專利名稱：苦鬼臼脂素的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及式I化合物用作胰島素樣生長因子-1受體酪氨酸磷酸化的抑制劑的用途，
其中，R1可相同或不同，為OH或OCH3，n為0、1或2，R2、R3及R4可相同或不同，為H、OH、O、OOCH3、OOCH2CH3、OCH3或OC2H5，或R3及R4共同形成醚或內(nèi)酯，并任選包含雙鍵Δ7(8)或Δ8(8′)。
特別地，所有式I化合物的9及9′位的碳原子具有順式構(gòu)型，即8-9及8′-9′鍵位于碳環(huán)平面或平面上(β鍵)，如式I實線所示。諸如碳1′及7′間的波形線表明該鍵可為α或β鍵。α鍵位于碳環(huán)平面的下面，如虛線所示。苯環(huán)優(yōu)選為α位，如所示的苦鬼臼脂素、去氧苦鬼臼脂素、α-及β-阿樸苦鬼臼脂素。
本發(fā)明特別涉及式II化合物用作藥物，
其中R2如式I所定義。優(yōu)選化合物為苦鬼臼脂素或苦鬼臼脂素。所述化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2所示。
天然產(chǎn)物鬼臼毒素及去氧鬼臼毒素，用作合成所述苦類衍生物的起始原料。為制備純凈形式的該類物質(zhì)，以有機溶劑萃取諸如足葉草或桃兒七的精細粉碎的干燥根莖。然后將萃取物過濾，并在硅膠上濃縮。收集包含目標物質(zhì)的流份，再經(jīng)酸性三氧化二鋁及硅膠等層析，最后重結(jié)晶。
去氧苦鬼臼脂素及苦鬼臼脂素可分別由去氧鬼臼毒素及鬼臼毒素制得。將1mg后者物質(zhì)溶于70％的甲醇水溶液中。向該溶液中加入20mg的乙酸鈉后，將混合物55℃溫化20小時。將醇蒸干后，以乙酸乙酯萃取所得產(chǎn)品，然后以硅膠層析純化，流動相己烷-乙酸乙酯混合物，和/或十八硅烷鍵合硅膠，流動相甲醇水溶液；HPLC)。
用作藥物的本發(fā)明特別感興趣的其它化合物，可以下式III描述
其中R3及R4如式I中所定義，其另外包含雙鍵Δ7(8)或Δ8(8′)，用作藥物。優(yōu)選的式III化合物為α-阿樸苦鬼臼脂素及β-阿樸苦鬼臼脂素。
α-及β-阿樸苦鬼臼脂素可經(jīng)鬼臼毒素在高溫下于緩沖的乙醇溶液中溫化制備，如Buchardt，O.等，J Pharmaceut Sci 75，1076-1080，1986中所述?？喙砭手丶捌浒阊苌锏娜铣扇鏕ensler，J.W.等，J Am Chem Soc 82，1714-1727，1960所述。
式I化合物中其它可提及的實例表苦鬼臼脂素、苦鬼臼脂素酮(picropodophyllone)、4′-去甲基苦鬼臼脂素，及苦鬼臼脂素乙酸酯衍生物，苦鬼臼脂素酸(picropodophyllic acid)的甲酯及乙酯衍生物。
本發(fā)明具體地涉及式I化合物用于抑制胰島素樣生長因子-1受體的酪氨酸磷酸化的藥物制備中的用途。
為了設(shè)計用于治療目的的IGF-1R酪氨酸激酶抑制劑，非常重要的是，該抑制劑不與胰島素受體激酶產(chǎn)生交叉反應(yīng)，后者與IGF-1R高度同源。同時抑制胰島素受體將導(dǎo)致體內(nèi)的致糖尿病性反應(yīng)。該反應(yīng)包括極其嚴重的副作用，由于受體激酶被阻滯，該副作用不能經(jīng)胰島素治療克服。但是現(xiàn)在已證實，參見圖3，苦鬼臼脂素為遠較酪氨酸磷酸化抑制劑類化合物強的IGF-1R抑制劑，且完全不干擾胰島素受體酪氨酸激酶。其也不干擾表皮生長因子、血小板衍生生長因子或成纖維細胞生長因子受體的酪氨酸磷酸化。
本發(fā)明的優(yōu)選方面涉及上述化合物在藥物制備中的用途，該藥物用于預(yù)防或治療IGF-1R依賴性疾病，如癌癥、動脈粥樣硬化癥，包括預(yù)防血管手術(shù)后冠狀動脈的再狹窄、銀屑病及肢端肥大癥。
鬼臼毒素長期以來一直被用于治療癌癥，然而其具有難以接受的副作用。鬼臼毒素抗癌效果及其副作用都源于其對微管聚集的抑制以及細胞的有絲分裂的停頓?，F(xiàn)已證實，鬼臼毒素及其無毒性的異構(gòu)體苦鬼臼脂素為極強的特異性胰島素樣生長因子-1受體酪氨酸磷酸化抑制劑，苦鬼臼脂素通常被認為無生物活性，該受體對癌癥細胞的存活發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。最重要的是，具有順式構(gòu)型內(nèi)酯環(huán)的苦鬼臼脂素或其它苦類衍生物都不抑制胰島素受體，胰島素受體與IGF-1R高度同源。它們也不抑制其它重要的生長因子受體激酶。與鬼臼毒素相比，苦鬼臼脂素具有低細胞毒性，這表明，苦鬼臼脂素為高度選擇性的IGF-1R抑制劑。
