專利名稱：一種巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法。
背景技術(shù)：
膠乳是橡膠樹次生韌皮部乳管細(xì)胞中特殊的細(xì)胞質(zhì)，是一種含有液體乳清的奶 狀物，其中包含許多與橡膠生物合成相關(guān)的酶類。在新鮮的膠乳中天然橡膠占總重的 20-60%。膠乳離心后分成了三層，上層是橡膠粒子，中間層是C-乳清，下層的顆粒狀物是 黃色體。在天然橡膠膠乳中，C-乳清是膠乳細(xì)胞內(nèi)含物中的水溶性成分，是膠乳細(xì)胞質(zhì)中 代謝活性成分存在的場所，其中蛋白含量占膠乳總蛋白的60%左右。黃色體是由單層膜包 被的特化的液泡，里面含有大量的酸性水解酶類，在膠乳凝乳和植物抗逆反應(yīng)中發(fā)揮著重 要作用。橡膠粒子是被半單位膜包裹的均質(zhì)圓形的橡膠核，可以分為兩類，一類是小橡膠粒 子(SRP)，另一類是大橡膠粒子(LRP)。LRP在膠乳中占大部分，SRP主要存在于Moir’s區(qū)。 現(xiàn)在證明大多與橡膠生物合成相關(guān)的蛋白位于SRP上。當(dāng)添加異戊烯焦磷酸時(shí)在二磷酸末 端會(huì)形成順式的聚異戊二烯鏈。但是在巴西橡膠中有關(guān)天然橡膠的生物合成仍然是一個(gè)長 期的謎題。隨著蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的學(xué)者開始把注意力轉(zhuǎn)向利用新技術(shù)來描述 蛋白的一些新特征，概述橡膠膠乳中的橡膠生物合成的過程。二十世紀(jì)90年代中期利用蛋 白組學(xué)技術(shù)鑒定出膠乳蛋白Hevb 9和Hevb 10是過敏原。在早期的研究中已有利用1_DE 和2-DE對橡膠膠乳蛋白的不同組份進(jìn)行研究的。首先，Martin(1991)發(fā)現(xiàn)巴西橡膠膠乳的 顆粒組份和細(xì)胞質(zhì)中含有大量的相關(guān)蛋白，在雙向電泳圖譜上只有一些高豐度的蛋白點(diǎn)是 可見的，顆粒組份蛋白的25%是幾丁質(zhì)酶/溶菌酶(Martin 1991)。為了研究橡膠樹死皮病 (TPD)的分子機(jī)理，Dian等分析膠乳的差異蛋白鑒定出五個(gè)與TPD疾病相關(guān)的蛋白(Dian et al. 1995)。其中一個(gè)26kDa蛋白的累積與該病的發(fā)生有很大關(guān)系，而乙烯可以抑制該蛋 白的表達(dá)。最近，有一些關(guān)于巴西橡膠樹的橡膠粒子、C-乳清、黃色體和種子的蛋白組學(xué)研 究報(bào)道，其它產(chǎn)膠植物像牛角瓜、白屈菜和萵苣的蛋白組學(xué)研究也有報(bào)道。然而，值得注意的是上述研究結(jié)果水平、垂直條帶在雙向電泳圖譜上的質(zhì)量差，尤 其是高豐度蛋白區(qū)域，例如橡膠延伸因子和小橡膠粒子蛋白區(qū)?？赡苁且?yàn)槟z乳與氧接觸 產(chǎn)生了不明化學(xué)成分使其變得更加粘稠，從而使分離出高質(zhì)量的蛋白以進(jìn)行蛋白組學(xué)研究 變得困難。據(jù)我們所知，直到現(xiàn)在還沒有能有效從膠乳亞細(xì)胞組份中獲得高質(zhì)量蛋白的方 法。有人認(rèn)為膠乳中富含大量的化合物，如鹽，礦物質(zhì)，脂類，碳水化合物，核酸，特別是其復(fù) 雜的膜系統(tǒng)，它們能隨蛋白一同被提取出來，而對雙向電泳會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的干擾。膠乳蛋白中 橡膠延伸因子占10-60%，它嚴(yán)重影響雙向電泳對膠乳蛋白的鑒定。因此將雙向電泳技術(shù)應(yīng) 用于橡膠膠乳蛋白組的研究還是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作，這主要是因?yàn)槠涞鞍捉M成和膜系 統(tǒng)復(fù)雜性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法，該方法蛋白提取效率 高，可從橡膠膠乳不同組份中提取出蛋白。本發(fā)明提供的巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法，包括下述步驟(1)以巴西橡膠膠乳、膠乳組份橡膠粒子、膠乳組份C-乳清或膠乳組份黃色體為 原料，其中對巴西橡膠膠乳、膠乳組份c-乳清，按體積比為1 4. 5 5.5，加入BPP蛋白提 取液進(jìn)行均質(zhì)化；對膠乳組份橡膠粒子、膠乳組份黃色體，按重量體積比為1 4. 5 5. 5， 加入BPP蛋白提取液進(jìn)行均質(zhì)化；然后室溫下漩渦振蕩，再經(jīng)超聲和離心處理后，收集下層 純化后的原料；(2)在步驟(1)中下層純化后的原料中加入其1.5 3倍體積的pH為8.0的 Tris-飽和酚經(jīng)漩渦振蕩后離心處理，然后轉(zhuǎn)移出上層相；(3)在步驟(2)所得上層相中加入與其等體積的BPP蛋白提取液，經(jīng)漩渦振蕩后離 心處理，再次轉(zhuǎn)移出上層相；(4)在步驟(3)所得上層相中加入其4. 