專利名稱：奶牛血液中分離出的抗菌肽及其編碼序列和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種從奶牛血液中分離出的具有抗菌 活性的抗菌肽及其編碼序列和用途。
背景技術(shù)：
抗菌肽(antimicrobial peptides)是生物細(xì)胞基因編碼產(chǎn)生的一類具有抗菌活 性的多肽，是機(jī)體在生物進(jìn)化過程中為適應(yīng)環(huán)境與自身生存而產(chǎn)生的天然免疫 活性分子，是天然免疫的重要介質(zhì)?？咕姆肿恿啃。逆溡话銥?0 50個(gè)氨 基酸殘基。目前發(fā)現(xiàn)抗菌肽除了具有廣譜的抗菌(革蘭陽性菌和革蘭陰性菌) 活性外，還對(duì)真菌(如白色念珠菌等)、病毒(如流感病毒、艾滋病病毒等)、 寄生蟲(如線蟲、鞭毛蟲等)及腫瘤等具有極強(qiáng)的殺滅能力，更為重要的是抗 菌肽對(duì)正常的真核細(xì)胞幾乎沒有作用，僅僅作用于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核 細(xì)胞，同時(shí)無免疫原性，不會(huì)產(chǎn)生過敏反應(yīng)?？咕牡臍⒕鷻C(jī)理與抗生素完全 不同，抗菌肽一般是通過作用于靶細(xì)胞的細(xì)胞膜，破壞其完整性并產(chǎn)生穿孔現(xiàn) 象，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜通透性增大，引起胞內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出而達(dá)到廣譜 抗菌的效果。因此，病原菌對(duì)抗菌肽一般不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。
目前，在治療細(xì)菌性疾病是主要依賴于抗生素，抗生素的使用為人類解除 細(xì)菌性感染發(fā)揮了巨大的作用。但是，由于長期濫用抗生素，細(xì)菌耐藥性越來 越強(qiáng)，耐藥菌株感染病例越來越多，不僅使得許多曾經(jīng)高度有效的抗生素藥物 失效，而且對(duì)人類生命健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。當(dāng)前，對(duì)病毒性疾病主要依賴 于疫苗接種，但發(fā)病后幾乎無藥可治；對(duì)寄生蟲性疾病基本不治療或不預(yù)防。每年由此造成的經(jīng)濟(jì)損失相當(dāng)巨大。
抗菌肽和小分子化學(xué)抗生素相比有以下特點(diǎn)(1)高效性，對(duì)病原生物最
小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)為0.25 4(ig/L; (2)廣
譜性，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲、腫瘤細(xì)胞均具有作用；(3)低毒性，由 于人類與哺乳動(dòng)物的正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)與病原生物和腫瘤細(xì)胞的不同，抗菌肽在起 作用的濃度范圍內(nèi)，對(duì)正常機(jī)體組織細(xì)胞的毒性很??；(4)穩(wěn)定性，經(jīng)10(TC 處理30 min或用pH值遠(yuǎn)偏離中性、較大離子強(qiáng)度的溶液處理后仍可保留生物活 性。某些多肽能在溶液中形成多聚體結(jié)構(gòu)或與細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)合，獲得抵抗蛋白 酶水解的能力；(5)迅速的殺菌能力，在體外實(shí)驗(yàn)中，大多數(shù)抗菌肽在有效MIC 的條件下，5min即能殺死99.7。/。的病原體；(6)抗菌肽還具有提高機(jī)體免疫系 統(tǒng)功能、提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)動(dòng)物生產(chǎn)等功能。
抗菌肽對(duì)食品中的多種革蘭氏陽性及陰性細(xì)菌均有較強(qiáng)的殺滅作用，能快 速抑制微生物的生長，人、畜食后易被體內(nèi)蛋白酶水解消化且無毒副作用，在 酸性條件下活性很強(qiáng)，具有良好的溶解性和穩(wěn)定性，是一種極具發(fā)展前景的新 型食品防腐劑；抗菌肽還能在發(fā)酵過程中定向培養(yǎng)或殺死某些菌種，或在食物 中定向保存有益菌群(如乳酸菌)和防止有害菌群異常發(fā)酵。大多數(shù)活性肽還 具有良好的溶解性、熱穩(wěn)定性以及在高濃度狀態(tài)下呈低黏度等加工特性，如大 豆多肽、菜籽多肽等，可添加到食品中，制作各種功能食品，且仍能保持原有 的生理活性，也可以直接制成口服劑型藥品、保健品、營養(yǎng)品等。在動(dòng)物飼料 抗菌肽添加劑研究方面，可用基因工程方法生產(chǎn)環(huán)保型抗菌肽添加劑，以減少 或避免抗生素添加劑引發(fā)的負(fù)面問題?？股靥砑觿┑氖褂脟?yán)重破壞了動(dòng)物腸 道的微生態(tài)平衡，并易在動(dòng)物體內(nèi)殘留，嚴(yán)重影響了畜產(chǎn)品的品質(zhì)和人類的健 康。