生物實驗結(jié)果顯示，亞微摩爾濃度的苦鬼臼脂素或其它苦類衍生物足以引起腫瘤細胞的死亡。然而，為達到最佳治療效果，據(jù)信長期保持相對恒定的抑制劑血漿濃度是重要的，這可使其持續(xù)飽和所有的IGF-1Rs，也因此最終殺死盡可能多的惡性細胞。因而，在持續(xù)輸液苦鬼臼脂素衍生物，并同時監(jiān)測化合物的血漿濃度為一種代替反復(fù)(例如，每日)注射的治療策略，反復(fù)給藥可引起治療間隔中IGF-1R的反復(fù)重新激活。
先前以鬼臼毒素治療人及動物的嘗試證實，其為相對較強的全身毒性(大鼠的LD50為14mg/kg)及局部毒性(組織損傷)的化合物。其細胞毒性與其結(jié)合β-微管有關(guān)，但體外測定時這僅在遠高于IGF-1R抑制需要的濃度的高濃度下發(fā)生(IC50分別為0.5～1.0μM及0.001μM)。該毒性使其不能用作經(jīng)腸胃外、口服及局部給藥的藥物。
本發(fā)明特別涉及上述化合物用于制備藥物的用途，該藥物用于預(yù)防或治療不同類型癌癥，例如惡性黑素瘤；原發(fā)性神經(jīng)外胚層瘤，如尤因氏肉瘤；神經(jīng)膠質(zhì)瘤，如惡性膠質(zhì)瘤及星細胞瘤；前列腺癌；乳腺癌；骨髓增生性及淋巴組織增生性疾病，如白血病、淋巴瘤；胃腸腫瘤，如胃癌、結(jié)腸癌及胰腺癌；婦科癌癥，如卵巢癌及子宮瘤。
至于不完全依賴IGF-1R的腫瘤，本發(fā)明化合物可增強其它抗癌藥物的效果。因而，本發(fā)明也涉及式I化合物與其它細胞增殖抑制劑(cytostaticum)合用。可以與本發(fā)明環(huán)木脂體合用的細胞增殖抑制劑(cytostatica)的實例可為長春新堿、紫杉醇及依托泊苷。
本發(fā)明特別涉及式III化合物在用于治療白血病的藥物制備中的用途。
除了治療癌癥，環(huán)木脂體可用于治療其它發(fā)病機理涉及IGF-1/IGF-1R的疾病，如動脈粥樣硬化及銀屑病，參見例如Bayes-Genis，A等，Circ Res 86，125-30(2000)。
本發(fā)明特別涉及式I化合物用于治療銀屑病的藥物制備中的用途。表皮增生為常見皮膚病銀屑病的重要特征。IGF-1刺激表皮角化細胞是細胞分化的基本條件，因而，對IGF-1敏感性的增加可發(fā)生銀屑病。在近期研究中，將IGF-1反義寡核苷酸注入人銀屑病病變部位，這種治療引起增生的表皮顯著地恢復(fù)正常，Wraight，C.J.，等，Nat Biotechnol 18，521-6(2000)。該結(jié)果有力地表明，IGF-1R刺激為銀屑病表皮增生的限速步驟，選擇性抑制劑靶向IGF-1R可形成新的潛在銀屑病治療的基礎(chǔ)。
本發(fā)明特別涉及式I化合物在制備藥物中的用途，該藥物用于治療動脈粥樣硬化及冠狀動脈成形術(shù)后的再狹窄。IGF-1為動脈細胞生長促進因子，并為諸如動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展及冠狀動脈成形術(shù)后的再狹窄之類的心血管疾病的中介蛋白。IGF-1促進了巨噬細胞的趨化性、過度的LDL膽固醇的攝取及促炎細胞因子的釋放。此外，IGF-1刺激了血管平滑肌細胞(VSMC)的增生及轉(zhuǎn)移形成新內(nèi)膜。因而，IGF-1在這些進程中似乎起著關(guān)鍵的作用，為了限制或逆轉(zhuǎn)斑塊增長、動脈粥樣硬化中的脆性及再狹窄的新內(nèi)膜增生，可使用IGF-1抑制劑抑制IGF-1的活性(Bayes-Genis，A.，等，CircRes 86，125-130，2000)。
本發(fā)明還涉及包含式I化合物以及生理上可接受的載體的藥學(xué)組合物。任選包含常規(guī)添加劑的藥學(xué)組合物，視疾病及患者情況，可以任何合適的途徑施用于患者。
進行非胃腸給藥時，所述化合物可以注射劑量進行給藥，或通過靜脈連續(xù)輸液化合物在生理可接受的稀釋劑中形成的溶液、懸液或乳化液，作為載體的稀釋劑可為無菌液體，如水、醇、油及其它可接受的有機溶劑，添加或不添加表面活性劑及其它可藥用佐劑。
化合物也可以儲存注射劑(depot injection)或植入片制劑形式使用，該制劑可以實現(xiàn)活性成份緩釋的方式進行配制。
口服使用時，化合物可制成固體或液體制劑，如膠囊、丸劑、片劑、錠劑、散劑、溶液、混懸劑或乳劑。
至于局部用藥，化合物以油膏、乳膏、軟膏、洗劑或貼片劑的形式進行給藥。
