專利名稱：：超敏反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及肥大細(xì)胞活化調(diào)節(jié)劑，特別是它們在治療和預(yù)防超敏疾病和病癥中的用途。更具體地，本發(fā)明涉及能夠抑制和/或防止肥大細(xì)胞活化的蛋白和肽。背景在過去幾十年，工業(yè)化世界中與超敏反應(yīng)相關(guān)病癥的普遍性有顯著增加。特別地，最常見類型的超敏反應(yīng)相關(guān)病癥，IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，已經(jīng)在發(fā)展中國家影響到超過25%的人群。超敏反應(yīng)為免疫反應(yīng)不適當(dāng)?shù)仄鹱饔玫慕Y(jié)果，可由很多抗原引起。它們由幾種細(xì)胞類型釋放的炎性介質(zhì)的組合產(chǎn)生。當(dāng)IgE反應(yīng)針對無害的環(huán)境抗原如花粉或塵螨時(shí)，發(fā)生一種形式的超敏反應(yīng)。作為結(jié)果而發(fā)生的IgE致敏肥大細(xì)胞釋放藥理學(xué)介質(zhì)產(chǎn)生了急性炎性反應(yīng)，其具有諸如哮喘或鼻炎的癥狀。氣管炎癥為哮喘發(fā)病機(jī)理的核心，包括募集并活化肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞進(jìn)入肺組織和支氣管肺泡空間。肥大細(xì)胞被認(rèn)為是超敏反應(yīng)中的關(guān)鍵效應(yīng)子之一。這些細(xì)胞遍布整個(gè)身體，緊鄰血管、神經(jīng)、黏膜表面和皮膚。在這些部位，它們處于檢測抗原并通過它們釋放幾種炎性介質(zhì)的能力而引起最早期變應(yīng)性反應(yīng)的良好位置。肥大細(xì)胞為身體內(nèi)僅有的表達(dá)特異于IgE的受體的細(xì)胞之一，IgE為負(fù)責(zé)出現(xiàn)變應(yīng)性反應(yīng)和哮喘的免疫球蛋白。肥大細(xì)胞可通過多種刺激物活化，但是，最明確的是經(jīng)由抗原與結(jié)合至細(xì)胞表面其高親和性受體(FeεRI)的IgE的相互作用。由FcεRIα結(jié)合的IgE進(jìn)行的抗原檢測導(dǎo)致受體交聯(lián)以及隨后該相同受體的β和Y亞基的ITAM基序中酪氨酸殘基的磷酸化。接下來，F(xiàn)cεRI受體的聚集誘導(dǎo)了復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)途徑的活化，這涉及到多種細(xì)胞相互作用，其最后導(dǎo)致釋放預(yù)形成的顆粒和分泌類花生酸、細(xì)胞因子和趨化因子。肥大細(xì)胞活化導(dǎo)致引起全身和/或局部作用的一系列生物化學(xué)事件，它們通常在變應(yīng)性和過敏反應(yīng)中被觀察到。當(dāng)前的用于治療超敏反應(yīng)相關(guān)病癥的方法主要包括糖皮質(zhì)激素類和其它癥狀緩解藥物的組合。不同于直接靶向肥大細(xì)胞，這些治療旨在干擾下游炎性介質(zhì)的作用。諸如腎上腺皮質(zhì)激素的抗炎藥物以非選擇性方式影響到多種細(xì)胞功能。因此，長期的類固醇治療導(dǎo)致的并發(fā)癥限制了其臨床使用。亟需新的治療手段來治療超敏反應(yīng)相關(guān)疾病和病癥。特別地，需要新的靶向肥大細(xì)胞的治療手段，以便調(diào)節(jié)與變應(yīng)性反應(yīng)相關(guān)的炎性介質(zhì)的釋放。發(fā)明概述本文描述了之前未知的參與肥大細(xì)胞活化和超敏反應(yīng)發(fā)作的基因。這些基因編碼的蛋白包含Pleckstrin同源(PH)、Src同源2(SH2)或Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)。這些結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為通過與存在于肥大細(xì)胞表面的受體的特異相互作用來調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化。因此本發(fā)明的某些方面和實(shí)施方案涉及通過給予含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白來調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化。本文還描述了能夠調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化的對應(yīng)SH3和/或PH結(jié)構(gòu)域序列的肽。本文描述的肽提供了治療和預(yù)防超敏疾病和病癥的手段。在第一方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化的肽，所述肽包含對應(yīng)以下結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，或(ii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域。在第一方面的一實(shí)施方案中，所述肽包含SEQIDNO:7所示的氨基酸。在第一方面的另一實(shí)施方案中，所述肽包含SEQIDNO:8或SEQIDNOs14-273中任一所示的氨基酸。在第一方面的另一實(shí)施方案中，所述肽包含SEQIDN0:11或SEQIDN0:12所示的氨基酸。在第一方面的一實(shí)施方案中，所述肽包含SEQIDN0:10或SEQIDNOs274-488中任一所示的氨基酸。在第一方面的另一實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)抑制肥大細(xì)胞活化。在第二方面，本發(fā)明提供了抑制或預(yù)防個(gè)體中肥大細(xì)胞活化的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體治療有效量的蛋白，所述蛋白包含以下至少之一(i)Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域，(ii)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，(iii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域，(iv)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的肽。在第二方面的一實(shí)施方案中，所述肥大細(xì)胞活化為IgE介導(dǎo)的。在第二方面的另一實(shí)施方案中，所述肥大細(xì)胞活化為非IgE介導(dǎo)的。在第三方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防個(gè)體中超敏疾病或病癥的方法，所述方法包括向所述個(gè)體給予治療有效量的蛋白，所述蛋白包含以下至少之一(i)Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域，(ii)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，(iii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域，(iv)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的肽。在第三方面的一實(shí)施方案中，所述超敏疾病或病癥包括肥大細(xì)胞活化。在第三方面的另一實(shí)施方案中，所述超敏疾病或病癥包括炎性反應(yīng)。在第三方面的另一實(shí)施方案中，所述超敏疾病或病癥可以為過敏反應(yīng)、藥物反應(yīng)、皮膚變應(yīng)性、濕疹、變應(yīng)性鼻炎、蕁麻疹、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸過敏、食物變應(yīng)性、變應(yīng)性結(jié)膜炎、昆蟲毒液變應(yīng)性以及呼吸疾病和病癥。該呼吸疾病或病癥可以為哮喘、變應(yīng)性哮喘、內(nèi)源性哮喘、職業(yè)性哮喘、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(COPD)。在第四方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)個(gè)體中免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括向所述個(gè)體給予治療有效量的蛋白，所述蛋白包含以下至少之一(i)Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域，(ii)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，(iii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域，(iv)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的肽。在第四方面的一實(shí)施方案中，所述蛋白為NEDD9。在第四方面的一實(shí)施方案中，所述蛋白為PHLDA1。