專利名稱：：使用抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物的治療方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用抗ErbB受體的抗體與類美坦素的偶聯(lián)物進行ErbB受體輩巴向癌癥治療的方法，以及其中所用的制品。相關技術說明1.美坦素(Maytansine)和類美坦素(Maytansinoid)最早，美坦素分離自非洲灌木Mqy^7wswrrato(美國專利3,896,111)。后來發(fā)現(xiàn)，有些微生物也能產生類美坦素，例如美坦醇(maytansinol)和C-3美坦醇酯(C-3maytansinolester)(美國專利4,151,042)。以下專利中描述了美坦醇及其類似物美國專利4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;和4,371,533。美坦素和類美坦素具有強細胞毒性，但它們在癌癥化療中的應用受到極大限制，因為它們對腫瘤的選擇性差會導致嚴重的副作用。美坦素的臨床試驗因其對中樞神經系統(tǒng)及胃腸道系統(tǒng)的嚴重副作用而中止(Issel等，遙癥治療回顧5:199-207(1978))。2.ErbB族受體酪氨酸激酶和抗ErbB抗體ErbB族受體酪氨酸激酶是細胞生長、分化和存活重要的介質。該受體家族包括4個不同成員上皮生長因子受體(EGFR或ErbBl),HER2(ErbB2或pl85腦)，HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。最早鑒定的pl85"e"是化療大鼠成神經細胞瘤轉化基因的產物。"W原癌基因的活化形式緣于其編碼蛋白跨膜區(qū)內的一個點突變(纈氨酸變成谷氨酸)。在乳房癌和卵巢癌中可觀察到人wew擴增，且與預后差相關(Slamon等，##，235:177-182(1987);Slamon等,存夢，244:707-712(1989);和美國專利4,968,603)。迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)人腫瘤發(fā)生類似"ew原癌基因中的點突變。在胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌、曱狀腺癌、胰腺癌和膀胱癌等其他癌癥中也存在ErbB2過量表達(通常但非一定是因為基因擴增)。見King等，存夢，229:974(1985);Yokota等，1:765-767(1986);Fukushigi等，為、f細y^蘭務夢，6:955-958(1986);Geurin等，膚差^研宏,3:21-31(1988);Cohen等，蕃差^,4:81-88(1989);Yonemura等，^癥^f宏，51:1034(1991);Borst等，i^^屋夢與^^f夢，38:363(1990);Weiner等，膚癥碌宏，50:421-425(1990);Ken等，蕃癥^f宏，50:5184(19卯)；Park等，^癥^f宏，49:6605(1989);Zhau等，為、子疾癥夢，3:354-357(1990);Aasland等，英萄癤癥染,悉，57:358—363(1988);Williams等，病理4錄夢59:46-52(1991);和McCann等，^癥，65:88-92(1990)。ErbB2還可能在前列腺癌中過量表達(Gu等，；#癥遞說，99:185-9(1996);Ross等，人類病理夢，28:827-33(1997);Ross等，膚癥，79:2162-70(1997);和Sadasivan等，必尿夢染j、，150:126-31(1993))。2000年4月13日的PCT公開WO00/20579描述了一種erbB2癌基因的剪接形式，該形式編碼一種組成型酪氨酸磷酸化的ErbB2受體。由這種剪接變異體編碼的erbB2蛋白框內缺失了16個氨基酸(CVDLDDKGCPAEQRAS)，其中2個是保守性半胱氨酸。大鼠pl85固和人ErbB2蛋白質產物的抗體已有所描述。Drebin與其同事獲得了抗大鼠"e"基因產物pl85"e"的抗體。見例如Drebin等，紐應，41:695-706(1985);Myers等，遊傻才法，198:277-290(1991);和W094/22478。Drebin等在疾差西，2:273-277(1988)中稱，與pl85"e"兩個不同區(qū)域反應的抗體的混合物對植入棵鼠的恥w轉化的NIH-3T3細胞具有抗腫瘤協(xié)同作用。另可見例如1998年10月20日的美國專利5,824,311。以下文獻中描述了其他不同特性的抗ErbB2抗體Tagliabue等，世喬痛癥染'悉，47:933-937(1991);McKenzie等，蕃差^，4:543-548(1989);Maier等,膚癥研宏51:5361-5369(1991);Bacus等，癌發(fā)生分子學，3:350-362(1990);Stancovski等，PNAS(USA)88:8691-8695(1991);Bacus等，；^癥^^:52:2580-2589(19卯)；Xu等，世##癥染志53:401-408(1993);WO94/00136;Kasprzyk等，4癥^f宏52:2771-2776(1992);Hancock等，^癥^f兌51:4575-4580(1991);Shawver等，^癥^f尤54:1367-1373(1994);Arteaga等，痛癥^f《54:3758-3765(1994);Harweuth等，蘭#化夢殺志267:15160-15167(1992);美國專利5,783,186;和Klapper等，蕃差/^14:2099-2109(1997)。Hudziak等在》、f逸。敏^參夢9(3):1165-1172(1989)中描述了一組抗ErbB2抗體的產生，這種方法的特征在于使用人乳房癌細胞線SK-BR-3。在SK-BR-3細胞與抗體接觸72小時后，通過細胞單層結晶紫染色測定了細胞的相對增殖率。用該試-險，最大抑制來自被稱為4D5的抗體，該抗體可抑制56%的細胞繁殖。該組中其他抗體在該試驗中對細胞繁殖的抑制程度較低。還發(fā)現(xiàn)，抗體4D5可以使得ErbB2過量表達的乳房癌細胞對TFN細胞毒作用敏感。另可見例如1997年10月14日的美國專利5,677171。Hudziak等所述的抗ErbB2抗體在以下文獻中得到了進一步的鑒定Fendly等，癥^f《50:1550-1558(1990);Kotts等，謬#26(3):59(A)(1990);Sarup等，4長源，1:72-82(1991);Sh印ard等,侈^i瘦夢染^11(3):117-127(1991);Kumar等，為、子勿應i參^11(2):979-986(1991);Lewis等，^癥與^瘦夢與X瘦浴^f夢37:255-263(1993);Pietms等，癥差^9:1829—1838(1994);Vitetta等，省癥^f宏54:5301—5309(1994);Sliwkowski等，4參化夢染,悉269(20):14661-14665(1994);scott等，蘭場化夢染志266:14300-5(1991);D，so腦等,4蜀辨夢虎虎孩91:7202-7206(1994);Lewis等，蕃癥^f《56:1457-1465(1996);和Schaefer等，碧差茵15:1385-1394(1997)。小鼠單克隆抗HER2抗體可抑制過量表達HER2達2+和3+水平的乳房癌細胞的生長，但是對于低水平表達HER2的細胞則沒有作用(Lewis等，^癥與^^夢與名瘦治^#(1993))。根據這一發(fā)現(xiàn)，將4D5人源化(Carter等，^茵;^夢魔應孩89:4285-4289(1992))。在經傳統(tǒng)化療后仍過量表達HER2的乳房癌患者中對稱為HERCEPTIN的這一人源化版本(huMAb4D5-8,rhuMAbHER2,美國專利5，821，337)進行了測試(Baselga等，侈^t^9f14:737-744(1996);Cobleigh等，侈^U^9t夢染^17:2639-2648(1999))。該試驗中的大多數(shù)患者有3+水平的HER過量表達，但其中一部分是2+腫瘤。值得注意的是，HERCEPTIN⑧在15。/。的患者中"i秀導產生了臨床反應(4%為完全反應，11%為部分反應)，反應持續(xù)時間的中值為9.1個月。1998年9月25日，HERCEPTIN⑥經食品與藥物管理委員會準許上市用于治療過量表達ErbB2蛋白的惡性乳房癌患者。同源性篩選發(fā)現(xiàn)了另夕卜2個ErbB受體家族的成員ErbB3(美國專利5,183,884和5,480,968,以及Kraus等，iW^S(T7&i)86:9193-9197(1989)和ErbB4(歐洲專利申請599,274;Plowman等，^茵/爭夢虎虎孩90:1746-1750(1993);和Plowman等，々,衫'366:473-475(1993))。這2種受體都在至少部分乳房癌細胞線中過量表達。3.類美坦素-抗體偶聯(lián)物為了提高治療指數(shù)，目前將美坦素和類美坦素與特異性結合腫瘤細胞抗原的抗體偶聯(lián)。含類美坦素的免疫偶聯(lián)物可見例如美國專利5,208,020;5,416,064和歐洲專利0425234Bl。Liu等在美國科學院院報93:8618-8623(1996)中描述了含類美坦素DM1與抗人結腸直腸癌單克隆抗體C242相連的免疫偶聯(lián)物。這種偶聯(lián)物對培養(yǎng)的結腸癌細胞具有強細胞毒作用，并在體內肺瘤生長試驗中表現(xiàn)出抗癌活性。Chari等在癌癥研究52:127-131(1992)中描述的免疫偶聯(lián)物中，類美坦素通過二辟i/睫與結合人結腸癌細胞線上抗原的小鼠抗體A7偶聯(lián)，或與結合HER2/恥m癌基因的小鼠單克隆抗體TA.l偶聯(lián)。體外測定了TA.l-類美坦素偶聯(lián)物對人乳房癌細胞線SK-BR-3的細胞毒性，該細胞線每細胞表達3xl(^HER-2表面抗原。該藥物偶聯(lián)物獲得了與游離類美坦素藥物相當?shù)募毎拘裕@種毒性可以通過增加每個抗體上結合的類美坦素分子數(shù)量來提高。A7-類美坦素偶聯(lián)物在小鼠中的全身性細胞毒性較低。雖然HERCEPTIN⑧是曾嘗試過多種抗癌治療的ErbB2過量表達型乳房癌治療史的一次突破，但約85。/。的受治者對HERCEPTIN⑧療法無反應或者只有弱反應，而且，在獲準上市前的臨床試驗中，全部受治患者的發(fā)病前時間中值僅為3.1個月。所以，臨床上亟需進一步開發(fā)HER2-靶向的抗癌藥物，以用于哪些對HERCEPTIN療法無反應或者只有弱反應的HER2過量表達型腫瘤或其他HER2表達相關性疾病的患者。本發(fā)明概述本發(fā)明的基礎是出人意料的實驗發(fā)現(xiàn)HERCEPTIN⑧-類美坦素偶聯(lián)物治療HERCEPTIN⑧療法無反應或弱反應型HER2(ErbB2)過量表達型胂瘤治療中非常有效。本
發(fā)明內容之一涉及治療哺乳動物腫瘤的方法，所述肝瘤的特征在于過量表達ErbB受體，而且對單克隆抗ErbB抗體治療無反應或弱反應，該方法包括給予所述哺乳動物治療有效量的抗ErbB抗體與類美坦素的偶聯(lián)物。在優(yōu)選實施方式之一中，所述患者是人。另一優(yōu)選實施方式中，所述ErbB受體是(人)ErbB2(HER2)。所述方法不受所用抗ErbB抗體作用機制的限制。因此，所述抗ErbB抗體可具有，例如，生長抑制特性和/或誘導細胞死亡和/或凋亡。在一特定優(yōu)選實施方式中，所述方法涉及對乳房癌、卵巢癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌、結腸直腸癌、曱狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌和膀胱癌等癌癥的治療。較好的是，乳房癌，尤其是過量表達ErbB2達2+水平或以上的乳房癌，達3+水平更好。優(yōu)選組的抗體具有4D5單克隆抗體的生物學特征，或與4D5單克隆抗體結合相同的表位，特別好的是鼠源單克隆抗體4D5(ATCCCRL10463)的人源化形式。本發(fā)明偶聯(lián)物所用的類美坦素可以是美坦素，或者，美坦醇或美坦醇酯更好。所述抗體和類美坦素可通過例如N-琥珀酰亞胺-4-(2-吡啶硫)丙酸酯(SPDP)或N-琥珀酰亞胺-4-(2-吡咬硫)戊酸酯(SPP)等雙特異性化學接頭偶聯(lián)?？贵w與類美坦素之間的接頭可以是例如二硫鍵，硫醚，酸不穩(wěn)定性基團，光不穩(wěn)定性基團，肽酶不穩(wěn)定性基團，或酯酶不穩(wěn)定性基團。在一特定實施方式中，本發(fā)明治療方法包括給予一種第二抗體，該第二抗體結合ErbB2并阻抑ErbB受體被配體激活。如果需要，可將該第二抗體與一種細胞毒試劑例如類美坦素偶聯(lián)。本發(fā)明的另一內容涉及一種制品，它包括一個容器和其中的組合物，該組合物包含抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物，還包含包裝內說明或標簽，上面說明了該組合物可用于治療以ErbB受體過量表達(最好達2+水平或以上)為特征的癌癥。本發(fā)明還涉及1.一種治療哺乳動物腫瘤的方法，其中的腫瘤以過量表達ErbB受體為特征，而且對抗ErbB抗體治療無反應或反應差，所述方法包括給予所述哺乳動物治療有效量的抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物。2.根據項1所述的方法，所述的哺乳動物是人。3.根據項2所述的方法，所述ErbB受體選自ErbBl(EGFR),ErbB2(HER2)，ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)。4.根據項3所述的方法，所述抗ErbB抗體是生長抑制性抗體。5.根據項3所述的方法，所述抗ErbB抗體誘導細胞死亡。6.根據項3所述的方法，所述抗ErbB抗體誘導細胞凋亡。7.根據項3所述的方法，所述抗體是抗ErbB2抗體。8.根據項7所述的方法，所述腫瘤是癌癥。9.才艮據項8所述的方法，所述癌癥選自乳房癌，卵巢癌，胃癌，子宮內膜癌，唾液腺癌，肺癌，腎癌，結腸癌，結腸直腸癌，曱狀腺癌，胰腺癌，前列腺癌和膀胱癌。10.根據項9所述的方法，所述癌癥是乳房癌。11.根據項10所述的方法，所述乳房癌以2+或以上水平過量表達ErbB2。12.根據項ll所述的方法，所述乳房癌以3+水平過量表達ErbB2。13.根據項12所述的方法，所述抗體具有4D5單克隆抗體(ATCCCRL10463)的生物學特征。14.根據項13所述的方法，所述抗體與4D5單克隆抗體(ATCCCRL10463)結合相同表位。15.根據項13所述的方法，所述抗體是單克隆抗體4D5(ATCCCRL10463)。16.根據項13所述的方法，所述抗體是人源化抗體。17.根據項16所述的方法，所述抗體選自以下人源化抗體huMAb4D5-l，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)。18.根據項17所述的方法，所述抗體是人源化抗體huMAb4D5-8(HERCEPTIN⑧)。19.根據項3所述的方法，所述抗體是抗體片段。20.根據項19所述的方法，所述抗體片段是Fab片段。21.根據項3所述的方法，所述類美坦素是美坦素。22.根據項3所述的方法，所述類美坦素是美坦醇。23.根據項3所述的方法，所述類美坦素是美坦醇酯。24.根據項23所述的方法，所述類美坦素是美坦醇C-3位的酯。25.根據項24所述的方法，所述類美坦素是圖1所示的DM1。26.根據項3所述的方法，所述抗體與類美坦素通過雙特異性化學接頭偶聯(lián)。27.根據項26所述的方法，所述化學接頭是N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶硫)丙酸酯(SPDP)或N-琥珀酰亞胺-4-(2-吡咬硫)戊酸酯(SPP)。28.根據項3所述的方法，將所述抗體與類美坦素偶聯(lián)的接頭選自二硫鍵，硫醚，酸不穩(wěn)定、光不穩(wěn)定、肽酶不穩(wěn)定和酯酶不穩(wěn)定的基團。29.根據項28所述的方法，所述接頭是二硫鍵基團或硫醚基團。30.根據項29所述的方法，所述接頭是二硫鍵基團。31.根據項3所述的方法，所述偶聯(lián)物的每個抗體分子連有l(wèi)-10個類美坦素分子。32.根據項31所述的方法，所述偶聯(lián)物的每個抗體分子連有3-5個類美坦素分子。33.根據項7所述的方法，還包括給予患者結合ErbB2并阻抑ErbB受體4皮配體活化的第二抗體。34.根據項33所述的方法，所述第二抗體包括單克隆抗體2C4(ATCCHB-12697)或人源化的2C4。35.根據項33所述的方法，所述第二抗體與細胞毒試劑偶聯(lián)。36.根據項35所述的方法，所述細胞毒試劑是類美坦素。37.—種產品，包括容器和裝于其中的組合物，該組合物含有抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物，該產品還包括包裝內說明書或標簽，上面指明所述組合物可用于治療以過量表達ErbB受體為特征的癌癥。38.根據項37所述的產品，所述包裝內說明書或標簽指明所述組合物可用于治療以過量表達ErbB2受體為特征的癌癥。39.根據項38所述的產品，所述癌癥是乳房癌。40.根據項38所述的產品，所述癌癥的特征是以2+或以上水平過量表達ErbB2受體。41.根據項40所述的產品，所述癌癥的特征是以3+水平過量表達ErbB2受體。圖1是類美坦素"DM1"的結構。圖2是HERCEPTIN-DM1偶聯(lián)物的結構。圖3是HERCEPTIN-DM1偶聯(lián)物在SephacrylS300凝膠過濾柱上的洗脫曲線。圖4是HER2轉基因質粒構建物的核苷酸序列(SEQIDNO:l),該構建物指導天然人HER2(ErbB2)在轉基因小鼠乳腺中的表達。該圖還包括HER2(ErbB2)cDNA插入片段的核苷酸.序列(SEQIDNO:2),以及HER2(ErbB2)的推定氨基酸序列(SEQIDNO:3),包括信號序列。在SEQIDNO:3中，殘基22-645是HER2(ErbB2)的胞外區(qū)。圖5顯示HERCEPTIN-DM1對HER2轉基因腫瘤的作用。將2mm3大小的MMTVHER2-轉基因腫瘤切片移植到FVB小鼠的乳房脂肪層中。當腫瘤長到250mm3時，連續(xù)5天給一組8個小鼠i.v.注射HERCEPTIN-DM1偶聯(lián)物。另2組小鼠每周用10mg/kgHERCEPTIN⑧或RITUXAN⑧進行IP處理兩次。圖6顯示人源化抗HER2抗體2C4的重鏈可變區(qū)序列。圖7顯示人源化抗HER2抗體2C4的輕鏈可變區(qū)序列。