本發(fā)明因此還涉及一種治療哺乳動物癌癥的方法，包括使用藥學(xué)組合物，該組合物包含式I化合物及生理上可接受的載體，在恒速給腫瘤患者注射給藥時，應(yīng)控制化合物的血漿水平，調(diào)整給藥速率以在足夠腫瘤控制或消失的時間內(nèi)保持0.05-5.0μM的血漿濃度。
實驗 材料 化學(xué)材料 培養(yǎng)基、胎牛血清及抗生素等細胞培養(yǎng)試劑購自Gibco，Sweden。除非另有說明，所有其他化學(xué)試劑均購自Sigma(St.Louis.MO，USA)?？沽姿崂野彼岬男∈髥慰寺】贵w(PY99)、抗IGF-1R α亞基及胰島素受體的多克隆抗體(N20)，及抗血小板衍生生長因子受體的多克隆抗體自Santa CruzBiotechnology Inc(Santa Cruz，CA，USA)獲得。IGF-1R α亞基的單克隆抗體(αIR-3)及抗成纖維細胞生長因子受體的單克隆抗體購自O(shè)ncogeneScience(Manhasset，NY，USA)。抗表皮生長因子受體的鼠單克隆抗體購自Life Science，抗IRS-1瓊脂糖結(jié)合物抗體購自UBI(Lake Placid，NY，USA)。
(3H)胸苷及(3H)亮氨酸購自Amersham Int.(UK)及抗α平滑肌肌動蛋白的單克隆抗體購自Sigma Immuno Chemicals(La Jolla，CA，USA)。重組IGF-1由Pharmacia Upjohn(Stockholm，Sweden)饋贈。去氧鬼臼毒素及鬼臼毒素(純度99.97％)、α-阿樸苦鬼臼脂素及β-阿樸苦鬼臼脂素由Analytecon SA，PreJorat，Switzerland惠贈，鬼臼毒素-4，6-O-苯亞甲基-β-D-吡喃葡萄糖甙由Conpharm AB，Uppsala，Sweden惠贈。依托泊苷購自Sigma。
細胞培養(yǎng) 人黑色素細胞系SK-MEL-2、SK-MEL-5及SK-MEL28、尤因氏肉瘤細胞系RD-ES及ES-1、肝細胞瘤細胞系HepG2、前列腺癌細胞系PC-3及乳腺癌細胞系MCF-7購自American Tissue Culture Collection，USA。惡性黑素瘤細胞系BE、DWB及FM55由CCK，Karolinska Hospital，Stockholm，Sweden的R Kiessling教授處獲得。R-及P6細胞系由R.Baserga教授(ThomasJefferson University，Philadelphia，PA，USA)惠贈。R-細胞為IGF-1R陰性，而P6細胞過度表達IGF-1R.。
角化細胞(HaCaT細胞)由MonaB ackdahl教授(Department of Dermatology，Karolinska Hospital，Stockholm，Sweden)提供并共同測定。HaCaT細胞系為自發(fā)的永生化人角化細胞細胞系(Boukamp P，等，J Cell Biol106761-771，1988)，其經(jīng)常用作銀屑病模型(Wraight，C.J.，等Nat Biotechnol18521～526，2000)。HaCaT細胞在Dulbecco′s Modified Eagle′s培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基包含10％胎牛血清、谷氨酰胺、芐青霉素及鏈霉素。
人血管平滑肌細胞(VSMC)基本上如前述的方法(Ross R.，J Cell Biol50172-186，1971)自人腎動脈手術(shù)標本分離并進行培養(yǎng)。簡而言之，VSMC可自原始外植體移出，隨后在融合時傳代。將細胞保持在F12培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包含15％的胎牛血清、0.05mg/ml維生素C、2μg/ml兩性霉素及200IU/ml青霉素。培養(yǎng)細胞為均一的人平滑肌細胞，可由其形態(tài)學(xué)及平滑肌特異性α肌動蛋白免疫染色確定，該肌動蛋白識別獨特的抗原表位。培養(yǎng)溫度為37℃，濕度85％，空氣中二氧化碳的濃度為5％。培養(yǎng)基每周更換2次，細胞在第2～8代以胰蛋白酶(0.25％)及EDTA(0.02％)溶液進行富集。
