專(zhuān)利名稱(chēng)：改善的氨基脂質(zhì)和遞送核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用脂質(zhì)顆粒進(jìn)行治療劑遞送的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明提供陽(yáng)離子脂質(zhì)和包含這些脂質(zhì)的脂質(zhì)顆粒(其對(duì)于核酸的體內(nèi)遞送是有利的)，以及適于體內(nèi)治療應(yīng)用的核酸-脂質(zhì)顆粒組合物。另外，本發(fā)明提供制備這些組合物的方法，以及使用這些組合物將核酸引入細(xì)胞中，例如，用于治療各種疾病病癥的方法。相關(guān)技術(shù)的描述例如，治療性核酸包括小干擾RNA(siRNA)，微小RNA(miRNA)，反義寡核苷酸，核酶，質(zhì)粒，和免疫刺激性核酸。這些核酸通過(guò)各種機(jī)制作用。在siRNA或miRNA的情形中， 這些核酸可以通過(guò)稱(chēng)為RNA干擾(RNAi)的過(guò)程下調(diào)特定蛋白的胞內(nèi)水平。在將siRNA或 miRNA引入到細(xì)胞質(zhì)中后，這些雙鏈的RNA構(gòu)建體可以結(jié)合稱(chēng)為RISC的蛋白。所述siRNA 或miRNA的有義鏈由RISC復(fù)合物置換，提供在RISC內(nèi)的模板，所述模板可以識(shí)別并結(jié)合具有與所結(jié)合的siRNA或miRNA的序列互補(bǔ)的序列的mRNA。已經(jīng)結(jié)合互補(bǔ)mRNA后，RISC復(fù)合物將mRNA裂解，并且釋放出所裂解的鏈。RNAi可以通過(guò)靶向相應(yīng)的編碼蛋白合成的mRNA 的特異性破壞而提供特定蛋白的下調(diào)。RNAi的治療性應(yīng)用非常廣泛，因?yàn)閟iRNA和miRNA構(gòu)建體可以用針對(duì)靶蛋白的任何核苷酸序列合成。迄今為止，siRNA構(gòu)建體已經(jīng)在體外和體內(nèi)模型中都表現(xiàn)出特異性下調(diào)靶蛋白的能力。另外，目前正在臨床研究中對(duì)siRNA構(gòu)建體進(jìn)行評(píng)估。然而，siRNA或miRNA構(gòu)建體目前面對(duì)兩個(gè)問(wèn)題，第一，其對(duì)血漿中核酸酶消化的敏感性，第二，當(dāng)其以游離siRNA或miRNA進(jìn)行系統(tǒng)施用時(shí)，其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的能力有限， 在所述細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中其可以結(jié)合RISC。這些雙鏈構(gòu)建體可以通過(guò)在分子內(nèi)結(jié)合化學(xué)修飾的核苷酸接頭而被穩(wěn)定，所述化學(xué)修飾的核苷酸接頭例如硫代磷酸酯基團(tuán)。然而，這些化學(xué)修飾僅提供對(duì)核酸酶消化的有限的保護(hù)，并且可能降低構(gòu)建體的活性?？梢酝ㄟ^(guò)使用載體系統(tǒng)如聚合物、陽(yáng)離子脂質(zhì)體或通過(guò)對(duì)構(gòu)建體進(jìn)行化學(xué)修飾如通過(guò)共價(jià)附著膽固醇分子而促進(jìn)siRNA或miRNA的細(xì)胞內(nèi)遞送[參考文獻(xiàn)]。然而，需要有改善的遞送系統(tǒng)來(lái)提高siRNA 和miRNA分子的功效并且減少或消除對(duì)化學(xué)修飾的需要。
反義寡核苷酸和核酶也可以抑制mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。在反義構(gòu)建體的情形中，這些單鏈脫氧核酸具有與靶蛋白mRNA的序列互補(bǔ)的序列，并且可以通過(guò)沃森-克里克堿基配對(duì)與mRNA結(jié)合。這種結(jié)合防止靶mRNA的翻譯和/或引發(fā)mRNA轉(zhuǎn)錄物的RNA酶H降解。因此，反義寡核苷酸具有極大的作用特異性(即，下調(diào)特定疾病相關(guān)的蛋白)的潛力。迄今為止，這些化合物已經(jīng)在一些體外和體內(nèi)模型中顯示是有希望的，所述模型包括炎性疾病、癌癥、和 HIV 的模型(在 Agrawal，Trends in Biotech.(生物科技趨勢(shì))14 :376-387(1996) 中綜述)。反義也可以通過(guò)與染色體DNA特異性雜交而影響細(xì)胞活性。目前正在進(jìn)行某些反義藥物的高級(jí)人類(lèi)臨床評(píng)估。這些藥物的靶標(biāo)包括bcl2和載脂蛋白B基因和mRNA產(chǎn)物。免疫刺激性核酸包括脫氧核糖核酸和核糖核酸。在脫氧核糖核酸的情形中，已經(jīng)表明某些序列或基序在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫刺激。這些序列或基序包括CpG基序，富含嘧啶的序列和回文序列。據(jù)信脫氧核糖核酸中的CpG基序由內(nèi)體受體、toll樣受體9 (TLR-9) 特異性識(shí)別，然后其引發(fā)先天性和獲得性免疫刺激途徑。