本發(fā)明的詳細描述1.M除非另作說明，本文中科技術語的意義與本領域的常規(guī)理解相同。Singleton等，《fi務夢和為、子^參學辭^,#2焱，J.Wiley&Sons(NewYork,NY1994)。本領域技術人員將會看出，還有許多與本文所述相似或等效的方法和材料可用于本發(fā)明。實際上，本發(fā)明并不局限于后文所述的方法和材料。本發(fā)明中術語的含意如下"ErbB受體，，或"ErbB"指屬于ErbB受體家族的酪氨酸激酶受體蛋白，包括ErbBl(EGFR),ErbB2，ErbB3和ErbB4受體，以及將來可能鑒定到的該家族其他成員。該定義特別包括相應erbB癌基因剪接形式所編碼的ErbB受體，這包括但不限于已公開PCT申請WOOO/20579(2000年4月13日公開)中所述的ErbB2缺失變體。ErbB受體一般包括一個結合ErbB配體的胞外區(qū)；親脂性跨膜區(qū)；保守的胞內酪氨酸激酶區(qū)；和包含數(shù)個可磷酸化酪氨酸殘基的羧基末端信號區(qū)。所述ErbB受體可以是"天然序列"的ErbB受體，或其功能性衍生物，例如"氨基酸序列變體"。優(yōu)選的是天然序列人ErbB受體。"ErbBl"，"表皮生長因子受體"和"EGRF，在本文中通用，都表示天然序列的EGFR,例如Carpenter等，i4^化夢半i回廚，56'.881-914(1987)所述，包括其天然突變體(例如Humphrey等，尸A^S(X^々,87:4207-4211(1990)所述的缺失突變EGFR，及其功能性衍生物，例如氨基酸序列變體。"6B1表示編碼EGFR蛋白質產物的基因。"ErbB2"或"HER2，，在本文中通用，都表示天然序列的人HER2蛋白，見例如Semba等，尸A^ST"5^」，82:6497-6501(1985)和Yamamoto等，《,辨'319:230-234(1986)(Genebank登錄號X03363)，及其功能性衍生物，例如氨基酸序列變體。"6B2指編碼人HER2的基因，表示編碼大鼠pl85"e"的基因。優(yōu)選的HER2是天然序列的人HER2。結合HER2的抗體的例子包括MAbs4D5(ATCCCRL10463)，2C4(ATCCHB-12697),7F3(ATCCHB-12216)和7C2(ATCCHB12215)(見，美國專利5,772,997,W098/77797;和美國專利5，840，525)。人源化抗HER2抗體包括美國專利5,821,337中表3中的huMAb4D5，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5陽4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN);人源化520C9(WO93/21319)。有關人抗HER-2抗體可見1998年6月30日的美國專利5,772,997和1997年1月3日公開的WO97/0027L"ErbB3，，和"HER3，，指受體多肽(例如美國專利5,183,884和5,480,968以及Kraus等，/WAS(X^4;86:9193-9197(1989)所述)，及其功能性變體，包括其氨基酸序列變體。結合HER3的抗體的例子包括美國專利5,968,511(Akita和Sliwkowski)所述，例如8B8抗體(ATCCHB12070)或其人源4b變體。"ErbB4，，和"HER4"指受體多肽(例如歐洲專利申請599,274;Plowman等，美國科學院院報90:1746-1750(1993);和Plowman等，366:473-475(1993),及其功能性變體，包括其氨基酸序列變體，例如W099/19488所述的HER4同種異型。"天然，，或"天然序列，，EGFR，HER2，HER3或HER4多肽可以分離自大自然，也可以用重組DNA技術、化學合成法，或以上及類似技術的聯(lián)合制<曰付。"功能性衍生物"包括氨基酸序列變體，以及天然多肽的共價衍生物，條件是它們保留了與天然多肽相當?shù)纳锘钚浴０被嵝蛄凶凅w與天然氨基酸序列的差異一般在于天然氨基酸序列中中一個或多肽氨基酸的取代、缺失和/或插入。缺失變體包括天然多肽的片段和N端和/或C端截短變體。通常，氨基酸序列變體與天然多肽應具有至少70%，甚至至少80%，甚至至少90%的同源性。"同源性"指氨基酸序列排列對比后(為了獲得最大同源性百分比，可以1入必要的空距)相同殘基的百分比。用于序列排列對比的方法和計算機程序都是本領域所熟知的。此類程序之一是GenetechInc.的"Align2"，已于1991年12月10日向美國版權局(Washington,DC20559)登記。"ErbB配體，，指能結合和/或激活ErbB受體的多肽。本發(fā)明中特別有意義的ErbB配體是天然序列人ErbB配體，例如表皮生長因子(EGF)(Savage等，蘭浙化夢雜志247:7612-7621(1972));轉化生長因子a(TGF-a)(Marqardt等，/^夢223:1079-1082(1984));雙調蛋白(又稱施旺細胞或角質形成細胞自泌生長因子(Shoyab等，存夢243:1074-1076(1989)，Kimura等，房,然348:257-260;和Cook等，為、子細^^^參^11:2547-2557(1991));betacellulin(Shing等，辨夢259:1604-1607(1993);和Sasada等，4務^夢和^:*#理夢研^:遞識l卯1173(1993));肝素結合性表皮生長因子(HB-EGF)(Higashiyama等，存夢251:936-939(1991));上皮調節(jié)蛋白(印iregulin)(Toyoda等，生物化學雜志270:7495-7500(1995);和Komurasaki等，癌差西15:2841-2848(1997))，heregulin(見后文)；神經調節(jié)蛋白-2(NRG-2)(Carraway等，々ii'387:512-516(1997));神經調節(jié)蛋白-3(NRG-3)(Zhang等，^笛存夢虎虎孩94:9562-9567(1997));或cripto(CR-l)(Kannan等，^錄/A夢染^272(6):3330-3335(1997))。結合ERFR的ErbB配體包括EGF,TGF-a,雙調蛋白，betacellulin,HB-EGF和上皮調節(jié)蛋白。結合HER3的ErbB配體包括heregulin。結合HER4的ErbB配體包括betacellulin,HB-EGF，NRG-2，NRG-3和heregulin。"heregulin(HRG)，，指激活(即結合后誘導復合物中酪氨酸殘基的磷酸化)ErbB2-ErbB3和ErbB2-ErbB4蛋白質復合物的多肽。其所包括的各種heregulin多肽可見Holmes等，辨夢256:1205-1210(1992);WO92/20798;Wen等,Mol,Cell，Biol"14(3):1909-1919(1994)和Marchiomi等，々處362:312-318(1993)所述。該術語包括天然HRG多肽的生物活性片段和/或變體，例如其EGF-樣區(qū)域片段(例如HRGp177.244)。"Erb異寡聚物，，是至少兩種不同ErbB受體非共價偶聯(lián)的寡聚物。當表達兩種或兩種以上ErbB受體的細胞接觸ErbB配體時就會形成此類復合物，它們可以按照例如Sliwkowski等，蘭參化夢染^269(20):14661-14665(1994)所述通過免疫沉淀進行分離，用SDS-PAGE進行分析。此類ErbB異寡聚物的例子包括EGFR-HER2，HER2-HER3和HER3-HER4復合物。而且，所述ErbB異寡聚物還包括兩個或兩個以上HER2受體與HER3、HER4或EGFR等另外的ErbB受體的組合。所述異寡聚物也包括細胞因子受體亞基(例如gpl!30)等其他蛋白質。在有關HER2變體(例如HER2片段)的描述中，"具有天然人HRE2的生物學活性"表示當所述片段在本發(fā)明(轉基因或非轉基因)動物模型中過量表達時，其誘導腫瘤生長的能力與天然HER2相當。"腫瘤，，指各種瘤細胞生長和增殖(不論其是惡性還是良性)，以及各種癌前和癌性細月包和組織。"癌，，和"癌性，，表示哺乳動物中以細胞生長失控為特征的生理狀況。癌的例子包括但不限于癌，、淋巴瘤，乳房癌，肉瘤，和白血病或淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤。更具體的例子包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌，包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺部的腺癌和肺部的鱗狀細胞癌，腹膜癌，肝細胞癌，胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，惡性膠質瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳房癌，結腸癌，直腸癌，結腸直腸癌，子宮內膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，陰道癌，曱狀腺癌，肝癌，肛門癌，陰莖癌，以及頭頸癌。過量表達某種ErbB受體的癌指細胞表面ErbB受體(例如HER2)水平明顯高于同類組織非癌性細胞。這樣的過量表達可能是因為基因擴增或轉錄和翻譯的增強所致。ErbB受體過量表達可以在診斷或預后試驗中通過測定(例如通過免疫組織化學試驗IHC)細胞表面ErbB蛋白質水平升高來判斷，15也可以通過測定細胞中ErbB編碼核酸的水平(例如通過原位焚光雜交FISH;見W098/45479,1998年10月公開)，Southern印跡或聚合酶鏈反應(PCR)技術(例如實時定量PCR(RT-PCR))。還可以通過檢測血清等生物液中的脫落抗原(shedantigen)(例如ErbB胞外區(qū))來研究ErbB受體過量表達(見，例如美國專利4,933,294,1990年6月12日授權;WO91/05264,1991年4月18日公開；美國專利5,401,638,1995年3月28日授權；和Sias等，^^夢才法染^、132:73-80(1990))。除此之外，還可以采用各種已知的體內試驗。例如，可以讓患者體內的細胞與抗體(可以帶有放射性同位素等可檢測標記)接觸，然后通過體外放射性掃描或分析接觸抗體前取自患者的活組織樣品來測評抗體與細胞的結合?？筛鶕總€細胞表達的HER2分子拷貝數(shù)(這可以用生物化學方法測定)將過量表達HER2的腫瘤進行免疫組織化學評分并進行生物化學分級0=0-10,000拷貝/細胞，1+=至少約200,000拷貝/細胞，2+=至少約500,000拷貝/細胞，3+=至少約2,000,000拷貝/細胞。3+水平的HER2過量表達可引起酪氨酸激酶的非配體依賴性激活(Hudziak等，美國科學院院報84:7159-7163(1987)),可見于約30%的乳房癌，這些患者的無復發(fā)存活率和總存活率大大降低(Slamon等，科學244:707-712(1989);Sl聽n等，科學235:177-182(1987))。相反，"并非以ErbB受體過量表達為特征的，，癌指，在診斷試驗中，與同類組織的非癌細胞相比，其表達ErbB受體并不高于正常水平。"非激素依賴性"癌指其增殖不依賴于存在結合癌細胞表面受體的激素。此類癌在臨床給予降低腫瘤內或腫瘤周圍激素濃度的藥物或手術不能緩解。非激素依賴性癌的例子包括非雄激素依賴性前列腺癌，非雌激素依賴性乳房癌，子宮內膜癌和卵巢癌。此類癌可能始于激素依賴性腫瘤，在接受抗激素治療后，由激素敏感期發(fā)展成為非激素控制性腫瘤。"抗體"在此取其最廣義的解釋，具體包括完整單克隆抗體，多克隆抗體，由至少2個完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，以及抗體片段，只要它們都具有所需的生物學活性。"單克隆抗體"指該抗體來自一群基本均一抗體，即構成該集群的各抗體完全相同，除了可能存在的少量天然突變。單克隆抗體具有針對單一抗原性位點的高特異性。而且，與多克隆抗體制劑不同，多克隆抗體制劑包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體，每個單克隆抗體只針對抗原的一個決定簇。除了特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)點還在于在合成時可以不受其他抗體的污染。修飾語"單克隆"表示該抗體的特征在于來自一個基本均一的抗體群，而不應理解成需由特殊方法制得。例如，本發(fā)明的單克隆抗體可以通過雜交瘤方法獲得(Kohler等，自然256:495(1975))，或通過重組DNA方法制得(見美國專利4,816,567)。"單克隆抗體，,還可以如Clackson等，自然352:624-628(1991)和Marks等，分子生物學雜志222:581-597(1991)所述，從噬菌體抗體庫中分離得到。本發(fā)明中，單克隆抗體還特別包括"嵌合"抗體及其片段，即重鏈和/或輕鏈的一部分與某種、某類或某亞類抗體相同或同源，其余部分則與另一種、類或亞類抗體相同或同源，只要它們具有所需的生物學活性(美國專利4,816,567;和Morrison等，美國科學院院報81:6851-6855(1984))。本發(fā)明的嵌合抗體包括靈長化(primatized)抗體，其中包含來自非人靈長類(例如古猴，猩猩等)的可變區(qū)抗原結合序列和人恒定區(qū)序列。"抗體片段"包括抗體的一部分，最好是抗原結合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的例子包括Fab,Fab',F(ab')2和Fv片段；二抗體(diabody);線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。"完整抗體，，包含抗原結合可變區(qū)以及輕鏈恒定區(qū)(QJ,重鏈恒定區(qū)(CH1,Ch2和Ch3)。恒定區(qū)可以是天然序列(例如人天然恒定區(qū)序列)或其氨基酸序列變異體。較好的是具有一種或多種效應功能的完整抗體。非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式指包含最少量非人免疫球蛋白序列的嵌合抗體。大多數(shù)人源化抗體是人接受者免疫球蛋白的超變區(qū)殘基被換成具有所需特異性、親和力和功能的非人(例如小鼠、大鼠、兔子或非人靈長類)超變區(qū)殘基(供者抗體)。有時，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基也被置換以非人殘基。而且，人源化抗體還可以包含受者抗體或供者抗體中沒有的殘基。這些修飾是為了進一步優(yōu)化抗體的性能。通常，人源化抗體一般包含至少一個，通常是兩個可變區(qū)，其中所有或幾乎所有超變環(huán)與非人免疫球蛋白的相對應，而FR則完全或幾乎完全是人免疫球蛋白的序列。人源化抗體還可以包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)(通常是人免疫球蛋白Fc)的至少一部分。有關細節(jié)見Jones等，自然321:522-525(1986);Riechmann等，自然332:323-329(1988);和Presta,當代結構生物學見解2:593-596(1992)。人源化抗ErbB2抗體包括美國專利5,821,337的表3中的huMAb4D5-l,huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5畫6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN⑧)；和該專利圖6中的人源化2C4抗體》抗體的"效應功能，，指抗體Fc區(qū)(Fc區(qū)天然序列或其氨基酸序列變異體)產生的生物學活性，例如Clq結合性；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合性；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體即BCR)下調，等。完整抗體可根據重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列分為不同的"類"。主要的五類是IgA，IgD，IgE，IgG和IgM,其中幾類還可以分為不同的"亞類，，(同種型)，例如IgGl，IgG2,IgG3，IgG4;IgAl和IgG2。抗體不同類的重鏈恒定區(qū)分別稱為a，(3，s，y和P。免疫球蛋白不同類的亞基結構和三維構型都是眾所周知的。"抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)"指以下由細胞介導的反應表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒細胞(例如天然殺傷細胞(NK細胞)，嗜中性粒細胞和巨嗟細胞)識別耙細胞上結合的抗體，然后引起靶細胞的裂解。介導ACDD的主要細胞即NK細胞只表達FcRIII,單核細胞則表達FcRI,FcRII和FcRIII。Ravetch和Kinet，^瘦夢祐i回,9:457-92(199l)第464頁的表3中總結了造血細胞上的FcR表達?？赏ㄟ^體外ADCC試驗，例如美國專利5,500,362或5,821,337，來評價某分子的ADCC活性。可用于此或者，也可以通過動物模型體內試驗來評價某分子的ADCC活性，例如Clynes等，PANS(USA)95:652-656(1998)所述。"人效應細胞，，是表達一種或多種FeR，并具有效應功能的白細胞。較好的是，此類細胞至少表達FcRIII,并具有ADCC效應功能。介導ADCC的核細胞，細胞毒T細胞和嗜中性粒細胞；其中優(yōu)選PBMC和NK細胞。效應細胞可以從其天然來源中分離，例如自血液或PBMC中分離。"Fc受體"或"FcR，，指結合抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列的人FcR。而且，優(yōu)選的FcR應能結合IgG抗體(y受體)，這包括FcRI、FcRII和FcRIII亞類，包括它們的等位變體和不同拼-接形式。FcRII受體包括FcRIIA("活化受體")和FcRIIB("抑制受體")，它們的氨基酸序列相似，主要區(qū)別在于胞質區(qū)?；罨荏wFcRIIA的胞質區(qū)含有一個免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcRIIB的胞質區(qū)含有一個免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(見M.Dae讓,免疫學年度回顧15:203-234(1997))。