專利名稱：快速清除多肽的生物動力學的制作方法
技術領域：
總體上本發(fā)明的領域涉及能與目標結合的多肽。更具體地，本發(fā)明的領域涉及顯 示有利生物動力學的低分子量結合劑，以及使用此類快速清除結合劑的成像方法。
背景技術：
可使用多種結合劑，例如抗體、親和體(affibody)、anticalin、適配體，實現(xiàn)與樣 品中目標的特異性結合。高分子量結合劑例如抗體不適合某些體內應用(例如成像應用)， 因為其花費很長時間遷移到目標位點，組織穿透性不佳，在對象體內停留很長時間，且主要 通過肝清除，與較小結合劑相比更有可能產生免疫應答。因此，對于某些體內應用，低分子 量、快速清除的結合劑是優(yōu)選的，因為其快速遷移到目標位點、組織穿透性、以及從體內快 速清除。一種快速清除的結合劑為親和體，其為一種基于蛋白A的ζ結構域的7kDa多肽。 親和體均共享一種共同的3螺旋蛋白折疊。使用噬菌體或酵母展示技術將IgG結合表面的 13個氨基酸殘基隨機化產生抗新目標的親和體。親和力成熟的蛋白產生為單個7kDa結構 域(單價親和體)或者兩個串聯(lián)7kDa結構域(二價親和體)。因為組織穿透性和低抗原性而特別適合某些體內應用的快速清除結合劑仍然可 能以干擾所需應用的方式從體內清除。例如，通過肝清除可干擾基于肝的成像應用；通過腎 清除放射性同位素標記的結合劑可導致對腎不可接受的放射劑量；或者從血液快速清除可 能需要減速以實現(xiàn)難進入組織的穿透。因此，需要改變快速清除結合劑的生物動力學的方法。此外，需要快速清除的生物 動力學調整的結合劑用于體內成像，其可用于臨床前或診斷成像的多種成像模式。

發(fā)明內容
本文提供了減少特異性結合目標的快速清除多肽肝攝取的方法，其包含提供一 種特異性結合目標的多肽；以及用酸性氨基酸殘基替換至少一個堿性或至少一個中性氨 基酸殘基以產生一種修飾多肽，其中所述修飾多肽的等電點低于天然多肽的等電點至少 0. 05-0. IpH 點。在某些實施方案中，所述修飾多肽的血液半衰期與天然多肽的血液半衰期基本相 同，而所述修飾多肽肝攝取與天然多肽相比大大減少。在某些實施方案中，所述多肽主要由包含α螺旋折疊的約60個氨基酸殘基或包 含成對α螺旋折疊片段的約120個氨基酸殘基組成。替代性地，所述多肽可主要由包含β 桶型折疊的約160個氨基酸殘基組成。在所有實施方案中，所述修飾多肽保持對其天然目標的結合親和力，因此，以未修 飾多肽的至少50%、75%、90%的特異性結合所述目標。在某些實施方案中，所述堿性氨基酸殘基選自組氨酸、賴氨酸和精氨酸，所述酸性 氨基酸殘基選自天冬氨酸或谷氨酸。所述中性氨基酸殘基可選自除組氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸之外的任何氨基酸殘基，所述酸性氨基酸殘基選自天冬氨酸或谷氨 酸，及其衍生物。所述修飾多肽可附加信號發(fā)生源，例如放射性、熒光、磁性、射線不透性("mTc或 18F)、冷光、磷光、同位素、或超聲不透性信號發(fā)生源。可選地或另外地，所述修飾多肽附加靶 向部分。本文還提供了根據所公開的方法生產的多肽，包括主要由SEQ ID號碼1-9的氨基 酸殘基組成的分離的多肽。還提供了包含本發(fā)明的修飾多肽的藥用組合物。本文還提供了包含所述修飾多肽和信號發(fā)生源的體內成像制劑。本文還提供了在使用結合目標的多肽進行體內成像程序期間降低肝背景噪聲的 方法。


圖1顯示了根據本文教導修飾的5種單體親和體的血液清除率。保留在血液(在 循環(huán)中)中的親和體總注射量百分比顯示于y軸。注射后時間顯示于χ軸。數據顯示盡管 序列變異，所述親和體顯示出相似的清除率特性。圖2顯示了 5種單體親和體的腎和肝清除率。肝(組2A)和腎(組2B)的保留在 每克組織中的親和體總注射量百分比對注射后耗用的時間作圖顯示。數據顯示大范圍的保 留值，顯示在所述親和體組中的序列可變性足以將其導向肝或腎清除。圖3顯示了肝和腎介導的親和體清除的相關性。