專利名稱：氨基酸-(3,4-二羥基-Phe)-Ser-Leu偽肽及其合成方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及偽肽，尤其涉及氨基酸與(3，4_ 二羥基-Phe)-Ser-LeU偽三肽的氨基 端縮合而得的清除自由基和抗血栓雙重活性的偽肽，本發(fā)明還涉及它們的合成方法以及它 們作為清除自由基的抗氧化劑、抑制血管舒張劑和抗血栓劑的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
含有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的化合物具有抗氧化的能力，可以清除自由基。而體內(nèi)自由基 過(guò)多的累積會(huì)引發(fā)各種疾病，例如心腦血管疾病、炎癥、衰老、神經(jīng)疾病等的發(fā)生。NO可以舒 張血管，當(dāng)有自由基清除劑存在，會(huì)抑制其舒血管作用。自由基與血小板的聚集也有關(guān)系， 超氧自由基可以促進(jìn)血小板的聚集。含有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物有清除自由基的作 用，進(jìn)而抑制血小板的聚集。所以設(shè)計(jì)一系列含有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的偽肽，發(fā)揮清除自由基并 抑制血小板聚集的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一類水溶性良好的、生物半衰期長(zhǎng)的、清除體內(nèi)自由基并 有抗血栓作用的偽肽。本發(fā)明目的之二是提供一種合成上述偽肽的方法；本發(fā)明目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的氨基酸-(3，4- 二羥基-Phe)-Ser-Leu偽肽，其結(jié)構(gòu)式為通式I所示 通式 I其中，AA選自氫(H)，甘氨酸殘基(Gly)，丙氨酸殘基(Ala)，纈氨酸殘基(Val)，亮 氨酸殘基(Leu)，異亮氨酸殘基(Ile)，苯丙氨酸殘基(Phe)，酪氨酸殘基(Tyr)，色氨酸殘基 (Trp)，絲氨酸殘基(Ser)，蘇氨酸殘基(Thr)，脯氨酸殘基(Pro)，谷氨酰胺殘基(Gln)，賴氨 酸殘基(Lys)，組氨酸殘基(His)，天冬氨酸殘基(Asp)或谷氨酸(Glu)殘基；其中，所述的 氨基酸或3，4- 二羥基-Phe均為左旋。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種合成上述氨基酸_(3，4_ 二羥 基-Phe) -Ser-Leu偽肽的方法；一種合成上述氨基酸_(3，4- 二羥基-Phe)-Ser-Leu偽肽的方法，包括(1)合成保護(hù)的(3，4- 二羥基-Phe)-Ser-Leu ；(2)將甘氨酸(Gly)，丙氨酸(Ala)，纈氨酸(Val)，亮氨酸(Leu)，異亮氨酸(Ile)， 苯丙氨酸(Phe)，酪氨酸(Tyr)，色氨酸(Trp)，絲氨酸(Ser)，蘇氨酸(Thr)，脯氨酸(Pro)， 谷氨酰胺(Gln)，賴氨酸(Lys)，組氨酸(His)，天冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu)分別與保護(hù) 基保護(hù)的(3，4- 二羥基-Phe)-Ser-Leu縮合，脫去保護(hù)基，即得。
3
本發(fā)明結(jié)合了下述認(rèn)識(shí)或依據(jù)完成了上述技術(shù)方案。自由基在體內(nèi)的水平升高會(huì) 導(dǎo)致諸如腫瘤疾病、自身免疫障礙、衰老、風(fēng)濕樣關(guān)節(jié)炎、心血管疾病以及神經(jīng)退等疾病的 發(fā)生，而抗氧化劑可以清除自由基，維持人體正常的生理機(jī)能。很多天然化合物都具備鄰苯 二酚結(jié)構(gòu)，是優(yōu)秀的抗氧化劑。黃酮類化合物就是一類含有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的抗氧化劑，可以 有效清除自由基，并有實(shí)驗(yàn)證明其抗血小板聚集的活性。而3，4- 二羥基-Phe也是含有鄰 苯二酚結(jié)構(gòu)，具有清除自由基能力，加上其結(jié)構(gòu)與氨基酸類似，可以作為氨基酸類似物縮合 到小分子肽中，一方面發(fā)揮其清除自由基的活性，另一方面在其氨基端和羧基端的保護(hù)，使 整個(gè)分子水溶性增加，不易將化合物中的3，4_ 二羥基-Phe部分代謝，提高了生物利用度。本發(fā)明人基于上述認(rèn)識(shí)，把十六種氨基酸與(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu偽肽 的氨端縮合，使制得的分子獲得四種性能，即依賴于肽的良好的水溶性、依賴于3，4_ 二羥 基-Phe結(jié)構(gòu)中的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的抗氧化性和清除自由基能力和抗血小板聚集的能力和依 賴于AA和Ser-Leu 二肽對(duì)3，4-二羥基-Phe結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。這樣一來(lái)，把(3，4-二羥 基-Phe)-Ser-Leu偽肽與十六種氨基酸縮合制得的分子便成為水溶性良好的、在體內(nèi)穩(wěn)定 的發(fā)揮清除自由基和抗血栓藥物。在大鼠血栓形成模型上的評(píng)價(jià)表明，本發(fā)明自由基清除劑具有優(yōu)秀的口服抗血栓 活性，可作為抗血栓劑應(yīng)用；ESR(電子自旋共振)法測(cè)定自由基的清除試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā) 明偽肽具有優(yōu)秀的清除自由基的能力，可作為自由基清除劑；抑制大鼠胸主動(dòng)脈動(dòng)脈環(huán)舒 張實(shí)驗(yàn)，表明本發(fā)明偽肽有優(yōu)秀的抑制血管舒張的活性。本發(fā)明的又一目的是提供一種含有本發(fā)明偽肽化合物的藥物組合物，該藥物組合 物由治療上有效劑量的本發(fā)明偽肽化合物與藥學(xué)上可接受的賦型劑或者輔加劑組成；即 將有效量的本發(fā)明化合物與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑配合后，按本領(lǐng)域常規(guī)的制劑方 法將其制備成任意一種適宜的藥物組合物。通常該組合物適合于口服給藥和注射給藥，也 適合其他的給藥方法。該組合物可以是片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、錠劑、栓劑，或口服液等 液體制劑形式。根據(jù)不同的給藥方法，本發(fā)明藥物組合物可以含有0. 1% -99%重量，優(yōu)選 10-60 %重量的本發(fā)明偽肽化合物。