人慢性髓性白血病細胞系K562/S及K562/Vcr30以及急性髓性白血病細胞系HL60/0及HL60/Nov獲自ATCC。K562/S及K562/VcR30為野生型(無抗性)細胞，而K562/Vcr30及HL60/Nov為細胞靜止抗性亞系。所有白血病細胞系在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基另外加入10％的胎牛血清、2mM的谷氨酰胺、芐青霉素(100U/ml)及鏈霉素(100μg/ml)。細胞生長于組織培養(yǎng)燒瓶中，該燒瓶保持95％空氣/5％CO2的氣氛中，置于37℃的濕度培養(yǎng)箱中。實驗細胞在60mm塑料皿或96孔塑料板中培養(yǎng)。
所有其它細胞系在Minimal Essential Medium中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基包含10％的胎牛血清、谷氨酰胺、1％芐青霉素及鏈霉素。細胞呈單層生長于組織培養(yǎng)燒瓶中，該燒瓶保持95％空氣/5％CO2氣氛中，置于37℃的濕度培養(yǎng)箱中。實驗細胞在35mm或60mm塑料皿或96孔塑料板中培養(yǎng)。實驗于亞融合生長條件下開始。
方法 體外酪氨酸激酶測定 IGF-1R催化的polyTyrGlu(pTG)底物磷酸化的操作方法基本上如前所述[Parrizas M.，等，ibid.，及Blum G.，等，ibid.]。免疫沉淀的IR源自Hepg2，IGF-1R源自P6細胞萃取物，免疫耗竭的上清液以分析非IGF-1R酪氨酸激酶。磷酸化聚合物底物以純的磷酸酪氨酸特異性單克隆抗體進行檢測，該單克隆抗體與辣根過氧化酶(HARP)結(jié)合。顏色由HRP生色底物鄰苯二胺二鹽酸鹽(OPD)顯色。顏色以分光光度測定法定量(ELISA reader)，并反應(yīng)了酪氨酸激酶的相對量。用IGF-1R及IR抗體對沉淀進行免疫印跡以驗證受體的存在。使用了一系列的稀釋液，以測定相對于IGF-1R及IR量的最佳條件。線性信號持續(xù)30分鐘，為上限達75ng/孔的IGF-1R濃度的函數(shù)。
簡而言之，4℃下，以1μg/ml小鼠抗IGF-1Rβ亞基的單克隆抗體(Lab Vision)包被96孔板(Immunolon，Nunc)過夜。板以BSA的PBS(ELISA封閉緩沖液，Pierce)封閉，加入源于P6細胞系的80μg/ml總蛋白裂解產(chǎn)物。將板溫育1小時后，以PBS Tween洗滌。在以IGF-1激活激酶之前，室溫向PBS中加入待考察的化合物并孵育30分鐘。按照廠家說明，用Sigma試劑盒測定激酶體外磷酸化。以分光光度測定法測定后，以統(tǒng)計軟件的回歸函數(shù)確定抑制劑的IC50值。
IGF-1R酪氨酸自磷酸化以夾心ELISA測定進行分析。簡而言之，4℃下，以1μg/ml鼠抗IGF-1Rβ亞基的單克隆抗體Ab-5(Lab Vision)包被96孔板(Immunolon，Nunc)過夜。將板以BSA的PBS Tween封閉1小時，加入源于P6細胞系的80g/ml總蛋白裂解產(chǎn)物。陰性對照組使用源于R-細胞系的總蛋白裂解產(chǎn)物。在以ATP激活激酶之前，向不含ATP的酪氨酸激酶緩沖液中加入待考察的化合物，室溫孵育30分鐘。使用Sigma試劑盒進行激酶分析。以分光光度測定法測定后，以統(tǒng)計軟件的回歸函數(shù)確定抑制劑的IC50值。
細胞生長及存活測定 細胞增殖試劑盒II(Roche Inc.)基于經(jīng)由活力細胞的呼吸鏈所致的甲基橙染料(orange formazan dye)中黃色四唑鹽XTT色度的變化(Roehm，NW等，J Immunol Methods 142257-265，1991)。將細胞以5000/孔濃度的接種于每孔含有100μl培養(yǎng)基的96孔板中，然后以不同濃度的藥物處理。將細胞培養(yǎng)24或48小時后，按照廠家操作規(guī)范，與XTT標記混合液孵育。4小時后，以帶有495nm濾器的多孔掃描分光光度計定量甲基橙染料。將吸收度與活力細胞數(shù)直接相關(guān)。繪制接種濃度為1000～10000細胞/孔(以1000細胞/孔的速率遞增)的未處理細胞的標準吸收度曲線。所有標準組及實驗組皆重復(fù)3次。
完整細胞受體的酪氨酸磷酸化測定 將細胞在6cm板中培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)，然后加入包含10％FBS及所需化合物的新鮮培養(yǎng)基，并孵育1小時。再將細胞裂解，以特異性抗體進行免疫沉淀反應(yīng)。免疫沉淀物以十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，并與抗磷酸酪氨酸抗體孵育。肌動蛋白(細胞萃取物)或IGF-1Rβ亞基的抗體載入作為對照。檢測后，將膜掃描定量。