有關FcR可見Ravetch和Kinet,免疫學年度回顧9:457-92(1991);Capd等，免疫學方法4:25-34(1994);和的Hass等，實驗室臨床醫(yī)學雜志126:330-41(1995)。本發(fā)明的"FcR"還包括將來鑒定到的FcR，還包括新生兒受體即FcRn,它負責IgG的母嬰傳遞(Guyer等，免疫學雜志117:587(1976)和Kim等，免疫學雜志24:249(1994))。"補體依賴性細胞毒性"或"CDC，，指分子在補體存在下裂解白細胞的能力。補體活化路徑從補體系統(tǒng)的第一組分(Clq)與某分子(例如抗體)與相應抗原的復合物結合開始?？赏ㄟ^CDC實驗來評價補體的激活，例如Gazzano-Santoro等，免疫學方法雜志202:163(1996)。"天然抗體，，通常為四聚糖蛋白，分子量約150,000道爾頓(Da)，由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構成。每條輕鏈通過一個二硫共價鍵與一條重鏈相連，免疫球蛋白不同同種型重鏈間二硫鍵的數(shù)量是不同的。每一重鏈和輕鏈還具有規(guī)則間隔的鏈間二硫橋。每一重鏈的一端具有一個可變區(qū)(VH)，后跟數(shù)個恒定區(qū)。每一輕鏈的一端為可變區(qū)(VO,另一端為恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)對齊，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)對齊?？梢哉J為，特定的殘基在輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)之間形成了一個界面。抗體描述中的"可變"指抗體可變區(qū)的某些部分彼此之間差異很大，并被用于特定抗體與其特定抗原的結合和特異性。然而，抗體可變區(qū)的可變性分布是不均勻的?？勺冃灾饕杏谳p鏈和重鏈可變區(qū)內的超變區(qū)?？勺儏^(qū)中保守性較高的部分稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各有4個FR,—般為P平面構型，彼此間通過3個成環(huán)超變區(qū)相連，有時，超變區(qū)構成P平面的一部分。各鏈中的超變區(qū)通過FR緊靠在一起，并與另一鏈中的超變區(qū)靠近，由此形成抗體的抗原結合位點(殘基Kabat等，免疫學上重要蛋白質的序列，第5X反，PublicHealthService,NationalInstituteofHealth,Bethesda，MD(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結合，但也具有各種不同的效應功能，例如參與抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)。"超變區(qū)"指抗體中負責結合抗原的氨基酸殘基序列。超變區(qū)主要包括輕鏈可變區(qū)中"互補決定區(qū)"或"CDR，，的氨基酸殘基(輕鏈可變區(qū)內的殘基24-34(Ll),50-56(L2)和89-97(L3)，和重鏈可變區(qū)內的殘基31-35(H1),50-56(H2)和95-102(H3);Kabat等，免疫學上重要蛋白質的序列，第5版，PublicHealthService,NationalInstituteofHealth,Bethesda，MD(1991))和/或"超變環(huán)"中的殘基(例如輕鏈可變區(qū)內的殘基26畫32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3),和重鏈可變區(qū)內的殘基26-32(Hl),53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和Lesk，分子生物學雜志196:901-917(1987》。"框架區(qū)"或"FR"殘基指可變區(qū)內上所超變區(qū)殘基之外的殘基。"分離的"抗體指從其自然環(huán)境中被鑒定，分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境中的雜質組分指那些會影響其診斷或治療用途的物質，這些雜質包括酶、激素以及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在優(yōu)選實施方式中，抗體被純化至(l)95wt,o/。(用Lowry法測定)，最好是99wt.%;(2)純化至可用轉杯測序儀測得至少15個N末端殘基或內部氨基酸序列的程度；或(3)純化至用還原或非還原Coomassie藍或銀染色(更好)的SDS-PAGE結果為均一。分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體，因為此時至少有一種該抗體天然環(huán)境中的組分將不存在。然而，分離抗體的制備至少需經一個純化步驟。"結合"所研究抗原(例如ErbB2抗原)的抗體指與該抗原的結合親和力足以適應以下用途的抗體作為靶向表達該抗原的細胞的診斷試劑和/或靶向傳送細胞毒性或其他化療藥物(例如類美坦素)的治療藥物。如果是結合ErbB2的抗體，它將優(yōu)先結合ErbB2而非其他ErbB受體，也可以是與EGFR、ErbB3或ErbB4等其他蛋白質沒有明顯交叉反應的抗體。此類實施方式中，ErbB2蛋白質的結合(例如細胞表面與內源性受體的結合)程度應低于10%。有時，抗ErbB2抗體與大鼠蛋白沒有明顯的交叉反應，例如見Schecter等，自然312:513(1984)和Drebin等，自然312:545-548(1984)。除非另作說明，"單克隆抗體4D5"和"4D5單克隆抗體，，指含有來自鼠4D5抗體的抗原結合殘基的抗體。例如，單克隆抗體4D5可以是具有鼠單克隆抗體4D5的抗原結合氨基酸殘基的鼠單克隆抗體4D5(ATCCCRL10463)或其變體，例如人源化抗體4D5。人源化4D5抗體的例子包括huMAb4D5-1,huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN⑧)，見美國專利5,821,337，其中優(yōu)選huMAb4D5-8(HERCEPTIN)。具有某指定抗體(例如單克隆抗體4D5)"生物學特征"的抗體指具有一個或多個該指定抗體區(qū)別于結合同一抗原(例如ErbB2)的其他抗體的生物學特征的抗體。例如具有4D5生物學特征的抗體以依賴于ErbB2表達水平的方式抑制ErbB表達細胞的生長，和/或以相同于4D5的方式結合ErbB2胞外區(qū)內的同一表位(例如阻抑單克隆抗體4D5結合ErbB2的抗體)。"生長抑制劑，，指在體外或體內抑制細胞尤其是ErbB表達癌細胞生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是能顯著降低S期ErbB表達細胞百分比的物質。生長抑制劑的例子包括(在S期以外)阻抑細胞周期發(fā)展的物質，例如引起Gl停滯和M期停滯的物質。典型的M期阻抑劑包括長春花提取物(包括長春新堿和長春花堿)，taxanes和topoII抑制劑，例如阿霉素、表柔比星、柔紅霉素、依托泊甙和博來霉素。阻滯G1的物質也參與S期阻滯，例如他莫昔芬、潑尼松、達卡巴嗪、氮芥、順鉑、曱氨蝶呤、5-氟尿嘧咬和Ara-C等DNA烷基化劑。其他相關信息可見蕃癥的為、f差礎，Mendelsohn和Israel編，Murakami等的第一章"細胞周期的調節(jié)，致癌基因和抗瘤藥物"(WBSaunders:Philadelphia,1995),p.l3。"生長抑制"性抗體的例子是結合ErbB2并抑制過量表達ErbB2的癌細胞生長的抗體。優(yōu)選的生長抑制性抗ErbB2抗體以0.5-30g/ml左右的濃度與SK-BR-3乳房癌細胞接觸6天后檢測，抑制培養(yǎng)的SK-BR-3乳房癌細胞達20%,更好的超過50%(例如50-100%)(1997年10月4日的美國專利5,677,171)。本發(fā)明后文將更詳細的描述SK-BR-3細胞生長抑制試驗。優(yōu)選的生長抑制性抗體是單克隆抗體4D5,例如人源化4D5。"誘導細胞死亡"的分子(例如抗體)指使得活細胞變成非活性細胞的分子。所述的細胞一般為表達ErbB2受體的細胞，尤其是過表達該受體的細胞。較好的是，所述細胞是癌細胞，例如乳房癌、卵巢癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌、曱狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌或膀胱癌的癌細胞。在體外，所述細胞可以是SK-BR-3細胞，BT474細胞，Calu3細胞，MDA-MB-453細胞，MDA-MB-361細胞或SKOV3細胞。體外細胞死亡可在沒有補體或免疫效應細胞存在的條件下測定，以區(qū)別于抗體依賴性細胞介導的細胞毒(ADCC)或補體依賴性細胞毒(CDC)所致的細胞死亡。因此，可采用熱滅活血清(即沒有補體)，并在沒有免疫效應細胞的條件下進行細胞死亡試驗。要確定某分子是否能夠誘導細胞死亡，可通過碘丙(PI)、臺盼藍(Moore等，細胞技術17:l-ll(1995))或7AAD攝取來檢測細胞膜完整性的損傷，并與未經處理的細胞相比較。優(yōu)選的細胞死亡誘導性抗體是能在BT474細胞PI攝取試驗中引起PI攝取的抗體?？烧T導細胞死亡的抗體的例子包括抗ErbB2抗體7C2和7F3(W098/17797)，包括其人源化和/或親和力成熟變體。"誘導凋亡"的分子(例如抗體)是根據膜聯(lián)蛋白V結合、DNA斷裂、細胞收縮、內質網膨脹、細胞破壞和/或膜泡(又稱凋亡體)測定，誘導細胞程序性死亡的分子。所述細胞一般是過量表達ErbB2受體的細胞。較好的是，所述細胞是腫瘤細胞，例如乳房癌、卵巢癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌、曱狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌或膀胱癌的癌細胞。在體外，所述細胞可以是SK-BR-3細胞，BT474細胞，Calu3細胞，MDA-MB-453細胞，MDA-MB-361細胞或SKOV3細胞。有多種方法可用于評價與細胞凋亡相關的細胞活動。例如，可通過膜聯(lián)蛋白結合來檢測磷酯酰絲氨酸(PS)轉移；通過DNA序列梯來配件DNA斷裂；通過亞二倍體細胞的增多來評價與DNA斷裂相伴的核/染色質收縮。較好的是，誘導凋亡的分子是在BT474細胞的膜聯(lián)蛋白結合試驗中，誘導的膜聯(lián)蛋白結合是未處理細胞的2-50倍，5-50倍，甚至10-50倍的分子。有時，促凋亡分子會進一步抑制ErbB受體的ErbB配體活化作用。其他情形中，促凋亡分子并不顯著抑制ErbB受體的ErbB配體活化作用。而且，所述分子可以誘導凋亡但并引起S期的細胞大量減少(例如，與對照相比，細胞百分比僅下降約0-10%)。誘導凋亡的抗體的例子包括抗ErbB2抗體7C2和7F3(W09S/17797)，包括其人源化和/或親和力成熟變體。"抑制，，ErbB受體的配體活化作用的抗體是如前所述降低或阻止所述活化作用的抗體，所述抗體能比單克隆抗體4D5更有效地抑制ErbB受體的配體活化作用，例如該抗體可以與單克隆抗體7F3或2C4或它們的Fab片段等效，更好的是與單克隆抗體2C4或其Fab片段等效。例如，抑制ErbB受體配體活化作用的抗體可以是抑制ErbB異寡聚物形成的效率比4D5高約50-100%的抗體。阻抑ErbB受體的配體活化作用可通過多種方式，例如干擾配體與ErbB受體結合，干擾ErbB復合物形成，干擾ErbB復合物中酪氨酸激酶活性和/或干擾ErbB受體內或其近旁酪氨酸激酶殘基的磷酸化。抑制ErbB受體的配體活化作用的抗體的例子包括單克隆抗體2C4和7F3(抑制ErbB2/ErbB3和ErbB2/ErbB4異寡聚物的HRG活化；以及EGF、TGF、雙調蛋白、HB-EGF和/或表調蛋白(epiregulin)對EGFR/ErbB2異寡聚物的活化)；和L26、L96和L288抗體(Klapper等，放虞差藥14:2099-2109(1997))，它們抑制EGF和NDF與T47D細胞的結合，該細力包表達EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4，還包括上述抗體的人源化及親和力成熟變體以及其他抗體。"表位，，指多種抗原的(單克隆或多克隆)抗體結合位點。結合特定表位的抗體可過"表位圖譜，，來鑒定。有許多已知方法可用于蛋白質上表位位置的制圖和特征分析，包括抗體-抗原復合物晶體結構解構，竟爭試驗，基因片段表達試驗和基于合成肽的試驗，見例如Harlow和Lane，在謬的炎^，實,發(fā)皇手,，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NewYork1999中的第11章。竟爭試驗可見后文。根據基因片段表達試驗，隨機或特定的基因構建使編碼蛋白質的開放讀碼框斷裂，然后測定所表達的蛋白質片段與所研究的抗體的反應性。可以通過例如PCR生成基因片段，然后體外轉錄，并在放射性氨基酸存在下翻譯成蛋白質。通過免疫沉淀和凝膠電泳來檢測放射性標記的蛋白質片段與抗體的結合。有些表位也可以用大型噬菌體展示的隨機肽序列庫(噬菌體庫)來鑒定。還可以在單純結合試驗中檢測已知的重疊肽片段庫是否與所測抗體結合。后一種方法適合鑒定約5-15個氨基酸的線性表位。當兩抗體識別相同或空間重合的表位時，"基本上結合同一表位"的抗體互為參比抗體。確定兩表位是否相同或空間重合最常用且最快的方法是竟爭試驗，該試驗用標記的抗原或標記的抗體進行，可采用多種模式。通常，將抗原固定在96孔板上，用放射性或酶標記來檢測非標記抗體抑制標記抗體結合的能力。"表位4D5，，指ErbB2胞外區(qū)內抗體4D5(ATCCCRL10463)所結合的區(qū)域。該表位靠近ErbB2的跨膜區(qū)，是圖4SEQIDNO:3中ErbB2胞外區(qū)氨基酸序列內的殘基519-625,包含端值。可通過常規(guī)交叉抑制試驗來篩選結合4D5表位的抗體，見例如Harlow和Lane，同上。也可以通過制作表位圖譜來確定抗體是否結合ErbB2的4D5表位(例如，SEQIDNO:3中殘基529-625之間的任一或多個殘基)。"表位3H4"指ErbB2胞外區(qū)內抗體3H4所結合的區(qū)域。該表位包括圖4SEQIDNO:3中ErbB2胞外區(qū)氨基酸序列內的殘基541-599。"表位7C2/7F3，，是位于ErbB2胞外區(qū)N末端7C2和/或7F3抗體(已在ATCC保藏，見后文)結合的區(qū)域。可通過常規(guī)交叉抑制試驗來篩選結合表位7C2〃F3的抗體，見例如Harlow和DavidLane，我伴，豸-發(fā)皇手,，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour，NewYork1988。也可以通過制作表位圖譜來確定抗體是否結合ErbB2上的7C2/7F3表位(例如，圖4SEQIDNO:3中殘基22-53之間的任一或多個殘基)。"對抗ErbB單克隆抗體治療無反應或反應差"的腫瘤在公認動物4莫型或人體臨床試驗中，與無處理或安慰劑處理相比，抗ErbB抗體治療沒有引起統(tǒng)計學上顯著的改善，或者，在抗ErbB抗體治療初期有反應，但隨著治療的繼續(xù)，腫瘤繼續(xù)長大。特別適合測定抗ErbB抗體效果的動物模型是本發(fā)明實施例3所述的轉基因動物模型。"處理"或"治療"都指以預防或減緩惡化(例如癌癥的發(fā)展或擴散)為目的的治療和預防手段。就本發(fā)明而言，理想的良好臨床效果包括但不限于緩解癥狀，減輕病重程度，穩(wěn)定疾病狀態(tài)(即不惡化)，延遲或減緩疾病發(fā)展，減輕病癥，和(部分或全面)恢復，不"^侖可測知或不可測知。"治療"也可以表示相對于不接受治療的預期存活期相比，延長了存活期。需要治療的包括已經患病和易于發(fā)病的，或需要預防的個體。"疾病，，指各種可因本發(fā)明治療方法而緩解的病癥，包括慢性和急性疾病，或使得哺乳動物易于患病的病理狀態(tài)。有待治療的疾病的例子包括但不限于良性和惡性腫瘤；白血病和淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，尤其是乳房癌、卵巢癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌、曱狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌或膀胱癌。特別適合用本發(fā)明方法治療的疾病是過量表達ErbB受體(例如ErbB2和/或EGFR),而且對于用所述過量表達的受體其抗體進行的治療無反應或反應差的惡性腫瘤，例如乳房癌。特別適合的是對于HERCEPTIN⑧治療無反應或反應差的、過量表達ErbB2受體的乳房癌。"治療有效量，，指藥物的用量可有效治療哺乳動物的疾病。以癌癥為例，藥物的治療有效量可減少癌細胞；縮小癌細胞；抑制癌細胞滲入周圍器官(即一定程度的減緩，最好是停止)；抑制腫瘤擴散(即一定程度的減緩，最好是停止)；一定程度地抑制腫瘤生長；和/或一定程度地緩解一種或多種與癌癥相關的癥狀。藥物阻止已存在的癌細胞生長和/或將其殺死可以是通過細胞靜止作用或細胞毒性作用。就癌癥治療而言，可以通過測定疾病發(fā)展的時間(TTP)和/或反應速度(RR)來確定效果。"細胞毒試劑"在此指可抑制細胞功能和/或造成細胞破壞的的物質，包括放射性同位素(例如At211,I131，I125,Y90,Re186,Re188，Sm153，Bi212，P32和Lu的放射性同位素)，化療試劑，以及來自細菌、真菌、植物或動物的毒性，例如小分子毒素或酶活性毒素，包括它們的片段和/或變體。"化療試劑"指用于治療癌癥的化合物，包括烷基化劑，例如塞替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXANTM)等；烷基硫酸酯，例如白消安，英丙舒凡和哌博舒凡；氮丙啶，例如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和烏瑞替哌；氮丙啶和methylamelamines，包括六曱蜜胺、曲他安、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基石克代磷酰胺和trimethylolomelamine;氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、次氯酸氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖、novembicin、月旦甾醇對苯乙酸氮芥、潑尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫司??