圖1本發(fā)明偽肽的合成路線圖。i)DCC、HOBt、NMM;ii)氯化氫/乙酸乙酯溶液 (4N) ；iii)10%鈀碳和氫氣(0. 02Mba).其中AA=甘氨酸(Gly)，丙氨酸(Ala)，纈氨酸 (Val)，亮氨酸(Leu)，異亮氨酸(lie)，苯丙氨酸(Phe)，酪氨酸(Tyr)，色氨酸(Trp)，絲氨 酸(Ser)，蘇氨酸(Thr)，脯氨酸(Pro)，谷氨酰胺(Gln)，賴氨酸(Lys)，組氨酸(His)，天冬 氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)殘基。
具體實(shí)施例方式為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它 們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 (3，4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4q)的制備DBoc-Ser-Leu-OBzl 的制備將 4. 00g(10. 18mmol)Leu-OBzlU. 90g(9. 25mmol)Boc-Ser和 1. 44g(10. 69mmol)HOBt置于IOOmL茄瓶中，加入50mLTHF，冰浴條件下滴入約20滴N甲基嗎啉，待溶液澄清，滴 加2. 28g(ll. 12mmol)DCC和15mL無(wú)水THF構(gòu)成的溶液。再向得到的溶液中滴入NMM約20 滴調(diào)pH值8 9。反應(yīng)混合物0°C攪拌10分鐘后，撤去冰浴，于室溫下反應(yīng)4小時(shí)后抽濾， 濾液減壓濃縮至干。得到的殘余物用70mL乙酸乙酯溶解、置于IOOmL分液漏斗中、依次用 5%碳酸氫鈉水溶液洗(20mLX3)、飽和氯化鈉水溶液洗(20mLX3)、5%硫酸氫鉀水溶液洗 (20mLX3)、飽和氯化鈉水溶液洗(20mLX3)、5%碳酸氫鈉水溶液洗(20mLX3)、飽和氯化 鈉水溶液洗(20mLX3)。乙酸乙酯層用無(wú)水硫酸鈉干燥、過(guò)濾、濾液減壓濃縮得到的油狀物 用石油醚浸泡一段時(shí)間后，磨洗得到3. 62g(96. 02%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI+-MS(m/ e)409[M+H]+.2) HCl · Ser-Leu-OBzl 的制備將IgBoc-Ser-Leu-OBzl (2. 45mmol)置于50mL茄瓶中，用約6mL無(wú)水乙醚將之溶 解，冰浴條件下滴加4N HCl/EtOAc約5mL，滴加完畢加蓋干燥管，撤去冰浴，使反應(yīng)于室溫 下進(jìn)行。約十分鐘后，觀察到反應(yīng)液析出白色固體，即反應(yīng)液由澄清變?yōu)闇啙幔?. 5小時(shí)后反 應(yīng)結(jié)束。向反應(yīng)液中加入約IOmL無(wú)水乙醚，減壓濃縮至干。再加入無(wú)水乙醚攪拌均勻，靜 置，傾去上清液，反復(fù)操作3次，沉淀減壓抽干，得到0. 80g (95. 24% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固 體。ESI+-MS (m/e) 309 [M+H] +3) Boc- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu-OBzl (1)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 3. 44g(9. 99mmol)Ser-Leu-OBzl 和 2. 70g (9. 08mmol) Boc- (3,4- 二羥基-Phe) -OH 得 4. 1 Ig (93% )標(biāo)題化合物，為淡黃色固體。 Mp 130-132°C ；ESI+-MS (m/e) 588 [Μ+Η]+ ;[α ]D20 = -31. 48 (c = 0. 115，甲醇)·4) HCl · H- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu-OBzl (2)的制備按照HCl · Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 2g(3. 41mmol) 1 得 1. 65g(92. 43% )標(biāo)題 化合物，為無(wú)色固體。ESI+-MS (m/e) 488 [M+H]+.5) (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4q)的制備將89mg (17. 0 μ mol) 2置于25mL茄瓶，用8mL甲醇將之溶解，加入10 %的鈀 碳10mg，待混合均勻后，用三通將反應(yīng)瓶、真空泵、氫氣袋相連，先用真空泵抽真空，再通 入H2,反復(fù)操作3 4次，使反應(yīng)瓶中充滿H2,室溫反應(yīng)約8小時(shí)，將反應(yīng)液減壓過(guò)濾， 濾液減壓濃縮，乙醚浸泡一段時(shí)間后，析出固體，傾去上清液，沉淀真空除去乙醚得到約 65mg(96. 31% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體 Mp 150-151 °C ；ESFMS (m/e) 396 [M-H]“ ； [ α ]D20 =-5. 40 (c = 0. 115，甲醇).實(shí)施例2Gly_ (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4a)的制備1) Boc-Gly- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu-OBzl (3a)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 1. 