專利名稱：一種重組人胰島素及生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種藥物生產(chǎn)方法，具體是一種重組人胰島素及生產(chǎn)方法。
背景技術：
糖尿病是目前世界上嚴重危害人類健康的三大非傳染性疾病之一，隨著人們生活 水平和生活方式的不斷提高和改善，糖尿病的發(fā)病率一直以每年10%的速度上升。據(jù)統(tǒng)計， 目前全世界有糖尿病病人約2億人，我國也有5000萬以上的糖尿病患者；2010年我國發(fā)病 人數(shù)預計將達到6000萬；到2025年，我國糖尿病患者總數(shù)將接近1億，成為世界上糖尿病 患者人數(shù)僅次于印度的第二大國。就近幾年的胰島素市場來看，2003年全球胰島素市場已 達40多億美元(其中歐美市場胰島素銷售額達39億美金)，成為占有全球降血糖藥物市 場10%以上的重要品種。2005年，全世界胰島素市場將有約為50億美元的經(jīng)濟效益，其 中98%都是來自于人胰島素市場。全球人胰島素的生產(chǎn)廠家主要有美國Lilly公司、丹麥 NOVO公司和德國Aventis公司三家巨頭，大約占據(jù)人胰島素98%左右的市場份額。而在 中國市場，由于人胰島素價格高，動物胰島素的使用比例仍然較高，大概占了 60%左右的胰 島素市場；人胰島素國內(nèi)市場98. 5%以上的份額主要依賴進口。近幾年，由于瘋牛病以及 動物口啼疫等傳播性疾病的蔓延，使以動物源為輔料的胰島素產(chǎn)品逐漸進入淘汰之列。發(fā) 達國家的糖尿病患者已普遍使用人胰島素，隨著人們對糖尿病及其治療認識水平的逐步提 高，我國使用人胰島素的患者也將大幅度上升，重組人胰島素取代動物胰島素勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種明顯改善國內(nèi)糖尿病患者的用藥質(zhì)量。本發(fā)明是以如下 技術方案實現(xiàn)的(1)發(fā)酵及上游階段在產(chǎn)業(yè)化期間，為避免從100L放大10噸規(guī)模的過 程中出現(xiàn)的發(fā)酵罐溶氧不均一等異常情況，我們先從工作種子接種到5升搖瓶，培養(yǎng)到一 定濃度后轉(zhuǎn)接到100升種子罐，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)，將種子液轉(zhuǎn)接到1噸發(fā)酵罐中，并采 用高品質(zhì)進口全自動電腦控制發(fā)酵罐，根據(jù)重組人胰島素生產(chǎn)工藝要求設置各種參數(shù)，適 應1噸規(guī)模的生產(chǎn)需要。(2)在下游純化階段選購瑞典進口連續(xù)流離心設備，進行管道化 快速高效的自動化分離，保證了在較短的時間內(nèi)將菌體分離出來；同時，采用高品質(zhì)德國進 口勻漿設備，勻漿壓力可以達到lOOObar，一次破碎率可以達到96%，只需經(jīng)過一次高壓勻 漿，菌體破碎程度就能完全達到要求，離心收集后，可以得到純度超過60%的經(jīng)過改造的人 胰島素原。經(jīng)過離心分離技術初步提取的胰島素原經(jīng)過鹽酸胍變性、還原，然后通過獨特的 柱層析技術，一步就可以得到純度超過95%以上的經(jīng)過改造的人胰島素原，對改造的人胰 島素原進行高濃度快速復性，1噸培養(yǎng)罐產(chǎn)生的人胰島素原約為1. 3公斤，由于采用高濃度 的復性技術，復性后即可直接進行胰島素原的酶切處理(胰酶、羧肽酶)，將復性后的胰島 素原轉(zhuǎn)化為天然的人胰島素。工作時間較長的超濾濃縮或其它濃縮工藝，同時也避免了超 濾濃縮或其它濃縮工藝過程中的蛋白質(zhì)損失。酶切后即可切除前導肽以及A、B鏈之間的連 接肽，獲得與天然胰島素完全一致的產(chǎn)品。每升發(fā)酵液經(jīng)過下游分離純化以及復性酶切轉(zhuǎn)
3化后可獲得750毫克以上的高純度、高效價的人胰島素。因為我們成功的解決了工藝中的 復性、柱層析等關鍵技術，所以在采用一些先進的大規(guī)模處理設備后，可以保證工藝成功放 大。