抗菌肽具有獨(dú)特的抗菌機(jī)制及廣譜而不產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)越性質(zhì)，它的出現(xiàn)為人們尋找理想的抗菌藥物和食品添加劑提供了新的方向，為人類戰(zhàn)勝耐藥微 生物帶來了新的契機(jī)，抗菌肽也因此具有巨大的應(yīng)用潛力。
自從世界上第一個(gè)抗菌肽天蠶素(cecr叩in)被發(fā)現(xiàn)以來，迄今已從生物界 分離到750多種抗菌肽，它們的分布極其廣泛，從哺乳動(dòng)物、甲殼動(dòng)物、魚類、 昆蟲、兩棲動(dòng)物、鳥類到植物、細(xì)菌和病毒等均有發(fā)現(xiàn)。目前，國內(nèi)有較多的 學(xué)者從不同陸生動(dòng)物和水生動(dòng)物體內(nèi)分離到一些具有活性的抗菌肽。而在哺乳 動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽主要有三類，分別是防御素、cathelicidins和histatinst23。防 御素根據(jù)氨基酸的數(shù)量、半胱氨酸的位置以及二硫鍵連接方式的不同，可分為a-防御素、P-防御素和e-防御素三類a-防御素是美國Lehrer實(shí)驗(yàn)室從兔肺巨噬細(xì) 胞中首先分離得到的陽離子性極強(qiáng)的小分子抗菌肽，主要存在于哺乳動(dòng)物中性 粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和動(dòng)物小腸的Paneth細(xì)胞內(nèi)；P-防御素首先在牛的氣管黏膜上 皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，大小約38 42個(gè)氨基酸殘基，由三個(gè)二硫鍵連接形成的P-折疊結(jié) 構(gòu)，三個(gè)二硫鍵的位點(diǎn)分別是1和5、 2和4; 3和6，主要存在于哺乳動(dòng)物的皮膚、
黏膜等上皮細(xì)胞中；e-防御素是從獼猴的白細(xì)胞中分離出來的一種成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的
新型防御素，由18個(gè)氨基酸組成。cathelicidins是哺乳動(dòng)物中另一大類抗菌肽， 最初是從豬的白細(xì)胞中分離到的。這類肽以沒有活性的前體形式貯存于中性粒 細(xì)胞的分泌顆粒中，受到細(xì)胞刺激通過蛋白水解而釋放，廣泛存在于豬、羊、 馬、牛、豚鼠、兔子和山羊的嗜中性細(xì)胞中。哺乳動(dòng)物抗菌肽的另一個(gè)家族是 histatins，是從人的唾液中分離出的一組富含組氨酸的小的陽離子肽，相對(duì)分子 質(zhì)量為3000 4000。它們具有殺真菌和細(xì)菌的活性，目前僅發(fā)現(xiàn)于人類和舊大 陸猴(Macaca fascicularis)中。
抗菌肽對(duì)哺乳動(dòng)物正常細(xì)胞一般無損傷，但是大多數(shù)抗茵肽在高濃度下(少 數(shù)抗茵肽甚至在低濃度下)有溶血作用，因而對(duì)哺乳動(dòng)物正常細(xì)胞也有一定毒 性。溶血作用與疏水殘基含量有關(guān)，肽分子中疏水殘基含量越高則往往溶血作用越強(qiáng)，抗菌肽溶血活性的存在是阻礙其應(yīng)用的重要因素，今后的研究要保證 抗菌肽抗菌活性的基礎(chǔ)上消除其溶血活性，才能夠真正促進(jìn)抗菌肽在醫(yī)藥、食 品等方面的應(yīng)用推廣。
目前，尚未見到從奶牛血液血紅蛋白內(nèi)進(jìn)行抗菌肽的分離鑒定的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種從奶牛血液中分離出的具有抗革蘭陽 性細(xì)菌、革蘭陰性細(xì)菌及病原真菌活性的抗菌肽，測(cè)定了其氨基酸序列，并給 出了該抗菌肽分離提純方法，且指明了其用途。
一種奶牛血液中分離出的抗菌肽，具有下述氨基酸序列
Asn-Glu-Phe-Thr-Pro-Val-Leu-Gin-Ala-Asp-Phe-Gin-Lys-Val-Val-Ala-Gly-Val-Ala-Asn-Ala-Leu-Ala-His-Lys，其分子量為2668.03，等電點(diǎn)pi為 7. 15。