兩者反向相關，顯示所述親和體 由肝和腎從血流中去除，在所述親和體組中的序列變異足以將所述清除以這樣或那樣的方 式轉變。圖4顯示了肝攝取與等電點的相關性。等電點和注射后2小時觀察到的肝保留作 圖，并擬合線性回歸。所述相關性的r平方值大于0. 98。圖5顯示了 2種二聚體親和體的血液清除率。保留在血液(在循環(huán)中)中的親和 體總注射量百分比顯示于y軸。注射后時間顯示于χ軸。數據顯示盡管序列不同，所述親 和體顯示出相似的清除率特性。圖6顯示了二聚體親和體的腎和肝清除率。肝(左)和腎(右)的保留在每克組 織中的親和體總注射量百分比對注射后耗用時間作圖顯示。數據顯示大范圍的保留值，顯 示在所述親和體組中的序列可變性足以將其導向肝或腎清除。圖7顯示了肝攝取與等電點的相關性。等電點和注射后2小時觀察到的肝保留證 實使用等電點導向從特定器官的清除是有效的，還可用于指導候選制劑選擇或淘汰目的。詳細說明在第一方面，本發(fā)明提供了一種減少特異性結合目標的多肽體內肝攝取的方法， 其包含(a)提供特異性結合目標的多肽；以及(b)用酸性氨基酸殘基替換步驟(a)中天然多肽的至少一個堿性氨基酸殘基或至 少一個中性氨基酸殘基以產生修飾多肽，其中所述修飾多肽的等電點低于步驟(a)中天然多肽的等電點至少0. 05-0. IpH
點ο
術語“氨基酸”系指天然存在和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸以相似方 式作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸為遺傳密碼編碼的氨基酸，以 及后來修飾的氨基酸，例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、0-磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸和磷酸 酪氨酸。本文定義的氨基酸類別并不互相排斥。因此，具有側鏈顯示兩種或更多種物理-化 學性質的氨基酸可包括在多個類別中。例如，具有芳香基團的氨基酸側鏈進一步被極性取 代基取代，例如Tyr (Y)，可同時表現(xiàn)出芳香疏水性和極性或親水性，因此可包括在芳香和極 性兩個類別中。根據本文提供的詳細公開，任何氨基酸的適當分類對本領域技術人員是顯 而易見的。“酸性氨基酸”系指具有側鏈PK值低于7的親水氨基酸。堿性氨基酸在生理pH 由于酸根的電離通常具有帶負電荷的側鏈。“堿性氨基酸”系指具有側鏈PK值高于7的親 水氨基酸。堿性氨基酸在生理PH由于與水合氫離子結合通常具有帶正電荷的側鏈。遺傳 編碼的堿性氨基酸包括His (H)、Arg (R)和Lys⑷。“中性氨基酸”系指非堿性或非酸性的 氨基酸，并因此在生理條件下實際上是非電離的。酸性、堿性和中性氨基酸的具體示例詳見 表2(下面)?！敖Y合目標”系指可被結合物結合的任何制劑。結合目標可包括一種或多種多肽、 蛋白質(例如抗體)、核酸(例如多核苷酸、DNA、RNA、或適配體)；多糖(例如凝集素或糖)、 脂、酶、酶底物、配體、受體、抗原或半抗原。所述目標可包括分離的化學基團或三維結構組 分(例如由肽折疊形成的3D結構)?！敖Y合”系指結合劑優(yōu)先結合目標的能力，其親和力比結合除預定目標或密切相關 目標以外的非特異性目標(例如BSA或酪蛋白)的親和力高至少兩倍。本文提供的結合劑 結合其各自目標的親和力KD值低于約1 X lOl1，更優(yōu)選地低于約1 X lOl1，最優(yōu)選地低于 約1Χ108ΜΛ類似地，“特異性結合”系指結合劑結合預定抗原的屬性，其親和力KD值低于 約 1Χ107ΜΛ當用于本文時，短語“血液半衰期”系指當消除為一級或準一級時，一種制劑的血 漿濃度降低一半所需的時間。對于多個衰減階段，術語“血液半衰期”系指表觀半衰期(如 果不同階段的衰減半衰期相似)，或者顯性半衰期(表明總清除)，如果不同半衰期不相似。當用于本文時，術語“熒光團”系指一種化學化合物，其暴露于特定波長的光被激 發(fā)時發(fā)光(在不同波長)。熒光團可以其發(fā)光性質或“顏色”描述。