；亞硝基脲，例如卡莫司汀、cholorozotocin、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司?。豢股?，例如阿克拉霉素、放線菌素、authramycin、偶氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素C、刺孢霉素、carabicin、洋紅霉素、carzinophilin、色霉素、放線菌素D、柔紅霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊達比星、marcellomycin、絲裂霉素、麥考酚酸、諾拉霉素、橄欖霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌羅霉素、quelamycin、羅多比星、絳色霉素、鏈佐星、殺結核菌素、烏苯美司、凈他司丁、佐柔比星；抗代謝藥，例如氨曱蝶啉和5-氟尿嘧吱(5-FU);葉酸類似物，例如denopterin、氨曱蝶啉、蝶羅呤、三甲曲沙；噤呤類似物，例如氟達拉濱、6-巰噪呤、硫嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU;雄激素，例如卡魯睪酮、屈他雄酮丙酸酯、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內酯；抗腎激素類(anti-adrenals)，例如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑，例如葉酸；醋葡醛內酯；醛磷酰胺苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸；安吖定；bestrabucil;比生群；edatraxate;地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；elfornithine;依利醋銨；依托革魯；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖；氯尼達明；米托胍腙；米4乇蒽醌；莫派達醇；nitmcrine;噴司他??；phenamet;，，比柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK;雷佐生；西佐喃；鍺螺胺；細交鏈胞菌酮酸；三亞胺醌；2,2',2'-三氯三乙胺；脲烷；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司?。欢甯事洞?；二漠衛(wèi)茅醇；哌泊溴烷；gacytosine;阿拉伯糖苷(Ara-C);環(huán)石粦酰胺；塞替派；taxanes，例如paclitaxel(TAXOL，Bristol-MyersSquibbOncology,Princton，NJ)和doxetaxel(TAXOTERE，Rhone-PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥；gemcitabine;6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨曱蝶啉；鉑同系物，例如順鉑和卡鉑；長春堿；鉑；依托泊甙(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C;米托蒽醌；長春新堿；長春瑞賓；navelbine;novantrone;替尼泊苷；道諾霉素；氨蝶呤；xeloda;ibandronate;CPT-11;拓樸異構酶抑制劑RFS2000;二氟甲基烏氨酸(DMFO);視黃酸；埃斯波素；capecitabine;和以上所述化合物的藥學上認可的鹽、酸或衍生物。"化療試劑"還包括調節(jié)或抑制激素對腫瘤作用的抗激素試劑，例如抗雌激素藥物他莫昔芬，雷洛昔芬，芳香酯抑制性4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬；keoxifene;LY117018;onapristone和托瑞米芬(Fareston)等；和抗雄激素藥物氟他胺，尼魯米特，bicalutamide，亮丙瑞林和革舍瑞林；以及它們的藥學上認可的鹽、酸或衍生物。"前藥，，在此指藥學活性物質的前體或衍生物形式，與親本藥相比，它們對腫瘤細胞的細胞毒性較低，但能被酶激活或轉化成活性較高的親本藥形式。見例如Wilman，"癌癥化療中的前藥"，^務化夢錄會會W14,pp.375-382,Belfast第615次會議(1986)和Stella等，"前藥一種藥物靶向傳遞的化學方法"，定^7秀#傳遽，Borchardt等編輯，pp.247-267，HumanaPress(1985)。本發(fā)明的前藥包括但不限于含磷酸酯前藥，含石充代磷酸酯前藥，含硫酸酯前藥，含肽前藥，D氨基酸改性前藥，糖基化前藥，含內酰胺前藥，含可取代苯氧基乙酰胺前藥或含取代苯乙酰胺前藥，5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿嘧啶前藥，它們能轉化為活性較高的細胞毒性游離藥?？山浹苌鸀榧毎拘运幬锏谋景l(fā)明前藥形式的例子包括但不限于前述化療試劑。"核酸"指聚核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，還包括由核苷酸類似物形成的DNA或RNA的等效物、類似物，單鏈(有義鏈或反義鏈)和雙鏈聚核苷酸。"分離的"核酸分子指經過鑒定，并去除了至少一種其天然來源中通常與之結合的污染性核酸分子的核酸。分離的核酸其形式不同于其天然形式。因此，分離的核酸分子不同于存在于天然細胞內的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括存在于抗體表達細胞內的核酸分子，即(例如)，其染色體位置不同于其天然細胞的核酸分子。"載體"在此指能夠運栽另一核酸的核酸分子。"表達載體"包括能夠合成自身所帶重組基因所編碼的HER2蛋白的質粒、粘?；蚴删w。優(yōu)選載體能夠自復制和自表達與之相連的核酸。本說明書中，"質粒，，和"載體"混用，因為質粒是最常用的載體形式。"轉錄調控元件，，和"轉錄調控序列，，在此混用，都指在特定宿主細胞內表達操作性連接的編碼序列所需的核酸(例如DNA)序列。例如，適用于原核細胞的調控序列包括啟動子，可選的操縱子序列，和核糖體結合位點。已知，真核細胞使用的是啟動子、增強子、剪接信號和聚腺苷酸信號。所謂調控序列包括促進或調節(jié)轉錄的各種元件，包括啟動子、RNA聚合物與轉錄因子間基本作用所需的核心元件，上游元件，增強子和應答元件(Lewin，"基因V",OxfordUniversityPress，Oxford,pp.847-873)本發(fā)明所稱某基因或一類基因的轉錄調控元件包括該基因或該類基因的完整天然轉錄調控元件區(qū)域，也包括其修飾形式。所述的修飾形式包括元件重排，元件缺失或異源序列，異源序列的插入。轉錄調控元件具有模塊性，有些調控元件(例如增強子)的功能沒有位置依賴性，這使得所述修飾成為可能。已有許多技術可用于剖析基因的調控序列，從而確定它們的位置和功能。可根據需要用此類信息來指導調控元件的修飾。然而，較好的是使用完整的轉錄調控元件全區(qū)域。"組織特異性啟動子"指這樣一段核苷酸序列它可作為啟動子調控與之操作性相連的選定DNA序列的表達，并能夠使得該選定DNA序列在特定組織細胞內表達，例如在乳腺細胞內。在一說明性實施方式中，可用采用了乳腺特異性啟動子的基因構建物來指導HER2蛋白或其片段在乳腺組織內的優(yōu)勢性表達。將核酸"操作性連接"即使之處于與另一核酸序列具有功能關系的位置。例如，前導序列或分泌性前導肽的DNA與某多肽的DNA操作性連接，如果它們表達為參與所述多肽分泌的前體蛋白質；啟動子或增強子與一段編碼序列操作性連接，如果該啟動子或增強子影響著所述序列的轉錄；或者，核糖體結合位點與一段編碼序列操作性連接，如果其位置促進翻譯?？偟恼f來，"操作性連接，，表示連接后的DNA序列連是連續(xù)的，如果是分泌性前導肽，則應連續(xù)而且在讀碼相內。然而，增強子的連接不必是連續(xù)的。所述連接可通過常規(guī)限制性位點的連接反應實現(xiàn)。如果沒有這樣的位點，可根據已知方法使用合成的寡核普酸接頭。"轉染"表示通過核酸介導的轉移將核酸分子(例如表達載體)導入宿主細胞。"轉化"過程表示細胞的基因型因攝取了異源DNA或RNA而被改變，例如，轉化細胞將表達重組HER2。"轉基因，，在此指對于導入了基因的轉基因動物或細胞而言部分或完全異源的核酸序列，或者，其序列與導入了基因的轉基因動物或細胞的內源基因同源，但它插入動物的基因組后改變了該基因組(例如，該同源序列插入在不同于天然基因所在的位置，或其插入造成基因敲除)?？蓪⑥D基因與一段或多段轉錄調控序列或選定核酸表達優(yōu)化所需的其他核酸(例如內含子)操作性連接。因此，"轉基因構建物"指包含轉基因并可包含其他核酸的核酸序列，所述其他核酸例如轉錄調控序列、聚腺苷酸化位點，復制起點，標記基因等，即對將轉基因插入宿主基因組整體操作可能有用的序列。"轉基因的"在此表示某動物或構建物含有轉基因。例如，"轉基因生物"指其一個或多個細胞經人為導入(例如本領域公知的轉基因技術)而含有異源核酸的動物，尤其是非人動物。通過精細的基因操作，例如微注射和重組病毒感染，將核酸直接導入細胞，或通過導入其前體而間接導入。"基因操作，，不包括育種和體外受精，而是指導入重組DNA分子。該分子可能整合到染色體內，也可能成為染色體外復制的DNA。在本文所述的典型轉基因動物中，轉基因使得細胞表達或過量表達重組形式的HER2蛋白。"建立者線，，或"建立動物，，表示這些動物是導入了轉基因的胚胎的成熟產物，即，這些動物由插入了DNA并被植入一種或多種代孕宿主的胚胎長成。"子代，，和"轉基因動物的子代"指原轉化哺乳動物每一后代的任一或所有后代。"非人動物，，指哺乳動物類中除人之外的所有成員。"哺乳動物"指包括人在內的所有哺乳類動物，包括圏養(yǎng)動物、放養(yǎng)動物、動物園內動物、參賽動物或寵物，例如小鼠、大鼠、兔子、豬、綿羊、山羊、牛和高級靈長類動物。"細胞，，，"細胞線，，和"細胞培養(yǎng)物，，在此混用，且都包括它們的后代。因此，"轉化子，，和"轉化細胞"包括原代細胞和由它們得到的培養(yǎng)物，不論存在幾次傳遞。還需要指出的是，所有子代的DNA內容不一定完全相同，因為存在著隨機突變。本發(fā)明包括篩選得到的與原轉化細胞具有相同功能或生物學活性的突變子代。根據后文所述，根據需要，它們可能具有不同的稱謂。"脂質體，，是由各種脂類、磷脂和/或表面活性劑構成的小泡，用于向動物傳遞藥物(例如本發(fā)明的抗ErbB2抗體，或化療試劑)。脂質體的組成一4殳排列成雙層，類似于生物膜的脂類排列。"包裝內說明，，指治療產品市售包裝內的說明書，其中的信息包括適應癥、使用方法、劑量、給藥方式、禁忌癥和/或使用注意事項。"心保護劑，，指預防或減輕患者與服藥(例如抗ErbB抗體或其類美坦素偶聯(lián)物)有關的心肌功能異常(即心肌病和/或充血性心衰)的化合物或組合物。例如，心保護劑能夠預防和減弱自由基介導的心臟毒性作用和/或預防和減弱氧化性應激損傷。本發(fā)明心保護劑的例子包括離子螯合劑dexrazoxane(ICRF-187)(Seifert等，秀務治《夢半孩28:1063-1072(1994));降脂藥和/或抗氧化劑，例如普羅布考(Signal等，分f勿應心返病夢染,悉27:1055-1063(1995));氨磷汀(氨基硫醇2-[(3-氨基丙基)氨基]乙硫醇二氫磷酸酯，又稱WR-2721，及其去磷酸細胞攝取形式，又稱WR-1065)和S-3-(3-曱基氨基丙基氨基)丙基磷酸硫代酸(WR-151327),見Green等，^癥^f兌54:738-741(1994);地高辛(Bristow,M.R.，BristowMR.編的秀錄W趟的心腐4，NewYork:Elsevier191-215(1980));卩-抑制劑，例如美托洛爾(Hjalmarson等，秀參47:增刊4:31-9(1994)和Shaddy等，4馬心處病染4129:197-9(1995));維生素E;抗壞血酸(維生素C);自由基清除劑，例如石竹酸，烏索酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC);自旋捕集化合物，例如a-苯基—叔丁基硝酮(PBN)(Paracchini等，我^研:《13:1607-1612(1993));硒基化合物，例如P251(Elbesen);等等。2.詳細描述本發(fā)明的基礎是在一種新的鼠HER2轉基因腫瘤模型中所獲得的結果，該模型中，HERCEPTIN⑧或由其得到的鼠抗體4D5對于腫瘤生長幾乎沒有作用。用該模型檢測HERCEPTIN⑧和HERCEPTIN⑧-類美坦素偶聯(lián)物的效用，意外發(fā)現(xiàn)于轉基因小鼠中移植腫瘤雖然對HERCEPTIN⑧治療反應較差，但HERCEPTIN⑧-類美坦素偶聯(lián)物卻非常有效。因此，本發(fā)明的基礎是用抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物來治療對抗ErbB抗體和/或類美坦素反應不良的ErbB過量表達型腫瘤。A.抗ErbB抗體的生成以下是本發(fā)明用來生成抗體的方法，只可視為舉例。以下將就抗ErbB2抗體來描述抗體的生產，但本領域技術人員可以看出，顯然可用類似方法生成和修飾ErbB受體家族其他成員的抗體。用來生產抗體的ErbB2抗原可以是例如ErbB2蛋白的胞外區(qū)或其片段的可溶形式，其中應包含所需的表位?；蛘?，也可使用在細胞表面表達ErbB2的細胞(例如經轉化而過量表達ErbB2的NIH-3T3細胞；或SK-BR-3等癌細胞；見Stancovski等，/MA^(X/5^)88:8691-8695(1991))來生產抗體。本領域才支術人員可以看出，還可用其他形式的ErbB2來生產抗體。(i)多克隆抗體可通過給動物多次皮下注射(sc)或腹膜內注射(ip)相關抗原和佐劑來產生多克隆抗體。按需要，可用雙官能劑或衍生劑將相關抗原與對待免疫動物具有免疫原性的蛋白質偶聯(lián)，所述蛋白質例如匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛曱狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑，所述雙官能劑例如馬來酰亞氨基苯曱酸基磺基琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))，N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基偶聯(lián))，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl2，或WNONR,其中的R和R'是不同的烷基。例如，將100g(兔)或5g(小鼠)蛋白質或偶聯(lián)物與3倍體積弗氏完全佐劑混合，用此溶液多點皮下注射，如此以抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動物。一個月后增強免疫，即用肽或偶聯(lián)物原用量的1/5至1/10與弗氏完全佐劑混合后多點皮下注射。7-14天后，放取動物的血，檢測血清的抗體效價。繼續(xù)對動物增強免疫，直至效價達到平臺期。較好的是用同一抗原與不同蛋白質或通過不同的交聯(lián)劑形成的偶聯(lián)物增強免疫。也可以用重組細胞培養(yǎng)物生成的融合蛋白形式的偶聯(lián)物。而且，可適當使用明礬等凝聚劑愛增強免疫反應。(ii)單克隆抗體單克隆抗體是由一群基本均一的抗體獲得的，即該群中的各抗體除可能極少量存在的天然突變之外完全相同。因此，修飾語"單克隆"是指抗體不是不同抗體的混合物這一特征。例如，單克隆抗體可用雜交瘤方法制備，最早的相關報道是Kohler等，々,然'256:495(1975),也可用重組DNA方法制備(美國專利4,816,567)。在雜交瘤方法中，如上所述地免疫小鼠或倉鼠等合適的宿主動物，為的是激發(fā)生產或能夠生產特異性結合免疫所用蛋白質的抗體的淋巴細胞。或者也可以進行淋巴細胞體外免疫。然后用合適的融合劑(例如聚乙二醇)將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞(Goding,卓^發(fā)我伴^理和^減，pp.59-103(AcademicPress,1986)。將所得的雜交瘤細胞接種并培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含有一種或多種可抑制非融合親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，如果親本骨髓瘤細胞沒有次黃嘌呤鳥噪呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則雜交瘤的培養(yǎng)基含有次黃嘌呤、氨甲蝶啉和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這將阻止HGPRT缺陷型細胞的生長。優(yōu)選的骨髓瘤細胞應能有效融合，支持抗體生產細胞穩(wěn)定而高水平地生產抗體，并對培養(yǎng)基(例如HAT培養(yǎng)基)敏感。優(yōu)選的骨髓瘤細胞線是鼠骨髓瘤細胞線，例如MOPC-21和MPC-ll小鼠腫瘤衍生的細胞線(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,CaliforniaUSA)和SP-2或X63-Ag8-653細月包(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville,MarylandUSA)。曾有人用人骨髓瘤和小鼠-人雜交骨髓瘤細胞線來生產人單克隆抗體(Kozbor，J.，Immunol,133:3001(1984);和Brodeur等，卓^發(fā)我伴^:,拔j和^"見pp.5l-63(MarcelDekker，Inc.,NewYork,1987)。對雜交瘤生長的培養(yǎng)基進行抗抗原單克隆抗體生產檢測。較好的是，雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體的結合特異性用免疫沉淀或體外結合試驗來測定，例如放射性免疫試驗(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。