所述抗菌多肽的制備方法如下
(1) 血液的采集與處理無菌條件下收集健康奶牛的血液于含肝素的試管 中，立即用0.9%的滅菌生理鹽水洗滌紅細(xì)胞2 4次，再用0. 83%氯化銨溶液溶 解紅細(xì)胞，于4。C下離心去除白細(xì)胞后，將含血紅素多肽的溶液經(jīng)凍干后再用 0.01%乙酸溶解；
(2) 抗菌肽的純化將粗提的血紅素溶液通過離子交換柱，陽離子復(fù)合物 結(jié)合陰離子樹脂上，以25rnM乙酸銨溶液洗去非陽離子分子，再以10%乙酸溶液 洗脫陽離子分子，并收集該洗脫液，將收集的洗脫溶液以20mL/h的速率倒入陽 離子交換柱子中，用雙光束紫外可見分光光度計(jì)在波長為230nm處監(jiān)測(cè)其吸光 度，收集洗脫峰，凍干，以0.01%乙酸重懸，在反相高效液相色譜上以梯度化的 30 35%乙腈和0. 1%三氟乙酸進(jìn)行，分別收集215nm處的肽，凍干，用0. 01%醋 酸溶解。本發(fā)明所述抗菌肽也可以依據(jù)相關(guān)編碼序列進(jìn)行人工合成，其制備方法可 以是固相化學(xué)法，也可以將抗菌肽的編碼基因克隆到載體上，然后在宿主細(xì)胞 中表達(dá)后獲得。其中表達(dá)載體可以是質(zhì)?；虿《局械囊环N，宿主細(xì)胞可以是原 核細(xì)胞，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等，宿主細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞、包括 酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。制備的抗菌肽可通過質(zhì)譜 鑒定。
所述抗菌肽可用于制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌或病毒感 染的藥物。
所述藥物含有上訴抗菌肽，并混合有一種或一種以上醫(yī)藥上可接受的載體 和/或添加劑。
所述抗菌肽還可用作飼料添加劑或食品添加劑。
本發(fā)明所具有的有益效果 (1)抗菌譜廣，對(duì)G+、 G-細(xì)菌和真菌都有高效的抗菌作用；(2)殺菌快 速；(3)高度的選擇性，原核細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞與正常的真核細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不同， 抗菌肽可以選擇地作用于原核細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞的作用不明顯； (4)不產(chǎn)生耐藥性；(5)無致畸作用。
本發(fā)明首次從奶牛血液中分離出了抗菌肽，除具有一般抗菌肽的共性之外， 還具有下列特點(diǎn)
(1) 與其他來源的抗菌多肽相比，該抗菌多肽具有結(jié)構(gòu)簡單、人工合成方
便，應(yīng)用于哺乳動(dòng)物無抗原性；
(2) 本發(fā)明抗菌肽分離于奶牛血液的紅細(xì)胞，而紅細(xì)胞為動(dòng)物血液成分之
一，參與血液循環(huán)過程，不存在溶血毒性，或溶血率值極低，具有不產(chǎn)生耐藥 性、無致畸作用、不易產(chǎn)生蓄積中毒等一些安全無毒副作用的生物學(xué)特性。


圖1為對(duì)粗提液進(jìn)行離子交換色譜法的結(jié)果圖； 圖2為對(duì)圖1中陽離子峰進(jìn)行RP-HPLC的結(jié)果圖； 圖3為對(duì)本發(fā)明抗菌肽的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:血液的采集與處理
在健康奶牛屠宰后，通過無菌方法將其血液收集于含肝素(15IU/ml)的試 管中，置于冰浴中，于lh內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，立即用0.9%的滅菌生理鹽水洗滌紅細(xì) 胞3次，再用0.83%氯化銨溶液溶解紅細(xì)胞(體積比為3: 1)。于4'C 700xg離 心15min去除白細(xì)胞后，將含血紅素多肽的溶液經(jīng)凍干后再用0.01%乙酸溶解。
實(shí)施例2:抗菌肽的純化