免疫沉淀及蛋白含量測定 將分離的細胞在10ml包含蛋白酶抑制劑的冰冷PBSTDS中裂解(Carlberg，M.等，J Biol Chem 27117453-17462，1996)。在1m樣品中加入50μl蛋白A或G瓊脂糖，并在定軌搖床4℃溫育15分鐘。以10,000r/分4℃離心10分鐘，保存上清液。使用購自Bio-Rad的試劑染色結(jié)合檢測法測定蛋白含量。將胎牛血清用作標準。加入15μl蛋白G瓊脂糖及5μl抗IGF-1R抗體。在定軌搖床4℃溫育3小時后，以14,000×g微型離心機脈沖離心10秒鐘收集沉淀。棄去上清液，并將沉淀以PBSTDS洗滌3次。
十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 將蛋白樣品溶解在2×樣品緩沖液中，該緩沖液包括Laemmli緩沖液及0.5％甲醇，然后96℃煮5分鐘。樣品以SDS-PAGE分離，使用4％濃縮凝膠及7.5％分離凝膠。在所有的實驗中同時運行標準分子量物質(zhì)(BioRad，Sweden)。
蛋白質(zhì)印跡 SDS-PAGE分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移過夜至硝基纖維素膜(Hybond，Amersham，UK)上，然后，室溫下于包含4％脫脂奶粉及0.02％Tween20的PBS、pH為7.5的溶液中封閉1小時。以一級抗體室溫孵育1小時后，以Tween的PBS洗滌3次，然后，再以二級抗體室溫孵育1小時。洗滌3次后，將膜以鏈親和素標記的辣根過氧化酶溫育30分鐘，再以Amersham ECLsystem(Amersham，UK)檢測。膜以Fluor-S(BioRad)掃描。
實驗1.鬼臼毒素衍生物對培養(yǎng)的黑素瘤細胞的IGF-1R磷酸化的影響 將FM55黑素瘤細胞接種于6cm皿中，使其在Minimal Essential培養(yǎng)基中的濃度達10,000細胞/cm2，該培養(yǎng)基加入10％胎牛血清(FCS)。當(dāng)皿中細胞密度達到65,000細胞/cm2時，以0.05μM鬼臼毒素、去氧鬼臼毒素、苦鬼臼脂素、去氧苦鬼臼脂素、4′-去甲基-7-(4，6-O-亞乙基-β-D-吡喃葡萄糖基)表鬼臼毒素(依托泊苷)及鬼臼毒素-4，6-O-苯亞甲基-β-D-吡喃葡萄糖甙(pf4，6-O)處理1小時。同時還用15μM依托泊苷及pf-4，6-O進行處理。然后，按照方法部分所述的方法富集細胞以進行測定及定量IGF-1R磷酸化。表1中的值表示3次實驗的平均值。
表1.完整細胞中IGF-1R磷酸化水平(％OD) 鬼臼毒素 5 去氧鬼臼毒素 2 苦鬼臼脂素 8 去氧苦鬼臼脂素 5 依托泊苷(0.05M)102 依托泊苷(15μM)105 Pf-4，6-O(0.05μM) 100 Pf-4，6-O(15μM) 102 該結(jié)果表明，除依托泊苷及Ppf-4，6-O外，鬼臼毒素、去氧鬼臼毒素、苦鬼臼脂素及去氧苦鬼臼脂素皆為IGF-1R磷酸化強抑制劑。
實驗2.苦鬼臼脂素對無細胞系統(tǒng)中IGF-1R磷酸化的劑量反應(yīng)效果 在完整細胞的所有這些數(shù)據(jù)表明，苦鬼臼脂素及鬼臼毒素防止IGF-1R磷酸化，但不能表明其是直接或間接作用于酪氨酸激酶。因而，我們分離出受體，測定了體外苦鬼臼脂素對IGF-1R催化的底物酪氨酸磷酸化及IGF-1R自磷酸化的影響?？喙砭手赜行У亟档土藀TG底物的磷酸化(IC50值0.006μM，見圖3)。與之相反，它并不能干擾EGFR及IR酪氨酸激酶底物磷酸化，同時也不能阻滯其它“非IGF-1R激酶”的磷酸化(圖3)，其由IGF-1R的免疫耗竭(immunodepletion)獲得。鬼臼毒素產(chǎn)生與苦鬼臼脂素類似的結(jié)果。
在下一組無細胞體系的實驗中，我們證實了PPP有效抑制IGF-1R的自磷酸化(詳見方法)，IC50值約0.001μM(見圖4)。PPT獲得類似反應(yīng)(未顯示數(shù)據(jù))。為考察PPP在ATP水平或在底物水平(即IGF-1R β亞基的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域)干擾酪氨酸自磷酸化，在測定中向反應(yīng)緩沖液加入不同濃度的ATP(19-300μM)。正如結(jié)果所示，這并不改變PPP的IC50值，該值保持在0.001～0.002μM(圖4)。這些結(jié)果意味著，ATP并不干擾IGF-1R自磷酸化抑制劑的作用，而是抑制了IGF-1R酪氨酸激酶底物的磷酸化。
