專利名稱：新型細胞凋亡檢測試劑及相關(guān)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更確切地說基于現(xiàn)代生物化學(xué)技術(shù)和現(xiàn)代蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)制 備新型細胞凋亡檢測試劑，并形成相應(yīng)的細胞凋亡檢測試劑盒，其制備及應(yīng)用特點。
背景技術(shù)：
一、人膜聯(lián)蛋白V (AnnexinV)的背景知識
人膜聯(lián)蛋白是一種鈣離子依賴性膜磷脂結(jié)合蛋白質(zhì)。它分布廣泛，在多種組織細胞(如 心肌細胞、血管內(nèi)皮、骨骼肌、肝細胞等)中有表達。人膜聯(lián)蛋白V是人體內(nèi)存在的一種蛋 白質(zhì)，共由319個氨基酸殘基組成，分子量約為36kDalton,等電點4.71 [Rand J H. "Amexin opathies" a new class of diseases [J]. Nature, 1999, 340 (13):1035-1036.]。它含有一個半胱氨酸殘
基，位于第四個重復(fù)序列中。在四級結(jié)構(gòu)中，此半胱氨酸殘基被埋藏在分子:內(nèi)部，只有在變
性條件下，它才暴露在表面，允許人膜聯(lián)蛋白v形成同源二聚體。人膜聯(lián)蛋白v只含有一個
潛在的糖基化位點，但它是一個非糖基化蛋白。人膜聯(lián)蛋白V最早由胎盤分離出來[YueYF，
Jiang H, Shi L, et al. Study on the mechanism of intrauterine infection of hepatitis B virus[J]. Chin J
Obstet Gynecol, 2004， 39(4): 224,6.]。從上世紀80年代開始，人們對人膜聯(lián)蛋白V的功能和結(jié)
構(gòu)進行了研究[Fadok VA, Savill JS, Haslett C, et al. Differnt populations of maciphages use either
the vitrotin receptor or the phosphatidylaerine rceptor to rcognize and rmove apoptotic cells[J]. J
Immoral, 1992 ,149: 4029; De ]VIeyer S. Influence of the administration of human annexin V on in
vitro binding of small hepatitis B surface antigen to human and to rat hepatocyte.[J] Viral Hepat,
2000，7 (2): 104; Patel S K， MaN, Monks T J， et al. Changes in gene expression during Chemical
induced nephrocarcinogenicity in the Eker rat [J]. Mol Car cinog， 2003, 38 (3):141-154.]。人膜聯(lián)蛋
白V的cDNA已經(jīng)被確定。[Liu JY.Yang Liu F,et al. Preparation of recombinat protein of
extracellular ligand binding domains of mouse VEGF receptor 2 a nd its application[J].China
Journal of Modern Medicine,2003,12 (24):2L]。人膜聯(lián)蛋白V的兩個結(jié)構(gòu)域位于其N端的尾部
和C端的核心區(qū)。C端結(jié)構(gòu)域是高度保守的，同人膜聯(lián)蛋白家族中的其他成員一樣，都是由
4個含有約70個氨基酸殘基組成的重復(fù)序列構(gòu)成。而N端序列的同源性卻小于5%[ Hawkins
TE,Christien J,Merrifield,et al. Calcium signaling and annexins[J]. Cell Biophys， 2000， 33:275-
296.]。另外，在其N端含有兩個蘇氨酸殘基，但是在標(biāo)準(zhǔn)的磷酸化條件下，不能被磷酸化。
人膜聯(lián)蛋白V不含有信號肽和可能跨越磷脂雙分子層的疏水序列，但它能被分泌到胞外，其
機制目前仍不十分清楚。天然來源的人膜聯(lián)蛋白V含量低，無法批量提供。目前人膜聯(lián)蛋白V的制備一般是通過基因工程技術(shù)在大腸桿菌中對人膜聯(lián)蛋白v基因進行直接表達，進一步
地，再對其表達產(chǎn)物形成的包涵體進行變復(fù)性處理，以及后期一系列的純化步驟，最終制備
人膜聯(lián)蛋白v蛋白質(zhì)[陳大明，謝虹，祁本忠，張穎梅，賈兵，楊紅偉，羅志福，張錦榮，金 小海，王凡，馬大龍。細胞凋亡檢測蛋白AnnexinV的制備純化和初步評價。原子能科學(xué)技 術(shù)，38， Siipl， 182-187]。純化工藝相對復(fù)雜，并且存在包涵體變復(fù)性處理，對其分子結(jié)構(gòu) 有一定影響，對后期蛋白的得率也有較大影響。目前，人膜聯(lián)蛋白V經(jīng)過FITC或者PI標(biāo)記 后，用于體外細胞凋亡的檢測分析，同時，放射性標(biāo)記人膜聯(lián)蛋白V的核醫(yī)學(xué)顯像還用于體 內(nèi)生物活體的細胞凋亡檢測分析。放射性人膜聯(lián)蛋白V的核醫(yī)學(xué)顯像劑主要包括99Tcm和碘 (123' 124' 125' 1311)以及1SF標(biāo)記的人膜聯(lián)蛋白V[Blankeneberg FG, Katsikis PD, TaitJF， et al. In vivo dictation during programmed cell death[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95,6349-6354]。
二、細胞凋亡的檢測技術(shù)
細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件下，受內(nèi)在遺傳機制的控制自動結(jié)束生命的 過程[Schmechel DE, Saunders AM, Strittoatter WS, Crain BJ, Hulette CM， Joo SH， et al. Increased amyloid beta-peptide deposition in cerebral cortex as a consequence of apolipoprotein E genotype in late-onset Alzheimer's disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:9649—9653.]。細胞 凋亡是一種積極排除生物體內(nèi)的過剩細胞和有害細胞的機制，在個體形態(tài)形成、形態(tài)改變等 發(fā)生過程中，在成體的恒常性的維持以及生物體的防御等方面發(fā)揮作用。該現(xiàn)象是以細胞核 濃縮、染色體DNA被以核小體為單位切成梯狀片段、細胞縮小，最終形成細胞凋亡小體等 形態(tài)變化為特征。不引起周圍細胞的溶解。細胞凋亡是在細胞群中散.