用離子交換柱層析(陽離子肽的可逆吸附，而負(fù)離子固定的離子交換柱) 對(duì)粗提的血紅素溶液進(jìn)行分離其中的抗菌肽。將粗提的樣品通過離子交換柱。 陽離子復(fù)合物結(jié)合陰離子樹脂上，通過25mM乙酸銨洗去非陽離子分子，再通 過10%乙酸洗脫陽離子分子。將收集的溶液以20 mL/h的速率倒入柱子中，用 雙光束紫外可見分光光度計(jì)在波長為230nm處監(jiān)測(cè)其吸光度。分別收集洗脫峰 5mL/峰)，凍干，用0.01%乙酸重懸。結(jié)果分離后，共有4個(gè)峰，El為陰離子峰， E2、 E3和E4為陽離子峰，參見圖l，經(jīng)抗菌活性檢測(cè)(實(shí)施例3的方法)，發(fā) 現(xiàn)峰液El無抗菌活性，而峰液E2、 E3和E4具有抗菌活性。
將峰液E2、 E3和E4混合后用反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離有活性 的肽。用梯度化的30 35%乙腈和0.1%三氟乙酸在Jupiter (5U C18 300A)分 離柱上進(jìn)行，分別收集215nm處的肽，凍干，用0.01%醋酸溶解。分離后，共 有7個(gè)峰，參見圖2，分別檢測(cè)7個(gè)峰液的抗菌活性。實(shí)施例3:抗菌活性檢測(cè)
用平板擴(kuò)散法測(cè)定離子交換法和反相高效液相色譜法分離肽的抗微生物活
性(受試菌株為金黃色葡萄球菌NCTC 4163、大腸桿菌Olll和白色念珠菌 3135A)。
將上述3種受試微生物涂布在己消毒的含營養(yǎng)物質(zhì)的下層瓊脂培養(yǎng)基 (10mL胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉湯(為Cole-Parmer公司產(chǎn)品)，10g超純的 瓊脂(SigmaA-6013)， 1L蒸餾水，pH7.4)上，用打孔器打孔，孔徑約2mm， 酒精燈稍加熱進(jìn)行封底后，用移液器向每孔中加入濃度為0.8pg/ml的測(cè)試樣品 5pL,每個(gè)平板包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽性對(duì)照采用通用的抗生素多粘霉 素B針對(duì)革蘭陰性菌，尼生素(乳酸鏈球菌肽)針對(duì)革蘭陽性菌，制霉素針對(duì) 酵母。陰性對(duì)照采用0.01%醋酸，因?yàn)槭褂闷淙芙鈽悠?。將平板靜置lh，以使 測(cè)試液擴(kuò)散入瓊脂中。然后，再添加一層瓊脂培養(yǎng)基(5(TC左右，營養(yǎng)成分同 下層培養(yǎng)基)。平板在37'C培養(yǎng)過夜，第二天早晨，記錄孔周邊的透明圈的直 徑。
離子交換法獲得的4個(gè)峰液經(jīng)抗菌活性檢測(cè)后，僅陽離子峰具有較強(qiáng)的抗 菌活性(參見表l)。對(duì)HPLC分離后的7個(gè)峰液進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)峰4 對(duì)3種受試微生物具有較強(qiáng)的抗菌活性(參見表2)。因此，峰4所含的抗菌肽 (即本發(fā)明所述抗菌肽)可望在治療動(dòng)物細(xì)菌性疾病和真菌性疾病方面有著很 好的應(yīng)用前景。根據(jù)已知抗菌肽的一般特性，峰4所含抗菌肽在抗菌藥物的應(yīng) 用以及詞料防霉和牛奶保鮮等方面也具有一定的應(yīng)用潛能。
表1離子交換法粗提肽的抗菌活性單位nun
峰大腸桿菌金黃色葡萄球菌白色念珠菌
El000
E2960
E313116
E4790表2 RP-HPLC純化肽的抗菌活性 單位mm
峰大腸桿菌金黃色葡萄球菌白色念珠菌
Fl400
F2900
F31050
F488.56
F5840
F61030
F7930
實(shí)施例4:質(zhì)譜分析
通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜來分析純化肽的分子量大小。取
0.5pL峰4樣品(50pL總樣品，HPLC處理)和0.5 pL基質(zhì)(10mg/mL a-氰-4-羥基苯丙烯酸，用0.1%三氟乙酸和60%乙腈配制)置于不銹鋼片上，使其在室 溫下干燥。在陽離子極激發(fā)熒光閾值時(shí)用恒溫生物分析儀收集數(shù)據(jù)。在內(nèi)校正 的指示下，因電噴射的電離作用，樣品(對(duì)前樣品用50。/。MeCN進(jìn)行1: 1稀釋) 以3pL/min的速率直接注入質(zhì)譜儀(使用電噴射離子化探針)，噴射電壓設(shè)定 在5kV，鞘氣(N2)設(shè)定大約33單位，毛細(xì)管溫度在22(TC。通過一系列的掃 描收集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)取平均值后產(chǎn)生觀察的光譜值。
結(jié)果所分離的抗菌肽的分子量為2668.03 ，氨基酸序列為 Asn-Glu-Phe-Thr-Pro-Val-Leu-Gln-Ala-Asp國Phe-Gln曙L(fēng)ys-Val-Val誦Ala-Gly曙Val誦Ala-