還已經(jīng)報(bào)道了一些免疫刺激性核糖核酸序列。據(jù)信這些RNA序列通過(guò)與toll-樣受體6和7(TLR-6和TLR-7)結(jié)合而引發(fā)免疫激活。另外，還報(bào)道了雙鏈RNA是免疫刺激性的，并且據(jù)信通過(guò)與TLR-3結(jié)合而激活。使用治療性核酸的一個(gè)公知的問(wèn)題涉及磷酸二酯核苷酸間鍵合的穩(wěn)定性和該接頭對(duì)核酸酶的敏感性。血清中外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶的存在導(dǎo)致具有磷酸二酯接頭的核酸的快速消化，并且因此，在存在血清或在細(xì)胞內(nèi)的條件下，治療性核酸可能具有非常短的半衰期。(Zelphati, 0.，等，Antisense. Res. Dev.(反義研究發(fā)展)3 :323-338(1993)；和 Thierry, A. R. ^ Gene Regulation =Biology of Antisense RNA and DNA ( ^ ! 反義 RNA 和 DNA 的生物學(xué))(編輯 Erickson，RP 和 Izant，JG ；Raven Press, NY (1992)的第 147-161頁(yè))。由于這些和其它已知的問(wèn)題，目前正處于開(kāi)發(fā)中的治療性核酸不利用在天然核酸中發(fā)現(xiàn)的基本磷酸二酯化學(xué)。通過(guò)減少血清或細(xì)胞內(nèi)降解的化學(xué)修飾部分克服了這一問(wèn)題。已經(jīng)檢測(cè)了在下列中的修飾核苷酸間磷酸二酯橋接(bridge)(例如，使用硫代磷酸酯，甲基磷酸酯或氨基磷酸酯鍵)，核苷酸堿基(例如，5-丙炔基-嘧啶)，或糖(例如，2’-修飾的糖)(mdmarm E.， 等，Antisense :Chemical Modifications (反義化學(xué)修飾)· Encyclopedia of Cancer (癌癥百科全書(shū))，卷X.，第64-81頁(yè)Academic Press Inc.(學(xué)院出版公司)(1997))。其他人已經(jīng)嘗試用2’ -5’糖連接(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，532，130)提高穩(wěn)定性。已經(jīng)嘗試了其它的改變。然而，這些技術(shù)方案無(wú)一被證明是完全令人滿(mǎn)意的，并且在體內(nèi)游離的治療性核酸仍然僅具有有限的功效。另外，如上述關(guān)于SiRNA和miRNA所述，存在與治療性核酸有限的穿過(guò)細(xì)胞膜的能力相關(guān)的問(wèn)題(參見(jiàn)，Vlassov，等，Biochim. Biophys. Acta(生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào))1197 :95-1082(1994))和與系統(tǒng)性毒性相關(guān)的問(wèn)題，如補(bǔ)體介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)，改變的凝結(jié)特性，和血細(xì)胞減少(cytopenia) (Galbraith，等，Antisense Nucl. Acid Drug Des.(反義核酸藥物和疾病)4 =201-206 (1994))。為了嘗試提高功效，研究者還利用基于脂質(zhì)的載體系統(tǒng)來(lái)遞送化學(xué)修飾的或未修飾的治療性核酸。在&切1^^，0和&01 1斤.C.，J. Contr. Rel. 41 :99-119(1996)中，作者提到陰離子(常規(guī)的)脂質(zhì)體、PH敏感的脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、促溶脂質(zhì)體、和陽(yáng)離子脂質(zhì)/反義團(tuán)聚體的使用。相似的siRNA已經(jīng)在陽(yáng)離子脂質(zhì)體中進(jìn)行系統(tǒng)施用，并且已報(bào)道這些核酸-脂質(zhì)顆粒在包括非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的哺乳動(dòng)物中提供靶蛋白的改善的下調(diào)(Zimmermarm 等，Nature (自然)441 :111-114 (2006)) 盡管取得這一進(jìn)步，在本領(lǐng)域中存在對(duì)改善適于常規(guī)治療應(yīng)用的核酸-脂質(zhì)顆粒和組合物的需求。優(yōu)選地，這些組合物將以高效率包封核酸，具有高的藥物脂質(zhì)比率，保護(hù)所包封的核酸免于在血清中降解和清除，適于系統(tǒng)遞送，并且提供所包封的核酸的細(xì)胞內(nèi)遞送。另外，這些核酸-脂質(zhì)顆粒應(yīng)該是良好耐受性的，并且提供充分的治療指數(shù)，以致以有效劑量的核酸進(jìn)行的患者治療不與對(duì)所述患者的顯著的毒性和/或危險(xiǎn)相關(guān)。本發(fā)明提供這樣的組合物、制備所述組合物的方法、和使用所述組合物將核酸引入到細(xì)胞中(包括用于治療疾病)的方法。
可以進(jìn)-中。
權(quán)利要求
