專利名稱：一種快速、高效提取水稻組織總rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域水稻組織總RNA的提取方法。
背景技術(shù)：
近年來，隨著生物技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，基因的克隆和表達(dá)研究，需要從植物材料中 提取高純度的RNA。盡管RNA的提取已經(jīng)成為很成熟的技術(shù)，但在實(shí)際研究中經(jīng)常很難做到 順利獲得質(zhì)量好的RNA。這歸咎于很多因素(如材料的保存不合理、器具不潔凈、操作不嚴(yán) 等)造成RNA的降解。而且提取不同植物材料中RNA的最適宜條件及其相應(yīng)方法也不盡相 同。目前市面上出售的植物總RNA提取試劑盒眾多，但均存在一定的缺陷，如提取時(shí)間長， 提取所需的條件較為苛刻，提取率低，提取的總RNA完整性較差等缺點(diǎn)。然而RNA質(zhì)量的好、 壞決定著實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度高、低。因此獲取一種快速、高效的植物組織RNA提取方法具有 重要的作用。2002年12月水稻基因組測序成功完成，共測定堿基對3億6千600萬個，精確度 達(dá)到99. 99%，并預(yù)測遺傳基因62435個。此后國內(nèi)外眾多學(xué)者將水稻作為一種重要的模式 植物對體內(nèi)的代謝、致病等基因進(jìn)行研究。然而這些研究的基礎(chǔ)都建立在總RNA提取的基 礎(chǔ)上，因此提取獲得一個完整性較好的總RNA是學(xué)者們研究的重要前提。因此本發(fā)明提出 了一種快速、高效提取水稻組織總RNA的方法。以期為水稻基因組學(xué)研究奠定重要的工作 ■石出。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、高效的水稻組織RNA提取方法。本發(fā)明的技術(shù)方案在于一種快速、高效提取水稻組織總RNA的方法，其特征在 于按以下步驟進(jìn)行(1)稱取水稻組織IOOmg置于陶瓷研缽(未滅菌)中，加入液氮后迅速研磨，研磨 時(shí)間控制在Imin之內(nèi)；(2)將研磨后的勻漿倒入1. 5ml EP管中，后加入Iml的Trizol，充分混勻后15s， 加0. 2ml氯仿溶液充分混勻15s ；(3) 12000g離心lOmin，取上層水相轉(zhuǎn)入新的1. 5ml PE管中，加0. 5ml異丙醇，于 20°C下靜置 20min ；(4) 12000g離心lOmin，倒掉上層清液，加Iml現(xiàn)配的75%的乙醇洗滌沉淀二次，取 沉淀物置超凈工作臺吹干，加DEPC水溶解。使用工具的前處理1.5ml PE 管和 1. 5πι1、200μ 1、10μ 1 的槍頭用 0. 的 DEPC 浸泡 12 小時(shí)，然后 120°C高壓蒸汽滅菌20min。0. 1% DEPC、玻璃試劑瓶120°C高壓蒸汽滅菌20min。水稻組織RNA的提取稱取水稻組織IOOmg置于陶瓷研缽(未滅菌)中，液氮中迅速研磨(Imin內(nèi))，倒A 1. 5ml EP管中，后加入lml的Trizol，充分混勻后15s，加0. 2ml氯仿溶液充分混勻15s。 12000g離心lOmin，取上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5ml PE管中，加0. 5ml異丙醇，于_20°C下靜置 20min, 12000g離心lOmin，倒掉上層清液，加lml現(xiàn)配的75%的乙醇洗滌沉淀二次，取沉淀 置超凈工作臺吹干，加DEPC水溶解。整個提取過程在45min內(nèi)完成。運(yùn)用紫外分光光度 法檢測樣品RNA的純度，或以的非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，電泳的電壓 120V，電流80mA，采用穩(wěn)壓電源，緩沖液為的TAE。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、提取時(shí)間短，整個提取操作流程在45min內(nèi)完成。2、提取總RNA完整性好，水稻根部總RNA溶液在紫外吸收波長260nm和280nm下 的吸光度比值為2. 03，其中5s，18s和28s條帶清晰，28s條帶與18s條帶的亮度比值接近 2 ；水稻葉部總RNA溶液在紫外吸收波長260nm和280nm下的吸光度比值為2. 05，其中5s， 16s, 18s, 25s和28s條帶清晰，28s條帶與18s條帶的亮度比值接近2 ；。3、提取效率高，lOOmg的水稻根可提取總RNA量為22. 8825 u g，100mg的葉可提取 的總 RNA 量為 51. 0642 iig。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例一的RNA電泳檢測圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例二的RNA電泳檢測圖。
具體實(shí)施例方式為充分公開本發(fā)明的一種快速、高效提取水稻組織總RNA的方法，以下結(jié)合方法 驗(yàn)證和實(shí)施實(shí)例加以說明。實(shí)施例一 水稻根部組織總RNA的提取稱取三葉一芯其水稻根部組織100mg置于陶瓷研缽(未滅菌)中，液氮中迅速研 磨(lmin內(nèi))，倒入1. 5ml EP管中，后加入lml的Trizol，充分混勻后15s，加0. 2ml氯仿溶 液充分混勻15s。12000g離心lOmin，取上層水相轉(zhuǎn)入新的1. 5ml PE管中，加0. 5ml異丙 醇，-20°C中靜置20min，12000g離心lOmin，倒掉上清，加lml現(xiàn)配的75%的乙醇洗滌沉淀 二次，取沉淀置超凈工作臺吹干，加30iU 0. 1% DEPC水溶解。水稻根部組織總RNA的純度檢測運(yùn)用美國瓦里安Cary50紫外分光光度計(jì)檢測檢測RNA溶液的純度。取上述DEPC 水溶解的RNA溶液1 ii 1，稀釋50倍，測定其在230nm、260nm、280nm、320nm下的吸光度。以 0D260nm/0D280nm的比值計(jì)算RNA純度。結(jié)果0D260nm/0D280nm= 2. 03水稻根部組織總RNA的提取量的計(jì)算根據(jù)RNA濃度的換算公式RNA ( U g/ U L) = 0D260 X 40 X稀釋倍數(shù)/1000由此可得，提取的RNA濃度為0. 76275 ug/uL,提取RNA的量為22. 8825 u g。水稻根部組織總RNA的完整性檢測以1 %的非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。取1 P LRNA溶液，4 y 1DEPC 水，liiL 6XLoading buffer，上樣。電泳檢測條件，電壓120V，電流80mA，穩(wěn)壓，緩沖液為