0 6. 0倍體積的硫酸銨沉淀蛋白，-22°c 放置6h以上，離心取下層蛋白沉淀；(5)將步驟(4)所得下層蛋白沉淀洗滌后離心，在空氣中風(fēng)干，風(fēng)干后的蛋白沉淀 用裂解緩沖液重懸后即可。在上述步驟中步驟(1)中所述的膠乳組份橡膠粒子、膠乳組份C-乳清和膠乳組份黃色體的制備 過程為巴西橡膠膠乳經(jīng)35000 45000g離心25 35min，樣品分為三層，最上層為橡膠 粒子，中間層為C-乳清，下層為黃色體，移去上層的橡膠粒子，余下的樣品置于液氮中，冰 柱出現(xiàn)后將C-乳清和黃色體分割開即可。其中，在步驟(1)中所述的膠乳組份橡膠粒子還需預(yù)處理，所述的預(yù)處理過程 為按橡膠粒子與洗滌溶劑的重量體積比為1 8 12，將橡膠粒子懸浮在經(jīng)-20°C預(yù)冷的 洗滌溶劑中，漩渦振蕩30min后，在3 5°C、25000 35000g離心10 20min后，收集流 動(dòng)相即可。其中，在步驟(1)中所述的膠乳組份黃色體還需預(yù)處理，所述的預(yù)處理過程為 按黃色體與洗滌溶劑的重量體積比為1 8 12，將粗提的黃色體加入經(jīng)-20°C預(yù)冷的洗 滌劑中，冰上放置lOmin，在3 5°C、25000 35000g離心10 20min后，收集下層沉淀即可。在橡膠粒子和黃色體預(yù)處理的過程中，所述的洗滌溶劑的組成為20mMTris-HCl， 300mM甘露醇和0. 5mM DTT，所述洗滌溶劑的pH為7. 2。其中，在步驟(1)中所述的膠乳組份C-乳清還需預(yù)處理，所述的預(yù)處理過程為 將粗提的C-乳清在3 5°C、25000 35000g離心10 20min后即可。步驟(1)和步驟(3)中所述的BPP蛋白提取液的組成為100mM EDTA，lOOmMpH為 8. 0的Tris，50mM硼砂，50mM維生素C，重量百分含量為1 %的PVPP，體積百分含量為1 %的 Triton X-100，體積百分含量為2%的0 -巰基乙醇和重量百分含量為30%的蔗糖。步驟(5)中裂解緩沖液的組成為7M尿素、2M硫脲、體積百分含量為2%的CHAPS、 13mM DTT和體積百分含量為IPG buffer。
步驟(5)中下層蛋白沉淀的洗滌過程為先采用在-20°C預(yù)冷6h以上的甲醇洗滌 1 2次，再采用-20°C預(yù)冷6h以上的丙酮洗滌2 3次。步驟(1)-(5)中所述的離心的過程為在3 5°C、25000 35000g離心10 20mino上述純化的過程是用于獲得純凈的不同組份，粗提橡膠粒子和黃色體經(jīng)洗滌過程 能除去污染物，如脂類，鹽離子，多糖，萜類，碳水化合物，核酸和其它有機(jī)溶劑；粗提C-乳 清經(jīng)離心可有效去除黃色體和其它有機(jī)化合物。本發(fā)明的有益效果是(1)從橡膠乳管膠乳中可以提取出高產(chǎn)量的蛋白；(2)從橡膠膠乳不同組份包括膜系統(tǒng)中提取蛋白進(jìn)行蛋白組分析；(3)從總膠乳和C-乳清中提取的蛋白，在考馬斯亮藍(lán)染色的2-DE膠上得到了上千 個(gè)背景清晰無拖尾現(xiàn)象的蛋白點(diǎn)，從黃色體中得到了幾百個(gè)蛋白點(diǎn)；(4)它符合質(zhì)譜分析的要求且能揭示出橡膠膠乳蛋白的新功能。


圖1是巴西橡膠膠乳的1-DE和2-DE蛋白圖譜；圖2是巴西橡膠膠乳中的橡膠粒子(A)，C-乳清(B)，黃色體(C)和黃色體膜⑶ 的2-DE蛋白圖譜；圖3和圖4是橡膠膠乳中兩個(gè)特殊蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜圖；圖5和圖6是橡膠粒子中兩個(gè)特殊蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜圖；圖7是本發(fā)明的流程圖。
具體實(shí)施例方式第一部分巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法實(shí)施例1取收集的新鮮巴西橡膠膠乳1ml，加入BPP蛋白提取液5ml進(jìn)行均質(zhì)化，BPP蛋白 提取液的組成為100mM EDTA, 100mM pH為8. 0的Tris (三羥甲基氨基甲烷)，50mM硼砂， 50mM維生素C，重量百分含量為1 %的PVPP，體積百分含量為1 %的Triton X-100，體積百 分含量為2 %的0 -巰基乙醇和重量百分含量為30 %的蔗糖，然后室溫將混合物劇烈漩 渦振蕩30min，總膠乳混合物在UP200S超聲處理器上70W/cm2低溫超聲5min，4°C、15000g 離心15min，下層是我們要收集的純化的總膠乳，收集下層純化的總膠乳，加入其兩倍體積 Tris-飽和酚(pH8. 0)，將各個(gè)混合物室溫漩渦振蕩15min，離心后(4°C，15min，15000g)，將 上層相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并加入與上層相等體積的BPP蛋白提取液，混合物漩渦振蕩 lOmin，在相同條件下離心，再將上層相轉(zhuǎn)到新的離心管，分別加入上層相5倍體積的硫酸 銨沉淀蛋白，_22°C放置6h或過夜，過夜后在4°C，15min，15000g條件下離心，倒去上清，沉 淀用-20°C預(yù)冷6h以上的甲醇洗滌一次，再在4°C，15min, 15000g條件下離心，倒去上清，沉 淀再用-20°C預(yù)冷6h以上的丙酮洗滌兩次，每次洗滌后4°C，15000g離心15min，最后洗完 倒去上清后在空氣中風(fēng)干，用裂解緩沖液重懸即得巴西橡膠蛋白，裂解緩沖液的組成為7M 尿素、2M硫脲、體積百分含量為2%的CHAPS、13mM DTT (二硫蘇糖醇)和體積百分含量為