在第五方面，本發(fā)明提供了抑制或預(yù)防個(gè)體中肥大細(xì)胞活化的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體治療有效量的肽，所述肽包含對應(yīng)以下結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，或(ii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域。在第六方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防個(gè)體中超敏疾病或病癥的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體治療有效量的肽，所述肽包含對應(yīng)以下結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，或(ii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域。在第六方面的一實(shí)施方案中，所述超敏疾病或病癥包括肥大細(xì)胞活化。在第六方面的另一實(shí)施方案中，所述超敏疾病或病癥包括炎性反應(yīng)。在第六方面的其它實(shí)施方案中，所述超敏疾病或病癥選自過敏反應(yīng)、藥物反應(yīng)、皮膚變應(yīng)性、濕疹、變應(yīng)性鼻炎、蕁麻疹、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸過敏、食物變應(yīng)性、變應(yīng)性結(jié)膜炎、昆蟲毒液變應(yīng)性以及呼吸疾病和病癥。該呼吸疾病或病癥可以為哮喘、變應(yīng)性哮喘、內(nèi)源性哮喘、職業(yè)性哮喘、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(COPD)。在第七方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)個(gè)體中免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括向所述個(gè)體給予治療有效量的肽，所述肽包含對應(yīng)以下結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，或(ii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域。在第五、第六和第七方面的一實(shí)施方案中，所述肽包含SEQIDNO:7所示的氨基酸序列或變體。在第五、第六和第七方面的其它實(shí)施方案中，所述肽包含SEQIDNO:8所示的氨基酸序列或變體。在第五、第六和第七方面的另一實(shí)施方案中，所述肽包含SEQIDNO11所示的氨基酸序列。在第五、第六和第七方面的又一實(shí)施方案中，所述肽包含SEQIDN0:12所示的氨基酸序列或變體。在第八方面，本發(fā)明提供了抑制肥大細(xì)胞活化的方法，所述方法包括抑制(i)NEDD9蛋白Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域(ii)PHLDAl蛋白pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域之一或二者結(jié)合至肥大細(xì)胞受體。在第九方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防個(gè)體中超敏疾病或病癥的方法，所述方法包括抑制(i)NEDD9蛋白Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域(ii)PHLDAl蛋白pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域之一或二者結(jié)合至肥大細(xì)胞受體。在第八和第九方面的一實(shí)施方案中，所述抑制包括給予包含對應(yīng)NEDD9蛋白Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域或PHLDAl蛋白pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列的肽。該肽可以包含SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。該肽可以包含選自SEQIDNO10、SEQIDNO:11禾口SEQIDNO12的氨基酸。在第十方面，本發(fā)明提供了包含(i)Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域，(ii)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，(iii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域，(iv)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的肽中至少之一的蛋白在制備用于治療超敏疾病或病癥的藥物中的用途。在第十方面的一實(shí)施方案中，所述蛋白為NEDD9。在第十方面的另一實(shí)施方案中，所述蛋白為PHLDA1。在第十一方面，本發(fā)明提供了包含對應(yīng)(i)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，或(ii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列的肽在制備治療超敏疾病或病癥的藥物中的用途。在第^^一方面的一實(shí)施方案中，所述肽包含選自SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO11禾口SEQIDNO12的氨基酸序列。在第十和第i^一方面的一實(shí)施方案中，所述超敏疾病或病癥選自過敏反應(yīng)、藥物反應(yīng)、皮膚變應(yīng)性、濕疹、變應(yīng)性鼻炎、蕁麻疹、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸過敏、食物變應(yīng)性、變應(yīng)性結(jié)膜炎、昆蟲毒液變應(yīng)性以及呼吸疾病和病癥。所述呼吸疾病或病癥可以為哮喘、變應(yīng)性哮喘、內(nèi)源性哮喘、職業(yè)性哮喘、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(COPD)。在第十二方面，本發(fā)明提供了用于治療超敏疾病或病癥的蛋白，其包含以下至少之一(i)Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域，(ii)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，(iii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域，(iv)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的肽在第十三方面，本發(fā)明提供了用于治療超敏疾病或病癥的肽，其包含對應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，或(ii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域。在第十四方面，本發(fā)明提供了鑒定調(diào)節(jié)包含Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域、Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域或pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域至少之一的蛋白的活性的試劑的方法，所述方法包括(a)讓候選試劑與所述蛋白在適合于允許所述候選試劑與所述蛋白相互作用的條件下接觸；以及(b)測定所述蛋白的活性。在第十五方面，本發(fā)明提供了篩選多種候選試劑以鑒定調(diào)節(jié)包含Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域、Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域或pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域至少之一的蛋白的活性的試劑的方法，所述方法包括(a)讓多種候選試劑與所述蛋白在適合于允許所述候選試劑與所述蛋白相互作用的條件下接觸；以及(b)測定所述蛋白的活性。在第十四和第十五方面的一實(shí)施方案中，所述蛋白為NEDD9或PHLDA1。在第十四和第十五方面的另一實(shí)施方案中，測定所述蛋白的活性包括測量肥大細(xì)胞活化的水平。在第十四和第十五方面的其它實(shí)施方案中，所述候選試劑為所述蛋白的激動(dòng)劑。在第十四和第十五方面的其它實(shí)施方案中，所述候選試劑為所述蛋白的激動(dòng)劑?？