發(fā)，階段性進行的，并 且依存于ATP的供給和RNA、蛋白質(zhì)的合成，是主動排除機制，不僅在個體發(fā)育時和卵細胞 退縮等生理狀態(tài)下可觀察到，而且在自身免疫性疾病、神經(jīng)變質(zhì)性疾病、缺血性疾病等很多 疾病及病理狀態(tài)下也可觀察到[Sorbi S, Nacmias B, Forleo P, Piacentini S, Latorraca S, Amaducci L. Epistatic effect of APP717 mutation and apolipoprotein genotype in familial Alzheimer's disease[J]. Ann Neurol 1995,38:124-127.]。細胞凋亡的細胞內(nèi)信息傳導(dǎo)途徑可大致 分為二個階段，即誘導(dǎo)階段和實行階段。近來研究表明，細胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)不在細胞 核，而在細胞質(zhì)。在凋亡細胞被誘導(dǎo)產(chǎn)生特征性形態(tài)改變和DNA降解之前，線粒體膜功能 發(fā)生改變，內(nèi)膜跨膜電位消失和線粒體內(nèi)蛋白酶活化物的釋放，激發(fā)各種凋亡相關(guān)的代謝變 化。誘導(dǎo)細胞凋亡的因素有內(nèi)源性的和外源性的因素。內(nèi)源性的因素包括細胞凋亡誘發(fā)機制 (如Fas配體、腫瘤壞死因子等)的激活和抑制機制(生長因子、激素、受體因子等增殖性 因子)的失活[St George- Hyslop PM, McLachlan D, Tsuda T, Rogaev E, Karlinsky H, Lippa CF,et al. Alzheimer's disease and possible gene interactions [J]. Science 1994,263:537.]。夕卜源性的因素 包括放射線、熱休克等物理性因素，藥物、毒物等化學(xué)性因素以及病毒、細菌等生物學(xué)因素。 近年來還發(fā)現(xiàn)活性氧以及一氧化氮在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、免疫性疾病及老化等方面
的作用都不同程度地與細胞凋亡有關(guān)。細胞凋亡的檢測方法目前有如下幾種方式1、形態(tài)學(xué)
觀察。(1) HE染色結(jié)合、光鏡觀察。凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團塊 狀，細胞表面有"出芽"現(xiàn)象。(2) 丫啶橙(AO)染色、熒光顯微鏡觀察。活細胞核呈黃綠 色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質(zhì)呈黃綠色，濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見細胞膜呈泡 狀月彭出及凋亡小體[Suzuki N， Cheung T, Cai X-D, et al. An increased percentage of long amyloid proteinprecursor(「APP717)mutants[J]. Science 1994,264:1336—1340.]。 (3)臺盼藍染色。如果 細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞 不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區(qū)別壞死細胞 有一定的幫助。(4)透射電鏡觀察?？梢姷蛲黾毎砻嫖⒔q毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集， 常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出"芽"及凋亡小體和凋亡小 體被臨近巨噬細胞吞噬現(xiàn)象。2、 DNA凝膠電泳。當(dāng)細胞發(fā)生凋亡或壞死，其細胞DNA均發(fā) 生斷裂，細胞內(nèi)小分子量DNA片斷增加，高分子量DNA減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA片斷。但 凋亡細胞DNA斷裂點均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180—200bpDNA片段，而壞死細 胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片段。利用此特征可以確定群體細胞的死亡，并可與壞死 細胞區(qū)別。正?；罴毎鸇NA電泳出現(xiàn)階梯狀(Ladder)條帶；壞死細胞DNA電泳類似血抹 片時的連續(xù)性條帶。3、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進行核小體測定。凋亡細胞的DNA斷裂 使細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片段組成，可由ELISA法檢測 [Teller JK, Russo C, DeBisk LM, Angelini G, Zaccheo D, Dagna-Bricarelli F, et al. Presence of soluble amyloid peptide precedes amyloid plaque formation in Down's Syndrome[J]. Nature Med 1996,2:93-95.]。該法敏感性高。同時，不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能精確測定 凋亡細胞發(fā)生的絕對量。4、流式細胞儀定量分析。該方法也是一種常用的檢測方法。檢測原 理是當(dāng)細胞發(fā)生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之 間。利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒 光強度來區(qū)分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞[Martin SJ， Reutelingsperger CP, McGahon AJ, Rader JA, van Schie RC, LaFace DM， Green DR. Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus: inhibition by overexpression ofBcl-2 and Abl[J]. J Exp Med 1995,182:1545-1556.]。利用Hoechs-PI染色法， 正常細胞對染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細胞主要攝取Hoecha染料，呈現(xiàn)強藍色熒光，