實驗3.苦鬼臼脂素及鬼臼毒素對培養(yǎng)細胞的多種受體酪氨酸激酶的特異性 將FM55黑素瘤細胞如實驗1所述的方法培養(yǎng)。當(dāng)皿中細胞密度達到65,000細胞/cm2時，分別以0(對照)及0.05μM苦鬼臼脂素及鬼臼毒素處理。然后分離細胞，以各自的抗體分別進行IGF-1R、成纖維細胞生長因子受體(FGFR)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、表皮生長因子受體(EGFR)、胰島素受體(IR)及胰島素底物-1(IRS-1)免疫沉淀反應(yīng)。IRS-1為IGF-1R的底物，因而其磷酸化依賴于磷酸化的IGF-1R。如上述方法進行凝膠電泳、蛋白質(zhì)印跡雜交及不同信號的定量。
表2.完整細胞IGF-1R磷酸化水平(％OD)
這表明苦鬼臼脂素及鬼臼毒素對IGF-1R是特異的。
實驗4.鬼臼毒素及苦鬼臼脂素對不同類型惡性細胞IGF-1R磷酸化的影響 將12種不同的細胞系接種于6cm皿中，使其在Minimal Essential培養(yǎng)基中的濃度達10,000細胞/cm2，該培養(yǎng)基加入10％胎牛血清(FCS)。當(dāng)皿中細胞密度達到65,000細胞/cm2時，以0、0.01、0.025、0.05、0.1或1.0μM劑量的鬼臼毒素及苦鬼臼脂素處理1小時。該細胞然后如上述方法收集進行測定并進行IGF-1R磷酸化定量。然后計算EC50值，其指50％有效濃度，即對每種抑制劑及細胞系而言磷酸化降低50％所需的濃度。其值如表3所示，結(jié)果基于兩次不同實驗。
表3.IGF-1R磷酸化的EC50值 *表示對照組無IGF-1R活性，nd指未檢測 這表明鬼臼毒素及苦鬼臼脂素抑制不同癌癥細胞的IGF-1R磷酸化。
實驗5.鬼臼毒素及苦鬼臼脂素對大量惡性細胞類型生存力的影響 將12類不同的細胞系接種于96孔板(培養(yǎng)基體積為每孔100μl)，使其在Minimal Essential培養(yǎng)基中的濃度達10,000細胞/cm2，該培養(yǎng)基加入胎牛血清。當(dāng)皿中細胞密度達到65,000細胞/cm2時，以不同劑量鬼臼毒素及苦鬼臼脂素處理48小時。然后，測定細胞活力(見上)。將各抑制劑及細胞系EC50計算為濃度值，該值為引起細胞存活率下降50％，結(jié)果如表4所示。以苦鬼臼脂素處理黑素瘤細胞系FM55及尤因氏肉瘤細胞系RD-ES的劑量反應(yīng)曲線如圖5A所示。兩種腫瘤細胞系活力隨苦鬼臼脂素濃度下降。圖5B表明鼠成纖維細胞細胞系的劑量反應(yīng)曲線，該細胞系或為缺失(R-)、或為過度表達人IGF-1R(P6)。P6細胞活力隨苦鬼臼脂素劑量下降，R-細胞無反應(yīng)。這表明苦鬼臼脂素選擇性阻滯IGF-1R。表4及圖5的所有結(jié)果基于4組不同的實驗。
表4.細胞活力的EC50(μM) *nd指未檢測 這表明鬼臼毒素及苦鬼臼脂素為腫瘤細胞活力的極強抑制劑。
實驗6.體內(nèi)惡性細胞生長抑制 將4～5周齡的無病原的裸鼠(nu/nu)圈養(yǎng)于無菌的塑料隔離籠中。以107細胞/鼠的劑量，皮下注射尤因氏肉瘤細胞系ES-1及黑素瘤細胞系BE(已知兩者皆表達IGF-1R)的0.2ml無菌生理鹽水溶液。實驗處理組每日腹膜內(nèi)注射100μl鬼臼毒素、去氧鬼臼毒素或苦鬼臼脂素溶液，溶劑為DMSO及生理鹽水的混合溶液(8∶2)。對照小鼠以溶劑處理，每組3～6只動物。每周監(jiān)測動物三次，觀察病癥及腫瘤生長情況。腫瘤大小以公式(d2×D)/2估計，其中d及D分別表示腫瘤的小、大直徑。仔細觀察小鼠的副作用情況，實驗結(jié)束后，將動物處死作病變組織學(xué)分析。所有實驗遵循研究機構(gòu)倫理委員會提供的實驗動物使用倫理規(guī)范。
第一批實驗考察鬼臼毒素、去氧鬼臼毒素及苦鬼臼脂素對裸鼠的全身及局部毒性。第一次實驗時，在鼠側(cè)腹植入不含藥物的溶劑、鬼臼毒素(0.25mg)、去氧鬼臼毒素(0.25mg)或苦鬼臼脂素(0.25mg)的滲透泵。7天內(nèi)，藥物以0.6μl/小時自皮下恒速輸出。泵的體積為100μl。7天后，將小鼠處死，分析泵出口處的皮膚及其鄰近皮下組織，并由有經(jīng)驗的病理學(xué)家給組織反應(yīng)評分。每組3只動物。以溶劑處理(對照組)不引起任何損傷。與之相反，鬼臼毒素導(dǎo)致嚴重的組織反應(yīng)，如壞死、出血及發(fā)炎(表5)。以去氧鬼臼毒素處理小鼠造成輕微損傷，然而苦鬼臼脂素處理的動物無明顯反應(yīng)(表5)。