s寫B(tài)匪C骨髓來源肥大細(xì)胞DEAE葡聚糖二乙基氨基乙基葡聚糖DNA脫氧核糖核酸DNP-IgE抗二硝基酚免疫球蛋白EdsRNA雙鏈RNAFc恒定片段FcεRIFcε受體I，高親和性IgE受體FcεRIα高親和性IgE受體的α亞基FcγRFcγ受體Fyn酪氨酸蛋白激酶FynIgE免疫球蛋白EIgG免疫球蛋白GIL-10白介素10ITAM基于免疫受體酪氨酸的活化基序kg千克LAMP-I脂質(zhì)體相關(guān)膜蛋白-ILAMP-2脂質(zhì)體相關(guān)膜蛋白-1Lck淋巴細(xì)胞特異的蛋白酪氨酸激酶Lyn蛋白酪氨酸激酶Lynm米mg毫克mRNA信使核糖核酸NEDD9神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育下調(diào)基因9PHpleckstrin同源PHLDAlpleckstrin同源樣結(jié)構(gòu)域家族A成員1PHRIP富含脯氨酸和組氨酸蛋白R(shí)BL-2H3細(xì)胞大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病2H3細(xì)胞RNA核糖核酸SDS-PAGE十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳SH2Src同源2結(jié)構(gòu)域SH3Src同源3結(jié)構(gòu)域siRNA小抑制RNATDAG51T細(xì)胞死亡相關(guān)基因51定義下文為一些定義，它們可能對于理解本發(fā)明的描述有幫助。它們旨在作為一般性定義，不應(yīng)將本發(fā)明的范圍僅限制于這些術(shù)語，它們是為了更好地理解以下描述而提供。除上下文另有要求或明確指出相反含義，本文中作為單數(shù)整數(shù)、步驟或元件陳述的整數(shù)、步驟或元件顯然包括所陳述的整數(shù)、步驟或元件的單數(shù)和復(fù)數(shù)形式。在整個(gè)本說明書中，除非上下文另有要求，措辭“包括(comprise)”或諸如“comprises”和“comprising”的變型應(yīng)理解為暗指包含所述步驟或元件或整數(shù)或成組的步驟或元件或整數(shù)，但是不排除任何其它步驟或元件或整數(shù)或成組的元件或整數(shù)。因而，在說明書上下文中，措辭“包括(comprising)”指“主要包括，但不必僅包括”。用在本文時(shí)，“試劑”在其范圍內(nèi)包括任何天然或制造的元素或化合物。因此，該術(shù)語包括但不限于任何化學(xué)元素和化合物、核酸、氨基酸、多肽、蛋白、抗體和抗體片段，以及其它的可能在本發(fā)明上下文中合適的物質(zhì)。用在本文時(shí)，術(shù)語“調(diào)節(jié)(modulating)”、“調(diào)節(jié)(modulates)”及其變型指，在本發(fā)明的特定調(diào)節(jié)分子或試劑存在下，分子的活性、產(chǎn)生、分泌或功能水平與該調(diào)節(jié)分子或試劑不存在下的其活性、產(chǎn)生、分泌或其它功能水平相比增加或降低。這些術(shù)語不隱含對增加或降低的量化。調(diào)節(jié)可以是任何足以產(chǎn)生期望結(jié)果的數(shù)量，并且可以是直接的或間接的。用在本文時(shí)，術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)劑”指一種或多種細(xì)胞類型分泌的且在免疫反應(yīng)的活化、維持、成熟、抑制、遏制或增強(qiáng)中起作用的分子介質(zhì)。用在本文時(shí)，術(shù)語“含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白”指含有以下一種或多種結(jié)構(gòu)域的蛋白(a)至少一個(gè)Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域，(b)至少一個(gè)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，(c)至少一個(gè)pleckstrin同源3(PH)結(jié)構(gòu)域。因此，含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白包括這樣的蛋白，其僅具有一個(gè)或多個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域，僅具有一個(gè)或多個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域，僅具有一個(gè)或多個(gè)PH結(jié)構(gòu)域，具有一個(gè)或多個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)或多個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域，具有一個(gè)或多個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域和一個(gè)或多個(gè)PH結(jié)構(gòu)域，或具有一個(gè)或多個(gè)SH2和一個(gè)或多個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)或多個(gè)PH結(jié)構(gòu)域。用在本文時(shí)，術(shù)語“肥大細(xì)胞活化途徑”在其范圍內(nèi)包括導(dǎo)致肥大細(xì)胞活化的發(fā)生在肥大細(xì)胞內(nèi)或表面上的生物學(xué)過程中的所有組分和步驟。一般地，肥大細(xì)胞的活化可以從外部刺激物開始，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級聯(lián)，其涉及一系列的細(xì)胞蛋白，例如磷酸酶、激酶以及接頭/調(diào)節(jié)因子，其引起肥大細(xì)胞活化。用在本文時(shí)，術(shù)語“給予(administering)，，以及該術(shù)語的包括“administer”和“administration”在內(nèi)的變型包括通過任何適當(dāng)?shù)氖侄巫尡景l(fā)明的化合物或組合物與有機(jī)體接觸、或?qū)⑵渫俊⑤斔突蛱峁┲劣袡C(jī)體。用在本文時(shí)，術(shù)語“抗體”包括IgG(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgAl和IgA2)、IgD、IgE、或IgM、以及IgY，完整抗體，包括單鏈完整抗體，及其抗原結(jié)合片段?？乖Y(jié)合抗體片段包括，但不限于，F(xiàn)ab、Fab'和F(ab')2、Fd、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、二硫化物連接的FvS(SdFv)和包含VL或VH結(jié)構(gòu)域的片段。抗體可以為任何動(dòng)物來源的。包括單鏈抗體在內(nèi)的抗原結(jié)合抗體片段可以僅包含可變區(qū)或連同完整或部分的以下成分鉸鏈區(qū)、CHI、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。還包括可變區(qū)和鉸鏈區(qū)、CHUCH2和CH3結(jié)構(gòu)域的任何組合。抗體可以是單克隆的、多克隆的、嵌合的、多特異性的、人源化的、以及人單克隆和多克隆抗體，其特異結(jié)合生物學(xué)分子。用在本文時(shí)，術(shù)語“核酸”指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有說明，還包括以類似于天然存在核苷酸的方式與核酸雜交的天然核苷酸的已知類似物。用在本文時(shí)，術(shù)語“多肽”或“肽”指通過肽鍵連接在一起的由氨基酸構(gòu)成的聚合物。術(shù)語“多肽”和“肽”在本文中可互換使用，盡管出于本發(fā)明的目的，“多肽”可以構(gòu)成全長蛋白的一部分。用在本文時(shí)，術(shù)語“多核苷酸”指脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸堿基或已知類似物或天然核苷酸或其混合物的單或雙鏈聚合物。用在本文時(shí)，遍及說明書使用的術(shù)語“突變”旨在包括任何和所有類型的功能性和/或非功能性核酸變化，包括與存在于樣品中的相同核酸區(qū)域或等位基因或更常見的核酸分子相比時(shí)，靶核酸分子中的突變和多態(tài)性。這類變化包括但不限于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的刪除、插入、易位、倒位和堿基取代。用在本文時(shí)，術(shù)語“多態(tài)性”指群體內(nèi)基因組中基因的序列內(nèi)的變異，例如等位基因變異和其它出現(xiàn)的或觀察到的變異。遺傳多態(tài)性指可作為核苷酸堿基對差異、可變mRNA剪接或翻譯后修飾包括例如糖基化結(jié)果的基因序列變異形式。因此，多態(tài)性指群體內(nèi)出現(xiàn)兩個(gè)或更多個(gè)遺傳上確定的可選序列或等位基因。這些差異可出現(xiàn)在基因組的編碼和非編碼部分，并且可作為差異而顯露或檢測到，所述差異在于核酸序列、基因表達(dá)，例如包括轉(zhuǎn)錄、加工、翻譯、輸送、蛋白加工、運(yùn)輸、DNA合成、表達(dá)的蛋白、其它基因產(chǎn)物或生化途徑的產(chǎn)物或翻譯后修飾以及任何其它顯露的差異。用在本文時(shí)，術(shù)語“治療”指任何以及所有的應(yīng)用，其補(bǔ)救疾病狀態(tài)或癥狀，或以任何其它方式預(yù)防、阻止、延緩或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展或其它不希望的癥狀。用在本文時(shí)，術(shù)語“個(gè)體”包括人和社會(huì)、經(jīng)濟(jì)或研究上重要的任何哺乳動(dòng)物物種的個(gè)體，包括但不限于以下屬綿羊、牛、馬、豬、貓、犬、靈長類和嚙齒類的成員。在一實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物為人。用在本文時(shí)，術(shù)語“有效量”和“治療有效量”在其含義內(nèi)包括無毒性但足夠提供期望治療效果的量的藥物或化合物。