Asn-Ala-Leu-Ala-His-Lys 。
實(shí)施例5:等電點(diǎn)分析
打開DNAStar軟件中EditSeq，打開file，點(diǎn)擊"new"中"new protien"，輸
入氨基酸序列，即可獲得等電點(diǎn)的數(shù)據(jù)。本分離肽的等電點(diǎn)為7.15。SEQUENCE LISTING
〈110〉河南科技學(xué)院
<120>奶牛血液中分離出的抗菌肽及其編碼序列和用途 <130〉天然抗茵肽的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景 〈160〉 1
<170〉 Patentln version 3.5
〈210〉 1
<211〉 25
〈212〉 PRT
〈213〉 奶牛
〈400〉 1
Asn Glu Phe Thr Pro Val Leu Gin Ala Asp Phe Gin Lys Val Val Ala 15 10 15
Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Lys 20 2權(quán)利要求
1.一種奶牛血液中分離出的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽具有下述氨基酸序列Asn-Glu-Phe-Thr-Pro-Val-Leu-Gln-Ala-Asp-Phe-Gln-Lys-Val-Val-Ala-Gly-Val-Ala-Asn-Ala-Leu-Ala-His-Lys，其分子量為2668.03，等電點(diǎn)pI為7.15。
2. 權(quán)利要求1所述的抗菌多肽的制備方法，其特征在于，該方法包括以下 步驟(1) 血液的采集與處理無菌條件下收集健康奶牛的血液于含肝素的試管 中，立即用0.9%的滅菌生理鹽水洗滌紅細(xì)胞2 4次，再用0. 83%氯化銨溶液溶 解紅細(xì)胞，于4°C下離心去除白細(xì)胞后，將含血紅素多肽的溶液經(jīng)凍干后再用 0.01%乙酸溶解；(2) 抗菌肽的純化將粗提的血紅素溶液通過離子交換柱，陽離子復(fù)合物 結(jié)合陰離子樹脂上，以25mM乙酸銨溶液洗去非陽離子分子，再以乙酸溶液洗脫 陽離子分子，并收集該洗脫液，將收集的洗脫溶液慢慢通入陽離子交換柱子中， 用雙光束紫外可見分光光度計(jì)在波長為230nm處監(jiān)測(cè)其吸光度，收集洗脫峰， 凍干，以0.01%乙酸重懸，在反相高效液相色譜上以梯度化的30 35%乙腈和0. 1% 三氟乙酸進(jìn)行，分別收集215nm處的肽，凍干，用0.01%醋酸溶解。
3. —種如權(quán)利要求1所述抗菌肽的用途，其特征在于，所述抗菌肽在制備 治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌或病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述抗菌肽的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物包括權(quán)利要 求1中的抗菌肽，并混合有一種或一種以上醫(yī)藥上可接受的載體和/或添加劑。
5. —種如權(quán)利要求1所述的抗菌肽的用途，其特征在于，所述抗菌肽在飼 料添加劑或食品添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從奶牛血液中分離出的具有抗菌活性的抗菌肽及其編碼序列和用途。所述抗菌肽具有序列表SEQ ID NO1中1至25位的氨基酸序列。該抗菌肽除具有一般抗菌肽抗菌譜廣、殺菌快速、高度的選擇性、不產(chǎn)生耐藥性、無致畸作用的共性之外，還具有下列特點(diǎn)(1)結(jié)構(gòu)簡單、人工合成方便，應(yīng)用于哺乳動(dòng)物無抗原性；(2)本發(fā)明抗菌肽分離于奶牛血液的紅細(xì)胞，而紅細(xì)胞為動(dòng)物血液成分之一，參與血液循環(huán)過程，不存在溶血毒性，或溶血率值極低。該抗菌肽可用于制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌或病毒感染的藥物，還可應(yīng)用于牛奶保鮮或其它食品防腐劑及飼料防霉劑等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C07K14/47GK101607992SQ20091006554
公開日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者劉興友, 理 楊, 杭柏林, 青 王, 王三虎, 王麗榮, 王自良, 胡建和, 坤 趙, 陳俊杰 申請(qǐng)人:河南科技學(xué)院