5而壞死細胞主要攝取碘化丙啶(PI)而呈強的紅色熒光。檢測細胞膜成分變化的人膜聯(lián)蛋白 V(AnnexinV)聯(lián)合PI法的基本原理是:在細胞凋亡早期位于細胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(PS) 遷移至細胞膜外測[Koopman G, Reutelingsperger CP, Kuijten GA， Keehnen RM， Pals ST, van Oers MH. Aimexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis[J]. Blood 1994,84:1415—1420.]。人膜聯(lián)蛋白V是一種鈣依賴性的磷脂結(jié) 合蛋白，它與PS具有高度的結(jié)合力。因此，人膜聯(lián)蛋白V可以作為探針檢測暴露在細胞外 測的磷脂酰絲氨酸。將人膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記上熒光素(如熒光素異硫氰酸酯FITC)，同時結(jié)合 使用PI(因壞死細胞PS亦暴露于細胞膜外測，且對PI高染)，進行凋亡細胞雙染法后用流式 細胞儀，即可檢測凋亡細胞。對于正?；罴毎?，人膜聯(lián)蛋白V、 PI均低染；對于凋亡細胞， 人膜聯(lián)蛋白V高染、PI低染；而對于壞死細胞，人膜聯(lián)蛋白V、 PI均高染。當(dāng)細胞發(fā)生凋亡 時，膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此人膜聯(lián)蛋白V聯(lián)合PI染色法檢測早期細胞凋 亡更為靈敏。人膜聯(lián)蛋白V聯(lián)合PI染色不需要固定細胞，可避免其他方法因固定造成的細胞 碎片過多或因固定出現(xiàn)DNA片段丟失[Mochizuki T， Kuge Y, Zhao S, Tsukamoto E, Hosokawa M, Strauss HW, BIankenberg FG, Tait JF, Tamaki N. Detection of apoptotic tumor response in vivo after a single dose of chemotherapy with 99mTc-a獄xin V[J]. J Nucl Med 2003,44:92—97.]。因此， 人膜聯(lián)蛋白V聯(lián)合PI染色法更省時，結(jié)果更為可靠，是目前最為理想的檢測細胞凋亡的方法。
三、熒光標(biāo)記技術(shù)
熒光標(biāo)記技術(shù)是指利用一些能發(fā)射熒光的物質(zhì)共價結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某 個基團上，利用它的熒光特性來提供被研究對象的信息。有機物質(zhì)分子在吸收光能后，分子 從激發(fā)態(tài)的最低振動能級向基態(tài)躍遷時的發(fā)射光稱為熒光。可以利用熒光染料與被研究對象 (蛋白質(zhì)、核酸等)吸附或共價結(jié)合后其熒光特性發(fā)生改變，從而反映出有關(guān)研究對象性能 的信息。熒光標(biāo)記技術(shù)起源于20世紀40年代時用熒光標(biāo)記抗體來檢測相應(yīng)的抗原。隨著現(xiàn) 代醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)和各種先進熒光檢測儀器及技術(shù)的應(yīng)用，熒光標(biāo)記作為一種非放射性的 標(biāo)記技術(shù)己應(yīng)用于生命科學(xué)的各個研究領(lǐng)域，并取得了迅速的發(fā)展。熒光標(biāo)記具有非放射性、 操作簡便、高穩(wěn)定性、高靈敏度和高選擇性等特點，且熒光標(biāo)記染料種類多、方法靈活，可 應(yīng)用于多種生物大分子及藥物的標(biāo)記[Evans KC， Berger EP, Cho C-G， Weisgraber KH， Lansbury PT. Apolipoprotein E is a kinetic but not a thermodynamic inhibitor of amyloid formation: implications for the pathogenesis and treatment of Alzheimer's disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA 1995,92:763—767; Hyman BT, West HL, Rebeck GW, Lai F, M纖DMA.Neur叩athological changes in Down's Syndrome hippocampal formation: effect of age and apolipoprotein E
6genotype[J]. Arch Neurol 1995,52:373—378.]。
常用的熒光標(biāo)記染料有以下幾類1、熒光素類染料。熒光素類染料的光穩(wěn)定性好，熒光
量子產(chǎn)率高，其活性基團易與被標(biāo)記分子中的-NH2， -OH， -SH等結(jié)合，常應(yīng)用于對蛋白質(zhì)、 核酸等物質(zhì)的分析。熒光素類標(biāo)記試劑包括標(biāo)準(zhǔn)熒光素及其衍生物，如熒光素異硫氰酸酯 (FITC)、羥基熒光素(FAM)、四氯熒光素(TET)等。其中FITC是應(yīng)用最為廣泛的一種 熒光素衍生物，廣泛用于雜交探針、Edman蛋白質(zhì)測序法及抗體的標(biāo)記。FAM、 TET主要用 于DNA自動測序和核酸探針等。但熒光素類衍生物的缺點是光淬滅率高、pH敏感性強和 發(fā)射波譜寬[Ignatius MJ, Gebicke-Haerter PJ, Skene JHP, Schilling JW,Weisgraber KH, Mahley RW, et al. Expression of apolipoprotein E during nerve degeneration and regeneration[J]. Proc Natl AcadSciUSA，1986,83: 1125-1129.]。 2、羅丹明類染料。羅丹明類染料(rhodamine dye)是生 物技術(shù)中常用的蛋白質(zhì)分析染料之一，主要包括R101、四乙基羅丹明(RB200)和羧基四甲 基羅丹明(TAMRA)等。在標(biāo)記反應(yīng)中活性基團大多與-NH2結(jié)合。與熒光素類衍生物相比， 羅丹明類具有更強的光穩(wěn)定性、更高的熒光產(chǎn)量和更低的pH敏感性。3、菁染料。菁染料是 一種比較特殊的染料，在光照下不穩(wěn)定。但它的摩爾消光系數(shù)高、光譜范圍廣且光量子產(chǎn)率 高。利用它的這些特性，已經(jīng)將其應(yīng)用于生物大分子熒光標(biāo)記。菁染料與雙鏈核酸結(jié)合時(包 括DNA和RNA)，其熒光強度會增加。當(dāng)專門用于DNA標(biāo)記時，必須先加入RNA酶進行 處理。菁染料也可以與寡核苷酸探針同時使用，以顯示和定量分析細胞中的特定核酸序列。 目前研究比較活躍的菁染料主要有兩大類， 一類是噻唑橙(thiazole orange， TO)、嗯唑橙 (oxazole orange, YO)系列及其二聚體染料；另一類是多甲川系列菁染料。菁染料主要用于 標(biāo)記核酸。4、其他熒光染料。二苯乙烯、萘酰亞胺、香豆素類、吖啶類、芘類等都可用于蛋 白質(zhì)標(biāo)記。菲啶類、吲哚、哌洛寧、色素酶A3等可用于標(biāo)記核酸[Kowall NC, McKee AC， Yankner BA, Beal MF. In vivo neurotoxicity of beta amyloid 「 (1~40) and the 「 (25—35) fragment[J]. Neurobiol Aging 1992,13:537-542.]。此外，以硼酸鹽為基質(zhì)的發(fā)光材料因具有合 成溫度低、易制備和亮度高等特點，也被認為是有價值的發(fā)光基質(zhì)。如某些稀土硼酸鹽以及 以摻雜稀土離子的硼酸鹽。
