮至比重為1. 05 1. 1,在 80 IOCTC下加熱烘干,或-50 -io°c下低溫冷凍干燥,或者真空低溫干燥。
8.權利要求7所述一種從北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基中提取蟲草素和蟲草多糖的方法,其 特征在于,所述真空低溫干燥的條件為真空度一 0. 09 一 0. IMpa,溫度范圍30 50°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基中同時提取蟲草素和蟲草多糖的方法,是利用提取劑對北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基中的蟲草素和蟲草多糖進行提取,同時使提取液經(jīng)大孔樹脂吸附后再次對北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基進行提取和吸附;再將吸附在大孔樹脂上的蟲草素和蟲草多糖洗脫下來,洗脫液濃縮干燥后得到的產(chǎn)品中含有蟲草素和蟲草多糖。本方法能從北冬蟲夏草固體培養(yǎng)基殘基中同時提取蟲草素和蟲草多糖,而且活性成分含量高;樹脂不需經(jīng)過酸堿再生可以重復使用,環(huán)保,成本低,工藝和設備簡單,可實現(xiàn)連續(xù)提取。
文檔編號C07H1/08GK101906127SQ20101023513
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權日2010年7月23日
發(fā)明者唐亮, 唐永范 申請人:上海國寶企業(yè)發(fā)展中心;上海國寶生物工程研究所