單克隆抗體的結合親和力可用Munson等，生物化學年報107:220(1980)所述的Scatchard試-瞼來測定。鑒定到所生產抗體具有所需特異性、親和力和活性的雜交瘤細胞后，將該克隆用有限稀釋法進行亞克隆，用標準方法培養(yǎng)(Goding，卓^鏖我傳.'^理和豸減pp.59-103(AcademicPress,1986)。合適的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640。此夕卜，也可以在動物體內培養(yǎng)雜交瘤細胞，例如腹水瘤。用常規(guī)抗體純化方法從培養(yǎng)基，復水或血清中分離出亞克隆分泌的單克隆抗體，純化方法例如蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳，透析或親和層析。用常規(guī)技術不難分離得到編碼單克隆抗體的DNA并測序(例如，用特異性結合鼠抗體重鏈和輕鏈編碼基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是此類DNA的優(yōu)選來源。分離后，將DNA插入表達載體，然后轉染原本不生產抗體蛋白的宿主細胞，例如大腸桿菌細胞，猴COS細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，由此在重組宿主細胞內實現(xiàn)單克隆抗體的合成。有關抗體編碼DNA在細菌內的重組表達可見Skerra等，^V七名瘦夢觀^5:256-262(1993)和Pluckthum,^瘦夢回^^130:151-188(1992)。另一種實施方式中，可從用McCafferty等，348:552-554(1990)所述方法建立的抗體噬菌體庫中分離單克隆抗體或抗體片段。Clackson等，々/4'352:624-628(1991)和Marks等，為、子4樹夢染志222:581-597(1991)描述了用噬菌體庫分離獲得小鼠和人抗體。以后的文獻中曾用鏈改組(Marks等，_^##/戎術，10:779-783(1992)),聯(lián)用感染和體內重組構建極大型噬菌體庫(Waterhouse等，^"凝^f兌21..2265_2266(1"3))來生產高親和力的人抗體。因此，這些技術都可作為傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術的備選用于分離單克隆抗體。還可以對DNA進行修飾，例如用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)編碼序列取代同源性鼠序列(美國專利4,816,567;和Morrison等，^譚存夢虎虎孩81:6851(1984))，或將某種非免疫球蛋白多肽的完整或部分編碼序列與該免疫球蛋白編碼序列共價連接。通常，所述用非免疫球蛋白多肽取代抗體的恒區(qū)，或者取代抗體的抗原結合位點之一的可變區(qū)，從而形成嵌合二價抗體，即包含某一抗原特異性的一個抗原結合位點，和另一抗原特異性的另一個抗原結合位點。(m)人源化抗體非人抗體人源化的技術是已知的。較好的是，人源化抗體內導入了來自其非人來源的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱為取自"輸入"可變區(qū)的"輸入，，殘基。人源化可基本上按照以下方法即Winter及其同事(Jones等，力然321:522-525(1986);Riechmann等，《然332:323-327(1988);Verhoeyen等,存夢239:1534-1536(1988)),用超變區(qū)取代人抗體內的相應序列。因此，此類"人源化"抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567),不到一個完整的人可變區(qū)被相應的非人序列所取代。實踐中，人源化抗體一般是人抗體，但其中部分超變區(qū)殘基，還可能包括部分FR殘基被鼠抗體相應位置的殘基所取代。挑選用來制造人源化抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)對于降低抗原性來說十分重要。按照"最佳擬合，，法，在整個已知人可變區(qū)序列庫中篩選鼠抗體的可變區(qū)序列。然后，將與鼠序列最近似的人序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims等，^瘦夢染志，151:2296(1993);Chothia等，為、子i參夢染,悉196:901(1987))。另一種方法使用所有人抗體特定亞類輕鏈或重鏈衍生的共有序列作為特定的框架區(qū)。該相同框架區(qū)可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter等，^蜀辨夢應應孩89:4285(1992);Presta等，名瘦夢染,悉151:2623(1993》。更重要的是，人源化抗體應保留對抗原的高親和力及其他優(yōu)良生物學特性。為此，一種優(yōu)選方法制備人源化抗體的過程為用親本序列和人源化序列的三維模型來分析親本序列和各種理論人源化產物。三維免疫球蛋白模型是已有的，并為本領域技術人員所熟知?？捎糜嬎銠C程序證明并展示特定候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構。對上述展示的研究可分析出個各殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，即分析出影響候選免疫球蛋白與其抗原結合的殘基。用該方法可選出FR殘基，并將受者序列與輸入序列結合，從而獲得所需的抗體特性，例如提高對靶抗原的親和力。通常，超變區(qū)殘基直接影響抗原結合，或影響最大。后文實施例1以人源化抗ErbB2抗體為例描述了制備方法。本發(fā)明的人源化抗體在人重鏈可變區(qū)內摻入非人超變區(qū)殘基，并可包含選自69H,71H和73H位置(采用Kabat的算才義瘦夢,#乂的蛋^#的,/^第5版)，PublicHealthService,NationalInstituteofHealth,Bethseda,MD(1991)所述的可變區(qū)編號體系)的框架區(qū)(FR)取代。實施方式之一中，人源化抗體含有2個和全部69H,71H和73H位置的框架區(qū)(FR)取代?？紤]了各種不同形式的人源化抗體，例如，人源化抗體可以Fab等抗體片段，或者，人源化抗體可以是完整抗體，例如完整的IgG,抗體。(iv)人抗體作為人源化的備選方案，可生產人抗體。例如，現(xiàn)在已經能夠生成經免疫后能生成完整人抗體庫而沒有內源性免疫球蛋白產生的轉基因動物(例如小鼠)。例如，據稱，嵌合和種系突變小鼠內抗體重鏈鉸鏈區(qū)(JH)純合缺失造成內源性抗體生產的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因轉移到此類種系突變小鼠中，在收到抗原攻擊后即可生成人抗體。見，例如Jakpbovits等，^萄存夢應應拔90:2551(1993);Jakobovits等，自然362:255-258(1993);Bmggermann等，名瘦夢半孩7:33(1993);和美國專利5,591,669,5,589,369和5,545,807?；蛘?，可用噬菌體展示技術(McCafferty等，自然348:552-553(1990))，從非免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因庫中體外制備人抗體或抗體片段。根據這一技術，將抗體V區(qū)基因框內克隆到絲狀噬菌體(例如M13或fd)的主衣殼蛋白或次衣殼蛋白基因中，在噬菌體顆粒表面展示為功能性抗體片段。因為絲狀噬菌體顆粒含有單鏈的噬菌體DNA拷貝，根據抗體功能的選擇同時選出了有此功能抗體的編碼基因。這樣，噬菌體模擬了B細胞的某些特性。噬菌體展示可用多種方式進行，見例如Johnson,KevinS.和Chiswell,DavidJ.，現(xiàn)^潛溝4務夢染,悉3:564-571(1993)。有多種V基因序列來源可用于噬菌體展示。Clackson等(么熬'352:624-628(199l))從免疫小鼠脾臟V基因的隨機小組合庫中分離到抗唑酮抗體的多樣性列陣。按照Marks等的方法(分子4游夢染^222:581_597(1"1))或Griffith等(欽洲12:725-734(1993))以及美國專利5,565,332和5,573,905所述的方法，可構建出非免疫人供體的V基因庫，并分離到針對一抗原多樣性列陣的抗體。如前所述，人抗體也可以通過體外激活B細胞來制備(見美國專利5,567,610和5,229,275)。有關人抗ErbB2抗體可見1998年6月30日的美國專利5,772,997和1997年1月3日的WO97/00271。(v)抗體片段已有多種技術可用于生成抗體片段。通常，這些片段通過完整抗體的酶消化衍生而得(Morimoto等，_^游化夢和i參參理夢才法染,志24:107-117(1992)和Brennan等，存夢229:81(1985))。然而，現(xiàn)在，這些片段也可以直接由重組宿主細胞生成。例如，可用上述噬菌體庫中分離得到抗體片段?；蛘撸蓮拇竽c桿菌中直接回收Fab'-SH片段，然后化學偶聯(lián)成F(ab')2片段(Carter等，^:參/炎^10:163-167(1982))。另一種方法直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物中分離F(ab')2片段。其他生成抗體片段的方法對本領域技術人員來說顯而易見。另一實施方式中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見W093/16185;美國專利5，571，894和美國專利5,587,458。這種抗體片段又稱"線性抗體，，，見美國專利5，641，870。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體即對至少兩種不同表位具有特異性的抗體，例如能結合ErbB2蛋白質上兩個不同表位的抗體。其他此類抗體可將ErbB2結合位點與EGFR、ErbB3和/或ErbB4的結合位點相組合。或者，可將抗ErbB2臂與另一臂結合，后者與白細胞上的觸發(fā)分子結合，使得細胞的防御機制集中針對表達ErbB2的細胞，所述觸發(fā)分子例如T細胞受體分子(例如CD2或CD3)，或IgG的Fc受體(FcR)FcRI(CD64)、FcRII(CD32)和FcRIII(CD16)。也可用雙特異性抗體將細胞毒試劑導向表達ErbB2的細胞。W096/16673描述一種抗ErbB2/抗FcRIII雙特異性抗體，美國專利5,837,234描述了一種抗ErbB2/抗FcRI雙特異性抗體，WO98/02463描述了一種抗ErbB2/Fc雙特異性抗體，美國專利5,821,337描述了一種抗ErbB2/抗CD3雙特異性抗體。制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。制備全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)方法以兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達為基礎，其中兩對鏈具有不同的特異性(Millstdn等，々#305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈與輕鏈的隨機配對，這些雜交瘤(四交瘤)可產生IO種不同抗體分子的混合物，其中只有一種是正確的雙特異性結構。正確分子的純化一般通過親和層析進行，該過程相當煩瑣，而且得率不高。WO93/08829和Tmunecker等，欽;z/i參夢染^10:3655-3659(1991)描述了類似的方法。另一種方法將具有所需結合特異性的抗體可變區(qū)(抗體-抗原結合位點)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合，最好與包含至少部分鉸鏈區(qū)、CH2和CH3的免疫^求蛋白重鏈恒定區(qū)融合。最好在至少一種融合體中含有輕鏈結合所必需位點的重鏈第一恒定區(qū)(CH1)。根據需要，可將編碼免疫球蛋白重鏈融合體的DNA和編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA分別插入不同的表達載體，然后共轉染合適的宿主。當構建過程使用不等量的三種片段可獲得最佳得率時，這為調節(jié)三段多肽片段相互比例提供了很大的靈活性。然而，當至少兩段片段等量時可獲得高得率，或者多肽之比無關緊要時，也可以將編碼兩段或三段多肽片段的聚核苷酸插入同一表達載體。在該方法的優(yōu)選實施方式中，雙特異性抗體的一臂包含具有第一結合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈，另一臂包含雜交的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(具有第二結合特異性)。已發(fā)現(xiàn)，這種不對稱結構有利于所需雙特異性化合物的分離，因為僅雙特異性分子的一半含有免疫球蛋白輕鏈易于分離。該方法可見WO94/04690。有關制備雙特異性抗體更詳細的內容可見Suresh等，錄夢才法，121:210(1986)。根據美國專利5，731,168描述的另一種方法，可對抗體分子對之間的界面進行基因工程改造，從而盡可能提高從重組細胞培養(yǎng)物中回收得到異二聚體的百分比。優(yōu)選界面至少包含抗體恒定區(qū)CH3的一部分。該方法中，第一抗體分子界面上的一段或多段小氨基酸側鏈用大氨基酸側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)置換。然后在第二抗體分子界面上通過用小氨基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)置換大氨基酸側鏈形成大小與大側鏈相同或近似的補償性"穴"。這樣可使得異二聚體的得率高于均二聚體等其他不需要的終產物。文獻中還記載了由抗體片段制備雙特異性抗體的技術。例如，可通過化學連接來制備雙特異性抗體。Brennan等，夢229:81(1985)描述的過程中，完整抗體經蛋白酶剪切生成F(ab')2片段。二硫酚復合劑亞砷酸鈉存在下還原這些片段，穩(wěn)定相鄰的二硫酚，避免形成分子內二硫鍵。然后將產生的Fab'片段轉變?yōu)榱虼趸綍跛狨?TNB)衍生物。然后用巰基乙胺將Fab'-TNB衍生物之一還原成Fab'-硫醇，與等量的另一種Fab'-TNB衍生物混合，形成雙特異性抗體。由此生成的雙特異性抗體可用于酶的選擇性固定200910化。最近已可以直接從大腸桿菌中回收Fab'-SH片段，然后可通過化學偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby等，^-發(fā)厓夢染U75:217-225(1992)描述了一種全人源化雙特異性抗體F(ab')2分子的產生。由大腸桿菌分別分泌各Fab'片段，然后直接體外化學偶聯(lián)成雙特異性抗體。這樣形成的雙特異性抗體能夠結合過量表達ErbB2受體的細胞和正常人T細胞，并觸發(fā)人細胞毒性淋巴細胞對人乳房癌腫瘤的裂解活性。已有多種從重組細胞培養(yǎng)物中直接制造和分離雙特異性抗體片段的技術。例如，可用亮氨酸拉鏈來制造雙特異性抗體。Kostelny等，尤瘦夢染,悉148(5):1547-1553(1992)。通過基因融合將Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab'片段連接。在鉸鏈區(qū)還原抗體均二聚體，形成單體，然后再氧化成抗體異二聚體。該方法也可以用來制造抗體均二聚體。Hollinger等，^馬存夢虎應孩90:6444-6448(1993)描述的"二抗體"技術提供了另一種制造雙特異性抗體片段的方法。其中的片段中，一段重鏈可變區(qū)(VH)通過一段連接肽與一段輕鏈可變區(qū)(VL)連接，這段連接肽很短以致不可能發(fā)生同一鏈內兩區(qū)之間的配對。因此，一片段的VH和VL被迫與另一片段的互補VL和VH配對，于是形成兩個抗原結合位點。還有另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來制造雙特異性抗體片段的方法，見Gruber等，名瘦夢森《152:5368(1994)。也可以制造二價以上的抗體，例如三特異性抗體。Tutt等，名瘦夢染,志147:60(1991)。(vii)其他氨基酸序列修飾可以對本發(fā)明中的抗ErbB2抗體進行氨基酸序列修飾。例如，可能需要改進抗體的結合親和力和/或其他生物學特性。制備抗ErbB2抗體的氨基酸序列變體可以通過在抗ErbB2抗體核酸內引入合適的核苷酸改變，或者通過肽合成。所述的修飾包括例如抗ErbB2抗體氨基酸序列內的缺失和/或插入和/或取代。只要最終結構具有所需的特征，可以聯(lián)合運用缺失、插入和取代來形成最終結構。氨基酸改變還可以改變抗ErbB2抗體的翻譯后加工，例如改變糖基化位點的數(shù)量或位置。一種鑒定抗ErbB2抗體內作為突變優(yōu)選位置的殘基或區(qū)域的方法稱為"丙氨酸掃描誘變，，，見Cunningham和Wells,;拜夢244:1081-1085(1989)。其中，確定一個殘基或一組殘基(例如arg、asp、his、lys和glu等帶電殘基)，置換以中性或負電氨基酸(最好是丙氨酸或苯丙氨酸)，從而影響氨基酸與ErbB2抗原之間的相互作用。然后，在取代位置導入更多或其他變異，從而進一步分析對取代表現(xiàn)出功能性敏感的氨基酸殘基。因此，雖然導入氨基酸序列變異的位點是預定的，但是該位置上突變的性質不要求預定。例如，為例分析某給定位點上突變的性能，在目標密碼子或區(qū)域進行Ala掃描和隨機誘變，然后在表達出的抗ErbB2抗體變體中篩選所需的活性。氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基末端融合，長度可以從一個殘基到包含百多個殘基的多肽，還包括單個或多個氨基酸殘基的鏈內插入。末端插入的例子包括具有N-末端曱硫氨?；鶜埢目笶rbB2抗體或該抗體與一段細胞毒性多肽的融合體。抗ErbB2抗體的其他插入變體包括其N或C末端與酶(例如ADEPT)或可延長抗體血清半壽期的多肽的融合體。另一種變體是氨基酸取代變體。這些變體中，抗ErbB2抗體內的至少一個氨基酸殘基被其他殘基取代。最有意義的取代突變位點包括超變區(qū)，但也要考慮改變FR。