61% IPG buffer o實(shí)施例2巴西橡膠膠乳組份黃色體的制備過程為鮮巴西橡膠膠乳經(jīng)35000 45000g離 心25 35min，樣品分為三層，最上層為橡膠粒子，中間層為C-乳清，下層為黃色體，移去 上層的橡膠粒子，余下的樣品置于液氮中，冰柱出現(xiàn)后將C-乳清和黃色體分割開得粗提 的黃色體，將所得粗提的黃色體預(yù)處理，預(yù)處理過程為按黃色體與洗滌溶劑的重量體積 比為1 8 12，將粗提的黃色體加入經(jīng)-20°C預(yù)冷的洗滌劑中，冰上放置lOmin，在3 5 °C、25000 35000g離心10 20min后，收集下層沉淀即可，洗滌溶劑的組成為20mM Tris-HCl，300mM 甘露醇 mannitol 和 0. 5mM DTT，且該洗滌溶劑的 pH 為 7. 2。稱取上述預(yù)處理后的黃色體lg，加入4. 5ml的BPP蛋白提取液進(jìn)行均質(zhì)化，BPP 蛋白提取液的組成為100mM EDTA, 100mM pH為8. 0的Tris，50mM硼砂，50mM維生素C， 重量百分含量為1 %的PVPP，體積百分含量為1 %的TritonX-100，體積百分含量為2 %的 3 -巰基乙醇和重量百分含量為30%的蔗糖，然后在室溫下將混合物劇烈漩渦振蕩30min， 混合物在UP200S超聲處理器上70W/cm2低溫超聲5min，在3 5°C、25000 35000g離 心10 20min后，收集下層純化的黃色體，在純化的黃色體中加入3倍體積Tris-飽和酚 (pH 8. 0)，將混合物室溫漩渦振蕩15min，在3 5°C、25000 35000g離心10 20min后， 將上層相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并加入等體積的BPP蛋白提取液，混合物漩渦振蕩lOmin， 在相同條件下離心，再將上層相轉(zhuǎn)到新的離心管，分別加入4. 5倍體積的硫酸銨沉淀蛋 白，-22°C放置6h或過夜，放置后在3 5°C、25000 35000g離心10 20min后，倒去上 清，蛋白沉淀用-20°C預(yù)冷6h以上的甲醇洗滌一次，倒去上清，再用-20°C預(yù)冷6h以上的丙 酮的洗滌兩次，每次洗滌后在3 5°C、25000 35000g離心10 20min，并且倒去上清液， 最后，將洗滌的蛋白在空氣中風(fēng)干，用裂解緩沖液重懸即得巴西橡膠蛋白，裂解緩沖液的組 成為7M尿素、2M硫脲、體積百分含量為2%的CHAPS、13mM DTT和體積百分含量為IPG buffer。實(shí)施例3C-乳清的制備過程為新鮮巴西橡膠膠乳經(jīng)35000 45000g離心25 35min，樣 品分為三層，最上層為橡膠粒子，中間層為C-乳清，下層為黃色體，移去上層的橡膠粒子， 余下的樣品置于液氮中，冰柱出現(xiàn)后將C-乳清和黃色體分割開得粗提的c-乳清，將所得粗 提的c-乳清經(jīng)預(yù)處理，預(yù)處理過程為將粗提的C-乳清在3 5°C、25000 35000g離心 10 20min后即可。取上述預(yù)處理后的C-乳清1ml，加入BPP蛋白提取液5. 5ml,BPP蛋白提取液的組 成為100mM EDTA, 100mM pH為8. 0的Tris，50mM硼砂，50mM維生素C，重量百分含量為1 % 的PVPP，體積百分含量為1 %的Triton X-100，體積百分含量為2%的0 -巰基乙醇和重量 百分含量為30%的蔗糖，然后室溫將混合物劇烈漩渦振蕩30min，混合物在UP200S超聲處 理器上70W/cm2低溫超聲5min，在3 5°C、25000 35000g離心10 20min后，收集下層純 化的C-乳清。接下來，在提純的C-乳清中加入1.5倍體積的Tris-飽和酚(pH 8.0)，將混 合物室溫漩渦振蕩15min，在3 5°C、25000 35000g離心10 20min后，將上層相轉(zhuǎn)移到 新的離心管中，并加入與上層相等體積的BPP蛋白提取液，混合物漩渦振蕩lOmin，在相同 條件下離心，再將上層相轉(zhuǎn)到新的離心管，分別加入5. 5倍體積的硫酸銨沉淀蛋白，-22°C放置6h以上，按上述條件離心后，蛋白沉淀用-20°C預(yù)冷6h以上的甲醇洗滌2次，用-20°C 預(yù)冷6h以上的丙酮洗滌2次，每次洗滌后在3 5°C、25000 35000g離心10 20min， 最后，將洗滌的蛋白在空氣中風(fēng)干，用裂解緩沖液重懸即得巴西橡膠蛋白，裂解緩沖液的組 成為7M尿素、2M硫脲、體積百分含量為2%的CHAPS、13mM DTT和體積百分含量為IPG buffer。