所需的確切量隨個(gè)體不同而變化，這取決于一些因素，例如所治療的物種、個(gè)體的年齡和總體狀況、所治療狀況的嚴(yán)重性、所給予的具體藥物和給藥模式等。因此，不可能指出確切的“有效量”。但是，對于任何給定病例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以僅采用任何常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定適當(dāng)?shù)摹坝行Я俊?。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，本文描述的發(fā)明可能有不同于所具體描述內(nèi)容的變型和改動(dòng)。應(yīng)理解本發(fā)明包括所有的這類變型和改動(dòng)。本發(fā)明還包括本說明書中個(gè)別或共同提及的或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及任何和所有組合的或任意兩種或更多種的所述步驟或特征。包括在本說明書中的任何對文獻(xiàn)、決議、原料、設(shè)備、制品等的討論僅出于為本發(fā)明提供背景的目的。不應(yīng)認(rèn)為是承認(rèn)任何或所有的這些材料形成了現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或者為本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中在本申請優(yōu)先權(quán)日之前所共知的一般知識(shí)。出于描述目的，將本文中提及的所有文獻(xiàn)通過引用并入。附圖簡要說明圖IA顯示人肥大細(xì)胞應(yīng)答IgE刺激的NEDD9相對基因表達(dá)時(shí)間進(jìn)程。圖IB顯示人肥大細(xì)胞應(yīng)答IgE刺激的PHLDAl相對基因表達(dá)時(shí)間進(jìn)程。圖IC顯示小鼠肥大細(xì)胞應(yīng)答IgE刺激的NEDD9相對基因表達(dá)時(shí)間進(jìn)程。圖ID顯示小鼠肥大細(xì)胞應(yīng)答IgE刺激的PHLDAl相對基因表達(dá)時(shí)間進(jìn)程。圖2A顯示RBL-2H3細(xì)胞應(yīng)答IgE刺激的相對NEDD9mRNA表達(dá)。結(jié)果表示為相對于未處理樣品值的相對倍數(shù)變化。圖2B顯示RBL-2H3細(xì)胞應(yīng)答離子霉素(ionomycin)刺激的相對NEDD9mRNA表達(dá)。結(jié)果表示為相對于未處理樣品值的相對倍數(shù)變化。圖2C顯示RBL-2H3細(xì)胞應(yīng)答IgE刺激的相對PHLDAlmRNA表達(dá)。結(jié)果表示為相對于未處理樣品值的相對倍數(shù)變化。圖2D顯示RBL-2H3細(xì)胞應(yīng)答離子霉素刺激的相對PHLDAlmRNA表達(dá)。結(jié)果表示為相對于未處理樣品值的相對倍數(shù)變化。圖3顯示在3種不同的靶向NEDD9基因表達(dá)的siRNAs存在下，與IgE孵育30分鐘的RBL-2H3細(xì)胞中肥大細(xì)胞脫粒百分比。不靶向任何基因的另外siRNA用作對照。圖4A顯示與陰性siRNA/DNP-IgE對照相比，給予針對NEDD9的siRNA與DNP-IgE的組合后，在Lewis大鼠中通過Evan藍(lán)恢復(fù)測量的肥大細(xì)胞脫粒程度。圖4B顯示與陰性siRNA/DNP-IgE對照相比，給予針對PHLDAl的siRNA與DNP-IgE的組合后，在Lewis大鼠中通過Evan藍(lán)恢復(fù)測量的肥大細(xì)胞脫粒程度。圖5顯示智人(Homosapiens)(HS)、小家鼠(Musmusculus)(MM)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)(RN)、黑猩猩(Pantroglodytes)(PT)、歐洲牛(Bostaurus)(BT)、家犬(Canisfamiliaris)(CF)和紅原雞(gallusgallus)(GG)中NEDD9SH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對。突出顯示的殘基指出推測的活性位點(diǎn)(HS、匪、RN、PT和BT中氨基酸9-28；CF中氨基酸殘基41-60；GG中氨基酸殘基41-59)。圖6為顯示活RBL-2H3細(xì)胞中生物素化MDDl攝取的柱狀圖，在以鏈霉親和素-APC細(xì)胞內(nèi)染色后通過FACS檢測。生物素化MDDl以0.OOlmMMDDl(2),0.OlmMMDDl(3)或0.ImMMDDl(4)的濃度給予細(xì)胞。對照細(xì)胞僅給予PBS(I)。圖7顯示MDDl肽對IgE受體交聯(lián)后RBL-2H3細(xì)胞脫粒的影響。(1)僅IgE包被(2)IgE包被+IgE受體交聯(lián)(3)MDDl肽(0.OlmM)預(yù)處理+IgE包被+IgE受體交聯(lián)(4)SCR肽0.OlmM預(yù)處理+IgE包被+IgE受體交聯(lián)。圖8顯示MDDl肽對卵清蛋白抗原(OVA)致敏小鼠肺功能的影響。對經(jīng)OVA鼻內(nèi)激發(fā)以誘導(dǎo)哮喘的小鼠，以8mg/kg靜脈內(nèi)共給予MDDl肽(A)或以lmg/ml鼻內(nèi)霧化共給予MDDl肽(B)。通過體積描記法測量肺阻力。RL:非阻力。圖9顯示哮喘誘導(dǎo)后OVA致敏小鼠中的炎性反應(yīng)水平。通過以β_乙酰甲膽堿激發(fā)，在經(jīng)鹽水、SCR對照肽或MDDl肽預(yù)處理的OVA致敏小鼠中誘導(dǎo)哮喘。(A)%血液中嗜酸性粒細(xì)胞⑶支氣管肺泡灌洗液中總細(xì)胞數(shù)(C)炎性病癥處的TNF表達(dá)和⑶血清中抗原特異IgE的水平。圖10顯示MDDl肽的局部給藥穩(wěn)定衍生自IgE受體交聯(lián)后IgE致敏小鼠的耳活檢組織的皮膚肥大細(xì)胞。小鼠左(L)耳僅以DMSO處理。右(L)耳以MDDl肽/DMSO或地塞米松/DMSO的混合物處理。圖11顯示MPX741和MPX742肽對IgE受體交聯(lián)后RBL-2H3細(xì)胞脫粒的影響。(1)僅IgE包被(2)IgE包被+IgE受體交聯(lián)(3)MPX741肽(0.OlmM)預(yù)處理+IgE包被+IgE受體交聯(lián)(4)MPX742肽0.OlmM預(yù)處理+IgE包被+IgE受體交聯(lián)。詳細(xì)說明細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為導(dǎo)致細(xì)胞活化的有序級聯(lián)事件。在大多數(shù)真核細(xì)胞中，這由主要由磷酸酶、激酶和接頭/調(diào)節(jié)因子組成的復(fù)雜蛋白網(wǎng)絡(luò)所推動(dòng)。通過促進(jìn)關(guān)鍵信號(hào)分子相互作用，接頭分子在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑中起了必不可少的作用。接頭分子內(nèi)的特異結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)促進(jìn)蛋白相互作用。這包括Src同源(SH)結(jié)構(gòu)域(例如Src同源2(SH2)和Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域)和pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域。在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)事件期間，Src同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合含磷酸酪氨酸的蛋白，觸發(fā)一系列的事件，導(dǎo)致對含Pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域的蛋白的募集。對含PH結(jié)構(gòu)域蛋白的募集又催化二級信使的產(chǎn)生，有助于信號(hào)級聯(lián)的持續(xù)。如本文所描述的，在肥大細(xì)胞活化期間，編碼含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域的蛋白的多個(gè)不同基因的表達(dá)改變了。確定在肥大細(xì)胞活化期間具有改變的表達(dá)的基因有NEDD9和PHLDA1，與靜息細(xì)胞相比，在活化的骨髓來源人肥大細(xì)胞中它們的表達(dá)都被上調(diào)。人NEDD9基因(神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育下調(diào)基因9)(GenBankIDs:NM_006403.2和ΝΜ_182966·2，EnsemblID:ENSG00000111859，Entrez基因ID4739和UniprotIDQ14511)，也稱為CasL(Crk相關(guān)底物淋巴細(xì)胞類型)和HEFl(人成絲增強(qiáng)子1)，編碼表達(dá)未加工的834氨基酸前體蛋白。NEDD9為多功能的錨定蛋白，參與傳播細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，并在多種組織內(nèi)的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和諸如高爾基體和板狀偽足的結(jié)構(gòu)中表達(dá)。