5g(2. 865mmol)2、0. 55g(3. 15mmol) Boc-Gly 得 1. 73g(93. 61 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體 Mp 107-108 "C ；ESI+-MS (m/ e)646[M+H]+，668[M+Na]+ ；[α ]D20 = -30. 43 (c = 0. 100，甲醇).2) Gly- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4a)的制備將IOOmg (15. 5 μ mol) 3a置于25mL茄瓶，用8mL甲醇將之溶解，加入10%的鈀碳 10mg，待混合均勻后，用三通將反應(yīng)瓶抽真空，再通入H2，反復(fù)操作3 4次，使反應(yīng)瓶中充 滿H2，室溫反應(yīng)約8小時(shí)，將反應(yīng)液減壓過(guò)濾，濾液減壓濃縮，乙醚浸泡一段時(shí)間后，析出固 體，傾去上清液，沉淀真空除去乙醚得到無(wú)色固體。冰浴條件下，向該固體粉末中緩慢滴加4mL 4N HCl/乙酸乙酯，加蓋干燥管，撤去冰浴，室溫下混懸反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加入 SmL無(wú)水乙醚，減壓濃縮，得到固體再用無(wú)水乙醚浸泡，傾去上清，反復(fù)操作3次，得到的固 體真空除去乙醚得到約67mg(94. 97% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體Mp 162_164°C ；ESOS (m/ θ)454[Μ-ΗΓ ;[a ]d2° = -12. 09 (c = 0. 115，甲醇)·實(shí)施例3Ala_ (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4b)的制備1) Boc-Ala- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu-OBzl (3b)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 0. 60g(3. 15mmol)Boc-Ala 制得 1. 70g(90. 17% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp 107-1080C5ESI+-MS (m/e) 658 [M+H] + ； [ α ]D20 =-31. 48 (c = 0. 115，甲醇).2) Ala-(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu (4b)的制備按照4a的制備方法，由IOOmg (15. 2 μ mol) 3b制得68mg (95. 61%)標(biāo)題化合物，為 無(wú)色固體。Mp 163-165°C ；ESr-MS (m/e) 467 [Μ-ΗΓ ； [ α ]D20 = -4. 25 (c = 0. 105，甲醇).實(shí)施例4Val_ (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4c)的制備1) Boc-Val-(3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu-OBzl (3c)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 0.68g (3. 15mmol)Boc-Val 制得 1. 78g(90. 56 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp 84-86 "C ；ESI+-MS(m/e)687[M+H]+， 709 [M+Na]725 [M+K]+ ； [ α ]D20 = -41. 44° (c = 0. 130，甲醇)·2) Val-(3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4c)的制備按照4a的制備方法由IOOmg (14. 9 μ mol) 3c制得66mg (91. 28% )標(biāo)題化合物，為 無(wú)色固體。Mp 155-157°C ；ESr-MS (m/e) 495 [Μ-ΗΓ ； [ α ]D20 = 17. 20 (c = 0. 125，甲醇).實(shí)施例5Leu_ (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4d)的制備1) Boc-Leu- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu-OBzl (3d)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 0. 73g(3. 15mmol)Boc-Leu 制得 1. 82g(90. 74% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp 132-134°C ;ESI+-MS (m/e) 701 [M+H]+ ； [ α ]D20 =-42. 77 (c = 0. 135，甲醇).2) Leu- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4d)的制備按照4a的制備方法由IOOmg (14. 3 μ mol) 3d制得67mg (91. 96% )標(biāo)題化合物，為 無(wú)色固體。Mp 145-147 °C;ESr-MS (m/e) 509 [Μ-ΗΓ ;[a ]D2CI = -16. 38° (c = 0. 105，甲醇)·實(shí)施例6Ile_(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu (4e)的制備l)Boc-Ile-(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu-OBzl (3e)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 0. 73g(3. 15mmol)Boc-Ile 制得 1. 78g(88. 