綠色熒光團(例如Cy3、 FITC和俄勒R綠)的特征在于其發(fā)光波長通常在515-540納米范圍內。紅色熒光團(例 如德州紅、Cy5、和4甲基羅丹明)的特征在于其發(fā)光波長通常在590-690納米范圍內。熒 光團的示例包括4_乙酰氨基4'-異硫氰酸根合芪_2，2' d 二磺酸，吖啶；吖啶和吖啶異 硫氰酸酯的衍生物；5_(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS) ；4-氨基_N_[3_乙烯基 磺?；?苯基]萘二酰亞胺-3，5 二磺酸酯(熒光黃VS) ；N-(4-苯胺基1-萘基)馬來酰 亞胺；鄰氨基苯甲酰胺；亮黃；香豆素；香豆素衍生物；7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素 120) ；7-氨基-三氟甲基香豆素(香豆素151)；焰紅染料；4'，6-diaminidino-2-苯基吲 哚(DAPI)、5'，5〃 - 二溴連苯三酚-磺酞(溴鄰苯三酚紅)；7_ 二乙基氨基-3-(4'-異 硫氰酸根合苯基)4-甲基香豆素；4，4' -二異硫氰酸根合二氫-芪_2，2' -二磺酸、4， 4' -二異硫氰酸根合芪_2，2' -二磺酸、5-[二甲基氨基]萘1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)； 曙紅；曙紅衍生物例如曙紅異硫氰酸酯；赤蘚紅；赤蘚紅衍生物例如赤蘚紅B和赤蘚紅異硫 氰酸酯；乙啡啶；熒光素及衍生物例如5-羧基熒光素(FAM) ；5-(4，6_ 二氯三嗪2-基)氨基熒光素(DTAF) ;2'，7' -二甲氧基-4' 5' -二氯_6_羧基熒光素(JOE)、熒光素異硫 氰酸酯(FITC) ；QFITC(XRITC)；熒光胺衍生物(與胺反應時放熒光)；IR144 ;IR1446 ；孔雀 石綠異硫氰酸酯；4-甲基傘形酮；正甲酚酞；硝基酪氨酸；堿性副品紅；酚紅、B-藻紅蛋白； ο-鄰苯二甲醛衍生物(與胺反應時發(fā)熒光)；芘及衍生物例如芘、丁酸芘、和琥珀酰亞胺基 1- 丁酸芘；活性紅4(Cibacron. RTM.亮紅3B-A)、羅丹明及衍生物例如6-羧基-X-羅丹明 (R0X)、6-羧基羅丹明(R6G)、麗絲胺羅丹明B磺酰氯、羅丹明(Rhod)、羅丹明B、羅丹明123、 羅丹明X異硫氰酸酯、磺基羅丹明B、磺基羅丹明101和磺基羅丹明101的磺酰氯衍生物 (德州紅)；N，N, N'，N'-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA) ；4甲基羅丹明、4甲基羅丹明 異硫氰酸酯(TRITC)；核黃素；玫紅酸和鑭系元素螯合物的衍生物、量子原子團、花青和方 ■ (squaraines)0當用于本文時，術語“等電點”系指分子不攜帶凈電荷時的pH。等電點可通過實驗 確定，或者對于多肽可基于一級序列計算。術語“天然多肽”意為以未修飾形式特異性結合目標的多肽。當用于本文時，術語“順磁性金屬離子”、“順磁性離子”或“金屬離子”系指對磁場 平行或反平行磁化至與該磁場成一定程度的比例的金屬離子。通常，這些是具有不成對電 子的金屬離子。合適的順磁性金屬離子的示例包括，但不限于，釓III[Gd3+或Gd(III)]、鐵 III [Fe3+或Fe (III)]、錳 II [Mn2+或Mn (II)]、釔 III [Yt3+或 Yt (III)]、鏑[Dy3+或Dy (III)]、 和鉻[Cr(III)或Cr3+]。在某些實施方案中，所述順磁性離子為鑭系元素原子Gd (III)，因 其高磁矩(u2 = 63BM2)、對稱性電子基態(tài)(S8)、以及目前許可其用于哺乳動物診斷?！靶蛄幸恢滦园俜直取币鉃橥ㄟ^在比較窗中比較兩個最佳排列序列所確定的值，其 中對于所述兩個序列的最佳排列，所述多核苷酸或多肽序列在比較窗中的部分與參考序列 (其不包含添加、替換或缺失)相比，可包含添加、替換或缺失(即缺口)。