4的TAE，電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-12C型。水稻根部組織總RNA的電泳圖片如圖1所示，可見，5s，18s和28s條帶清晰，28s條帶與18s條帶的亮度比值接近2。實(shí)施例二水稻葉部組織總RNA的提取稱取三葉一芯其水稻葉部組織IOOmg置于陶瓷研缽(未滅菌)中，液氮中迅速研 磨(Imin內(nèi))，倒入1. 5ml EP管中，后加入Iml的Trizol，充分混勻后15s，加0. 2ml氯仿溶 液充分混勻15s。12000g離心lOmin，取上層水相轉(zhuǎn)入新的1. 5ml PE管中，加0. 5ml異丙 醇，-20°C中靜置20min，12000g離心lOmin，倒掉上清，加Iml現(xiàn)配的75%的乙醇洗滌沉淀 二次，取沉淀置超凈工作臺吹干，加30 μ 1 0. 1% DEPC水溶解。水稻葉部組織總RNA的純度檢測運(yùn)用美國瓦里安Cary50紫外分光光度計(jì)檢測檢測RNA溶液的純度。取上述DEPC 水溶解的RNA溶液30 μ 1，取1 μ 1稀釋50倍，測定其在230nm、260nm、280nm、320nm下的吸 光度。以0D260nm/0D280nm的比值計(jì)算RNA純度。結(jié)果0D260nm/0D280nm= 2. 05水稻葉部組織總RNA的提取量的計(jì)算根據(jù)RNA濃度的換算公式RNA ( μ g/ μ L) = 0D260 X 40 X稀釋倍數(shù)/1000由此得，提取的RNA濃度為1. 70214 μ g/ μ L，提取RNA量為51. 0642 μ g水稻葉部組織總RNA的完整性檢測 以1 %的非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。取1 μ LRNA溶液，4ul DEPC 水，IyL 6 X Loading buffer，上樣。電泳檢測條件，電壓120V，電流80mA，穩(wěn)壓，緩沖液為 的TAE，電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-12C型。水稻葉部組織總RNA的電泳圖片 如圖2所示，可見，5s, 16s, 18s, 25s和28s條帶清晰，28s條帶與18s條帶的亮度比值接近 2。 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
一種快速、高效提取水稻組織總RNA的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行(1)稱取水稻組織100mg置于陶瓷研缽(未滅菌)中，加入液氮后迅速研磨，研磨時(shí)間控制在1min之內(nèi)；(2)將研磨后的勻漿倒入1.5ml EP管中，后加入1ml的Trizol，充分混勻后15s，加0.2ml氯仿溶液充分混勻15s；(3)12000g離心10min，取上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5ml PE管中，加0.5ml異丙醇，于-20℃下靜置20min；(4)12000g離心10min，倒掉上層清液，加1ml現(xiàn)配的75％的乙醇洗滌沉淀二次，取沉淀物置超凈工作臺吹干，加DEPC水溶解。
2.根據(jù)權(quán)利要去1所述的快速、高效提取水稻組織總RNA的方法，其特征在于整個提 取過程在45min內(nèi)完成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速、高效提取水稻組織總RNA的方法，其特征在于RNA提 取完成后采用的非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速、高效提取水稻組織總RNA的方法，其特征在于電泳電 壓為120V，電流為80mA，采用穩(wěn)壓電源，緩沖液為的TAE。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速、高效提取水稻組織總RNA的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行稱取水稻組織100mg置于陶瓷研缽(未滅菌)中，加入液氮后迅速研磨，研磨時(shí)間控制在1min之內(nèi)；將研磨后的勻漿倒入1.5ml EP管中，后加入1ml的Trizol，充分混勻后15s，加0.2ml氯仿溶液充分混勻15s；12000g離心10min，取上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5ml PE管中，加0.5ml異丙醇，于20℃下靜置20min；12000g離心10min，倒掉上層清液，加1ml現(xiàn)配的75％的乙醇洗滌沉淀二次，取沉淀物置超凈工作臺吹干，加DEPC水溶解。本發(fā)明水稻組織總RNA的提取方法具有快速、高效、完整性等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C07H21/02GK101875930SQ20091031060
公開日2010年11月3日 申請日期2009年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月28日
發(fā)明者何海斌, 葉陳英, 方長旬, 林志華, 林文雄, 王海斌, 陳榮山 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)