1.具有下述結(jié)構(gòu)(II)的氨基脂質(zhì)
2.權(quán)利要求1的氨基脂質(zhì)，其具有下述結(jié)構(gòu)
3.具有下述結(jié)構(gòu)之一的氨基脂質(zhì)
4.包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的氨基脂質(zhì)的脂質(zhì)顆粒。
5.權(quán)利要求4的脂質(zhì)顆粒，其中所述顆粒還包含中性脂質(zhì)和能夠減少顆粒聚集的脂質(zhì)。
6.權(quán)利要求5的脂質(zhì)顆粒，其中所述脂質(zhì)顆粒以約20-60%DLin-K-DMA 5-25%中性脂質(zhì)25-55% Chol 0. 5-15% PEG-脂質(zhì)的摩爾比率包含(i)DLin-K-C2-DMA；(ii)中性脂質(zhì)，其選自DSPC，POPC，DOPE，和SM；(iii)膽固醇；和(iv)PEG-脂質(zhì)。
7.權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的脂質(zhì)顆粒，其還包含治療劑。
8.權(quán)利要求7的脂質(zhì)顆粒，其中所述治療劑是核酸。
9.權(quán)利要求8的脂質(zhì)顆粒，其中所述核酸是質(zhì)粒。
10.權(quán)利要求8的脂質(zhì)顆粒，其中所述核酸是免疫刺激性寡核苷酸。
11.權(quán)利要求8的脂質(zhì)顆粒，其中所述核酸選自由下列各項(xiàng)組成的組siRNA，微小RNA， 反義寡核苷酸和核酶。
12.權(quán)利要求11的脂質(zhì)顆粒，其中所述核酸是siRNA。
13.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的脂質(zhì)顆粒和藥用賦形劑、載體或稀釋劑。
14.一種調(diào)控細(xì)胞的多肽表達(dá)的方法，所述方法包括向細(xì)胞提供權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的脂質(zhì)顆粒。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述治療劑選自siRNA，微小RNA，反義寡核苷酸和能夠表達(dá)siRNA、微小RNA或反義寡核苷酸的質(zhì)粒，并且其中所述siRNA，微小RNA或反義RNA包括這樣的多核苷酸，所述多核苷酸特異性結(jié)合編碼所述多肽的多核苷酸，或其互補(bǔ)體，以使所述多肽的表達(dá)減少。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述治療劑是質(zhì)粒，所述質(zhì)粒編碼所述多肽或其功能變體或片段，以使所述多肽或其功能變體或片段的表達(dá)增加。
17.一種治療受試者中以多肽的過(guò)量表達(dá)為特征的疾病或病癥的方法，所述方法包括向所述受試者提供權(quán)利要求13的藥物組合物，其中所述治療劑選自siRNA，微小RNA，反義寡核苷酸和能夠表達(dá)siRNA、微小RNA或反義寡核苷酸的質(zhì)粒，并且其中所述siRNA，微小 RNA或反義RNA包括這樣的多核苷酸，所述多核苷酸特異性結(jié)合編碼所述多肽的多核苷酸， 或其互補(bǔ)體。
18.一種治療受試者中以多肽的低表達(dá)為特征的疾病或病癥的方法，所述方法包括向所述受試者提供權(quán)利要求13的藥物組合物，其中所述治療劑是編碼所述多肽或其功能變體或片段的質(zhì)粒。
19.一種在受試者誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述受試者提供權(quán)利要求13 的藥物組合物，其中所述治療劑是免疫刺激性寡核苷酸。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述藥物組合物與疫苗或抗原組合提供給患者。
21.一種疫苗，其包含權(quán)利要求10的脂質(zhì)顆粒和與疾病或病原體相關(guān)的抗原。
22.權(quán)利要求21的疫苗，其中所述抗原是腫瘤抗原。
23.權(quán)利要求21的疫苗，其中所述抗原是病毒抗原、細(xì)菌抗原或寄生蟲(chóng)抗原。
全文摘要
本發(fā)明提供用于向細(xì)胞遞送治療劑的優(yōu)良組合物和方法。具體地，這些包括新型脂質(zhì)和核酸-脂質(zhì)顆粒，其提供有效的核酸包封和在體內(nèi)包封的核酸向細(xì)胞的有效遞送。本發(fā)明的組合物是高度有效的，由此允許以相對(duì)低的劑量有效地敲低特定的靶蛋白。另外，與本領(lǐng)域先前已知的組合物和方法相比，本發(fā)明的組合物和方法毒性較小，并且提供較高的治療指數(shù)。
文檔編號(hào)C07D517/00GK102245590SQ200980149266
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2009年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月9日
發(fā)明者托馬斯·D·馬登, 皮埃特·R·卡利斯, 肖恩·C·森普爾, 芭芭拉·穆伊, 邁克爾·J·霍普, 陳建新, 馬爾科·A·丘福利尼 申請(qǐng)人:泰米拉制藥公司, 英屬哥倫比亞大學(xué)