實(shí)施例4橡膠粒子的制備過程為鮮巴西橡膠膠乳經(jīng)35000 45000g離心25 35min，樣 品分為三層，最上層為橡膠粒子，中間層為C-乳清，下層為黃色體，上層即為粗提的橡膠粒 子，該粗提的橡膠粒子還需經(jīng)預(yù)處理，預(yù)處理過程為按橡膠粒子和洗滌溶劑的重量體積比 為1 8 12，將橡膠粒子懸浮在經(jīng)-20°C預(yù)冷的洗滌溶劑中，漩渦振蕩30min后，在3 5°C、25000 35000g離心10 20min后，收集流動(dòng)相即可，其中，洗滌溶劑的組成為20mM Tris-HCl,300mM 甘露醇 mannitol 和 0. 5mM DTT,且該洗滌溶劑的 pH 為 7. 2。稱取上述預(yù)處理過的橡膠粒子lg，加入BPP蛋白提取液5ml，BPP蛋白提取液的組 成為100mM EDTA, 100mM pH為8. 0的Tris，50mM硼砂，50mM維生素C，重量百分含量為1 % 的PVPP，體積百分含量為1 %的Triton X-100，體積百分含量為2%的0 -巰基乙醇和重量 百分含量為30%的蔗糖，然后室溫將混合物劇烈漩渦振蕩30min，混合物在UP200S超聲處 理器上70W/cm2低溫超聲5min，在3 5°C、25000 35000g離心10 20min后，收集下層 純化的橡膠粒子，接下來，在提純的橡膠粒子中加入兩倍體積的Tris-飽和酚(pH 8.0)，將 混合物室溫漩渦振蕩15min，在3 5°C、25000 35000g離心10 20min后，將上層相轉(zhuǎn) 移到新的離心管中，并加入等體積的BPP蛋白提取液，混合物漩渦振蕩lOmin，在相同條件 下離心。再將上層相轉(zhuǎn)到新的離心管，分別加入5倍體積的硫酸銨沉淀蛋白，_22°C放置6h 或過夜，按上述條件離心后，蛋白沉淀用-20°C預(yù)冷6h以上的甲醇洗滌1次，用-20°C預(yù)冷 6h以上的丙酮洗滌3次，每次洗滌后在3 5°C、25000 35000g離心10 20min，最后，將 洗滌的蛋白在空氣中風(fēng)干，用裂解緩沖液重懸即得巴西橡膠蛋白，裂解緩沖液的組成為7M 尿素、2M硫脲、體積百分含量為2%的CHAPS、13mM DTT和體積百分含量為IPG buffer。第二部分本發(fā)明提取方法制備的巴西橡膠膠乳蛋白的性能測試2. 1提取的巴西橡膠膠乳蛋白含量的測定用Bradford分光光度計(jì)(Shimadzu UV-160，Kyoto，Japan)測定蛋白濃度，用牛血 清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)，利用上述方法從新鮮的總膠乳、黃色體和C-乳清中提取的蛋白含量分別 為7035士314，5474士219，和7616士280 y g/ml。從lml新鮮膠乳中提取出7. Omg蛋白，占 膠乳總蛋白的50%。提純的C-乳清中可獲得蛋白7. 6mg/ml，如下表1所示。表1橡膠膠乳中不同組份的蛋白產(chǎn)量和2-DE膠上的蛋白檢測點(diǎn)
組份蛋白產(chǎn)量標(biāo)準(zhǔn)誤點(diǎn)的數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)
_Og /ml)_^__誤差
新鮮的總膠乳7035±3141358±6 " 橡膠粒子—一±280583±25
C-乳清7616±2191248±51
黃色體5474—385±15
黃色體膜一724士 33
注SE，標(biāo)準(zhǔn)誤差；_，沒有檢測。2. 2提取的巴西橡膠蛋白的單向電泳和雙向電泳圖譜分析單向電泳使用16厘米凝膠板，分離膠12. 5%聚丙烯酰胺、濃縮膠4%聚丙烯酰胺。 每個(gè)泳道加樣30微克蛋白。在雙向電泳中，24cm的IPG膠條大約上樣800 y g蛋白。pH4_7線性梯度IPG膠條 (GE Healthcare)，室溫重泡漲 24h。根據(jù)說明書(2-DE Manual, GE Healthcare)將膠條置 于Ettan IPGphor等電聚焦系統(tǒng)中進(jìn)行等電聚焦。凝膠使用改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)R250染色方法(Wang et al. 2007b)進(jìn)行染色， 以每英寸 600 點(diǎn)掃描凝膠，用 Image Master 2D Platinum Software (Version 5.0， GEHealthcare)分析。如附圖1所示，從巴西橡膠樹膠乳中提取的膠乳蛋白的l-DE(A)和總膠乳的 2-DE(B)結(jié)果顯示，1-DE中的蛋白圖譜依次是黃色體(泳道1)，C-乳清(泳道2)，橡膠粒 子(泳道3)和總膠乳(泳道4)。M代表分子量標(biāo)記蛋白。總膠乳蛋白中的許多蛋白點(diǎn)被 顯示在右邊2-DE圖譜的B中。有1350個(gè)蛋白點(diǎn)被檢測出來，蛋白點(diǎn)的數(shù)量見表2。圖2中橡膠粒子(A)、C-乳清⑶、黃色體(C)和黃色體膜⑶的2-DE圖譜上依 次檢測到583，1248，385和724個(gè)蛋白點(diǎn)。