在隨后的實驗中，我們每天經(jīng)腹腔注射每種化合物100μl，給藥5天，分析了藥物的全身效果。注射了兩個劑量(7或28mg/kg/天)，每種藥物每個劑量使用3-6只小鼠。每天仔細檢查小鼠的不適、病況及體重減輕情況。首次證實了小鼠對不含藥物的溶劑耐受良好。然而，低劑量和高劑量鬼臼毒素處理的小鼠都發(fā)病，兩天內(nèi)分別有67％和100％的動物死亡(表6)。低劑量去氧鬼臼毒素處理的小鼠3天后顯示出嚴重的患病癥狀。由于病況嚴重或死亡，兩天后停止了高劑量實驗。與之相反，每種劑量苦鬼臼脂素處理的小鼠在整個5天實驗中仍然存活，未顯示出任何患病癥狀(表6)。
由于鬼臼毒素及去氧鬼臼毒素的毒性，我們僅使用了苦鬼臼脂素來分析其對腫瘤異種移植物的影響。為此，在裸鼠中建立了ES-1(尤因氏肉瘤細胞)及BE(黑素瘤細胞)異種移植物。當(dāng)ES-1及BE腫瘤開始在皮下生長且可測量時，每天經(jīng)腹腔給小鼠注射苦鬼臼脂素(28mg/kg，產(chǎn)生高于約0.05μM的平均血漿濃度所必需)或80％DMSO生理鹽水溶液作為載體處理4～6，隨后的4-～6天不作處理。然后處死小鼠，由富有經(jīng)驗的病理學(xué)者分析腫瘤?？喙砭手孛黠@抑制了兩類腫瘤的生長并導(dǎo)致其退化(見圖6A及6B)，腫瘤樣本的組織學(xué)分析顯示出大面積的壞死。
該結(jié)果表明，與鬼臼毒素及去氧鬼臼毒素相反，動物對苦鬼臼脂素耐受良好并引起腫瘤退化。
表5.局部毒性 0，表示無組織反應(yīng)；*伴有充血及輕微炎癥的輕微組織反應(yīng)；**伴有強烈炎癥的中等組織反應(yīng)；***伴有壞死及出血的強烈組織反應(yīng) 表6.全身毒性
實驗7.苦鬼臼脂素及其衍生物對人類白血病細胞存活的影響 按照方法及實驗1和2中所述的方法，以蛋白質(zhì)印跡雜交測定白血病細胞系(K562/S、K562/Vcr30、HL60/0及HL60/Nov)表達的IGF-1R。
將上述細胞系接種于96-孔板(25000細胞/孔，每孔培養(yǎng)基體積為100μl)的RPMI40培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中補充胎牛血清。24小時后，加入不同濃度的苦鬼臼脂素及其衍生物α-阿樸苦鬼臼脂素及β-阿樸苦鬼臼脂素，將細胞培養(yǎng)72小時。然后測定細胞活力(見上)。每個化合物及細胞系的EC50值見下表(表7)。該結(jié)果基于3次不同實驗。
表7中的結(jié)果表明，需要0.11～0.32μM苦鬼臼脂素來引起4種細胞系中3種的50％細胞死亡，然而，對于長春新堿抗性細胞系K562/VcR30需要高于0.5μM的濃度。與之相反，α-及β-阿樸苦鬼臼脂素的IC50值低至0.01-0.05μM。
表7.細胞活力的IC50(μM) 可以總結(jié)出苦鬼臼脂素衍生物α-及β-阿樸苦鬼臼脂素為白血病細胞及存活的高效抑制劑。
實驗8.苦鬼臼脂素對用細胞增殖抑制劑處理的惡性細胞的交互作用 白血病細胞系K562/S、K562/Nov、HL60/0及HL60/Nov按照實驗7所述的96-孔板中培養(yǎng)。24小時后，以不同濃度的抗癌藥物長春新堿處理細胞72小時，加入或不加入0.05μM苦鬼臼脂素共培養(yǎng)。已經(jīng)證實，該濃度的苦鬼臼脂素不會引起腫瘤細胞的任何可檢測的細胞死亡。然后測定了細胞活力。每一抑制劑及細胞系的IC50值如下表所示(表8)。該結(jié)果基于3次不同實驗。
如表所示，用苦鬼臼脂素共培養(yǎng)降低所有4個細胞系細胞活力的IC50值。
表8.細胞活力的IC50(nM) 該結(jié)果表明苦鬼臼脂素可增加惡性細胞對傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的敏感性。
實驗9.苦鬼臼脂素及鬼臼毒素對人銀屑病模型細胞系IGF-1R磷酸化及細胞存活的影響 HaCaT細胞為一種永生化的人類角質(zhì)化細胞，代表了一種銀屑病細胞系模型，將其接種于6cm培養(yǎng)皿或96-孔板(每孔培養(yǎng)基體積100μl)，使其在包含10％胎牛血清的Dulbecco′s Modified Eagle′s培養(yǎng)基中的濃度為7,000細胞/cm2。當(dāng)細胞濃度到達50,000細胞/cm2時，以在培養(yǎng)基中的終濃度為0或0.05μM鬼臼毒素或苦鬼臼脂素培養(yǎng)。0μM表示對照的未處理對照組。培養(yǎng)1小時后，如實驗1所述的方法，收集6cm培養(yǎng)皿中細胞以供測定并定量IGF1R磷酸化。培養(yǎng)48小時后，如上述方法，以細胞增生試劑盒II測定96-孔板培養(yǎng)的細胞活力。