NEDD9含有SH3結(jié)構(gòu)域和富含SH2結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域有利于與Lck、Lyn和Fyn以及其它細(xì)胞內(nèi)伙伴的高選擇性相互作用，其中Lck、Lyn和Fyn為位于包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和Fc受體在內(nèi)的表面受體下游的重要細(xì)胞內(nèi)角色。PHLDAl(Pleckstrin同源樣結(jié)構(gòu)域，家族A，成員1)(GenBankID:NM_007350,Ensembl基因ID:ENSG00000139289，Entrez基因ID-.22822)編碼蛋白PHLDAl(UniprotIDQ8WV24)，也稱為PHLAl、TDAG51(Τ細(xì)胞死亡相關(guān)基因51)和PHRIP(富含脯氨酸和組氨酸的蛋白)。PHLDAl含有pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域。PH結(jié)構(gòu)域以高親和力結(jié)合限制于細(xì)胞膜的磷酸肌醇(磷脂酰肌醇的磷酸化衍生物)。通過結(jié)合磷酸肌醇，含PH結(jié)構(gòu)域蛋白通常被募集至細(xì)胞膜，然后在這里它們在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮功能。在某些方面和實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了能夠調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化的肽。這些肽包含對應(yīng)SH3結(jié)構(gòu)域序列和/或PH結(jié)構(gòu)域序列的至少一部分的序列。優(yōu)選地，該SH3結(jié)構(gòu)域?yàn)镹EDD9SH3結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，該P(yáng)H結(jié)構(gòu)域?yàn)镻HLDAlPH結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的其它方面和實(shí)施方案中，提供了含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白，它們也能夠調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化。不限制于特定機(jī)制，認(rèn)為含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白(例如NEDD9和PHLDA1)通過它們的SH2結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域和/或PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合至在肥大細(xì)胞內(nèi)部具有對應(yīng)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異靶蛋白而調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活性。相應(yīng)地，本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和肽可以減弱、增強(qiáng)、阻止或以其它方式改變SH2結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域或PH結(jié)構(gòu)域與位于肥大細(xì)胞表面受體下游重要細(xì)胞內(nèi)角色如Lck、Lyn和Fyn的相互作用。因此，可以以本發(fā)明的肽和含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白給藥來調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化，從而提供治療和/或預(yù)防超敏疾病和病癥的手段。含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和競爭肽本文描述能夠調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白。根據(jù)本發(fā)明的方面和實(shí)施方案，能夠調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化的蛋白包含SH2、SH3或PH結(jié)構(gòu)域的至少之一。適合的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的實(shí)例包括但不限于NEDD9和PHLDAl。在本說明書上下文中，應(yīng)理解NEDD9蛋白包括該包含SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白的所有變體和亞型。NEDD9蛋白的亞型例如包括亞型1(Q14511)(REFSEQ登記號(hào)NM_006403.2)、亞型2(UniProt:Q5XKI0)、亞型CRA_a(UniProt識(shí)別號(hào)Q5T9R4)、和亞型CRA_c(REFSEQEAW55302.1)。其它的NEDD9蛋白變體例如列在UniProt數(shù)據(jù)庫中，包括蛋白(UniProtQ5TI59)。也涉及源自翻譯后修飾的NEDD9蛋白，例如亞型1蛋白pll5、pl05、p65和p55。類似地，在本說明書上下文中，應(yīng)理解PHLDAl蛋白包括該包含PH結(jié)構(gòu)域的蛋白的所有變體和亞型。因此，PHLDAl蛋白可以由EntrezGeneID22822描述的PHLDAl基因(Pleckstrin同源樣結(jié)構(gòu)域家族A成員1)編碼，其表達(dá)產(chǎn)生5913核苷酸的轉(zhuǎn)錄本(參見NCBIREFSEQ登記號(hào)NM_007350)，并且例如可翻譯成REFSEQ:NP_031376、REFSEQEAW97312.1或UniProt識(shí)別號(hào)Q8WV24指出的蛋白。也涉及Entrez數(shù)據(jù)庫中變體PHLDAlCRA_a(例如REFSEQ:AAH18929.3、AAI10821.1和AI26426.2)編碼的PHLDAl蛋白。本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白可以具有，但不限于，SEQIDNO:2或SEQIDN0:4所示的多肽序列。編碼本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的多核苷酸序列可以為SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示，或顯示出足夠的序列一致性以至于與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示的序列雜交。在可選擇實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的多核苷酸序列可以與SEQIDNO:1所示的序列和/或SEQIDNO:3所示的序列有至少40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性。根據(jù)其它方面和實(shí)施方案，本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白可以具有但不限于SEQIDNO:6所示的多肽序列。編碼本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的多核苷酸序列可以為SEQIDNO:5所示，或顯示足夠的序列一致性以至于與SEQIDNO:5的序列雜交。在可選擇實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的多核苷酸的核苷酸序列可以與SEQIDNO:5所示的序列有至少40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的一致性。本文描述了包含對應(yīng)于SH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分的序列的肽。優(yōu)選地，該SH3結(jié)構(gòu)域?yàn)镹EDD9SH3結(jié)構(gòu)域。本文還描述了包含對應(yīng)于PHLDAl蛋白PH結(jié)構(gòu)域的至少一部分的序列的肽。本發(fā)明的肽可以認(rèn)為是“競爭肽”，因?yàn)樗鼈兊男蛄兄辽俨糠謱?yīng)于部分或全部NEDD9SH3結(jié)構(gòu)域，或部分或全部PHLDA1PH結(jié)構(gòu)域。根據(jù)某些方面和實(shí)施方案，本發(fā)明的肽可以具有SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO=IUSEQIDNO:12禾口SEQIDNO13所示的序列。根據(jù)其它方面和實(shí)施方案，本發(fā)明的肽可以具有SEQIDNOS14-273中任一所示的序列。根據(jù)其它方面和實(shí)施方案，本發(fā)明的肽可以具有SEQIDNOS:274_488中任一所示的序列。一般而言，本發(fā)明的蛋白和為分離或純化形式。應(yīng)理解，包括在本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和肽范圍內(nèi)的有其變體和片段。用在本文時(shí)，術(shù)語“變體”指基本上相似的序列。