熒光標(biāo)記技術(shù)在蛋白質(zhì)和核酸分析研究中應(yīng)用廣泛，這種標(biāo)記方法在其它物質(zhì)的檢測中 同樣具有重要的作用。例如還原末端的多糖及寡糖的熒光標(biāo)記；利用分子熒光特性能直接 測定藥品與人血清中某些特定物質(zhì)的含量；熒光標(biāo)記還可以用于表征生物活性分子的自由基 等等[LaDu M， Falduto M, Manelli A, Reardon C, Getz G, Frail D.Isoform-specific binding of apolipoprotein E to amyloid[J]. J Biol Chem 1994,269:23403—23406.]。
蛋白質(zhì)熒光衍生化是將蛋白質(zhì)中氨基酸的一些功能性基團共價連接上熒光物質(zhì)。其中最常用的衍生化位點就是氨基。氨基上的氫原子在堿性條件下可被取代，因反應(yīng)較溫和，被廣 泛采用。能與氨基起反應(yīng)的熒光衍生化試劑主要包括芳香鄰二醛類如鄰苯二甲醛(OPA);酰
氯類如丹磺酰氯(Dns-CL);氯甲酸酯類如芴甲氧羰基氯(FNOC-CL);氰酸酯類如熒光素異 硫氰酸酯(FITC);碳酸脂類如6-氨喹啉基-N-琥珀酰亞胺碳酸脂；酸酐類如N-9-芴甲氧基 碳酰-氨基酸基-N-羧酸酐。氨基酸羧基也可以作為衍生化位點，但是因為需要的反應(yīng)體系要 求較高，因此在應(yīng)用上遠沒有氨基衍生化應(yīng)用的廣泛。能與羧基起反應(yīng)的熒光試劑主要包括 香豆素類如4-溴甲基-7-甲氧基香豆素(Br-Mmc);重氮甲烷類如l-芘重氮甲烷；苯胺類如9， 10-二氨基菲和芳香鹵代垸類如9-氯甲基蒽。其他可以衍生化的位點還有羰基，衍生化試劑有 肼類試劑如丹磺酰肼，鄰苯二胺類如鄰苯二胺；巰基熒光衍生化，衍生化試劑有N-[P-苯-l,3 -氧氮雜茂]-苯馬來酰亞胺(BIPM) [Neve RL, Dawes LR， Yankner BA, Benewitz LL， Rodriguez W,Higgins GA. Genetics and biology of the Alzheimer's amyloid precursor[.T]. Prog Brain Res 1990,86:257-267.]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明著眼研制一種高效、靈敏、經(jīng)濟的新型細胞凋亡檢測試劑。首先，應(yīng)用融合蛋白 表達技術(shù)制備了偶聯(lián)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)的人膜聯(lián)蛋白V重組融合蛋白(命名為 GPPAN-V)。重組蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)如圖1所示。對GPPAN-V蛋白質(zhì)進行了 SDS-PAGE電 泳鑒定。如圖2所示。鑒定結(jié)果表明，制備的GPPAN-V重組蛋白質(zhì)純度較高，并且溶解性 良好。電泳鑒定還表明，GPPAN-V結(jié)構(gòu)均一性良好。氨基酸組成實驗表明，氨基酸組成與預(yù) 期一致。對GPPAN-V的多種研究表明，人膜聯(lián)蛋白V偶聯(lián)GST后，其生物學(xué)活性仍舊保持 不變，能夠正常展示其生物學(xué)功能。對GPPAN-V重組蛋白質(zhì)進行FITC的化學(xué)偶聯(lián)結(jié)合實驗， 制備出FITC熒光標(biāo)記的GPPAN-V重組蛋白質(zhì)FITC-GPPAN-V。對FITC-GPPAN-V進行純化， 純化圖譜如圖3所示。對純化后的FITC-GPPAN-V進行電泳鑒定，電泳鑒定圖如圖4所示， 電泳鑒定結(jié)果表明FITC-GPPAN-V的化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，均一性較好。FITC化學(xué)標(biāo)記的GPPAN-V 重組蛋白質(zhì)目測顯示綠色熒光，在熒光顯微鏡下檢測進一步驗證了以上觀測結(jié)果。隨后，將 自行制備的FITC標(biāo)記的GPPAN-V重組蛋白質(zhì)作為新型細胞凋亡檢測試劑應(yīng)用于對細胞凋亡 的檢測分析中，同時以市場上己有的、以FITC標(biāo)記的人膜聯(lián)蛋白V作為主要檢測試劑的商 品化試劑盒作為對照。經(jīng)不同方法標(biāo)記的凋亡細胞經(jīng)流式細胞儀檢測，分別分成未標(biāo)記細胞 組、單標(biāo)PI細胞組、單標(biāo)FITC-GPPAN-V細胞組、雙標(biāo)FITC-GPPAN-V和PI細胞組、雙標(biāo) 市場上購買的商品化試劑盒FITC標(biāo)記的人膜聯(lián)蛋白V和PI細胞組。其中，單標(biāo)PI細胞組 檢測的是凋亡晚期的細胞，單標(biāo)人膜聯(lián)蛋白V-FITC檢測到的是凋亡早期的細胞，而雙標(biāo)人膜
8聯(lián)蛋白V-FITC和PI能將凋亡早期和晚期的細胞區(qū)分丌。檢測實驗結(jié)果如圖5所示，圖5為 以商品化FITC-人膜聯(lián)蛋白V試劑盒為對照，使用新型標(biāo)記蛋白質(zhì)FITC-GPPAN-V對凋亡細 胞檢測的結(jié)果。實驗結(jié)果表明，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記的GPPAN-V新型重組蛋白質(zhì)同樣能夠用于細 胞凋亡的檢測分析，使用該試劑的實驗組同樣展示出細胞早期凋亡的現(xiàn)象，其效果與目前商 品化的FITC標(biāo)記人膜聯(lián)蛋白V的試劑盒檢測效果相問。實驗結(jié)果也進一步驗證了連接有標(biāo) 簽蛋白GST的GPPAN-V重組蛋白質(zhì)中的人膜聯(lián)蛋白V結(jié)構(gòu)能夠正確折疊，從而展示出人膜 聯(lián)蛋白V的生物學(xué)功能。所以我們研制的FITC-GPPAN-V可以作為一個新的有效的用于細胞 凋亡檢測的工具。由T GPPAN-V重組蛋白質(zhì)的制備要比制備單獨的高純度的人膜聯(lián)蚩白V 蛋白容易得多，這意味著試劑盒的成本可以降低，從而形成一種新穎有效的有前途的新型細 胞凋亡檢測試劑盒，更好地應(yīng)用于科學(xué)研究、檢測分析，甚至實際臨床應(yīng)用中。 以FITC-GPPAN-V為主要成份的細胞凋亡檢測試劑盒有如下特點
1、 有效性。細胞凋亡作為一個現(xiàn)代生命科學(xué)，尤其是細胞生物學(xué)及相關(guān)醫(yī)療診斷、治療 方面的一個熱點，被廣泛研究和關(guān)注，大量相關(guān)科學(xué)研究需要進行細胞凋亡的檢測以獲得重 要的科學(xué)研究數(shù)據(jù)與結(jié)果。FITC-、GPPAN-V與其他商品化試劑，如PI,可以形成-個簡單實 用的檢測試劑盒，能夠高效、靈敏地進行這一檢測過程。