所述百分比計算 方法為，確定相同核酸堿基或氨基酸殘基在兩個序列中都出現(xiàn)的位點數量以產生匹配位點 的數量，匹配位點數量除以比較窗中位點總數，所得結果乘以100以產生序列一致性百分 比。術語“蛋白質”、“肽”和“多肽”用于本文時描述任何氨基酸鏈，無論其長度或翻譯 后修飾(例如糖基化或磷酸化)。因此，所述術語在本文可互換使用以指代氨基酸殘基的聚 合物。所述術語還適用于氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基酸殘基為相應天然氨基酸的 人工化學模擬物。因此，術語“多肽”包括全長、天然蛋白質，以及重組或合成產生的多肽，其 對應于全長天然蛋白質或天然蛋白質的特定結構域或部分。所述術語還包括成熟蛋白質， 其具有一個添加的氨基末端甲硫氨酸以促進在原核細胞中的表達。本發(fā)明的多肽可為化學 合成或通過重組DNA方法合成；或者可按照標準生物化學純化方法從其天然表達的組織中 純化。當用于本文時，術語“生理條件”系指哺乳動物體內通常出現(xiàn)的條件。因此，生理 條件意為PH約6. 5到約7. 5，以及溫度在約25°C到約37°C的范圍內。當用于本文時，術語“放射性核素”通常系指引入對象之后可被放射性檢測追蹤的 任何原子。代表性的放射性原子包括氟-18、錒-225、鉍-212、砷-72、銦-110、銦-111、 銦-113m、鎵-67、鎵-68、鍶-83、鋯-89、釕-95、釕-97、釕-103、釕-105、汞-107、汞-203、 錸-186、錸-188、硫-121m、硫 _122m、硫 _125m、銩-165、銩-167、銩-168、锝 _94m、锝 _99m、銀-111、鉬-197、鈀-109、銅-62、銅-64、銅-67、釔-86、釔-90、鈧-47、釤-153、镥-177、 銠-105、鐠-142、鐠-143、鋱-161、鈥-166、金-199、鈷-57、鈷-58、鉻-51、鐵-59、硒-75、 鉈-201、或鐿-169。術語“anticalin骨架”系指多肽的氨基酸殘基，其提供由一個或多個環(huán)連接的8 個反平行β鏈組成的圓柱形β桶的三維結構，以足夠容納具有目標結合環(huán)的桶型一端，因 此可結合目標。術語“親和體骨架”通常系指多肽的氨基酸殘基，其提供足夠容納所述多肽的結合 界面氨基酸殘基的三維結構，因此可結合目標。以相同拓撲結構(ζ-域3螺旋折疊)維持 結合位點和結合活性的任何序列都基于所述親和體骨架。術語“基本一致”或“同源”的多種語法形式在肽的語境下表明包含具有所需一致 性序列的肽，例如在特定比較窗中與參考序列有至少80 %、85 %、90 %、或95 %的序列一致 性。當用于本文時，術語“信號發(fā)生源”系指使用一種或多種檢測技術(例如光譜測 定、量熱法、光譜法或肉眼檢查)能提供可檢測信號的分子?？蓹z測信號的合適示例可包括 光信號、和電信號或放射性信號。用于所述創(chuàng)新方法的信號發(fā)生源的示例包括，例如，生色 團、熒光團、Raman活性標簽、放射性標記、酶、酶底物、或上述各項的組合。合適的放射性同
氟、溴和碘)同位素以及包括锝、釔、錸和銦的金屬也是有用的標記。可用作信號發(fā)生源的 優(yōu)選射電金屬包括99mTC、mIn、97RU、67CU、67Ga、68Ga、72AS、89&和2(I1T1?？捎米餍盘柊l(fā)生源的 優(yōu)選放射鹵素包括=123I和131L用于通過正電子成像術(“PET”)體內診斷成像的放射性 同位素包括"C、18F和1241。順磁性標記可為以金屬復合物或金屬氧化物顆粒形式存在的金 屬離子。合適的順磁性同位素可包括157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe。當用于本文時，術語“靶向基團”系指在蛋白質-蛋白質復合物中識別并特異性結 合一種或多種蛋白質的化學種類(即，有機分子或生物分子)。在一些實施方案中，所述靶 向基團能結合靠近或鄰近短暫反應(例如僅反應數秒或數分鐘)部分的蛋白質片段。實施方案本文提供了通過改變等電點調整蛋白質序列的生物動力學以增加或減少體內肝 和/或腎新陳代謝的方法。