75 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp 68-70 "C ；ESI+-MS (m/e) 701 [M+H]+， 723 [M+Na]+，739 [M+K] + ；[α ]D20 = -38. 06 (c = 0· 120，甲醇)·2) lie-(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu (4e)的制備按照4a的制備方法由IOOmg (14. 3 μ mol) 3e制得64mg(87. 84% )標(biāo)題化合物，為 無(wú)色固體。Mp 148-149 °C ;ESr-MS (m/e) 509 [Μ-ΗΓ ;[a ]D20 = 7. 30° (c = 0· 115，甲醇)·實(shí)施例7Phe_ (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4f)的制備1) Boc-Phe- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu-OBzl (3f)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 0. 84g(3. 15mmol)Boc-Phe 制得1. 92g(91. 29% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp 173-175°C ;ESI+-MS (m/e) 735 [M+H]+ ； [ α ]D20 =-35. 91 (c = 0. 110，甲醇)2) Phe- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4f)的制備按照4a的制備方法，由IOOmg (15. 2 μ mol) 3f制得70mg(94. 45% )目標(biāo)化合物，為 無(wú)色固體。Mp 143-145°C ；ESr-MS (m/e) 543 [Μ-ΗΓ ； [ α ]D20 = -9. 57 (c = 0. 115，甲醇).實(shí)施例8Tyr_ (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4g)的制備1) Boc-Tyr- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu-OBzl (3g)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 0. 89g(3. 15mmol)Boc-Tyr 制得
1.95g(90. 74 % )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp 153-154 °C ；ESI+-MS (m/e) 751 [M+H]+， 773[M+Na] + ;[α ]D20 = -35. 19 (c = 0. 115，甲醇)·2) Tyr- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4g)的制備按照4a的制備方法，由IOOmg (13. 3 μ mol) 3g制得69mg (92. 41 % )標(biāo)題化合物，為 無(wú)色固體。Mp 151-153°C ；ESr-MS (m/e) 559 [Μ-ΗΓ ;[α ]D20 = -23. 01 (c = 0. 125，甲醇).實(shí)施例9Trp_ (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4h)的制備1) Boc-Trp- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu-OBzl (3h)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由由 0. 96g(3. 15mmol) Boc-Trp 制得
2.OOg (90. 30% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp 160-1620C5ESI+-MS (m/e) 774[M+H] + ； [ α ]D20 =-37. 07 (c = 0. 100，甲醇)·2) Trp- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4h)的制備按照4a的制備方法，由IOOmg (12. 9 μ mol) 3h制得70mg (92. 81%)標(biāo)題化合物，為 無(wú)色固體。Mp 169-171°C ；ESr-MS (m/e) 582 [Μ-ΗΓ ;[α ]D20 = -10. 43 (c = 0. 100，甲醇).實(shí)施例IOSer- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4i)的制備1) Boc-Ser- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu-OBzl (3i)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由由 0. 65g(3. 15mmol) Boc-Ser 制得 1. 80g(93. 20% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp 93-95°C ；ESI+-MS(m/e)675[M+H]+ ； [ α ]D20 =-37. 16 (c = 0. 115，甲醇).2) Ser-(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu (4i)的制備按照4a的制備方法，由IOOmg (14. 8 μ mol) 3i制得66mg (91.91%)標(biāo)題化合物，為 無(wú)色固體。Mp 149-151°C ；ESr-MS (m/e) 483 [Μ-ΗΓ ;[α ]D20 = -16. 97 (c = 0. 110，甲醇).實(shí)施例IlT-(3，4- 二羥基-Phe)-Ser-Leu (4 j)的制備1) Boc-Thr- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu-OBzl (3j)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 0. 69g(3. 15mmol)Boc-Thr 制得 1. 83g(92. 83% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp 123-125°C;ESI+-MS(m/e)689[M+H]+ ； [ α ]D20 =-37. 90 (c = 0. 100，甲醇)·2) Thr- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4j)的制備按照4a的制備方法，由IOOmg (14. 5 μ mol) 3 j制得67mg (92. 56% )標(biāo)題化合物，為 無(wú)色固體。Mp 148-150 0C ；ESr-MS (m/e) 497 [Μ-ΗΓ ;[a ]D20 = -10. 18 (c = 0. 110，甲醇).實(shí)施例12P- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4k)的制備1) Boc-Pro- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu-OBzl (3k)的制備
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按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 0. 68g(3. 15mmol)Boc-Pro 制得 1. 78g(90. 82% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp 81-83°C ；ESI+-MS(m/e)685[M+H]+ ； [ α ]D20 =-27. 96 (c = 0. 095，甲醇)·2) Pro- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4k)的制備按照4a的制備方法，由100mg(14. 6μπι01)31 制得69mg(95. 54% )標(biāo)題化合物，為 無(wú)色固體。Mp 135-137°C ；ESr-MS (m/e) 493 [Μ-ΗΓ ； [ α ]D20 = -44. 09 (c = 0. 110，甲醇).實(shí)施例1Χ1η_(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu (41)的制備1) Boc-Gln- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu-OBzl (31)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 0. 78g(3. 15mmol)Boc-Gln 制得
1.87g(91. 28% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp 168-169°C ;ESI+_MS (m/e) 716 [M+H]+； [ α ]D2° =-37. 68 (c = 0. 105，甲醇)·2) Gln-(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu (41)的制備按照4a的制備方法，由100mg(14.00ymol)31制得67mg(91.25% )標(biāo)題化合物， 為無(wú)色固體。Mp 150-152°C;ESr-MS(m/e)524[M-Hr ;[a ]D2。= -1. 26 (c = 0. 095，甲醇).實(shí)施例14Lys_ (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4m)的制備1) Boc-Lys (Boc) -(3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu-OBzl (3m)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 1. 09g(3. 15mmol) Boc-Lys (Boc)制得
2.07g(88. 64% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp 106-108°C ;ESI+-MS (m/e) 816 [M+H] + ； [ α ]D20 =-31. 48 (c = 0. 115，甲醇).2) Lys- (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu 的制備按照4a的制備方法，由100mg(12. 3μπι01)3πι制得60mg(93. 14% )標(biāo)題化合物，為 無(wú)色固體。Mp 162-163°C ；ESr-MS (m/e) 524 [Μ-ΗΓ ； [ α ]D20 = -21. 24 (c = 0. 110，甲醇).實(shí)施例15His_ (3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu (4n)的制備l)Boc-His (Boc)-(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3n)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 1. 12g(3. 15mmol)Boc-His (Boc)制得 2. 18g(92. 33% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp 115-117°C ;ESI+-MS (m/e) 825 [M+H]+ ； [ α ]D20 =-26. 79 (c = 0. 105，甲醇).2) His-(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu (4n)的制備按照4a的制備方法，由IOOmg (12. 1 μ mol) 3η制得59mg (91. 04%)標(biāo)題化合物，為 無(wú)色固體。Mp 151-153°C ；ESr-MS (m/e) 533 [Μ-ΗΓ ;[α ]D20 = -16. 23 (c = 0. 115，甲醇).實(shí)施例16Asp_ (3,4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu (4o)的制備l)Boc_Asp (OBzl)-(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3o)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 1.06g(3. 