2、 經(jīng)濟性。也是它的實用性。目前，市場上的細胞凋亡檢測試劑盒價格昂貴， 一方面原 因是主要的檢測試劑"FITC標(biāo)記的人膜聯(lián)蛋白V"生產(chǎn)成本高。人膜聯(lián)蛋白V的純化工藝相 對于GPPAN-V要復(fù)雜得多，它通常包括舞雜的包涵體變復(fù)性處理步驟，這進一步影響了其 產(chǎn)量得率，也對人膜聯(lián)蛋白V蛋白質(zhì)本身的穩(wěn)定性有負面影響，這限制了其應(yīng)用。GPPAN-V 重組蛋白質(zhì)的制備相比于目前人膜聯(lián)蛋白V的制備，要簡單得多，表達產(chǎn)物以可溶形式存在， 無需進行復(fù)雜的包涵體處理步驟，而且，后期純化只需要簡單的一步親和層析即可完成制備 過程。同時，基于現(xiàn)代基因工程技術(shù)，重組工程菌可以高密度發(fā)酵，非常適合工業(yè)化大規(guī)模 生產(chǎn)，這又進一步降低了成本。同時，我們的研究證實，GPPAN-V可以被有效地進行FITC 熒光標(biāo)記，從而制備出FITC-GPPAN-V，應(yīng)用于檢測。所以，以FITC-GPPAN-V為主要成分 的檢測試劑盒生產(chǎn)成本大大降低，有利于其推廣使用。這也使得我們研制的GPPAN-V重組 蛋白質(zhì)在實用性方面優(yōu)于目前市場上已有的細胞凋亡檢測試劑盒。
3、 新穎性。首次將GST偶聯(lián)的人膜聯(lián)蛋白V (GPPAN-V),應(yīng)用于細胞凋亡的檢測，并 形成配套的細胞凋亡檢測試劑盒。研究表明，該檢測方法具有靈敏、高效、方便的特點。


附圖l.GPPAN-V重組融合蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)示意圖。其中，"一"下劃線區(qū)域表示GST編碼
9框；下劃線區(qū)域表示Precission Protease蛋白酶作用位點；"......"下劃線區(qū)域表示
人膜聯(lián)蛋AV編碼框。
附圖2. 12%SDS-PAGE電泳檢測菌體全蛋白及GPPAN-V重組蛋白質(zhì)純化。其中，Lane 1， 菌體全蛋白；Lane 2，菌體破碎液沉淀；Lane 3,菌體破碎液上清；Lane 4-7，純化后的 GPPAN-V重組蛋白質(zhì)；Lane 8，蛋白質(zhì)分子量參照物。
附圖3. SephadexG-25葡聚糖凝膠柱層析制備FITC-GPPAN-V熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。其中，峰1 為含有FITC-GPPAN-V熒光標(biāo)記蛋白的組分；峰2為未標(biāo)記FITC的GPPAN-V重組蛋白 質(zhì)組份；最后經(jīng)過很長時間有一個不很明顯的峰3，為沒有結(jié)合任何蛋白的FITC。
附圖4. 12% SDS-PAGE電泳鑒定制備的FITC-GPPAN-V熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。其中，Lanel、 2， 標(biāo)記之前的GPPAN-V重組蛋白質(zhì)；Lane 3、 4, FITC熒光標(biāo)記后的洗脫峰1; Lane 5，菌 體全蛋白。
附圖5.應(yīng)用流式細胞儀技術(shù)進行細胞凋亡檢測分析實驗結(jié)果圖。其中，圖5-l，未標(biāo)記細胞 組；圖5-2 ，單標(biāo)PI細胞組；圖5-3,單標(biāo)FITC-GPPAN-V細胞組；圖5-4，雙標(biāo)FITC-GPPAN-V 和PI細胞組；圖5-5，試劑盒中的FITC標(biāo)記的人膜聯(lián)蛋白V (AnxV-FITC)和PI雙標(biāo)細胞組。
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具體實施例方式
實施例1. GPPAN-V重組蛋白質(zhì)的制備 實驗材料與試劑GPPAN-V基因工程菌株由本實驗室備存；Tryptone、 Yeast Extract為Oxoid 公司產(chǎn)品；各種層析介質(zhì)均為瑞典Pharmacm公司產(chǎn)品；其他所需分析純級試劑為北京化工 廠產(chǎn)品；部分色譜級試劑為美國Sigma公司產(chǎn)品；
實驗設(shè)備臺式低溫離心機(5417R)為德國Eppendorf公司產(chǎn)品；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)為 美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機為美國Bedonan公司產(chǎn)品；恒溫空氣搖床 (OSFT-HS-R-32)為葡萄牙Teq公司產(chǎn)品；奧立龍520A酸度計為美國Orion公司產(chǎn)品；JY98-超聲波細胞粉碎機為寧波新芝科器研究所產(chǎn)品；大型蛋白純化系統(tǒng)(FPLC， UPC-900)為瑞 典Pharmacia公司產(chǎn)品蛋白質(zhì)冷凍干燥機為德國Christ公司產(chǎn)品；Elix/RiOs純水系統(tǒng)為美 國Millipore公司產(chǎn)品。
實驗方法
1、 GPPAN-V重組蛋白質(zhì)基因的表達
挑取鑒定為陽性的單克隆菌落至3mL (含amp 50ug/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)12個小時。將過夜培養(yǎng)的3mL菌液按1:10的比例接種于400mL (含amp 50ug/mL)的TM表達培養(yǎng)基中，37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)大約3小時，擴增至OD600約為0.4-0.8。 降低溫度至3(TC， IPTG濃度為O.lmM，低溫表達16小時，表達GPPAN-V重組蛋白質(zhì)。取 表達菌液lmL， 6000rpm離心10分鐘，倒去上清液，收獲菌體沉淀，進行SDS-PAGE電泳， 鑒定表達情況。其余表達菌液則用于后續(xù)的目標(biāo)蛋白純化。
2、 GPPAN-V重組蛋白質(zhì)的純化
將擴大培養(yǎng)表達的400mL菌體加入16mL磷酸緩沖液重懸混勻，將重懸的菌體于冰上進 行超聲破碎，功率800W,工作時間5秒，間隙時間15秒。將菌體破碎后得到的懸液進行離 心，20000rpm離心20分鐘后，立即轉(zhuǎn)移上清至另一離心管，將轉(zhuǎn)移后的上清20000rpm重 復(fù)離心20分鐘，轉(zhuǎn)移上清并置于冰上。利用GST親和柱純化GPPAN-V重組蛋白質(zhì)。首先， 將谷胱甘肽瓊脂糖介質(zhì)顛倒混勻，取2mL介質(zhì)加入層析柱，然后加入10mL 20%的乙醇讓其 自然沉降，待乙醇流盡后加入lOmL磷酸緩沖液清洗柱子，等到磷酸緩沖液與層析介質(zhì)平面 持平時蓋好層析柱蓋子，待用。在室溫下，用IO個柱體積的磷酸緩沖液進行柱平衡，洗至紫 外檢測值到基線不變?yōu)橹?。將離心完的上清液加入GST親和柱，室溫結(jié)合15-30分鐘，可適當(dāng)攪拌，以4mL/分鐘的流速上樣。用10個柱體積的磷酸緩沖液洗滌柱子，至紫外檢測值不 變?yōu)橹埂Ｊ占蠘臃宕治?。配?0mM的還原型谷胱甘肽溶液，即洗脫液3mL。加到GST 親和柱上，充分結(jié)合10分鐘，其間可輕微攪拌。然后，用洗脫緩沖液洗脫，流速2mL/分鐘， 分部收集洗脫下來的重組蛋白質(zhì)，同時記錄收集峰值，繼而用磷酸緩沖液洗，直至無蛋白溶 液流出為至。最后，對GST親和柱進行再生和保存。用0.04MNaOH溶液洗3次，每次10mL， 再用lOmL磷酸緩沖液平衡至中性，20。/。乙醇保存于4。C。
3、 SDS-PAGE檢測