還提供了已使用本方法改變以表現(xiàn)改善生物動力學的多肽。進 一步提供了使用本文提供的多肽在體內成像的方法(例如臨床前成像或診斷成像)?？傮w上，本文提供的方法使本領域普通技術人員可通過改變多肽的等電點調整多 肽的生物動力學?？捎糜诎被崽鎿Q的方法包括通過本領域技術人員已知的多種方法誘 變編碼所述多肽的cDNA，所述誘變方法包括隨機誘變、定點誘變、以及使用易錯PCR誘變。 一種向結合界面位點引入隨機替換的方法為在所需替換的密碼子處使用包含簡并引物的 DNA。替代性地，可使用標準合成肽合成技術產生所述多肽。表1 (下面)提供了在多種類型的快速清除結合劑中替換類型的通常指導。變化 列表明對于對應類型的替換等電點轉變的方向。
初始替換變化影響
權利要求
一種減少特異性結合目標的多肽體內肝攝取的方法，其包含(a)提供一種特異性結合目標的多肽；以及(b)用酸性氨基酸殘基替換步驟(a)中天然多肽的至少一個堿性氨基酸殘基或至少一個中性氨基酸殘基以產生修飾多肽，且其中所述修飾多肽的等電點低于步驟(a)中天然多肽的等電點至少0.05 0.1pH點。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述修飾多肽以天然多肽的至少50%、75%、或 90%的特異性結合所述目標。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述堿性氨基酸殘基選自組氨酸、賴 氨酸和精氨酸，所述酸性氨基酸殘基選自天冬氨酸或谷氨酸。
4.根據權利要求1到3中任一權利要求所述的方法，其中所述中性氨基酸殘基選自除 組氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸之外的任何氨基酸殘基，且所述酸性殘基選自 天冬氨酸或谷氨酸，及其衍生物。
5.根據權利要求1到4中任一權利要求所述的方法，其中所述修飾多肽主要由SEQID 號碼1-8的氨基酸殘基組成。
6.根據權利要求1到5中任一權利要求所述的方法，其中所述修飾多肽進一步包含靶 向部分。
7.根據權利要求1到6中任一權利要求所述的方法，其中所述修飾多肽進一步包含信 號發(fā)生源。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述信號發(fā)生源選自放射性、熒光、磁性、射線不 透性、冷光、磷光、同位素、或超聲不透性信號發(fā)生源。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述信號發(fā)生源包含99mTc或18F。
10.一種修飾多肽，如權利要求1到6中任一權利要求所定義。
11.一種藥用組合物，其包含根據權利要求10所述的修飾多肽。
12.一種包含所述修飾多肽的診斷成像劑，所述修飾多肽帶有如權利要求7到9中任一 權利要求所定義的信號發(fā)生源。
13.根據權利要求12所述的診斷成像劑，其作為藥用組合物提供。
14.一種目標體內成像的方法，所述方法包含(a)作為成像程序的部分，將根據權利要求12或權利要求13所述的診斷成像劑引入哺 乳動物對象；以及(b)使所述對象成像。
全文摘要
本發(fā)明提供了減少特異性結合目標的多肽體內肝攝取的方法，其包含(a)提供一種特異性結合目標的多肽；以及(b)用酸性氨基酸殘基替換步驟(a)中天然多肽的至少一個堿性或至少一個中性氨基酸殘基以產生一種修飾多肽，其中所述修飾多肽的等電點低于天然多肽的等電點至少0.05-0.1pH點。還提供了使用所述創(chuàng)新方法生產的多肽，以及使用所述方法和制劑的成像技術。
文檔編號C07K16/28GK101952314SQ200880127378
公開日2011年1月19日 申請日期2008年12月17日 優(yōu)先權日2007年12月19日
發(fā)明者B·D-L·李, C·倫德爾, E·貢內里烏松, F·A·休德, J·W·卡斯特爾, M·E·馬里諾, M·林德博里 申請人:通用電氣公司