15mmol)Boc-Asp (OBzl)制 得 2. 06g(89. 20% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp 136-138 °C ；ESI+-MS(m/e)807[M+H]+, 829[M+Na] + ;[α ]D20 = -35. 23 (c = 0. 095，甲醇)·2) Asp-(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu (4o)的制備按照4a的制備方法，由IOOmg (12. 6 μ mol) 3o制得62mg (95. 91%)標(biāo)題化合物，為 無(wú)色固體。Mp 147-1490C ；ESr-MS (m/e) 511 [Μ-ΗΓ ； [ α ]D20 = 21. 68 (c = 0. 125，甲醇).實(shí)施例17Glu_ (3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu (4p)的制備
l)Boc-Glu (OBzl)-(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu-OBzl(3p)的制備按照Boc-Ser-Leu-OBzl 的制備方法由 1. 02g(3. 15mmol) Boc-Glu (OBzl)制得
2.llg(92. 98% )標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。Mp 67-68°C ；ESI+-MS(m/e) 793[M+H]+ ； [ α ]D20 =-38. 06 (c = 0. 120，甲醇).2) Glu-(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu (4p)的制備按照4a的制備方法，由IOOmg (12. 4 μ mol) 3p制得63mg(96. 54% )標(biāo)題化合物，為 無(wú)色固體。Mp 133-135°C ；ESr-MS (m/e) 525 [Μ-ΗΓ ； [ α ]D20 = -5. 64 (c = 0. 115，甲醇).試驗(yàn)例1本發(fā)明化合物口服給藥的抗血栓活性試驗(yàn)1)大鼠手術(shù)與器械SD大鼠(雄性，220 230g)按IOnmol · kg—1劑量口服本發(fā)明的化合物，30min后 按UOOmg-kg—1劑量腹腔注射烏拉坦溶液進(jìn)行麻醉。麻醉大鼠仰臥位固定，分離右頸總動(dòng) 脈，于近心端夾動(dòng)脈夾，近心端和遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，將遠(yuǎn)心端的手術(shù)線于皮毛用止血 鉗夾緊，準(zhǔn)備在遠(yuǎn)心端插管。2)插管插管為硅烷化過(guò)的聚乙烯膠管，分三段，中段為聚乙烯膠管，長(zhǎng)60. Omm,內(nèi)徑
3.5mm ；兩端為相同的聚乙烯管，管長(zhǎng)100. Omm,內(nèi)徑1. Omm，外徑2. Omm該管的一端拉成尖管 (用于插入大鼠頸動(dòng)脈或靜脈)，外徑為1. Omm0將編好號(hào)的干凈青霉素小瓶中分別裝入6cm 長(zhǎng)的黑色手術(shù)線，稱重；然后取出絲線，按照編號(hào)放入準(zhǔn)備好的插管的中段較粗的插管中。打開(kāi)大鼠右側(cè)動(dòng)脈夾，用注射器通過(guò)尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液 (50IU · kg—1)，然后將插管的動(dòng)脈端插入大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，將計(jì)算量的肝素緩緩注入大鼠 體內(nèi)。3)給藥溶液藥品生理鹽水(3ml · kg—1，口服給予)、阿斯匹林(劑量為30mg/kg,按試驗(yàn)例1 的方法靜脈給予)的生理鹽水溶液、本發(fā)明化合物(劑量為lOnmol/kg，口服給予)的生理 鹽水溶液。4)血栓稱重計(jì)時(shí)開(kāi)始15分鐘后，剪斷動(dòng)靜脈插管，停止循環(huán)，用眼科鑷小心取出絲線，在濾紙 上輕輕蘸掉血滴，放入事先稱重好的青霉素小瓶中，精確稱重并記錄。計(jì)算出血栓的濕重。 每個(gè)藥品重復(fù)11次給藥。統(tǒng)計(jì)各組的血栓濕重(X 土SD)，并做t檢驗(yàn)。5)結(jié)果經(jīng)口服給藥，本發(fā)明的化合物都具有很好的抗栓活性。結(jié)果列入表2。表1.本發(fā)明的化合物經(jīng)口服給藥的抗血栓活性 η = 10 ；NS =生理鹽水；ASP =阿司匹林；a.與生理鹽水相比，P < 0. 01。試驗(yàn)例2本發(fā)明化合物4i 口服給藥的量效關(guān)系1)大鼠手術(shù)與器械SD 大鼠(雄性，220 230g)按 IOnmol · kg-1, Inmol · kg-1 和 0. Inmol · kg-1 劑量 口服4i，30min后按UOOmg-kg—1劑量腹腔注射烏拉坦溶液進(jìn)行麻醉。麻醉大鼠仰臥位固定， 分離右頸總動(dòng)脈，于近心端夾動(dòng)脈夾，近心端和遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，將遠(yuǎn)心端的手術(shù)線 于皮毛用止血鉗夾緊，準(zhǔn)備在遠(yuǎn)心端插管。2)插管插管為硅烷化過(guò)的聚乙烯膠管，分三段，中段為聚乙烯膠管，長(zhǎng)60. Omm,內(nèi)徑 3. 5mm ；兩端為相同的聚乙烯管，管長(zhǎng)100. Omm,內(nèi)徑1. Omm，外徑2. Omm該管的一端拉成尖管 (用于插入大鼠頸動(dòng)脈或靜脈)，外徑為1. Omm0將編好號(hào)的干凈青霉素小瓶中分別裝入6cm 長(zhǎng)的黑色手術(shù)線，稱重；然后取出絲線，按照編號(hào)放入準(zhǔn)備好的插管的中段較粗的插管中。