箭頭指示的蛋白點(diǎn)用MS鑒定。蛋白點(diǎn)的數(shù)量見 表2。在1-DE膠的高低分子量區(qū)都觀察到了特殊蛋白條帶(圖1，A，泳道1-4)，黃色體 樣品只觀察到四條主帶(圖1，A，泳道1)，這與之前報(bào)道過的黃色體蛋白1-DE膠上只有幾 條主帶結(jié)果相一致(Wei et al. 2008 ；ffu et al. 2008)，B_乳清中的蛋白只還不到20個(gè)， 其中，蛋白hevein占B_乳清總可溶性蛋白的50-70% (Yeanget al. 2002)，然而在總膠乳 (圖1，A，泳道4)、橡膠粒子(圖1，A，泳道3)和C-乳清(圖1A，泳道2)的1-DE圖譜上有 30多條蛋白條帶。總膠乳(圖1，A，泳道4)和C-乳清(圖1，泳道2)的1-DE圖譜非常相 似，僅在低分子量區(qū)有幾條差異帶，說明膠乳中蛋白的種類與C-乳清中的相似。得到蛋白點(diǎn)最多的是總膠乳(表1)，在其雙向電泳膠上可見1358士65高度重復(fù) 蛋白點(diǎn)(圖1，B)。C-乳清蛋白的2-DE膠與總膠乳的相似，這和前面的1-DE結(jié)果一致(圖 1，A)，在它的2-DE膠上能看見1200多個(gè)背景清晰無拖尾的蛋白點(diǎn)。橡膠粒子中檢測出 583士25蛋白點(diǎn)(表1 ；圖2，A)，黃色體得到的蛋白點(diǎn)最少385士15(表1 ；圖2，C)，可能是 由于它在1-DE膠上存在幾種高豐度蛋白(圖1，A，泳道1)，嚴(yán)重限制了目標(biāo)蛋白和其他聚 集的蛋白點(diǎn)轉(zhuǎn)移到IPG膠條上，從而影響后續(xù)的等電聚焦，因此造成蛋白點(diǎn)位置的不精確 和許多重要蛋白的鑒定。2. 3提取的橡膠蛋白在雙向電泳膠上高豐區(qū)蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜分析蛋白鑒定使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(Wang et al. 2009)。首先，將凝膠上的 蛋白用牛胰蛋白酶酶解(Wang et al. 2007c)。酶解后，收集多肽并在真空中干燥以用于質(zhì) 譜分析。用 flexAnalysis 軟件(Version 3. 2，Bruker-Daltonics，USA)分析圖譜。將符 合標(biāo)準(zhǔn)的胰蛋白酶肽轉(zhuǎn)移到BioTool質(zhì)譜程序(Bruker-Daltonics)，使用MASCOT軟件在 nonredundant NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分類檢索。70分的高M(jìn)ascot分?jǐn)?shù)(閾值)、高肽覆蓋率 和其他的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都證明2-DE膠上蛋白點(diǎn)的鑒定結(jié)果好。鑒定結(jié)果如附圖3-6所示，4個(gè)蛋白點(diǎn)(點(diǎn)1和3來自于總橡膠膠乳，點(diǎn)6和7來自于橡膠粒子)與表2中的是相對應(yīng)的。PMF圖譜顯示(A，D，G，J)與肽序列中(B，E，H， K)劃線部分相匹配，Mascot分?jǐn)?shù)(C，F(xiàn)，I，L)是根據(jù)點(diǎn)1 (A-C)，點(diǎn)3 (D-F)，點(diǎn)6 (G-I)和點(diǎn) 7(J-L)分別覆蓋的范圍。點(diǎn)6和點(diǎn)7在PMF圖譜中相似并且相匹配的序列被檢測出來，它 們在橡膠粒子中是2種REF的蛋白亞型。為進(jìn)一步確定此法適合質(zhì)譜分析，切取膠乳不同組份在雙向電泳膠上高豐區(qū)的蛋 白點(diǎn)，點(diǎn)的標(biāo)記如圖(圖1，B ；圖2，A-D)，通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析鑒 定出25個(gè)蛋白(詳見附表2)。其中，挑出5個(gè)蛋白譜結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)闡述(圖3-6，A-L)，這 些蛋白點(diǎn)分別是總膠乳(點(diǎn)1和3)、橡膠粒子(點(diǎn)6和7)，點(diǎn)1，點(diǎn)3，點(diǎn)6和點(diǎn)7的肽指紋 譜圖譜(圖3-6，A，D，G，J)、肽序列(圖3-6，B, E，H，K)及Mascot檢索結(jié)果(圖3-6, C， F，I，L)的注釋也被分別表示出來了。Mascot檢索結(jié)果說明它們分別是SRPP(點(diǎn)1)、3-1， 3_葡聚糖酶(點(diǎn)3)、液泡H+-ATPaSe質(zhì)子泵催化A蛋白亞單位(點(diǎn)24)、兩個(gè)橡膠延伸因子 亞型(點(diǎn)6和7)(表2)。肽指紋譜圖譜肽同位素質(zhì)譜簇對應(yīng)的峰范圍為500 3000m/z，大部分低噪信比 的峰分布在1000 2000m/z區(qū)域內(nèi)(圖3_6，A，D，G，J)。