通常，如果兩序列在特定區(qū)域上或未明確指出時(shí)在整個(gè)序列上具有特定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(“序列一致性”百分比)，則該兩序列為“基本上相似的”。因此，本文公開的多核苷酸和多肽序列的“變體”與參照序列有至少40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、83%、85%、88%、90%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性。通常，序列變體具有共同的定性生物學(xué)活性。多核苷酸序列變體一般編碼這樣的多肽，它們一般具有共同的定性生物學(xué)活性。本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和競爭肽的同源物也包括在術(shù)語“變體”的含義之內(nèi)。同源物通常來自不同科、屬或種，其具有與本文公開的對應(yīng)的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白或競爭肽基本上相同的生物學(xué)功能或活性。例如，含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白或競爭肽同源物可以包括，但不限于源自其它不同的哺乳動(dòng)物物種的那些。另外，術(shù)語“變體”也包括本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和肽的類似物。多肽“類似物”為這樣的多肽，其為本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的衍生物或本發(fā)明的肽的衍生物，該衍生物包括添加、刪除、置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，以至于該蛋白/肽基本上保留了相同功能。術(shù)語“保守氨基酸置換”指在本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白多肽鏈或本發(fā)明的肽內(nèi)以一個(gè)氨基酸置換或替換另一具有類似性能的氨基酸。例如，以帶電氨基酸谷氨酸(Glu)置換類似的帶電氨基酸天冬氨酸(Asp)為保守氨基酸置換。氨基酸添加可以產(chǎn)生自本發(fā)明的多肽與另一多肽或肽的融合，所述另一多肽或肽如多組氨酸標(biāo)簽、麥芽糖結(jié)合蛋白融合蛋白、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合蛋白、綠色熒光蛋白融合蛋白，或產(chǎn)生自添加表位標(biāo)簽如FLAG或c-myc。通常，可以改變本文描述的蛋白和肽的性能和特征，以便使得更適合特定治療應(yīng)用?？梢员桓纳频倪@類性能和特征的非限定性實(shí)例包括但不限于溶解性、化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性、細(xì)胞攝取、毒性、免疫原性以及降解產(chǎn)物的排泄?？梢愿纳票疚拿枋龅碾牡奶卣骱托阅艿姆椒ê褪侄螢楸绢I(lǐng)域所公知。例如，一種手段是搜尋并鑒定對特定性能為負(fù)面或正面決定基(determinant)的特定氨基酸殘基。這可以例如通過采用側(cè)鏈截短(side-chainamputation)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，其中沿肽序列以原始型殘基(prototypicresidue)L-丙氨酸一次一個(gè)地置換氨基酸。弄清關(guān)鍵決定位點(diǎn)為生成和測試在鑒定位點(diǎn)具有天然和非天然氨基酸置換的變體提供了基礎(chǔ)。顯示出期望的特征的先導(dǎo)肽可以用作設(shè)計(jì)具有改善的穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)性能的模擬態(tài)分子的模板。這種方法采用合理設(shè)計(jì)和分子模型指導(dǎo)的結(jié)構(gòu)修飾。這些包括但不限于構(gòu)象限制的建筑塊以及肽鍵等排物(參見，例如，Vagneretal,2008,"Peptidomimetics,asynthetictoolofdrugdiscover(模擬肽，藥物開發(fā)的合成工具)，，，CurrentOpinioninChemicalBiology,12-.292-296.)。兩序列之間的序列一致性百分比可以通過在比較窗口中比較兩最佳比對的序列來確定。比較窗口內(nèi)的序列部分可以例如相對于參照序列(例如，本文公開的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白或肽的多核苷酸或多肽序列)包括刪除或添加(即空位)(該參照序列不包括刪除或添加)，以便最佳比對兩序列。接著可這樣計(jì)算序列一致性百分比確定兩序列中均存在相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)量，以得到匹配位置數(shù)量，以匹配位置數(shù)量除以比較窗口內(nèi)的位置總數(shù)并將結(jié)果乘以100，得到序列一致性百分比。對于兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多肽序列，序列一致性百分比指，當(dāng)在比較窗口針對最大對應(yīng)比較并比對時(shí)，或采用以下的序列比較算法之一測量或通過手工比對并肉眼檢查而指定區(qū)域時(shí)，在指定區(qū)域上(或者，當(dāng)未指定時(shí)，在整個(gè)序列上)相同的氨基酸殘基或核苷酸的特定百分比。對于序列比較，典型地是，一個(gè)序列用作參照序列，測試序列與其比較。當(dāng)采用序列比較算法時(shí)，將測試和參照序列輸入計(jì)算機(jī)，視情況指定亞序列坐標(biāo)，并且指定序列算法程序參數(shù)?？墒褂媚J(rèn)程序參數(shù)，或者可指定可選擇參數(shù)。然后，序列比較算法基于程序參數(shù)計(jì)算測試序列相對于參照序列的百分比序列一致性。用于比較的序列比對方法在本領(lǐng)域中是公知的。可采用已知的計(jì)算機(jī)程序常規(guī)確定用于比較的序列的最佳比對，這些程序包括但不限于PC/Gene程序中的CLUSTAL(可從Intelligenetics，MountainView,California獲得)；ALIGN程序(2·0版)以及GCGWisconsin遺傳學(xué)軟件包，第10版(可從AccelrysInc.,9685ScrantonRoad,SanDiego,California,USA獲得)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTABESTFIT程序(Wisconsin序列分析包，Unix第8版，GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,575ScienceDrive,Madison,Wis.53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman的局部同源算法以發(fā)現(xiàn)兩序列之間的最佳同源片段(AdvancesinAppliedMathematics2:482-489(1981))。當(dāng)采用BESTFIT或任何其它序列比對程序來確定兩序列之間的同源程度時(shí)，可以設(shè)置參數(shù)以使得一致性百分比在參照序列的全長上計(jì)算，以及允許至多參照序列中核苷酸或氨基酸殘基總數(shù)的5%的同源空位。GAP采用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443-453中描述的算法來發(fā)現(xiàn)匹配數(shù)最大化且空位數(shù)最小化的兩完整序列比對。GAP考慮所有可能的比對和空位位置，并生成具有最大數(shù)量的匹配堿基和最少空位的比對。它允許提供空位生成罰分和以匹配堿基為單位的空位延伸罰分。GAP顯示最佳比對家族的一個(gè)成員。確定查詢序列和目標(biāo)序列之間的最佳整體匹配的另一方法，也稱為全局序列比對，可采用基于Brutlag及其同事的算法的FASTDB計(jì)算機(jī)程序(Comp.App.Biosci.6237-245(1990))來確定。在序列比對中，查詢和目標(biāo)序列都為DNA序列。可通過將U轉(zhuǎn)變?yōu)門來比較RNA序列。所述全局序列比對的結(jié)果示為百分比一致性。BLAST和BLAST2.O算法可以用來確定百分比序列一致性和序列相似性。它們分別在Altschuletal.(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389_3402和Altschuletal(1990)J.Mol.Biol.215403-410中有說明。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件為公眾可從NationalCenterforBiotechnologyInformation(國家生物技術(shù)信息中心)獲得的。這種算法包括首先鑒定高得分序列對(HSPs)，這通過在查詢系列中鑒定長度W的短字(shortwords)來進(jìn)行，當(dāng)在數(shù)據(jù)庫序列中與相同長度的字比對時(shí)，它們或者匹配或者滿足某種正值的閾值得分Τ。T稱為鄰字得分閾值(neighbourhoodwordscorethreshold)(Altschuletal，同上)。