打開(kāi)大鼠右側(cè)動(dòng)脈夾，用注射器通過(guò)尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液 (50IU · kg—1)，然后將插管的動(dòng)脈端插入大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，將計(jì)算量的肝素緩緩注入大鼠 體內(nèi)。3)給藥溶液藥品將4i 按 IOnmol · kg—1，Inmol · kg—1 和 0. Inmol · kg—1 劑量配置生理鹽水溶 液，供口服給藥。4)血栓稱重計(jì)時(shí)開(kāi)始15分鐘后，剪斷動(dòng)靜脈插管，停止循環(huán)，用眼科鑷小心取出絲線，在濾紙上輕輕蘸掉血滴，放入事先稱重好的青霉素小瓶中，精確稱重并記錄。計(jì)算出血栓的濕重。 每個(gè)藥品重復(fù)11次給藥。統(tǒng)計(jì)各組的血栓濕重(I 土SD)，并做t檢驗(yàn)。5)結(jié)果經(jīng)口服給藥，在IOnmol · kg—1，Inmol · kg^,0. Inmol · kg—1 劑量下，4i 依賴地發(fā)揮 抗血栓作用。結(jié)果列入表3。表2 口服給予4i的量效關(guān)系 試驗(yàn)例3本發(fā)明的化合物用ESR法檢測(cè)清除NO自由基a.溶液的配制①M(fèi)GD溶液的配制取7. 325mg MGD溶于ImL純凈水中，制得濃度為25mM的MGD 溶液；②FeSO4溶液的配制取FeSO4 · 7H20 3. 475mg溶于ImL純凈水中，制得濃度為 12. 5mM的 FeSO4 溶液；③SNAP溶液的配制將SNAP 25mg溶于ImL純凈水中，得到濃度為ΙΙΟμΜ的母液 (綠色)，取10 μ L母液，稀釋到lmL，制得濃度為1 μ M的SNAP溶液；④樣品溶液的配制取約Img待測(cè)樣品溶于ImL純凈水中，得到濃度為ImM的樣品溶液。b. ESR參數(shù)設(shè)定表3ESR參數(shù)設(shè)定 c.數(shù)據(jù)測(cè)定(1)將①和②按體積比1 1均勻混合，制得棕色的[(MGD)2-Fe2+]絡(luò)合⑤；(2)依次將⑤，④，③等比例混合，其中，空白組用相同體積的純凈水代替④；(3)將混合液于37°C下孵育30min后，用2mm石英管吸取各個(gè)混合液，置于ESR波 譜儀的諧振腔進(jìn)行測(cè)定。d.對(duì)NO自由基的清除百分率的計(jì)算記錄譜圖中三個(gè)主峰中第一個(gè)峰的PH值(峰強(qiáng)度)，空白組(純凈水組)記
11為PHblank,待測(cè)化合物組為PHteug,根據(jù)公式“自由基的清除百分率=(PHBLAffi-PHDrug)丨 phbumx100% ’’來(lái)計(jì)算待測(cè)化合物對(duì)N0自由基的清除百分率(n = 3)。
e.實(shí)驗(yàn)結(jié)果本發(fā)明化合物均有很好的清除NO自由基的能力 表4ESR測(cè)定化合物對(duì)NO自由基的清除百分率(i±SD) 其中，化合物的濃度為10_3mol/L(n = 3)；統(tǒng)計(jì)學(xué)方法t檢驗(yàn)法a表示化合物對(duì)NO自由基的清除百分率與3，4_ 二羥基-Phe相比，P < 0.05廣表 示化合物對(duì)NO自由基的清除百分率與3，4-二羥基-Phe相比，P <0.01 ;e表示化合物對(duì) NO自由基的清除百分率與4q相比，P < 0. 05 ;d表示化合物對(duì)NO自由基的清除百分率與4q 相比，P < 0. 01。試驗(yàn)例4本發(fā)明的化合物抑制大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備a.手術(shù)器械眼科剪(直)，眼科鑷(直)，眼科鑷(彎)，16cm手術(shù)剪，表面皿b.儀器LMS_2B型二道生理記錄儀(成都儀器廠)；肌肉張力換能器(北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司)；THS-15型數(shù)控超級(jí)恒溫槽(寧波天恒儀器廠)。c.試劑NE，Ach (上海試劑三廠)NaCl，CaCl2, NaHCO3, NaH2PO4, MgCl2 · 6H20, EDTA_2Na (北京化工廠)KCl (北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)無(wú)水葡萄糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)a.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SD雄性大鼠(首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，約200g)2、實(shí)驗(yàn)步驟a. Krebs-Henseleit (K-H)液的制備①鹽儲(chǔ)備液NaCl95. 5g+KCl 5. 5g+MgCl2 · 6H20 3. 3g+CaCl2 3. 7g 與 IOOOmL H2O
混合，超聲溶解。
②磷酸二氫鈉溶液=NaH2PO4 1. 56g與IOOmL H2O混合，超聲溶解。③乙二胺四乙酸二鈉溶液EDTA_2Na 1. 12g與IOOmL H2O混合，超聲溶解。④K-H 液=NaHCO3 5. 04g+ 無(wú)水葡萄糖 6. 00g+1500mL H20+36mL ②溶液 +3mL ③溶 液 +225HiL ①溶液 +I236HiL H2O其中，H2O為蒸餾水，溶液①②③均要避光保存；④一定要按順序配制，每步保證固 體完全溶解，并且要當(dāng)天配制，當(dāng)天使用。每種溶液都要保證完全溶解，澄清透明。b.大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的制備200g左右雄性SD大鼠斷頸處死、剪開(kāi)胸骨、暴露出心臟、用鑷子夾起心臟、沿胸椎 取下胸主動(dòng)脈。立即在K-H緩沖液中將胸主動(dòng)脈與其它組織分離，并保持血管內(nèi)皮完整。在 K-H緩沖液中把胸主動(dòng)脈剪成2mm寬的數(shù)段血管環(huán)待用。在肌肉張力換能器(量程5g)上懸掛一個(gè)Ig的砝碼，記錄指針移動(dòng)的格數(shù)。把胸 主動(dòng)脈環(huán)懸掛于肌肉張力換能器上、浸入持續(xù)通氧(95%02+5%C02)的浴槽中、調(diào)節(jié)胸主動(dòng) 脈環(huán)的張力使指針的移動(dòng)格數(shù)與掛Ig砝碼移動(dòng)的格數(shù)相同。