這些結(jié)果說明獲得的PMF圖譜質(zhì) 量高且肽質(zhì)譜假象很少。胰蛋白酶的自吸峰或是角蛋白的混入都可造成肽質(zhì)譜假象，嚴(yán)重 影響質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確性。有趣的是兩個(gè)橡膠延伸因子亞型(點(diǎn)6和7)的肽指紋圖譜極為 相似。在點(diǎn)6和點(diǎn)7中都(圖5-6，G和J)觀察到了 1046，1159，1606，1849m/z范圍內(nèi)多肽 質(zhì)譜主峰，說明胰蛋白酶的酶解過程很充分，使2-DE膠上蛋白亞型完全分離開了(圖2，A)。 因此高質(zhì)量的肽指紋譜圖譜增加了與確定蛋白相匹配的多肽的數(shù)量，而隨后產(chǎn)生的Mascot 檢索結(jié)果和序列覆蓋范圍也非常高(圖3-6 ；表2)。在鑒定的25個(gè)蛋白中，有5個(gè)(點(diǎn)1，6，7，8和10)是橡膠粒子(圖2，A)或總膠 乳(圖1，B)中的橡膠蛋白延伸因子或其亞型；有3個(gè)(點(diǎn)1，9，和11)是總膠乳(圖1， B)、橡膠粒子(圖2，A)和C-乳清(圖.2，B)中的SRPP (表2)。仔細(xì)識(shí)別2-DE膠上的這 些蛋白點(diǎn)的特殊位置，我們發(fā)現(xiàn)點(diǎn)1，9和11的圖形很像，且電泳后在同一條帶上。點(diǎn)2，6， 7和8出現(xiàn)了相似的結(jié)果?？偰z乳(圖1，B)和黃色體(圖2，C)中3個(gè)蛋白點(diǎn)(點(diǎn)3，16， 和17)是0-1，3_葡聚糖酶(表2)。毫無疑問的，膠乳其他具有代表性的蛋白也被鑒定出 來了(表2)它們分別是膠乳過敏原(點(diǎn)5和12)，膠乳富集蛋白(點(diǎn)14)，銅/鋅超氧化 物歧化酶蛋白(點(diǎn)15)，幾丁質(zhì)酶A鏈晶體結(jié)構(gòu)(點(diǎn)18)，羥基腈分解酶A鏈(點(diǎn)23)，熱休 克蛋白(HSP) 70家族伴侶腔結(jié)合蛋白(BiP)前體(點(diǎn)25)，和其他蛋白(見表2)。在研究中，鑒定出的高富集蛋白是橡膠粒子(圖2，A)或總?cè)槟z(圖1，B)的 REF (點(diǎn)1，6，7，8和10)。盡管橡膠延伸因子的提取原理仍在進(jìn)一步研究中，但是這種蛋白在 橡膠生物合成過程中起著至關(guān)重要的作用(Yeang et al. 2002)。橡膠延伸因子又名Hevbl 過敏原，是由Dermis和Light首次發(fā)現(xiàn)的(1989)。它與乳清游離橡膠粒子緊密結(jié)合，能催化 異戊烯轉(zhuǎn)移酶將大量順式異戊二烯結(jié)合到橡膠分子上(Dermis and Light 1989 ；Sando et al. 2009)。在此研究中，我們從橡膠粒子(點(diǎn)6，7，8和10)和總膠乳(點(diǎn)2)中鑒定出5種橡 膠延伸因子亞型(表2 ；圖1，B ；圖2，A)，這與Duan等的結(jié)果一致(Duan et al. 2006)。另一 個(gè)橡膠粒子結(jié)合蛋白是SRPP，又名Hevb3過敏原(Yeang et al. 2002 ；Sando et al. 2009)。 有證據(jù)表明SRPP可能和Hevbl—樣在橡膠生物合成中起重要作用(Oh et al. 1999)。然 而，在我們的研究中，我們從橡膠粒子和純化的C-乳清中都分離出來了 SRPP，這與Yan等從患有死皮病的橡膠樹C-乳清中分離出3種SRPP亞型結(jié)果一致(Yan et al. 2008)。以上結(jié) 果表明SRPP不僅與橡膠粒子結(jié)合，其亞型也可能是胞質(zhì)蛋白。膠乳中另一典型蛋白是0-1，3_葡聚糖酶(又名Hevb3)，在我們的研究中(表2) 總膠乳(圖1，B)和黃色體(圖2，C)中都含有它。與之前有報(bào)道的0-1，3_葡聚糖酶存 在于膠乳黃色體中(Churngchow et al. 1995 ；Oh et al. 1999 ；Yeang et al. 2002)結(jié)果一 致。研究人員在研究0-1，3-葡聚糖酶時(shí)，通過膠乳過敏者的IgE鑒定出其是膠乳黃色體 中36kDa的蛋白(Yeang et al. 2002 ；Barre et al. 2009)。微生物入侵高等植物，植物就會(huì) 表達(dá)合成3 -1，3-葡聚糖酶，它和幾丁質(zhì)酶一樣是一種植物病程相關(guān)蛋白，屬于物病程相 關(guān)蛋白2家族(Churngchow et al. 1995 ；Barre et al. 2009)。創(chuàng)傷、乙烯和各種組織病菌 感染及激發(fā)子都能誘導(dǎo)0-1，3-葡聚糖酶的合成，從而抑制真菌類的生長(Churngchow et al. 1995)。膠乳蛋白過敏原Hevb7是一個(gè)43kDa pi 5. 0左右的蛋白，與patatin同源的橡膠 生物合成抑制劑(Posch et al. 1997 ；Yeang et al. 2002 ；Barre et al. 2009)。在總膠乳 (圖1，B)和C-乳清(圖2，B)中鑒定出等電點(diǎn)5. 