這些最初的鄰字命中用作起始查詢的種子以發(fā)現(xiàn)含有它們的更長HSPs。這些字命中沿每一序列雙向延伸，只要累積比對得分可增加。對于核苷酸序列，累積得分采用參數(shù)M(對于成對的匹配殘基的獎(jiǎng)賞分；總是>0)和N(對于錯(cuò)配殘基的罰分；總是<0)計(jì)算。對于氨基酸序列，得分矩陣被用于計(jì)算累積得分。當(dāng)出現(xiàn)以下情況時(shí)，每一方向上的字命中延伸停止累積比對得分從其最大獲得值減小數(shù)量X；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)分殘基比對積累導(dǎo)致累積得分變?yōu)榱慊蛞韵?；或到達(dá)任一序列的末端。該BLAST算法參數(shù)W、T和X確定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用默認(rèn)字長(W)ll，期望值(E)10，M=5，N=-4，以及兩條鏈比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序采用默認(rèn)字長3，期望值(E)10，以及BLOSUM62得分矩陣(參見HenikoffandHenikoff(1989)Proc.Natl,Acad.Sci.USA89:10915)比對(B)50，期望值(E)10，M=5，N=-4，以及兩條鏈比較。BLAST算法也進(jìn)行兩序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)分析(參見，例如Kar1inandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sd.USA90:5873_5787)。BLAST算法提供的對相似性的一種衡量是5最小和概率(P(N))，其提供對兩核苷酸或氨基酸序列之間偶然匹配的概率的指示。例如，當(dāng)測試核酸與參照核酸比較的最小和概率小于約0.2、更優(yōu)選小于約0.01、且最優(yōu)選小于約0.001時(shí)，認(rèn)為測試核酸類似于參照核酸。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和肽的片段?！捌巍睘槎嚯姆肿?，其編碼或?yàn)楸景l(fā)明含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和/或肽或其變體的組成部分。該片段通常具有與其作為組成部分的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和/或肽共同的定性生物學(xué)活性。該肽片段可以為約3至約2000氨基酸長度，約3至約1750、約3至約1500氨基酸長度，約3至約1250氨基酸長度，約3至約1000氨基酸長度，約3至約950氨基酸長度，約3至約900氨基酸長度，約3至約850氨基酸長度，約3至約800氨基酸長度，約3至約750氨基酸長度，約3至約700氨基酸長度，約3至約650氨基酸長度，約3至約600氨基酸長度，約3至約550氨基酸長度，約3至約500氨基酸長度，約3至約450氨基酸長度，約3至約400氨基酸長度，約3至約350氨基酸長度，約3至約300氨基酸長度，約3至約250氨基酸長度，約3至約200氨基酸長度，約3至約150氨基酸長度，約3至約125氨基酸長度，約3至約100氨基酸長度，約3至約75氨基酸長度，約3至約50氨基酸長度，約3至約40氨基酸長度，約3至約35氨基酸長度，約3至約30氨基酸長度，約3至約25氨基酸長度，約3至約20氨基酸長度，約3至約15氨基酸長度，約3至約10氨基酸長度，約3至約7氨基酸長度，約5至約10氨基酸長度，約5至約15氨基酸長度，約5至約20氨基酸長度，約5至約25氨基酸長度，約5至約30氨基酸長度，約5至約35氨基酸長度，約8至約12氨基酸長度，約8至約15氨基酸長度，約8至約20氨基酸長度，約8至約25氨基酸長度，以及約8至約30氨基酸長度。還涉及本文公開的多核苷酸的片段。多核苷酸“片段”為多核苷酸分子，其編碼或?yàn)楸景l(fā)明多核苷酸或其變體的組成部分。多核苷酸片段可以或可以不編碼保留了生物學(xué)活性的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白或肽。根據(jù)本發(fā)明使用的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白或肽的生物學(xué)活性片段通?？梢跃哂袑?yīng)全長蛋白的免疫調(diào)節(jié)活性的至少約50%，更通常具有至少約60%的這種活性，更通常具有至少約70%的這種活性、更通常具有至少約80%的這種活性、更通常具有至少約90%的這種活性、且更通常具有至少約95%的這種活性。該片段例如可用作雜交探針或PCR引物。該片段可以源于本發(fā)明的多核苷酸或可以通過一些其它手段、例如化學(xué)合成而合成。本發(fā)明含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和肽的變體可通過誘變生成。誘變可以針對本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白或肽，或編碼核酸，其例如采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法通過隨機(jī)誘變或定點(diǎn)誘變進(jìn)行。這類方法例如在CurrentProtocolsInMolecularBiology(現(xiàn)代分子生物學(xué)規(guī)程)(第9章)，Ausubeletal，1994，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork中有描述，在此通過引用將其公開內(nèi)容并入本文。本文描述的變體和類似物也包括與其它化學(xué)部分復(fù)合的多肽、融合蛋白或以其它方式翻譯后修飾的多肽。此外，含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白、肽及其片段或變體可以具有其它的翻譯后修飾，包括側(cè)鏈修飾如乙?；?、脒基化、甲氨?；⑦€原烷基化和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它修飾。含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白、肽及其變體或片段可以采用本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法獲得。例如，本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白、肽及其變體或片段可以采用標(biāo)準(zhǔn)重組核酸技術(shù)獲得，或者可以例如采用常規(guī)液相或固相合成技術(shù)合成。本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和肽可以例如通過以一種或多種諸如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8蛋白酶的蛋白酶消化多肽而產(chǎn)生。所消化的肽片段可以通過例如高效液相色譜(HPLC)技術(shù)純化。重組蛋白產(chǎn)生技術(shù)一般可以包括將編碼含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的基因或編碼本文描述的肽的序列克隆進(jìn)用于隨后在適合的微生物內(nèi)過表達(dá)的質(zhì)粒中。構(gòu)建表達(dá)載體或質(zhì)粒的適當(dāng)方法例如在標(biāo)準(zhǔn)教科書中有詳細(xì)描述，例如Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)，ColdSpringHarbor,NewYork,1989,禾口Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology(現(xiàn)代分子生物學(xué)規(guī)程)，JohnWileyandSons,copyright2007。產(chǎn)生本發(fā)明的重組的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和肽的方法例如在標(biāo)準(zhǔn)教科書中有詳細(xì)描述，例如Coliganetal.,CurrentProtocolsinProteinScience(現(xiàn)代蛋白科學(xué)規(guī)程)，(第5章)，JohnffileyandSons,Inc.,copyright2007,以及PharmaciaBiotech.,TheRecombinantProteinHandbook(M^lSS)1994,PharmaciaBiotech?？捎糜诋a(chǎn)生本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和肽的常用表達(dá)系統(tǒng)包括例如細(xì)菌(如，大腸桿菌(E.coli))、酵母(如，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)曲霉菌(Aspergillus)，巴斯德畢赤酵母(Pichiapastorisis))、病毒(如，桿狀病毒和牛痘病毒)、細(xì)胞(如，哺乳動(dòng)物和昆蟲的)以及無細(xì)胞系統(tǒng)。