表1中"優(yōu)選取代，，列舉了保守性的取代。如果此類取代改變了生物學活性，則可引入更具實質性的取代即表1中所謂"取代范例，，或后文就氨基酸種類所述的取代，并對產物進行篩選。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>顯著不同的取代(a)取代區(qū)域內多肽主鏈的結構，例如平面或雙螺旋構象，(b)目標位點的電荷或疏水性，或(c)側鏈體積。根據側鏈特征，可將天然殘基分為(1)疏水性正亮氨酸，met,ala，val,leu，ile;(2)中性親水性:cys,ser,thr;(3)酸性asp,glu;(4)堿性asn，gin,his,lys，arg;(5)影響鏈取向的殘基gly,pro;和(6)芳香性trp,tyr，phe非保守性取代可能將一類的成員改變成另一類的。也可以耳又代不參與維持抗ErbB2抗體正確構象的半胱氨酸殘基，通常用絲氨酸，這可以提高分子的氧化穩(wěn)定性，避免誤交聯(lián)。另一方面，也可以在抗體內增加半胱氨酸鍵以提高穩(wěn)定性(尤其當抗體是Fv片段等抗體片段時)。特別優(yōu)選的取代變體中，親本抗體(人源化抗體或人抗體)超變區(qū)內的一個或多個殘基被取代。通常，選來進一步研究的變異抗體應具有優(yōu)于其親本的生物特性。產生此類取代變體的一個筒便方法涉及采用噬菌體展示的親和成熟。簡而言之，對多個超變區(qū)位點(例如6-7個位點)進行突變，形成各位置上所有可能的取代。由絲狀噬菌粒以單價形式展示這些抗體，且是與包裝在各噬菌粒內的M13基因III的產物形成的融合體。然后如本文所述對噬菌體展示的變體進行生物學活性(例如結合親和力)篩選。為了確定進行修飾的候選超變區(qū)位點，可通過丙氨酸掃描誘變來鑒定對抗原結合性貢獻顯著的超變區(qū)殘基。也可以或還可以進行抗原-抗體復合物的晶體結構分析，確定抗體和人ErbB2的接觸點。這樣的接觸殘基及其附近殘基就是本文所述取代的候選位點。待此類變體產生后，就可根據本文所述對變體組進行篩選，在一個或多個相關試驗中挑選具有優(yōu)良特性的抗體繼續(xù)研究?？梢跃托δ軐Ρ景l(fā)明抗體進行修飾，例如增強抗體的抗原依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。這可以通過在抗體Fc區(qū)引入一個或多個氨基酸取代。也可以或還可以在Fc區(qū)引入半胱氨酸殘基，從而在該區(qū)域形成鏈間二辟u鍵。由此形成的均二聚體抗體提高了內化能力并/或提高了補體介導的細胞殺傷和抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。見Caron等，,-發(fā)屋夢染^176:1191-1195(1992)和Shopes，B.，名瘦夢染,悉148:2918-2922(1992)。也可以用異雙官能交聯(lián)劑制備具有增強抗腫瘤活性的均二聚抗體，見Wolff等，膚癥^f兌53:2560-2565(1993)。也可以將抗體改造成具有2個Fc區(qū)，從而增強補體裂解和ADCC能力。見Stevenson等，戎膚秀務設^"3:219-230(1989)。為了延長抗體的血清半壽期，可以在抗體(特別是抗體片段)內加入一個補救受體結合表位，見美國專利5,739,277。本文中的"補#1受體結合表位"指IgG分子(例如IgGPIgG2，IgGs或IgG4)Fc區(qū)內能夠延長IgG分子體內血清半壽期的表位。(viii)糖基化變體抗體在其恒定區(qū)內的保守性位點被糖基化(Jefferis和Lund,化學免疫學65:111-128(1997);Wright和Morrison,TibTECH15:26-32(1997))。免疫球蛋白的寡糖側鏈會影響蛋白質的功能(Boyd等，分子免疫學32:1311-1318(1996);Wittwe和Howard,生物化學29:4175-4180(1990))和糖蛋白分子內區(qū)域間的相互作用，這可能影響糖蛋白的構象和三維表面(Hefferis和Lund,同上;Wyss和Wagner,當K生物j支術7:409-416(1996》。寡糖還可能基于特殊的識別結構將某糖蛋白靶向特定的分子。例如，據報道，在半乳糖基化的IgG中，寡糖部分"彈"出在CH2內空間，末端的N-乙?；咸前窔埢蚨軌蚺c甘露糖結合蛋白結合(Malhotra等，^然'屋夢1:237-243(1995))。用糖肽酶從中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生的CAMPATH-1H(—種重組人源化鼠單克隆IgGl抗體，能夠識別人淋巴細胞的CDw52抗原)中的去除部寡糖，導致補體介導的裂解作用(CMCL)完全喪失(Boyd等，分子免疫學32:1311-1318(1996))，但是用神經酰胺酶選擇性地去除唾液酸殘基則對DMCL沒有影響。另據報道，抗體糖基化還會影響抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。例如，據報道，抗體的糖基化會影響抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。具體地說，具有四環(huán)素調節(jié)的P(1,4)-N-乙?；咸前忿D移酶III(GnIII)(—種催化等分GlcNAc形成的糖基轉移酶)表達的CHO細胞具有增強的DCC活性(Umana等，成熟生物技術17:176-180(1999》?？贵w的糖基化一般是N連接或O連接的。N連接指糖基連接于天冬酰胺殘基的側鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸是糖基與天冬酰胺側鏈酶促結合的識別序列，其中的X是脯氨酸之外的任一氨基酸。因此，多肽內存在以上三肽序列之一則形成一個潛在的糖基化位點。O連接糖基化指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一與羥基氨基酸(一般為絲氨酸或蘇氨酸，但也可以使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸)連接?？贵w的糖基化變體即抗體的糖基化方式被改變的變體。所謂"改變"即刪除一個或多個抗體內的原糖基，增加一個或多個糖基，改變糖基化的組成(糖基化方式)和糖基化程度等。給抗體增加糖基化位點可通過改變含有一個或多個上述三肽序列的氨基酸序列(如果是N連接糖基化位點)。改變還可以通過增加或取代原抗體的一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基(如果是O連接糖基化位點)。同理，去除糖基化位點也可以通過改變抗體天然糖基化位點內的氨基酸。改變氨基酸序列?？梢酝ㄟ^改變其核酸序列。編碼抗ErbB2抗體氨基酸序列變體的核酸分子可用多種本領域已知方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源中分離(如果存在天然氨基酸序列變體)，或通過對抗ErbB2抗體的預制變體或非變異體進行寡核苷酸介導(定點)誘變、PCR誘變和盒誘變。還可以改變抗體糖基化(包括糖基化方式)而不改變氨基酸序列或其核苷酸序列。糖基化主要依賴于表達該抗體的宿主細胞。因為用來表達作為潛在治療劑的重組糖蛋白(例如抗體)的細胞一般都不是原天然細胞，所以可以期望抗體糖基化方式的顯著變異(見，例如Hse等，生物化學雜志272:9062-9070(1997))。除選擇宿主細胞之外，在重組生產抗體過程中影響糖基化的因素還包括生長模式、培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)物密度、給氧條件、pH、純化方法等。已有多種方法可用來在特定宿主內改變糖基化方式，包括引入或過量表達參與寡糖生產的酶(美國專利5,047,335;5,510,261和5，278，299)。可以用酶例如內切糖苦酶H(EndoH)消除糖蛋白的糖基化或某種類型的糖基化。此外，可以通過基因工程使得重組宿主細胞產生缺陷，不能加工某種類型的多糖。以上技術或類似技術都是本領域已知的?？贵w的糖基化結構可以通過常規(guī)糖分析技術來分析，包括凝集素層析，NMB質譜，HPLC,GPC，單糖組成分析，順序酶促消化和HPAEC-PAD(通過高pH離子交換層析根據電荷來分離寡糖)。為分析目的解離寡糖的技術也是已知的，包括但不限于酶促處理(一般用肽-N-糖苷酶F/內腔-P-半乳糖苦酶)，用強堿性條件主要解離O連接結構，和用無水肼釋放N和O連接寡糖的化學方法。(ix)篩選具有所需特性的抗體以上描述了制備抗體的技術。根據需要，然后可以挑選具有某些生物學特征的抗體。例如，要鑒定生長抑制性抗ErbB2抗體，可以通過篩選抑制過量表達ErbB2的癌細胞生長的抗體。實施方式之一中，所選的生長抑制性抗體在約0.5-30g/ml濃度對細胞培養(yǎng)物中SK-BR-3細胞生長的抑制可達20-100%，較好的是約50-100%。為了鑒定這樣的抗體，可進行美國專利5,677,171所述的SK-BR-3試驗。根據該試驗，將SK-BR-3細胞培養(yǎng)在1:1的F12和DMEM培養(yǎng)基中，其中補充了10%胎牛血清，谷氨酰胺和青霉素、鏈霉素。在一個35mm細胞培養(yǎng)皿上接種20,000個SK-BR-3細胞(2ml/35mm培養(yǎng)皿)。每培養(yǎng)皿內加0.5-30g/ml抗ErbB2抗體。6天后，用電子COULTER細胞計數(shù)儀清點細胞數(shù)，并與未處理細胞比較。挑選抑制SK-BR-3細胞生長達20-100%或50-100%的抗體作為生長抑制性抗體。要挑選誘導細胞死亡的抗體，可以通過與對照相比評價由PI、臺盼藍或7AAD攝取反映的細胞膜破損。優(yōu)選試驗是BT474細胞PI攝取試驗。根據該試驗，將BT474細胞(獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville,MD)培養(yǎng)在Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM):Ham'sF-12(50:50)中，其中補充了10°/。熱滅活的FBS(Hyclone)和2mML-谷氨酰胺。(因此，該試驗在無補體和免疫效應細胞的條件下進行)。以3xlO"培養(yǎng)皿的密度將BT474細胞接種到100x20mm培養(yǎng)皿上，過夜附著。然后去除培養(yǎng)基，換以純新鮮培養(yǎng)基或含10g/ml相應單克隆抗體的培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)3天。每次處理后用PBS洗滌細胞單層，并通過胰蛋白酶消化解離。然后在4。C以1200rpm離心細胞5分鐘，將沉淀重懸于3ml冰冷的Ca"結合緩沖液(10mMHepes,pH7.4，140mMNaCl，2.5mMCaCl2),并等分后轉移到35mm濾網蓋12x75試管(lml/管，每一處理組3管)內，消除細胞塊。然后在試管內加入Pl(IOg/m)?？捎肍ACSCAN流式細月包計凄t儀和FACSCONVERTCellQuest軟件(BectonDickinson)分析樣品。根據PI吸收測定，誘導細胞死亡達統(tǒng)計學上顯著水平的抗體可選作細胞死亡誘導性抗體。為了挑選誘導凋亡的抗體，可用BT474細胞進行膜聯(lián)蛋白結合試驗。如前所述培養(yǎng)BT474細胞，并接種到培養(yǎng)皿中。然后去除培養(yǎng)基，換以純新鮮培養(yǎng)基和含有10g/ml單克隆抗體的培養(yǎng)基。培養(yǎng)3天后，用PBS洗滌細胞單層，用胰蛋白酶消化解離。然后離心細胞，重懸于Ca"結合緩沖液中，如前所述等分到試管中進行細胞死亡試驗。然后在試管內加入帶標記的膜聯(lián)蛋白(例如膜聯(lián)蛋白V-FTIC)(lg/ml)?？捎肍ACSCAN流式細胞計數(shù)儀和FACSCONVERTCellQuest軟件(BectonDickinson)分析樣品?？商暨x與對照相比誘導膜聯(lián)蛋白結合達統(tǒng)計學顯著水平的抗體作為凋亡誘導性細胞。除了膜聯(lián)蛋白結合試驗之外，還可以采用BT474細胞DNA染色試驗。為例進行該該試驗，將經以上兩段所研究抗體處理的BT474細胞與9g/mlHOECHST33342在37。C共培養(yǎng)2小時，然后在EPICSELITE流式細胞計數(shù)儀(CoulterCorporation)上用MODFITLT軟件(VeritySoftwareHouse)進行分析。挑選誘導的凋亡細胞百分比比未處理細胞(至多100%凋亡細胞)高2倍(3倍或以上更好)的抗體作為促凋亡抗體。為了鑒定阻抑ErbB受體被配體活化的抗體，可測定抗體阻抑ErbB配體與表達ErbB受體的細胞結合的能力(例如所研究的ErbB受體與另一ErbB受體偶聯(lián)成ErbB異寡聚體)。例如，可將天然表達或轉染后表達ErbB異寡聚體內各ErbB受體的細胞與抗體共培養(yǎng)，然后接觸帶標記的ErbB配體。然后，評價抗ErbB2抗體阻抑配體與ErbB異寡聚體內ErbB受體結合的能力。例如，可如后文實施例l所述，在24孔板內，在冰上，用MCF7培養(yǎng)物單層進行抗ErbB2抗體抑制HRG與MCF7乳房癌細胞線結合的試驗?？稍诟骺變燃尤肟笶rbB2單克隆抗體，培養(yǎng)30分鐘。然后加入1251-標記的rHRGl|77.224(25pm)，繼續(xù)培養(yǎng)4-16小時。制作量效曲線，己酸所研究抗體的IC50。實施方式之一中，在該試驗中，阻抑ErbB受體^皮配體活化的抗體抑制HRG與MCF7細胞結合的ICso約50nM或以下，約10nM或以下更好。如果所述抗體是抗體片段，例如Fab片段，該試驗中抑制HRG結合MCF7細胞的IC50約1OOnM或以下，約50nM或以下更好。也可以或還可以評價抗ErbB2抗體阻抑ErbB配體激發(fā)ErbB異寡聚物內ErbB受體的酪氨酸磷酸化的能力。例如，可將內源性表達或轉染表達ErbB受體的細胞與抗體共培養(yǎng)，然后用抗磷酸酪氨酸單克隆抗體(可以與可測標記偶聯(lián))分析ErbB配體依賴性酪氨酸磷酸化活性。也可采用美國專利5,766,863所述的激酶受體活化試驗來測定ErbB受體活化，和抗體對此活性的阻抑能力。實施方式之一中，可篩選抑制HRG激發(fā)MCF7細胞內p180酪氨酸磷酸化的抗體。例如，可將MCF7細胞培養(yǎng)在24孔板中，在各孔中加入抗ErbB2單克隆抗體，室溫培養(yǎng)30分鐘；然后在各孔中加入rHRGl177-224(0.2nM)，繼續(xù)培養(yǎng)8分鐘。抽干各孔中的培養(yǎng)基，力。入100|alSDS樣品IC沖液(5。/。SDS，25mMDTT和25mMTris-HCl,pH6.8)終止反應。各種樣品(25pl)在4-12%梯度凝膠(Novex)上電泳，然后電泳轉移到聚二氟乙烯膜上。進行抗磷酸酪氨酸(lg/ml)免疫印跡，用反射密度法定量測定M,180,000處主要反應性帶的強度。所選抗體應能顯著抑制HRG激發(fā)的p180酪氨酸磷酸化，即在該試驗中僅為對照的0-35°/。。根據反射密度法測定，繪制抑制HRG激發(fā)pl80酪氨酸磷酸化的量效曲線，并計算所研究抗體的IC5o。實施方式之一中，阻抑配體活化ErbB受體的抗體抑制HRG激發(fā)p180酪氨酸磷酸化的IC5G約為50nM或以下，10nM或以下更好。如果所述抗體是Fab等抗體片段，其在該試驗中抑制HRG激發(fā)p180酪氨酸磷酸化的IC5Q約為lOOnM或以下，50nM或以下更好。也可以按照Schaefer等，致蕃差^15:1385-1394(1997)所述，評價抗體對MDA-MB-175細胞的生長抑制作用。根據該試驗，MDA-MB-175細胞可用抗ErbB2單克隆抗體(10g/ml)處理4天，然后用結晶紫染色?？笶rbB2抗體共培養(yǎng)對該細胞線造成的生長抑制與單克隆抗體2C4相似。另一實施方式中，外源性HRG不能顯著逆轉這種抑制作用。較好的是，不論是否存在外源性HRG，所述抗體都能夠比單克隆抗體4D5更強(或者比單克隆抗體7F3更強)地抑制MDA-MB-175細胞的增殖。實施方式之一中，根據共免疫沉淀實驗測定，所研究的抗ErbB2抗體可阻抑ErbB2與MCF7和SK-BR-3細胞內ErbB3的heregulin依賴性結合，且比單克隆抗體4D5更有效，更好的是比單克隆抗體7F3更有效。為了篩選能與某研究抗體所結合的ErbB2上的表位結合的抗體，可進行常規(guī)交叉阻抑實驗，例如我體，發(fā)皇手,，ColdSpringHarborLaboratory,Harlow和DavidLane編輯(1988)所述。也可以或還可以用已知方法制作表位圖譜(見圖1A和IB)。然后，可根據以上細胞試驗的結果進行動物(例如鼠、模型、人臨床試驗)試驗。例如，用后文實施例所述的轉基因小鼠模型可證明某種抗體不能或能有限地治療ErbB2過量表達型腫瘤。B.抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物(免疫偶聯(lián)物)制備抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物可通過將抗ErbB抗體與類美坦素分子化學連接，但不可顯著削弱抗體和類美坦素分子各自的生物學活性。類美坦素是本領域所熟知的，它可用已知方法合成，也可以從天然原料中分離。合適的類美坦素見美國專利5,208,020等專利和非專利出版物。優(yōu)選的類美坦素是美坦醇和在芳環(huán)或其他位置上被修飾的美坦醇類似物，例如各種美坦醇酯。本領域內已知許多接頭可用于制作抗體-類美坦素偶聯(lián)物，例如美國專利5,208,020或歐洲專利0425235B1和Chari等，痛癥研:《52:127-131(1992)所述。此類接頭包括以上專利中所述的二硫基，硫醚基，酸不穩(wěn)定性基團，光不穩(wěn)定基團，肽酶不穩(wěn)定基團，或酯酶不穩(wěn)定基團，其中優(yōu)選二硫基和硫醚基?？贵w與類美坦素的偶聯(lián)物可用多種雙官能蛋白質偶聯(lián)劑來制備，例如N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯，iminothiolane(IT),亞氨酸酯的雙官能衍生物(例如鹽酸己二酰亞胺二甲酯)，活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)，醛(例如戊二醛)，二重氮化合物(例如二(對重氮苯曱?；?己二胺)，二重氮衍生物(例如二(對重氮笨曱?；?-乙二胺)，二異氰酸酯(例如2,6-二異氰酸甲苯酯)，和雙活性氟化合物(例如1,5-二氟-2，4-二硝基苯)。