首先配制12%分離膠和4%濃縮膠。分離膠配制ddH20 3.35mL; 1.5M Tris-HCl (pH 8.8) 2.5mL; 10%SDS100uL: 20% Acryl/0.8% Bis Jt液4.0mL; TEMED 5uL; 10%APS 50uL;濃 縮膠配制ddH20 6.1mL; 0,5M Tris-HCl (pH 6.8)2.5mL; 10%SDS 100uL: 20°/。Acryl/0.8%Bis C液1.3mL; 10%APS 50uL; TEMED 10uL。然后對樣品進行處理將lmL/管的樣品6000rpm 轉(zhuǎn)離心5分鐘，收獲菌體。完全倒干菌液后，加入20nL去離子雙蒸水，充分混勻。等體積 加2X樣品緩沖液(0.5M Tris-HCl(pH 6.8) 4mL; ddH20 20mL; Glycerol 4.0mL; e -巰基乙醇 0.4mL;溴酚蘭20mg), 20pL/管，充分混勻。沸水中變性10分鐘，煮完后以4'C 12000rpm 離心10分鐘，取15^xL上清液進行電泳。100V, 30分鐘。打開凝膠膠板，做好標(biāo)記后去下 膠，小心移入染色器皿中，加入100mL染色液(0.1%考馬斯亮藍11250:乙醇:冰醋酸==5:4:1， 過濾后用)，加蓋振蕩染色1.5小時。將染色液倒去，染色的凝膠用水漂洗數(shù)遍，瀝干水后置 于染色皿中，再加入100mL脫色液(醫(yī)用酒精:冰醋酸:水=45:5:50)，加蓋，脫色至凝膠能清 晰顯示出蛋白條帶止。SDS-PAGE可以鑒定制備的GPPAN-V重組蛋白質(zhì)的純度和含量。
4、 考馬斯亮藍G250法測定GPPAN-V重組蛋白質(zhì)濃度
在OD595nm、敏感度為1的條件下，取lmL的G250溶液于比色皿中，然后將比色皿放 到儀器中進行調(diào)零。取lmL的G250溶液和100uL的蛋白樣品溶液于比色皿中混合，反應(yīng)3 分鐘，然后將比色皿放進儀器中進行測量、讀數(shù)，做2-3管平行。根據(jù)考馬斯亮蘭G250標(biāo)準(zhǔn) 曲線公式計算出樣品蛋白的濃度。蛋白濃度p (mg/mL)=對應(yīng)濃度值乂稀釋倍數(shù)。通過G250 分光光度法測定純化的GPPAN-V重組蛋白質(zhì)。將純化后的GPPAN-V重組蛋白質(zhì)進行脫鹽及 凍干，保存。
實驗結(jié)果
誘導(dǎo)表達后收集菌體，離心后超聲破碎菌體，經(jīng)親和層析純化。圖1為GPPAN-V的一
14級結(jié)構(gòu)示意圖。圖2所示為GPPAN-V重組基因工程菌的表達及純化鑒定結(jié)果。其中，第一 泳道為菌體全蛋白，第二泳道為菌體破碎液沉淀，第三泳道為菌體破碎液上清。與圖中第二 泳道相比，第三泳道中含有大部分的GPPAN-V重組蛋白質(zhì)，表明大部分GPPAN-V重組蛋白 質(zhì)以可溶性形式存在。第四至第七泳道為親和層析純化后的鑒定結(jié)果。由圖中可見，在 61kDalton位置，為GPPAN-V重組蛋白質(zhì)的條帶。經(jīng)過親和層析柱純化后，可以去除幾乎全 部的菌體雜蛋白，得到了濃度較高、純度較好的GPPAN-V重組蛋白質(zhì)。
實施例2. FITC-GPPAN-V熒光標(biāo)記蛋白的制備
實驗材料與試劑FITC、 DTT、 e-巰基乙醇為德國Mark公司產(chǎn)品；Tris、 SDS、甘氨酸、丙 烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺為美國Sigma公司產(chǎn)品；GST親和介質(zhì)為GE Healthcare公司產(chǎn)品； 其他所需分析純級試劑為北京化工廠產(chǎn)品；部分色譜級試劑為美國Sigma公司產(chǎn)品。
實驗設(shè)備高速冷凍離心機為美國Beckman公司產(chǎn)品；奧立龍520A酸度計為美國Orion公 司產(chǎn)品；電泳儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；大型蛋白純化系統(tǒng)(FPLC, UPC-900)為瑞典 Pharmacia公司產(chǎn)品；熒光顯微鏡為德國Christ公司產(chǎn)品；Elix/RiOs純水系統(tǒng)為美國Millipore 公司產(chǎn)品。
實驗方法
1 、 GPPAN-V重組蛋白的準(zhǔn)備用0 4°C的pH 8.0磷酸緩沖液將目標(biāo)蛋白溶液稀釋至濃度為 10mg/mL左右，放于冰槽中。
2、 熒光色素準(zhǔn)備按每毫克蛋白加入FITC熒光素0.01mg計算，稱取所需的FITC熒光素， 用3%碳酸鈉水溶液溶解。
3、 結(jié)合反應(yīng)避光，逐滴將FITC溶液加入到目標(biāo)蛋白溶液中，邊加邊攪拌，充分攪勻，在 0 4"C持續(xù)攪拌18 24小時，進行結(jié)合反應(yīng)。
4、 透析結(jié)合完畢后，將標(biāo)記好的目標(biāo)蛋白溶液進行離心處理，2500。m， 20分鐘，除去其 中少量的沉淀物，上情液裝入MD34型透析袋(MWCO3500)中，置于燒杯中，4'C條件下，用 pH8.0磷酸緩沖液透析72小時，每8小時更換一次緩沖液。
5、 過柱取透析完畢的標(biāo)記物，通過SephadexG-25葡聚糖凝膠柱(26mmX200mm)，分離 游離熒光素，根據(jù)分子量大小不同的蛋白質(zhì)，其洗脫體積不同，標(biāo)記好的FITC-GPPAN-V最 先被洗脫下來，其次是未標(biāo)記的GPPAN-V融合蛋白，最后為未標(biāo)記上蛋白質(zhì)的熒光分子。
15根據(jù)紫外檢測值變化，分別收集各個洗脫峰。洗脫液0.01mol/L磷酸緩沖液(pH7.2);過濾量: 12mL;收集量20mL,稀釋1.7倍左右。 7、保存凍干保存，置-20'C備用。
實驗結(jié)果
經(jīng)SephadexG-25葡聚糖凝膠柱層析，去除未標(biāo)記的蛋白及未和蛋白質(zhì)結(jié)合的FITC。經(jīng) SephadexG-25葡聚糖凝膠過濾后可以得到三個洗脫峰，如圖3所示，其屮，峰1，為結(jié)合FITC 的GPPAN-V重組融合蛋白質(zhì)(FITC-GPPAN-V)，顯示綠色熒光；峰2，很小，為未標(biāo)記FITC 的GPPAN-V重組蛋白質(zhì)，最后經(jīng)過很長時間有一個不很明顯的峰3，為沒有結(jié)合任何蛋白的 FITC。電泳檢測洗脫峰1中的成分，如圖4所示。由電泳結(jié)果可知，峰1中含有FITC-GPPAN-V 標(biāo)記重組蛋白質(zhì)。
實施例3.應(yīng)用新型熒光標(biāo)記蛋白FITC-GPPAN-V檢測細胞凋亡
實驗材料與試劑人膜聯(lián)蛋白V-FITC試劑盒為北京眾康志恒生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PMSF， DTT, (3-巰基乙醇為德國Mark公司產(chǎn)品；細胞培養(yǎng)基為美國Invi加gen公司產(chǎn)品；甘油、 NaH2P04、 Na2HP04、 NaCl、 HC1、 EGTA為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。
實驗設(shè)備流式細胞儀為美國Cole-parmer公司產(chǎn)品；臺式低溫離心機(5417R)為德國 Eppendorf公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機為芙國Beckman公司產(chǎn)品；Elbc/RiOs純水系統(tǒng)為美國 Millipore公司產(chǎn)品。
實驗方法
1、 誘導(dǎo)細胞凋亡用過氧化氫處理Hela細胞，過夜培養(yǎng)12小時待用。