01分子量43. OkDa(表2)的Hevb7蛋白 (點(diǎn)5和12)。膠乳富集蛋白(gi :4235430)、幾丁質(zhì)酶A鏈(gi 157831407)、Cu/Zn超氧化 物歧化酶(gi :27449246)、羥基腈分解酶(gi :124365253)、V型ATP酶亞單位A(gi =137460) 和其他蛋白如結(jié)合蛋白(gi :62433284)、50S核糖體蛋白(gi 124021007)、肌動(dòng)蛋白(gi 58013197)和氧化酶調(diào)節(jié)劑A0X3前體(gi =162463026)等都是膠乳典型蛋白并且都被鑒定 出來了(表2)。天然橡膠生物合成最重要的兩種蛋白R(shí)EF和SRPP都集中在膠乳粒子中(Yeang et al. 2002 ；Sando et al. 2009)。最近，Sando等報(bào)道REF主要分布在乳管細(xì)胞中，SRPP主要 分布在韌皮部內(nèi)部的乳管細(xì)胞而外部很少(Sando et al. 2009)。因此，他們提出乳管細(xì)胞 橡膠粒子的分布模式，認(rèn)為SRPP在橡膠生物合成過程中起重要作用，而橡膠延伸因子可能 與橡膠延伸的終止有關(guān)(Sando et al. 2009)。在研究中，研究發(fā)現(xiàn)2種橡膠延伸因子，一種 是與SRPP分子量(點(diǎn)9)相似的23kDa蛋白(點(diǎn)10)，另一種是至少有3種亞型(點(diǎn)6_8) 的14kDa蛋白。一般來說，橡膠延伸因子的分子量大約為14kDa(Dennis and Light 1989 ； Yeang et al. 2002 ；Barre etal. 2009 ；Sando et al. 2009)，SRPP 是 23_25kDa 蛋白(Yeang et al. 2002 ；Barre et al. 2009 ；Sando et al. 2009)，眾所周知他們都應(yīng)該是與橡膠粒子 緊密結(jié)合在一起的(Yeang et al. 2002 ；Sando et al. 2009)。然而，在發(fā)明人的研究中，提 出新的關(guān)于橡膠延伸因子分子量和SRPP亞細(xì)胞定位的見解。為證明乙烯在天然橡膠生物 合成中的作用，申請人進(jìn)一步用本發(fā)明提取方法從乙烯處理的橡膠樹膠乳不同組份中提取 蛋白，得到了高分辨率2-DE圖譜。質(zhì)譜分析鑒定出300多種蛋白，并且得到了乙烯反應(yīng)蛋 白。這些結(jié)果說明用本發(fā)明提取的蛋白的方法進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，能揭示出橡膠膠乳膜蛋 白的一些新功能。表2MALDI T0F MS對橡膠膠乳蛋白的鑒定結(jié)果 a是確定蛋白點(diǎn)的數(shù)目，在圖1和圖2中被標(biāo)明了b是依據(jù)NCBInr數(shù)據(jù)庫確定的數(shù)字e’d是蛋白鑒定實(shí)驗(yàn)(c)和理論(d)質(zhì)量(kDa)和等電點(diǎn)6是與PMF相匹配的多肽數(shù)和總的搜查多肽數(shù)f是蛋白鑒定的氨基酸覆蓋范圍8是1^針對NCBInr數(shù)據(jù)庫的查詢分?jǐn)?shù)。上述結(jié)果表明本發(fā)明提取方法可以從橡膠膠乳不同組份包括膜系統(tǒng)中提取蛋白 進(jìn)行蛋白組份析，從總膠乳和C-乳清中提取的蛋白，在考馬斯亮藍(lán)染色的2-DE膠上得到了 上千個(gè)背景清晰無拖尾現(xiàn)象的蛋白點(diǎn)，從黃色體中得到了幾百個(gè)蛋白點(diǎn)。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定出的25個(gè)膠乳蛋白，證明這種方法提取的蛋白適合做雙向電泳和質(zhì)譜分析，能得 到更多具有新功能的膠乳蛋白，這種方法可在全球范圍內(nèi)用于不同乳膠組份蛋白組的比較 蛋白組學(xué)研究。如無特殊指明，上述所采用的試劑或方法均為常規(guī)試劑或常規(guī)方法。以上列舉具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明。需要指出的是，以上實(shí)施例只用于對本 發(fā)明作進(jìn)一步說明，不代表本發(fā)明的保護(hù)范圍，其他人根據(jù)本發(fā)明的提示做出的非本質(zhì)的 修改和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法，其特征在于，包括下述步驟(1)以巴西橡膠膠乳、膠乳組份橡膠粒子、膠乳組份C-乳清或膠乳組份黃色體為原料，其中對巴西橡膠膠乳、膠乳組份C-乳清，按體積比為1∶4.5～5.5，加入BPP蛋白提取液進(jìn)行均質(zhì)化；對膠乳組份橡膠粒子、膠乳組份黃色體，按重量體積比為1∶4.5～5.5，加入BPP蛋白提取液進(jìn)行均質(zhì)化；然后室溫下漩渦振蕩，再經(jīng)超聲和離心處理后，收集下層純化后的原料；(2)在步驟(1)中下層純化后的原料中加入其1.5～3倍體積的pH為8.0的Tris-飽和酚經(jīng)漩渦振蕩后離心處理，然后轉(zhuǎn)移出上層相；(3)在步驟(2)所得上層相中加入與其等體積的BPP蛋白提取液，經(jīng)漩渦振蕩后離心處理，再次轉(zhuǎn)移出上層相；(4)在步驟(3)所得上層相中加入其4.0～6.0倍體積的硫酸銨沉淀蛋白，-22℃放置6h以上，離心取下層蛋白沉淀；(5)將步驟(4)所得下層蛋白沉淀洗滌后離心，在空氣中風(fēng)干，風(fēng)干后的蛋白沉淀用裂解緩沖液重懸后即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法，其特征在于，步驟(1)中所述 