優(yōu)選的偶聯(lián)劑包括可形成二硫鍵的N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，蘭參化173:723-737(1978))和N-琥珀酰亞胺-4-(2-吡咬硫)戊酸酯(SPP)?？蓪⒔宇^連接于類美坦素分子的各個位置，這取決于連接的類型。例如，可用常規(guī)偶聯(lián)技術在具有羥基的C3位，羥曱基修飾的C14位，羥基修飾的C15位，和具有羥基的C20位形成酯鍵。優(yōu)選實施方式之一中，連鍵形成于類美坦素或美坦醇類似物的C3位。抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物的每個抗體分子一般連有約1-10個類美坦素分子，以約3-5個為佳。C.藥物制劑將具有所需純度的抗體與可選的藥學上認可的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(,效銀秀參存夢，第16版，Osol,A,編(19S0))混合，制備成凍干劑或水溶液形式的本發(fā)明抗體-類美坦素偶聯(lián)物治療性制劑。認可的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用劑量和濃度對受主無毒，包括緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，和其他有機酸緩沖液；抗氧化劑，包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑，例如氯化十八烷基二曱基芐基銨，氯化己烷雙胺，亞芐基二氯，苯索氯銨，苯酚或芐醇，例如對羥基苯曱酸曱酯或丙酯的對羥基苯曱酸烷酯，兒茶酚，間苯二酚，環(huán)己醇，3-戊醇和間苯曱酚；低分子量(少于10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，組氨酸，精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其他糖類，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA;糖，例如蔗糖，甘露醇，海藻糖，山梨醇；成鹽反離子，例如鈉；精神復合物，例如Zn-蛋白質復合物；和/或非離子性表面活性劑，例如TWEEN,PLURONICS或聚乙二醇(PEG)。優(yōu)選的冷凍干燥抗ErbB2抗體制劑可見WO97/04810。本發(fā)明的制劑也可以包含一種以上針對特定適應癥的活性化合物，較好的是，彼此的活性相互補充而不相互消減。例如，同一制劑中可另含結合EGFR、ErbB2(例如結合ErbB2上其他表位)、ErbB3、ErbB4或血管內皮生長因子(VEGF)的抗體或抗體-類美坦素偶聯(lián)物。組合物也可以或還可以含有化療試劑、細胞毒性試劑、細胞因子、生長抑制劑、抗激素劑和/或心保護劑。這些分子以適宜的有效含量存在?？梢詫⒒钚猿煞职谖⒛z嚢中。例如，可采用凝聚技術或界面聚合技術分別包入羥甲基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸甲酯)微膠嚢內，包于膠體藥物傳遞系統(tǒng)(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、納米粒子和納米膠嚢)中或包于粗乳液中。此類技術可參考^效銀秀游辨夢第16版，Osol,A.編(1980)?？梢灾苽涑删忈屩苿?。緩釋制劑的合適例子包括內含抗體的固體疏水性聚合物半透性有形(例如膜或微膠囊)基質。緩釋基質的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥基乙基曱基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國專利3,773,919),L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物，非可降解的乙烯-乙酸乙酯共聚物，可降解的乳酸-乙二酸共聚物，例如LUPRONDEOPT(由乳酸-乙二酸共聚物和乙酸leuprolide構成的注射微球)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。體內使用的制劑必須無菌。這可以通過除菌濾膜過濾做到。D.使用抗ErbB2抗體-類美坦素偶聯(lián)物的治療方法
技術領域：
：本發(fā)明認為，可用抗ErbB2抗體-類美坦素偶聯(lián)物治療多種疾病，例如良性或惡性腫瘤；白血病和、淋巴癌；還包括例如神經、月交質細胞、星形細胞、下丘腦、腺體、巨噬細胞、上皮、基底細胞、嚢胚腔、炎癥、血管生成和免疫疾病。所治的疾病主要是癌癥。本發(fā)明可治的癌癥例如但不限于惡性癌癥、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤、白血病或淋巴癌。更具體的是鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌(包括小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺腺癌和肺鱗狀細胞癌)，腹膜癌，肝細胞癌，胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，成膠質細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳房癌，結腸癌，直腸癌，直腸結腸癌，子宮內膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌、曱狀腺癌、肝癌、肛門癌，陰莖癌，以及頭頸癌。所治的癌應包含ErbB表達細胞，這樣，本發(fā)明的抗ErbB抗體就能與以過量表達ErbB受體為特征的癌結合。在優(yōu)選實施方式之一中，所述的癌包含ErbB2表達細胞，更好的是以過量表達ErbB2受體為特征的細胞?？捎枚喾N已知的診斷/預后試驗來測定癌中ErbB例如ErbB2的表達。實施方式之一中，可通過IHC,用HERCEPTEST⑧(Dako)來分析ErbB2過量表達。可用腫瘤活檢樣品的石蠟包埋組織切片進行IHC試驗，ErbB2蛋白染色強度定級如下0級沒有觀察到染色，或者，僅10%以下腫瘤細胞的細胞膜被染色；1+級10%以上腫瘤細胞膜有弱染色/或難以察覺的染色。細胞僅部分細胞膜被染色。2+級10%以上腫瘤細胞的全細胞膜被弱-中度染色。3+級10%以上腫瘤細胞的全細胞膜被中度-強染色。ErbB2過量表達呈0至l+級的腫瘤可認為不具有過量表達ErbB2的特征，2+至3+的腫瘤則認為以過量表達ErbB2為特征。測定腫瘤中ErbB2過量表達的程度，也可以或還可以對福爾馬林固定或石蠟包埋的腫瘤組織進行FISH試驗，例如INFORM(Ventana，Arizona出售)或PATHVISION(Vysis,Illinois)。實施方式之一中，癌癥表達(或過量表達)EGFR。過量表達EGFR的癌癥例如鱗狀細胞癌(如上皮鱗狀細胞癌)，肺癌(如小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺腺癌和肺鱗狀細胞癌)，腹膜癌，肝細胞癌，胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，成膠質細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳房癌，結腸癌，直腸癌，直腸結腸癌，子宮內膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌、曱狀腺癌、肝癌、肛門癌，陰莖癌，以及頭頸癌。較好的是，本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物和/或與之結合的ErbB(例如ErbB2)或EGFR蛋白由細胞內化，這樣可提高免疫偶聯(lián)物殺死其所結合癌細胞的療效。優(yōu)選實施方式之一中，細胞毒試劑(類美坦素)靶向或干擾癌細胞內的核酸。本發(fā)明的治療針對的是對非偶耳關抗ErbB抗體無反應或反應差的ErbB過量表達腫瘤。這些患者可能曾經接受過無類美坦素偶聯(lián)抗ErbB抗體治療，但沒有獲得顯著改善，或者只得到暫時改善。然而，患者曾接受非偶聯(lián)抗ErbB抗體治療并不是其作為本發(fā)明治療候選者的條件。本領域一般技術人員根據患者公開的臨床信息和記錄，不難判斷其是否適合本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物治療。對不曾接受(非偶聯(lián))抗ErbB抗體治療的哺乳動物-尤其是人-進行治療也在本發(fā)明范圍內?？刹捎靡阎椒▽⒖笶rbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物給予哺乳動物尤其是人，例如靜脈內(例如推注或連續(xù)滴注)、肌內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、動脈內、滑膜腔內、鞘內、口服、局部、吸入途徑。優(yōu)選通過靜脈內或皮下給予抗體?？蓪⑵渌委熍c抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物治療相聯(lián)合。聯(lián)合給藥包括用單獨制劑或單一制劑聯(lián)合給藥，和按一定順序給藥，最好存在著多種活性成分同時發(fā)揮各自生物學活性的時候。優(yōu)選實施方式之一中，患者接受兩種或兩種以上不同抗ErbB抗體治療，至少其中之一的形式是與類美坦素的偶聯(lián)物。例如，患者接受第一抗ErbB2抗體-類美坦素偶聯(lián)物治療，其中的抗體是生長抑制劑(例如HERCEPTIN),并接受第二抗ErbB2抗體或抗體-免疫偶聯(lián)物治療，所述第二免疫偶聯(lián)物例如抗體-類美坦素偶聯(lián)物，可阻抑ErbB受體被配體活化(例如2C4或其人源化和/或親和成熟變體)或誘導ErbB2過量表達細胞凋亡(例如7C2,7F3或它們的人源化變體)。另一實施方式中，治療包括給予特異性結合兩種或兩種以上不同ErbB受體(例如ErbB2和EGFR受體)的抗體，其中至少一種抗ErbB抗體以類美坦素偶聯(lián)物形式給予。較好的是，以上聯(lián)合治療可獲得協(xié)同效應。也可將抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物與針對其他非ErbB受體族腫瘤相關抗原的抗體聯(lián)合給予。此處的其他抗體可(例如)結合血管內皮生長因子(VEGF)，其形式可以是與類美坦素的偶聯(lián)物，或其他免疫偶聯(lián)物。實施方式之一中，本發(fā)明的治療包聯(lián)合給予抗ErbB2抗體-類美坦素偶聯(lián)物與一種或多種化療制劑或生長抑制劑，包括聯(lián)合給予不同化療制劑的混合物。優(yōu)選的化療制劑包4舌taxanes(例如paclitaxel和doxetaxel)和/或anthracycline抗生素。此類化療制劑的準備和使用劑量可以按照制造商的說明書或根據經驗決定。此類化療的準備和使用劑量也可參考化^f應夯，M.C.Perry編，Williams&Wilkins，Baltimore,函(1992)?？蓪⒖贵w—類美坦素偶聯(lián)物與抗激素化合物聯(lián)用，后者例如抗雌激素化合物，如他莫昔芬；抗孕酮化合物，例如onapristone(EP616812);或抗雄激素化合物，例如氟他胺，它們的劑量是已知的。當待治療的癌癥非激素依賴性時，患者可能已接收過抗激素治療，當癌癥變?yōu)榉羌に匾蕾囆院?，可給予患者抗ErbB2抗體(和上述他藥物)。有時，還可能優(yōu)選給患者聯(lián)用心保護劑(為了預防或減輕與治療相關的心肌功能不良)或一種或多種細胞因子。除以上治療方法之外，還可以對患者進行手術切除癌細胞和/或放射治療。以上聯(lián)用制劑的劑量可以是目前所用的，也可以略低，因為這些制劑可能與抗ErbB2抗體產生疊加(協(xié)同)效應。就預防或治療疾病而言，抗體-類美坦素偶:f關物的合適劑量取決于所治疾病的種類、程度和病程，抗體是用于預防還是用于治療，先前的治療，患者的臨床記錄和對抗體的反應，以及主治醫(yī)生的考慮?？贵w-類美坦素偶聯(lián)物可以一次性給予患者，或分多次給予。根據疾病的種類、程度，不論是一次性給予或多次給予或連續(xù)輸注，抗體、類美坦素偶聯(lián)物的初始候選劑量約為lg/kg至15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)。根據以上因素，典型的日用劑量約為lg/kg至100mg/kg或以上。如果是數(shù)日或更長時間的重復給藥，才艮據病情，治療應持續(xù)至癥狀抑制達到要求。一種優(yōu)選給藥方案包括抗ErbB2抗體—類美坦素偶聯(lián)物初始劑量約4mg/kg，然后每周的維持劑量約2mg/kg。然而，也可以采用其他給藥方案。可用常規(guī)技術和試驗來監(jiān)測本發(fā)明治療的進展。E.本發(fā)明另一實施方式提供一種含有治療前述疾病所需材料的產品。該產品包括容器和容器上或與之在一起的標簽或包裝內說明。合適的容器包括例如瓶，管形瓶或注射管等。容器可以用玻璃或塑料等多種材料制成。容器內裝用于治療疾病的組合物，并具有無菌接口(例如，容器可以是一個靜脈輸液袋或帶塞管形瓶，塞子可讓針頭穿透)。至少組合物中有效成分之一是抗ErbB2抗體-類美坦素偶聯(lián)物。標簽或包裝內說明指明，該組合物用于治療選定的疾病，例如癌癥。另一實施方式中，標簽或包裝內說明指明，含結合ErbB2的抗體的組合物可用于治療表達ErbB受體的癌癥，所述受體選自表皮生長因子受體(EGFR)、ErbB2、ErbB3和ErbB4，最好是EGFR。此外，標簽和包裝內說明還指明，接受治療的患者所患應是以ErbB受體(選擇EGFR,ErbB2，ErbB3或ErbB4)活化過度為特征的癌癥。例如，所述癌癥可以是過量表達上述受體之一和/或過量表達某種ErbB配體(例如TGF-)的癌癥。標簽和包裝內說明還可以指明，組合物也可以用來治療非以過量表達ErbB2受體為特征的癌癥。例如，雖然HERCEPTIN⑧的包裝內說明書指明該抗體用于治療其腫瘤過量表達ErbB2蛋白的乳房癌轉移患者，它還另一種實施方式中，包裝內說明可以指明，該抗體-類美坦素偶聯(lián)物或組合物還可用于治療非激素依賴性癌癥，例如前列腺癌、結腸癌或結腸直腸癌。而且，本發(fā)明產品還可以包括(a)第一容器，其中的組合物含第一抗體與類美坦素的偶聯(lián)物，該抗體結合ErbB2并抑制過量表達ErbB2的癌細胞生長；和(b)第二容器，其中的組合物含第二抗體或其與類美坦素的偶聯(lián)物，該抗體結合ErbB2并阻抑ErbB受體被配體活化。本發(fā)明此實施方式的產品還包括說明該第一和第二抗體可治療癌癥的包裝內說明書。本發(fā)明的產品也可以或還可以包括內含藥學上認可的緩沖液(例如注射用無菌水(BWFI),磷酸鹽緩沖液，Ringer溶液和葡萄糖溶液)的第二(或第三)容器。該產品還可以根據銷售和使用者需要包括其他物質，例如其他緩沖液，稀釋劑，過濾器，針頭和注射管等。以下非限定性實施例將進一步詳細描述本發(fā)明。實施例1抗ErbB2單克隆抗體4D5的產生，鑒定和人源化按照Fendly等，#癥研_究50:1550-1558(1990)所述制備特異性結合ErbB2胞外區(qū)的鼠單克隆抗體4D5。簡而言之，按Hudziak等，^萄ff夢虎虎拔84:7158-7163(1987)所述培養(yǎng)NIH3T3/HER2-34。。細胞(每細胞表達約lxl()S個ErbB2分子)，用含25mMEDTA的磷酸鹽緩沖液(PBS)收獲，用于免疫BALB/小鼠。在第0、2、5、7周，給小鼠腹膜內(i.p.)注射含107個細胞的0.5mlPBS。給予抗血清可免疫沉淀32P標記的ErbB2的小鼠在第9周和第13周i.p.注射麥胚凝集素瓊脂糖(WGA)純化的ErbB2膜提取物。這以后，靜脈內(i.v.)注射0.1mlErbB2制劑，將脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞線X63-Ag8.653融合。通過ELISA和放射性免疫沉淀篩選ErbB2結合性雜交瘤上清液。表位圖譜和鑒定用竟爭結合試驗(Fendly等，4癥^f宏50:1550-1558(1990))測定單克隆抗體4D5所結合的ErbB2表位。進行交叉阻抑試驗，即用PANDEXTM篩選儀定量測定完整細胞上的直接熒光。用標準方法(Wofsy等，"^的遂#"才法，p.287，Mishel和Schiigi(編)，SanFrancisco:W丄FreemanCo.(1980))將單克隆抗體與異硫氰酯熒光素酯(FITC)偶聯(lián)。用胰蛋白酶解離下鋪滿的NIH3T3/HER2-3柳細胞單層，洗滌一次，重懸于含0.5%胎牛血清白蛋白(BSA)和0.1%NaN3的冷PBS,濃度為1.75x106細胞/ml。加入膠乳粒子(IDC，Portland,OR)至1%,用以減少PANDEX板膜的堵塞。在PANDEXTM板的孔內加入201細胞懸浮液和201純化單克隆抗體(100g/ml至0.1g/ml)，冰上培養(yǎng)30分鐘，各孔加入預定稀釋度的FITC標記的單抗201，培養(yǎng)30分鐘，洗滌，用PANDEXTM定量測定熒光。如果單克隆抗體抑制彼此的結合比抑制無關對照抗體高出50%或以上，則可認為它們針對相同的表位。該試驗中，設定單克隆抗體4D5針對表位1(ErbB2胞外區(qū)內氨基酸殘基529-625，包括端值，見SEQIDNO:3)。用乳房癌細胞線SK-BR-3評價單克隆抗體4D5的生長抑制特征(見Hudziak等,為、子勿應^:炎夢9(3):1165-1172(1989))。簡而言之，用胰蛋白酶(0.25v/v。/。)解離下SK-BR-3細胞，懸浮于完全培養(yǎng)基，4xl()5細胞/ml。將100jil(4xl04個細月包)的等份加入96孔微稀釋板孔中，待細胞附著后加入lOOpl純培養(yǎng)基或含單克隆抗體(最終濃度為5g/ml)的培養(yǎng)基。72小時后，用PBS(pHT"洗板2次，用結晶紫(曱醇中的0.5%溶液)染色，按Sugarnan等，存夢230:943-945(1985)所述分析相對細胞增殖。單克隆抗體4D5抑制SK-BR-3細胞相對細胞繁殖達56%。還評價了單克隆抗體4D5抑制HRG刺激MCF7全細胞裂解液中MJ80,000蛋白質酪氨酸磷酸化的能力(Lewis等，膚癥研^J56:1457-1465(1996))。據報道，MCF7細胞表達所有已知ErbB受體，但表達水平較低。