具體實施例方式發(fā)酵及上游階段在產(chǎn)業(yè)化期間，為避免從100L放大10噸規(guī)模的過程中出現(xiàn)的溶 氧不均一等異常情況，我們先從工作種子接種到5升搖瓶，培養(yǎng)到一定濃度后轉(zhuǎn)接到100升 種子罐，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)，將種子液轉(zhuǎn)接到1噸發(fā)酵罐中，并采用高品質(zhì)進口全自動電 腦控制發(fā)酵罐，根據(jù)重組人胰島素生產(chǎn)工藝要求設置各種參數(shù)，適應1噸規(guī)模的生產(chǎn)需要。 之后到2007年，建成10規(guī)模生產(chǎn)線后，在1噸規(guī)模發(fā)酵罐操作成熟度的基礎上，建立10噸 大型發(fā)酵罐的工作參數(shù)。在下游純化階段因為規(guī)模放大必將帶來料液體積增加而造成后處理困難，我們 選購瑞典進口連續(xù)流離心設備，進行管道化快速高效的自動化分離，保證了在較短的時間 內(nèi)將菌體分離出來；同時，采用高品質(zhì)德國進口勻漿設備，勻漿壓力可以達到lOOObar，一 次破碎率可以達到96%，只需經(jīng)過一次高壓勻漿，菌體破碎程度就能完全達到要求，離心收 集后，可以得到純度超過60%的經(jīng)過改造的人胰島素原。經(jīng)過離心分離技術初步提取的胰島素原經(jīng)過鹽酸胍變性、還原，然后通過獨特的 柱層析技術，一步就可以得到純度超過95%以上的經(jīng)過改造的人胰島素原，采用我公司獨 創(chuàng)的復性工藝，對改造的人胰島素原進行高濃度快速復性，1噸培養(yǎng)罐產(chǎn)生的人胰島素原約 為1. 3公斤，按每0. 5公斤胰島素原復性體積1000升復性液計算，在2小時內(nèi)2600升的復 性體積即可完成復性。由于采用高濃度的復性技術，復性后即可直接進行胰島素原的酶切處理(胰酶、 羧肽酶)，將復性后的胰島素原轉(zhuǎn)化為天然的人胰島素。避免了其它公司因復性時蛋白質(zhì)濃 度低，復性后需要經(jīng)過工作量極大，工作時間較長的超濾濃縮或其它濃縮工藝，同時也避免 了超濾濃縮或其它濃縮工藝過程中的蛋白質(zhì)損失。酶切后即可切除前導肽以及A、B鏈之間 的連接肽，獲得與天然胰島素完全一致的產(chǎn)品。每升發(fā)酵液經(jīng)過下游分離純化以及復性酶切轉(zhuǎn)化后可獲得750毫克以上的高純 度、高效價的人胰島素。
權利要求
一種重組人胰島素及生產(chǎn)方法，其特征是，1)控制10噸發(fā)酵規(guī)模的工藝參數(shù)的穩(wěn)定，使收率保證達到180g菌體/L發(fā)酵液2)在高蛋白濃度情況下，進行高效率復性，復性效率超過90％；3)用酶切除C肽后，在大規(guī)模層析條件下，酶切收率大于95％。實現(xiàn)400kg的年生產(chǎn)力，總收率達75g/L以上，純度達99.5％以上，效價大于28.5U/mg，質(zhì)量符合美國藥典標準(27版)；獲得低精蛋白鋅重組人胰島素注射液(50R和30R)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人胰島素及生產(chǎn)方法，解決重組人胰島素從中試規(guī)模(100L)放大到小批量(1噸)生產(chǎn)，直至產(chǎn)業(yè)化(10噸)過程中的關鍵技術問題；(1)控制10噸發(fā)酵規(guī)模的工藝參數(shù)的穩(wěn)定，使收率保證達到180g菌體/L發(fā)酵液(2)在高蛋白濃度情況下，進行高效率復性，復性效率超過90％；(3)用酶切除C肽后，在大規(guī)模層析條件下，酶切收率大于95％。實現(xiàn)400kg的年生產(chǎn)力，總收率達75g/L以上，純度達99.5％以上，效價大于28.5U/mg，質(zhì)量符合美國藥典標準(27版)；獲得低精蛋白鋅重組人胰島素注射液(50R和30R)。
文檔編號C07K14/62GK101921332SQ20091003224
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月9日 優(yōu)先權日2009年6月9日
發(fā)明者許偉 申請人:許偉