c.目標(biāo)物4a_q抑制血管條Ach舒張活性的測(cè)定待Ig預(yù)張力的基線走平后，往浴槽中加NE (0. 2π^/ιΛ，10μ ，終濃度0. 1 μ mol/ L)，血管條收縮，穩(wěn)定后，加入目標(biāo)化合物4a_q的水溶液(lmg/mL，15 μ L，終濃度1 μ mol/L) 以及Ach (lmg/mL，15 μ L，終濃度5X 10_5mol/L)舒張平穩(wěn)后記錄結(jié)果。用K-H緩沖液將主 動(dòng)脈環(huán)洗3-5次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)。3、抑制舒張百分率計(jì)算Ach引起的舒張格數(shù)LAeh，加入待測(cè)化合物和Ach引起的舒張格數(shù)Lteug，NE引起的 收縮格數(shù)LNE。根據(jù)公式“抑制舒張百分率=(Likh-Lteug) /LneX 100%"來(lái)計(jì)算待測(cè)化合物對(duì) Ach引起的血管條舒張的抑制百分率(η = 3)。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明化合物均有很好的抑制血管舒張的活性。表5本發(fā)明化合物對(duì)Ach引起的血管舒張的抑制百分率
Comp.抑制舒張率(％)
62.04士 1.80 63.51±8.52 81.02±10.15 80.21±3.45a’b 86.79±0.84a,b 62.94±7.18 47.80±5.84 85.67士 5.03 b 75.03±9.89 79.18±4.76a,b 72.04士 11.95 83.60土 9.14 59.83土4.81 SS^liLSS3·1" 69.67土 3.63 64.02土 4.16 84.48士 7.19a’b 其中，化合物的終濃度為10_6mol/L(n = 3)；統(tǒng)計(jì)學(xué)方法t檢驗(yàn)法
a表示化合物對(duì)Ach引起的血管舒張的抑制百分率與3，4-二羥基-Phe相比，P < 0. 01 ;b表示化合物對(duì)Ach引起的血管舒張的抑制百分率與(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu 相比，P < 0. 01。
權(quán)利要求
氨基酸 (3，4 二羥基 Phe) Ser Leu偽肽，其結(jié)構(gòu)式為通式I所示通式I其中，AA選自氫(H)，甘氨酸殘基(Gly)，丙氨酸殘基(Ala)，纈氨酸殘基(Val)，亮氨酸殘基(Leu)，異亮氨酸殘基(Ile)，苯丙氨酸殘基(Phe)，酪氨酸殘基(Tyr)，色氨酸殘基(Trp)，絲氨酸殘基(Ser)，蘇氨酸殘基(Thr)，脯氨酸殘基(Pro)，谷氨酰胺殘基(Gln)，賴氨酸殘基(Lys)，組氨酸殘基(His)，天冬氨酸殘基(Asp)或谷氨酸(Glu)殘基。F2009100851525C0000011.tif
2.一種合成權(quán)利要求1所述氨基酸_ (3，4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu偽肽的方法，包括以 下步驟(1)合成保護(hù)的(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu；(2)將甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，絲氨酸， 蘇氨酸，脯氨酸，谷氨酰胺，賴氨酸，組氨酸，天冬氨酸或谷氨酸分別與保護(hù)基保護(hù)的(3， 4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu縮合，脫去保護(hù)基，即得。
3.一種清除自由基藥物組合物，其特征在于由治療或預(yù)防上有效量的權(quán)利要求1所 述的氨基酸_(3，4_ 二羥基-Phe)-Ser-LeU偽肽和藥學(xué)上可接受的載體或輔料所組成。
4.一種抗血管舒張藥物組合物，其特征在于由治療或預(yù)防上有效量的權(quán)利要求1所 述的氨基酸_(3，4_ 二羥基-Phe)-Ser-LeU偽肽和藥學(xué)上可接受的載體或輔料所組成。
5.一種抗血栓藥物組合物，其特征在于由治療或預(yù)防上有效量的權(quán)利要求1所述的 氨基酸_(3，4_ 二羥基-Phe)-Ser-LeU偽肽和藥學(xué)上可接受的載體或輔料所組成。
6.權(quán)利要求1所述的氨基酸_(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu偽肽在制備清除自由基藥 物中的用途。
7.權(quán)利要求1所述的氨基酸_(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu偽肽在制備抗血管舒張藥 物中的用途。
8.權(quán)利要求1所述的氨基酸_(3，4- 二羥基-Phe) -Ser-Leu偽肽在制備抗血栓藥物的 用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了氨基酸-(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu偽肽及其合成方法和應(yīng)用。其合成方法包括(1)合成保護(hù)的(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu；(2)將甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，脯氨酸，谷氨酰胺，賴氨酸，組氨酸，天冬氨酸或谷氨酸分別與保護(hù)基保護(hù)的(3，4-二羥基-Phe)-Ser-Leu縮合，脫去保護(hù)基，即得。本發(fā)明偽肽化合物除具有良好的清除NO自由基活性外，還具有抑制血管舒張的性能，并且具有優(yōu)秀的口服抗血栓活性，可作為清除自由基及抗血栓雙重活性藥物。
文檔編號(hào)C07K5/087GK101906136SQ20091008515
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2009年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月2日
發(fā)明者孫丹璐, 彭師奇, 趙明 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)