該結(jié)果表明，鬼臼毒素及苦鬼臼脂素均為HaCaT細胞的IGF-1R磷酸化及細胞活力有效抑制劑。
表9.0.05μM鬼臼毒素及苦鬼臼脂素對HaCaT細胞 IGF-1R磷酸化(1小時)及細胞存活水平(48小時)的影響 實驗10.鬼臼毒素及苦鬼臼脂素在動脈粥樣硬化及再狹窄模型中對培養(yǎng)的人血管平滑肌細胞(VSMC)的IGF-1R磷酸化及細胞增生的影響 IGF-1為動脈細胞生長促進因子，為諸如動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展及冠狀動脈成形術(shù)后的再狹窄之類的心血管疾病的中介蛋白。血管壁中的VSMC過度生長在這些事件中起著關(guān)鍵的作用，其由IGF-1引起(Bayes-Genis A，等，ibid.)。為了進行實驗，將分離并培養(yǎng)的VSMC并置于24-孔板(20.000-40.000細胞/孔)中培養(yǎng)，基本上按照實驗9所述的方法，研究鬼臼毒素及苦鬼臼脂素對IGF-1R磷酸化及VSMC生長、存活的影響。此外，通過測量摻入(3H)胸苷的DNA(DNA合成)及摻入(3H)亮氨酸的蛋白質(zhì)(蛋白合成)，評定了細胞增生。在前一種情況下，細胞(20.000～40.000細胞/孔)在24-孔板中生長，并加入1μCi/ml(3H)胸苷和IGF-1(nM～μM濃度；單獨或存在胎牛血清)，加入或不加入不同濃度(0～1.0μM)鬼臼毒素或苦鬼臼脂素條件下培養(yǎng)24小時。然后，以F12-培養(yǎng)基洗滌細胞，以5％的冰冷三氯乙酸(TCA)沉淀DNA。將DNA溶于0.1M KOH中，將每孔500μl溶液加入至液體閃爍體(scintillation liquid)中，以液體閃爍計數(shù)儀檢測其放射活性。在后一種情況下，將細胞如上述方法培養(yǎng)24小時，但不加入(3H)胸苷。相反，將(3H)亮氨酸加入使?jié)舛冗_1μCi/ml，但僅在溫育的后90分鐘進行。用冷磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)洗滌細胞，在冰冷TCA中沉淀蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)溶解在含有5％十二烷基磺酸鈉、20mM Na2CO3及2mM EDTA的溶液中。用液體閃爍計數(shù)儀檢測其放射活性。VSMC中的DNA及蛋白質(zhì)合成結(jié)果以對照細胞的％表示，對照細胞即那些未用鬼臼毒素或苦鬼臼脂素培養(yǎng)的細胞。
結(jié)論 已經(jīng)證實，苦鬼臼脂素及其在內(nèi)酯環(huán)上具有順式構(gòu)型的衍生物，為IGF-1R酪氨酸激酶的特異性強抑制劑。
苦鬼臼脂素誘導(dǎo)胰島素樣生長因子-1受體的失活引起惡性細胞的大量死亡，而缺乏胰島素樣生長因子-1受體的細胞具有抗性?？喙砭手丶捌溲苌锏男聶C制可用于治療癌癥及其它IGF-1R依賴性疾病。
權(quán)利要求
1.式II化合物在制備用于預(yù)防或者治療銀屑病、再狹窄以及動脈粥樣硬化癥的藥物中的用途，
其中R2為OH，并且其中9及9′位的碳原子具有順式構(gòu)型并且8-9以及8’-9’鍵為β鍵，其中苯環(huán)在α-位，其為苦鬼臼脂素。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述的化合物與細胞增殖抑制劑組合給藥。
3.權(quán)利要求1或2的用途，在制備用于預(yù)防或者治療銀屑病的藥物中的用途。
4.權(quán)利要求1或2的用途，在制備用于預(yù)防或者治療再狹窄的藥物中的用途。
5.權(quán)利要求1或2的用途，在制備用于預(yù)防或者治療動脈粥樣硬化癥的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及苦鬼臼脂素在制備用于預(yù)防或者治療銀屑病、再狹窄以及動脈粥樣硬化癥的藥物中的用途。
文檔編號C07D317/54GK101606929SQ200910134759
公開日2009年12月23日 申請日期2002年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月19日
發(fā)明者奧利·拉森, 馬格努斯·阿克塞爾森 申請人:阿克塞拉公司