的膠乳組份橡膠粒子、膠乳組份C-乳清和膠乳組份黃色體的制備過程為巴西橡膠膠乳經(jīng) 35000 45000g離心25 35min，樣品分為三層，最上層為橡膠粒子，中間層為C-乳清，下 層為黃色體，移去上層的橡膠粒子，余下的樣品置于液氮中，冰柱出現(xiàn)后將C-乳清和黃色 體分割開即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法，其特征在于，所述的膠乳 組份橡膠粒子還需預(yù)處理，所述的預(yù)處理過程為按橡膠粒子與洗滌溶劑的重量體積比為 1 8 12，將橡膠粒子懸浮在經(jīng)-20°C預(yù)冷的洗滌溶劑中，漩渦振蕩30min后，在3 5°C、 25000 35000g離心10 20min后，收集流動(dòng)相即可。
4.權(quán)利要求2所述的巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法，其特征在于，所述的膠乳組份 黃色體還需預(yù)處理，所述的預(yù)處理過程為按黃色體與洗滌溶劑的重量體積比為1 8 12，將粗提的黃色體加入經(jīng)-20°C預(yù)冷的洗滌劑中，冰上放置lOmin，在3 5°C、25000 35000g離心10 20min后，收集下層沉淀即可。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法，其特征在于，所述的洗滌 溶劑的組成為20mM Tris-HCl，300mM甘露醇和0. 5mM DTT，所述洗滌溶劑的pH為7. 2。
6.權(quán)利要求2所述的巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法，其特征在于，所述的膠乳組份 C-乳清還需預(yù)處理，所述的預(yù)處理過程為將粗提的C-乳清在3 5°C、25000 35000g離 心10 20min后即可。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法，其特征在于，步驟(1)和步驟 (3)中所述的BPP蛋白提取液的組成為IOOmM EDTA, IOOmM pH為8. O的Tris，50mM硼砂， 50mM維生素C，重量百分含量為1 %的PVPP，體積百分含量為1 %的Triton X-100，體積百 分含量為2%的β _巰基乙醇和重量百分含量為30%的蔗糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法，其特征在于，步驟(5)中裂解 緩沖液的組成為7Μ尿素、2Μ硫脲、體積百分含量為2%的CHAPS、13mM DTT和體積百分含量 為 IPG buffer ο
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法，其特征在于，步驟(5)中下層 蛋白沉淀的洗滌過程為先采用在-20°C預(yù)冷6h以上的甲醇洗滌1 2次，再采用-20°C預(yù) 冷6h以上的丙酮洗滌2 3次。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法，其特征在于，步驟(1)_(5) 中所述的離心的過程為在3 5°C、25000 35000g離心10 20min。
全文摘要
本發(fā)明公開一種巴西橡膠膠乳蛋白的提取方法，含以下步驟(1)以巴西橡膠膠乳、膠乳組份橡膠粒子、膠乳組份C-乳清或膠乳組份黃色體為原料，加入BPP蛋白提取液進(jìn)行均質(zhì)化，然后室溫下漩渦振蕩，再經(jīng)超聲和離心處理，收集下層純化后原料；(2)在下層純化后原料中加入Tris-飽和酚經(jīng)漩渦振蕩后離心處理，然后轉(zhuǎn)移出上層相；(3)在所得上層相中加入BPP蛋白提取液，經(jīng)漩渦振蕩后離心處理，再次轉(zhuǎn)移出上層相；(4)在所得上層相中加入硫酸銨沉淀蛋白，放置后離心取下層蛋白沉淀；(5)將所得下層蛋白沉淀洗滌后離心，在空氣中風(fēng)干，風(fēng)干后的蛋白沉淀用裂解液重懸后即可。該方法蛋白提取效率高，可從橡膠膠乳不同組份中提取出蛋白。
文檔編號(hào)C07K1/30GK101885755SQ201010197868
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月9日
發(fā)明者王旭初, 王海燕, 田維敏, 郭安平 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所