2、 檢測細胞凋亡待測細胞的濃度為5X'105-5X106+/mL。取lmL細胞懸浮液，1000rpm, 4"C離心10分鐘，棄上清。加入lmL預(yù)冷的磷酸緩沖液，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000rpm, 4 'C離心10分鐘，棄上清(對于貼壁細胞，先用胰酶消化，再用磷酸緩沖液洗滌)。重復(fù)以上 步驟兩次。將細胞重懸于200uL含25mM Ca離子的碳酸緩沖液。加入10uL FITC-GPPAN-V 或者商品化試劑盒中FITC-人膜聯(lián)蛋白V，以及10uL PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15分鐘 或4"C反應(yīng)30分鐘。加入300uL結(jié)合緩沖液，在1小時內(nèi)上機檢測。
3、 檢測結(jié)果分析流式細胞術(shù)可以將實驗樣本中正常、壞死、凋亡細胞區(qū)分開。以FITC和PI熒光作雙參數(shù)點圖，細胞分為四個區(qū)左上，PI單標(biāo)，代表機械損傷細胞；左下，代表活 細胞；右上，人膜聯(lián)蛋白V和PI共標(biāo)，代表為凋亡晚期或壞死細胞；右下，人膜聯(lián)蛋白V 單標(biāo)，代表早期凋亡細胞。分別觀察四群細胞比例，檢測凋亡現(xiàn)象。
實驗結(jié)果
將不同方法標(biāo)記的凋亡細胞經(jīng)流式細胞儀檢測，分別分成未標(biāo)記細胞組、單標(biāo)PI細胞組、
單標(biāo)FITC-GPPAN-V細胞組、雙標(biāo)FITC-GPPAN-V禾口 PI細胞組、雙標(biāo)試劑盒人膜聯(lián)蛋白 V-FITC和PI細胞組。其中，單標(biāo)PI檢測的是凋亡晚期的細胞，單標(biāo)人膜聯(lián)蛋白V-FITC檢 測到的是凋亡早期的細胞，而雙標(biāo)人膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI能將凋亡早期和晚期的細胞區(qū)分 開。實驗結(jié)果如圖5所示。流式細胞術(shù)可以將實驗樣本中正常、壞死、凋亡細胞區(qū)分開。 以FITC和PI熒光作雙參數(shù)點圖，檢測結(jié)果可以將細胞分為四個區(qū)左上，表示PI單標(biāo) 結(jié)果，代表機械損傷細胞；左下，不被標(biāo)記，代表活細胞；右上，人膜聯(lián)蛋白V和PI共標(biāo)， 代表為凋亡晚期或壞死細胞；右下，人膜聯(lián)蛋白V單標(biāo)，代表早期凋亡細胞。據(jù)圖5所示現(xiàn)
象分析，圖5-1中未標(biāo)記任何物質(zhì)細胞，不能檢測到凋亡細胞，只在左下區(qū)域檢測到活細胞；
圖5-2中單標(biāo)PI可以在左上和左下都檢測檢測到細胞 ，表示除了有活細胞外還有大量的凋亡 晚期的細胞；圖5-3中單標(biāo)FITC-GPPAN-V能在左下和右下檢測到細胞，表示除了有活細胞 外還檢測到有大量的凋亡早期的細胞，說明FITC-GPPAN-V能檢測到凋亡早期的細胞；圖5-4 為雙標(biāo)FTIC-GPPAN-V和PI，可以看到能在左上、左下和右下檢測到細胞，說明在檢測到活 細胞外，還可以檢測到凋亡不同時期的細胞，并且FITC-GPPAN-V和PI能把細胞區(qū)分為凋亡 早期和晚期兩種形態(tài)圖5-5為陽性對照，雙標(biāo)商品化試劑盒人膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI，可以 在左上、左下和右下檢測到不同狀態(tài)的細胞。比較圖5-4和圖5-5可以看到，F(xiàn)ITC-GPPAN-V 能夠明顯地標(biāo)記早期的細胞凋亡，并且和試劑盒人膜聯(lián)蛋白V-FITC具有相同的效果。
以上試驗表明，F(xiàn)ITC-GPPAN-V能夠檢測出早期細胞凋亡現(xiàn)象，并且其效果和商品化試 劑盒中人膜聯(lián)蛋白V-FITC具有相同的效果，說明連接有標(biāo)簽蛋白GST的GPPAN-V并沒有 影響人膜聯(lián)蛋白V的正確折疊，能夠展示出人膜聯(lián)蛋白V的生物學(xué)功能。FITC-GPPAN-V可 以作為一種新型的檢測早期細胞凋亡的工具，由于GPPAN-V的制備要比人膜聯(lián)蛋白V蛋白 質(zhì)的制備更容易，成本更低，對于應(yīng)用于細胞學(xué)方面的檢測是一個很好的選擇。序列表
<120> —種新型細胞凋亡檢測試劑及試劑盒的研制
<130>
<160> 1
<170>
<210> 1 <211> 561 <212> PRT
<400> 1
Met Ser Pro He Leu Gly Tyr Trp Lys lie Lys Gly Leu Val Gin Pro Thr Arg Leu Leu 15 10 15
Leu Glu Tyr Leu Glu Leu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys 21 25 30 35
Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr lie Asp 41 45 50 55
Gly Asp Val Lys Leu Thr Gin Ser Met Ala lie lie Arg Tyr lie Ala Asp Lys His Asn 61 65 70 75
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu lie Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu 81 85 90 95
Asp lie Arg Tyr Gly Val Ser Arg lie Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val 101 105 110 115Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys 121 125 130 135
Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 141 145 150 155
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys 161 165 170 175
Lys Arg lie Glu Ala lie Pro Gin lie Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr He Ala 181 185 190 195
Trp Pro Leu Gin Gly Trp Gin Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp 201 205 210 215
Leu Glu Val Leu Phe Gin Gly Pro Leu Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gin Gly Pro Leu 221 225 230 235
Gly Ser Ala Gin Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe Asp Glu Arg Ala 241 245 250 255