由于ErbB2、ErbB3和ErbB4的分子大小幾乎相同，因此，用Western印跡分析法評價全細胞裂解液不可能分辨出是哪一蛋白被酪氨酸磷酸化。然而，這些細胞是HRG酪氨酸磷酸化試驗理想的材料，因為在試驗條件下，在沒有外源HRG加入的條件下，它們產生MJ80,000范圍內蛋白的酪氨酸磷酸化水平為零或不可能測得。將MCF7細胞培養(yǎng)在24孔板內，在各孔內加入抗ErbB2抗體，室溫下培養(yǎng)30分鐘；然后在各孔內加入rHRG1n7-244至0.2nM最終濃度，繼續(xù)培養(yǎng)8分鐘。小心地抽干各孔內的培養(yǎng)液，加入100^1SDS樣品緩沖液(5。/。SDS，25mMDTT，25mMTris-HCl，pH6.8)終止反應。各樣品(251)在4-12%梯度凝膠(Novex)上電泳，然后電泳轉移到聚二氟乙烯膜上。進行抗磷酸酪氨酸(4G10，獲自UBI,用量為lg/ml)免疫印跡，按已知方法(Holmes等，存夢256:1205-1210(1992)和SIiwkowski等，務化夢殺，悉269:14661-14665(1994))，用反射密度法定量測定Aa80,000主反應帶的強度。單克隆抗體4D5顯著抑制Mr180,000處HRG誘導的酪氨酸磷酸化信號產生，但在沒有HRG存在時，不能激發(fā)MJ80，000范圍內蛋白質的酪氨酸磷酸化。而且，該抗體與EGFR(Fendly等，^癥^f究50:1550-1558(1990))、ErbB2、ErbB3或ErbB4無交叉反應。單克隆抗體4D5阻抑HRG激發(fā)的酪氨酸磷酸化可達50%。還評價了在有或沒有外源性rHRGl存在下，單克隆抗體4D5對MDA-MB-175和SK-BR-3細胞的生長抑制作用(Schaefer等，致4差西15:1385-1394(1997))。MDA-MB-175細胞內的ErbB2水平比正常乳房上皮細胞高4-6倍，該細胞內的ErbB2-ErbB4受體組成型地被酪氨酸磷酸化。不論有無外源HRG,單克隆抗體4D5都能抑制MDA-MB-175細胞的增殖。4D5對細胞增殖的抑制作用依賴于ErbB2表達水平(Lweis等，^癥與克瘦夢與!瘦治《夢37:255-263(1993》。SK-BR-3細胞內測得的最大抑制為660/0。然而，外源性HRG可抵消這一作用。人源化將鼠單克隆抗體4D5人源化，采用新的"基因轉變誘變"法，見美國專利5,821,337。以下實施例所用的人源化單克隆抗體4D5稱為huMAb4D5-8。該抗體為IgGl同種型。實施例2HERCEPTIN-DM1偶聯(lián)物1.HERCEPTIN的純化將HERCEPTIN(huMAb4D5-8，rhuMAbHER2,美國專利5，821,337)(每管含440mg抗體)溶于50mlMES緩沖液(25mMMES,50mMNaCl,pH5.6)。將樣品上到陽離子交換柱(SepharoseS，15cmxl.7cm)上，該柱預先用同種緩沖液平衡。然后用該緩沖液洗柱(5倍柱體積)。將緩沖液內NaCl濃度提高至200mM來洗脫HERCEPTIN。合并含抗體的流出組分，稀釋至10mg/ml，在含50mm磷酸鉀，50mMNaCl，2mMEDTA，pH6.5的緩沖液中透析。2.用SPP修飾HERCEPTIN用N-琥珀酰亞胺-4-(2-吡啶硫)戊酸酯(SPP)修飾純化后的HERCEPTIN,以引進二硫吡啶基團。用SPP(用2.3ml乙醇賠償5.3摩爾當量)處理44.7ml含抗體(376mg,8mg/ml)的50mM磷酸鉀緩沖液(pH6,5,NaCl(50mM)，EDTA(lmM))。氬氣氛下環(huán)境溫度下培養(yǎng)90分鐘后，用SephadexG25柱凝膠過濾反應混合物，該柱先用35mM檸檬酸鈉，154mMNaCl和2mMEDTA平衡。合并含抗體的流出組分，并分析。如前所述測定抗體的修飾度。修飾抗體(HERCEPTIN⑧-SPP-Py)的回收率為337mg(89.7%),每個抗體有4.5個可釋放的2-硫吡啶基。3.HERCEPT扁-SPP-Py與DM1的偶聯(lián)用前述35mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6.5)稀釋修飾抗體(337.0mg，9.5|umol可釋放2-硫吡咬基)成2.5mg/ml最終濃度。然后在該抗體稀釋液中加入DM1(結構見圖1)(1.7當量，16.1lumol)以3.0mM二曱基乙酰胺(DMA，在最終反應混合物中的濃度為3。/。(v/v))配制的溶液。反應在氬氣氛下、環(huán)境溫度下進行20小時。HERCEPTIN-DM1偶聯(lián)物的結構見圖2。將反應液上樣到SephacrylS300凝膠過濾柱(5.0cmx90.0cm，1.77L)上，該柱預先用35mM檸檬酸鈉，154mMNaCl(pH6.5)平衡。流量為5.0ml/min,收集65份組分(每份20.0ml)。主峰位于第47組分附近(圖3)。主峰含單體HERCEPTIN-DM1。合并第44-51組分并分析。通過測定252nm和280nm處的吸光度來測定每抗體分子所連接的DM1藥物個數(shù)，發(fā)現(xiàn)每個抗體分子連接3.7個藥物分子。實施例3轉基因動物為了提高HERCEPTIN的臨床活性，制作了一種轉基因HER2q'、鼠模型，可用于進行新的HER2定向療法的臨床前試驗。表達"ew突變活化形式(即大鼠HER2的類似物)的轉基因小鼠很容易形成腫瘤，但是乳房癌過量表達的HER2沒有發(fā)生突變，而且，在過量表達非突變HER2的轉基因小鼠內，腫瘤的形成也緩和得多(Webster等，；#癥^:參夢夢孩5:69-76(1994))。為了增強非突變HER2腫瘤的形成，進一步增強了轉基因小鼠內非突變HER2的過量表達。在小鼠乳腺上皮細胞內促進HER2表達的任意啟動子均可用于本發(fā)明構建物中。許多乳蛋白基因是由只在乳腺中具有活性的啟動子/增強子元件轉錄的。乳蛋白基因包括編碼酪蛋白(a-S和P)、P-乳球蛋白、ot-乳白蛋白和乳清酸性蛋白的基因。綿羊p-乳球蛋白啟動子在本領域內了解較充分，且已廣泛使用(Whitelaw等，^務化夢染,悉286:31-39(1"2))。然而，類似的其他啟動子DNA片段也適用。優(yōu)選啟動子是小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)長末端重復序列(LTR)衍生的啟動子。本發(fā)明的一種HER2轉基因構建物就采用了MMTVLTR啟動子。為了增強非突變HER2腫瘤的形成，我們用上游ATG缺失的HER2cDNA質粒來制造轉基因小鼠，該缺失是為了防止上游ATG密碼子啟動翻譯，該密碼子啟動翻譯會降低HER2下游真起始密碼子啟動翻譯的頻率(見Child等,^參必夢染^274:24335-24341(1999))。此外，可在5'端增加一個嵌合內含子，這也將提高表達水平(見Neuberger和Williams,^^研兌16:6713(1988)，Buchman和Berg，為、f細/^^:參夢8:4395(1988);Brinster等，^馬存夢虎虎孩85:836(1988))。這一嵌合內含子衍生自Promega的載體，即pCI-neo哺乳動物表達載體(bp890-1022)。cNDA的3'端側接人生長素外顯子4和5，以及聚腺苷酸化序列。而且，選用FVB小鼠，因為該品系更容易形成腫瘤。采用MMTV-LTR啟動子來確保HER2在乳腺內的組織特異性表達。為了使得動物更容易形成腫瘤，伺以AIN76A飲食(Rao等，逸^蕃^f《f口治^f45:149-158(1997))。該轉基因質粒構建物的核苷酸序列(SEQIDNO:l)見圖4。適合轉基因實驗的動物可從標準商業(yè)來源獲得，例如Taconic(Germantown，N.Y.)。許多品系都適合，但優(yōu)選的是FVB雌鼠，因為它們更容易形成腫瘤。用FVB雄鼠進行交配，并用切除了輸精管的CD.l種鼠激發(fā)假孕。切除了輸精管的小鼠可從各供應商處獲得。用假孕鼠與FVB小鼠或129/BL6xFVB的p53雜合小鼠交配。用p53等位基因雜合的小鼠來增強腫瘤形成，但這被證明并非必需。所以，有些F1腫瘤是混合品系的。建立了腫瘤的小鼠都是FVB品系的。獲得了6個建立鼠，具有某些發(fā)展中的腫瘤，不生育后代。實施例4以HER2轉基因小鼠作為腫瘤模型評價HER2-定向治療實施例3制造的轉基因建立小鼠在2月齡左右，其乳腺組織活檢根據免疫組織化學染色顯示為3+級HER2表達。經測定，脫落進入血清的HER2胞外區(qū)約為1.2ng/ml(Huang等，/^7丄)。該小鼠在在產下4窩仔后，約5月齡時發(fā)生乳房瘤。在無菌條件下手術切除該腫瘤，切取2mn^的小片，植入野生型FVB雌小鼠的乳房脂肪層中。31個接受移植的小鼠中22個發(fā)生腫瘤，潛伏期為5周。隨著繼續(xù)傳代，腫瘤形成的潛伏期越來越短，生長越來越快，接受移植者中的腫瘤發(fā)病率提高至95%以上。根據免疫組織化學染色監(jiān)測，在原代腫瘤中，HER2表達為3+級，但不一致，在第一代之后，則變成了一致的3+。腫瘤小鼠，對于腫瘤生長^f又有中等抑制作用(圖5)。HERCEPTIN⑧或4D5治療期間生長的腫瘤的HER2表達為3+，這說明沒有HER2陰性腫瘤選擇性。而且，將cy3-HERCEPTIN⑧注射入患腫瘤小鼠后，檢測到其對腫瘤細胞的修飾，這說明無效并非因為抗體沒有與腫瘤接觸。因為該腫瘤模型的持續(xù)性表達HER2,且對HERCEPTIN⑧無反應，如實施例3所述，用HERCEPTIN⑧-類美坦素DM1偶聯(lián)物試驗了一種新的方法。圖5顯示，在該沖莫型中，HERCEPTIN⑧-類美坦素DM1偶聯(lián)物具有顯著的抗肺瘤活性。RITUXAN⑧是一種無關的抗CD20單克隆抗體，在以上研究中用作陰性對照。與對照抗體RITUXAN㊣比較，對HERCEPTIN⑧幾乎沒有反應，但HERCEPTIN⑧的類美坦素偶聯(lián)物卻具有顯著的抗腫瘤活性。如圖5所示，所有接受HERCEPTIN⑧-類美坦素偶聯(lián)物治療的小鼠的腫瘤都顯著縮小，雖然都沒有消失。約4周后，腫瘤開始恢復生長。此時，殺死5個小鼠，發(fā)現(xiàn)，它們的腫瘤表達HER2水平為3+。可見，對HER2陰性腫瘤沒有選擇性。根據這一發(fā)現(xiàn)，在其后的5天內用HERCEPTIN⑧-類美坦素偶聯(lián)物對其余3只小鼠進行治療，腫瘤因而再次減退。生物材料的保藏以下雜交瘤細胞線已在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209,USA;K呆藏抗體ATCC號保藏曰7C2ATCCHB-122151996年10月17曰7F3ATCCHB-122161996年10月17日4D5ATCCCRL-104631990年5月24日2C4ATCCHB-126971999年4月8日保藏根據有關用于專利程序的微生物保藏的國際認可的布達佩斯條約進行(布達佩斯條約)。以上保藏確保培養(yǎng)物自保藏日起30年內保持存活。ATCC根據布達佩斯相關條約，以及Genetech,Inc.與ATCC之間的協(xié)議獲得以上微生物，并保證自相關美國專利授權或在任一美國或國外專利申請最先公開后，培養(yǎng)物的后代永久地、無限制地對公眾開放，并保證對美國專利商標局根據35USC§122和委員會的相關規(guī)定(包括37CFR§1.12,尤其是886OG638)認可的主體開放。以上保藏如正在申請歐洲專利，則在歐洲專利公知將被授權，或授權被撤回或視為撤回之日之前，保藏微生物的樣品將只發(fā)放給需要樣品者授權的專業(yè)人士。(EPC規(guī)則28(4))。本申請的受讓人同意，如果保藏物在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下死亡或滅失或破壞，將在收到通知后立即更換以同種培養(yǎng)物的活樣品。不應將可以獲得保藏物理解為獲得許可實施本發(fā)明，這樣的理解將違反各國政府根據各自專利法所授予的權利。以上說明書已足以使本領域技術人員能夠實施本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不應僅限于保藏的構建物，因為保藏的實施方式只是為了說明本發(fā)明某些方面的內容，任何與之等效的構建物都應屬于本發(fā)明范圍內。本發(fā)明對生物材料進行保藏并不意味著以上描述不能滿足實施本發(fā)明包括最佳實施方式在內的各項內容所需，也不應將其理解成將權利要求的范圍局限于具體描述所代表的內容。實際上，根據以上描述，本領域技術人員不難發(fā)現(xiàn)除本文所示和所述之外的修改，這些都應歸入權利要求的范圍內。需要指出的是，根據本文所述，本領域一般技術人員都能夠將本發(fā)明的技術運用于具體的問題或場合。本發(fā)明產品的實施例及其代表性的分離方法、用途和制造方法都不應理解為是對本發(fā)明的限定。權利要求1.一種抗體-藥物偶聯(lián)物，其中抗ErbB2抗體經共價連接至所述抗ErbB2抗體的賴氨酸或半胱氨酸殘基的共價接頭共價連接類美坦素，所述類美坦素選自美坦素、美坦醇和美坦醇酯。2.根據權利要求1所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述類美坦素是美坦醇C-3位的酯。3根據權利要求1所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述類美坦素是具有如下結構的DM1:4.根據權利要求1所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述共價接頭包含選自二硫鍵，硫醚，酸不穩(wěn)定、光不穩(wěn)定、肽酶不穩(wěn)定和酯酶不穩(wěn)定的基團的連接基團。5.根據權利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述連接基團選自二硫鍵基團和石克醚基團。6.根據權利要求4所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述連接基團包含二硫鍵基團。7.根據權利要求1所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物的每個抗體分子<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>連有l(wèi)-10個類美坦素分子。8.根據權利要求7所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物的每個抗體分子連有3-5個類美坦素分子。9.根據權利要求1所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述共價接頭是雙特異性化學接頭。10.根據權利要求1所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述共價接頭選自N-琥珀酰亞胺一3-(2-吡咬二硫代)丙酸酯(SPDP),琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯(SMCC)，N-琥珀酰亞胺-4-(2-吡啶硫)戊酸酯(SPP)，iminothiolane(IT),鹽酸己二酰亞胺二曱酯，辛二酸二琥珀酰亞胺酯，戊二醛，二(對重氮苯曱?；?己二胺，二(對重氮苯甲?；?-乙二胺，2，6-二異氰酸曱苯酯，和1,5-二氟-2,4-二硝基苯。11.根據權利要求9所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述共價接頭選自SPDP，SMCC，和SPP。12.根據權利要求1所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述抗體是人源化抗體。13.根據權利要求12所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述抗ErbB2抗體是人源化單克隆抗體4D5(ATCCCRL10463)。14.根據權利要求12所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述人源化抗ErbB2抗體選自以下人源化抗體huMAb4D5-1,huMAb4D5-2，huMAb4D5-3,huMAb4D5-4，huMAb4D5-5,huMAb4D5國6，huMAb4D5畫7和huMAb4D5-8(HERCEPT歸)。15.根據權利要求12所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述人源化抗ErbB2抗體是huMAb4D5-8(HERCEPTIN⑧)。16.根據權利要求1所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述抗ErbB2抗體是生長抑制性抗體，其在體外有效抑制SK-BR-3乳房腫瘤細胞的生長。17.根據權利要求1所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述抗體具有4D5單克隆抗體(ATCCCRL10463)的生物學特征，使得抗體顯示出以依賴于ErbB2表達水平的方式對SK-BR-3細胞的抑制效應，和/或阻抑單克隆抗體4D5結合ErbB2。18.根據權利要求1所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述抗體與4D5單克隆抗體(ATCCCRL10463)結合基本上相同的表位。19.根據權利要求1所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述抗體是抗體的抗原結合片段。20.根據權利要求19所述的抗體-藥物偶聯(lián)物，所述抗原結合片段選自Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab')2，F(xiàn)v片段，二抗體，線性抗體，和單鏈抗體分子。21.—種藥物制劑，其包含權利要求l-20任一項的抗體-藥物偶聯(lián)物。22.—種產品，包括容器和裝于其中的組合物，該組合物含有權利要求1-20任一項的抗體-藥物偶聯(lián)物或者是權利要求21的藥物制劑，該產品還包括包裝內說明書或標簽。全文摘要本發(fā)明涉及使用抗ErbB抗體-類美坦素偶聯(lián)物的治療方法，以及此類方法中所用的制品。具體地說，本發(fā)明涉及用抗ErbB受體的抗體與類美坦素的偶聯(lián)物進行ErbB受體靶向癌癥治療的方法。文檔編號C07K16/32GK101518653SQ200910126199公開日2009年9月2日申請日期2000年6月23日優(yōu)先權日1999年6月25日發(fā)明者M·斯利夫科夫斯基,R·斯瓦爾,S·埃里克森,W·布拉特爾申請人:基因技術股份有限公司