Asp Ala Glu Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu Gly Thr Asp Glu Glu Ser lie Leu 261 265 270 275
Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn Ala Gin Arg Gin Glu lie Ser Ala Ala Phe Lys Thr 281 285 2卯 295
Leu Phe Gly Arg Asp Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys 301 305 310 315
19Leu lie Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu Leu Lys His Ala 321 325 330 335
Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr Glu lie lie Ala Ser Arg Thr Pro 341 345 350 355
Glu Glu Leu Arg Ala lie Lys Gin Val Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp 361 365 370 375
Asp Val Val Gly Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Gin Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gin Ala 381 385 390 395
Asn Arg Asp Pro Asp Ala Gly He Asp Glu Ala Gin Val Glu Gin Asp Ala Gin Ala Leu 401 405 410 415
Phe Gin Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu Lys Phe lie Thr lie Phe Gly 421 425 430 435
Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg Lys Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr lie Ser Gly Phe 441 445 450 455
Gin lie Glu Glu Thr lie Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gin Leu Leu Leu Ala 461 465 470 475
Val Val Lys Ser lie Arg Ser lie Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu Tyr Tyr Ala Met 481 485 4卯 495
Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu lie Arg Val Met Val Ser Arg Ser Glu lie 501 505 510 515
20Asp Leu Phe Asn lie Arg Lys Glu Phe Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met 521 525 530 535
lie Lys Gly Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp 541 545 550 555
Asp 56權(quán)利要求
1.一種可用于細胞凋亡檢測分析的新型重組蛋白質(zhì)GPPAN-V，其詳細的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)如下所示MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSLEVLFQGPLGSAQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMKGLGTDEESILTLLTSRSNAQRQEISAAFKTLFGRDLLDDLKSELTGKFEKLIVALMKPSRLYDAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLEDDVVGDTSGYYQRMLVVLLQANRDPDAGIDEAQVEQDAQALFQAGELKWGTDEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETIDRETSGNLEQLLLAVVKSIRSIPAYLAETLYYAMKGAGTDDHTLIRVMVSRSEIDLFNIRKEFRKNFATSLYSMIKGDTSGDYKKALLLLCGEDD
2. 根據(jù)權(quán)利要求l， 一種用于體外細胞凋亡檢測的新型試劑FITC (熒光素異硫氰酸酯)標(biāo) 記的重組蛋白質(zhì)FITC-GPPAN-V。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2，以FITC-GPPAN-V為主要試劑而構(gòu)成的用于細胞凋亡檢測分析的試劑盒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3， 一般情況下，權(quán)利要求3中的這種新型試劑盒應(yīng)包括如下內(nèi)容 FITC-GPPAN-V，碘化丙啶(PI)，以及相應(yīng)的緩沖液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 ，基于GPPAN-V重組蛋白質(zhì)而形成的其他細胞凋亡檢測分析產(chǎn)品或試劑品o
6. 根據(jù)權(quán)利要求1， 2， 3， 4， 5，指應(yīng)用于細胞生物學(xué)研究以及臨床檢測分析等科學(xué)研究與 實際應(yīng)用中。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型細胞凋亡檢測試劑及相關(guān)試劑盒的研制?；诂F(xiàn)代生物工程技術(shù)，將谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)與人膜聯(lián)蛋白V(annexin V)偶聯(lián)起來形成一種新型重組融合蛋白GPPAN-V(其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)示意圖如附圖1所示)。含有GPPAN-V重組基因表達載體的大腸桿菌宿主菌誘導(dǎo)后的高效表達產(chǎn)物GPPAN-V重組融合蛋白質(zhì)以可溶形式存在，通過親和層析純化即可制備出具有較高純度的GPPAN-V重組融合蛋白質(zhì)。GPPAN-V重組融合蛋白質(zhì)與熒光素異硫氰酸酯(FITC)進行化學(xué)偶聯(lián)后形成可用于細胞凋亡檢測的新型細胞凋亡檢測試劑FITC-GPPAN-V。以FITC-GPPAN-V為核心形成的新型細胞凋亡檢測試劑盒，具有經(jīng)濟、靈敏、高效的優(yōu)點。
文檔編號C07K19/00GK101665537SQ200910148569
公開日2010年3月10日 申請日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月29日
發(fā)明者健 井 申請人:健 井