也可以采用例如Madinetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.97:559_564(2000),PelhamandJackson,Eur.J.Biochem.,67247-256(1976),RobertsandPaterson,Proc.Natl.Acad.Sci.,70:2330_2334(1973)，Zubay,Ann.Rev.Genet.,7:267(1973),GoldandSchweiger,Meth.Enzymol.,20537(1971)，Lesleyetal.，J.Biol.Chem.，266(4):2632_2638(1991)，Baranovetal.，Gene,84463-466(1989)以及Kudlickietal.,Analyt.Biochem.，206:389_393(1992)中描述的方法，使用無細(xì)胞系統(tǒng)，例如真核兔網(wǎng)狀細(xì)胞、麥芽提取物系統(tǒng)和原核E.coli無細(xì)胞系統(tǒng)。本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和競爭肽(以及每一種的片段和變體)可以采用本領(lǐng)域公知的液相和固相化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法合成(參見，例如Hackengetal.,ProcNatlAcadSciUSA.96(18)10068-73(1999)，以及StewardandYoung,SolidPhasePeptideSynthesis(固相肽合成)(第二版)，PierceChemicalCo.，Illinois,USA(1984)。一般而言，這種合成方法包括向生長肽鏈順序添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸或適當(dāng)保護(hù)的氨基酸。第一氨基酸的氨基或羧基基團(tuán)一般被適合的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。然后經(jīng)保護(hù)的氨基酸連接至惰性固體支持物，或者在適合于形成酰胺鍵的條件下，通過添加互補(bǔ)(氨基或羧基)基團(tuán)被適當(dāng)保護(hù)的序列中的下一氨基酸而在溶液中使用。接著從該新添加的氨基酸殘基中除去保護(hù)基團(tuán)，并添加下一(受保護(hù)的)氨基酸，以此類推。當(dāng)所有期望的氨基酸都已連接后，順序或同時(shí)除去任何剩余的保護(hù)基團(tuán)以及任何固體支持物(有必要的話)，以生成最后的多肽。可通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對本發(fā)明含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和肽的氨基酸序列的改變。例如，只要保持了正確的閱讀框?？梢酝ㄟ^包括添加、刪除或置換核苷酸(保守和/或非保守的)在內(nèi)的核苷酸替換技術(shù)實(shí)現(xiàn)氨基酸改變。示例性技術(shù)包括隨機(jī)誘變、定點(diǎn)誘變、寡核苷酸介導(dǎo)的或多核苷酸介導(dǎo)的誘變、通過使用現(xiàn)有的或改造的限制酶位點(diǎn)刪除所選區(qū)域、以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。出于本發(fā)明目的的免疫調(diào)節(jié)活性測試可以通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)的任一種來進(jìn)行。對本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和肽(及其每一種的片段和變體)的純化可以采用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)，例如Coliganetal.,CurrentProtocolsinProteinScience(現(xiàn)代蛋白科學(xué)規(guī)程)，(第6章)，JohnWileyandSons，Inc.，copyright2007中描述的那些方法。例如，如果蛋白或肽為可溶狀態(tài)，可以采用標(biāo)準(zhǔn)方法如柱層析來分離。本文描述的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和肽可以經(jīng)遺傳改造而含有輔助純化的各種親和標(biāo)簽或載體蛋白。例如，使用工程化進(jìn)含有本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和/或肽的表達(dá)載體中的組氨酸和蛋白標(biāo)簽可以促進(jìn)例如通過天然或變性條件下金屬螯合層析(MCAC)進(jìn)行的純化?？梢詾榇笠?guī)模生產(chǎn)而按比例擴(kuò)大純化。技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明不被所使用的產(chǎn)生或純化方法所限，以上描述的方法和技術(shù)是僅出于示例目的而提供。免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)和抑制肥大細(xì)胞活化本文描述了調(diào)節(jié)個(gè)體中免疫反應(yīng)的方法。該方法包括向個(gè)體給予治療有效量的蛋白，該蛋白包括以下的至少之一(i)Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域，(ii)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，(iii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域，(iv)本發(fā)明的肽。在一實(shí)施方案中，該蛋白為NEDD9或其片段或變體。在另一實(shí)施方案中，該蛋白為PHLDAl或其片段或變體。通過本發(fā)明的方法可以增強(qiáng)或抑制免疫反應(yīng)。例如，給予有效量的負(fù)調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化途徑的本文描述的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白或肽可以導(dǎo)致肥大細(xì)胞活化遏制。于是，給藥后個(gè)體內(nèi)的超敏反應(yīng)可以被減弱或防止。可選擇地，給予有效量的正調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化的本文描述的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白或肽可以導(dǎo)致肥大細(xì)胞活化增強(qiáng)。于是，給藥后可以增強(qiáng)個(gè)體內(nèi)的超敏反應(yīng)。本文還提供了抑制或防止肥大細(xì)胞活化的方法。在本發(fā)明的某些方面，抑制或防止肥大細(xì)胞活化的方法可以包括給予包含以下的至少之一的蛋白(i)Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域，(ii)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，(iii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域，(iv)本發(fā)明的肽。優(yōu)選地，該蛋白為NEDD9或PHLDA1。在本發(fā)明的其它方面，抑制或防止肥大細(xì)胞活化的方法包括給予治療有效量的肽，該肽包含對應(yīng)于(i)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域或(ii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列。優(yōu)選地，該肽的序列至少部分對應(yīng)于NEDD9Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，該肽的序列至少部分對應(yīng)于PHLDAlpleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，至少部分對應(yīng)于NEDD9Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域的肽可以具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，至少部分對應(yīng)于NEDD9Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域的肽可以具有SEQIDNOS14-273中任一所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，至少部分對應(yīng)于PHLDAlpleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域的肽可以具有SEQIDNO10,SEQIDN0:11或SEQIDNO12所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，至少部分對應(yīng)于PHLDAlpleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域的肽可以具有SEQIDNO13所示或SEQIDNOs274-488中任一所示的氨基酸序列。肥大細(xì)胞活化可以通過IgE依賴機(jī)制發(fā)生，例如通過肥大細(xì)胞表面上的IgE交聯(lián)。另外地或可選擇地，肥大細(xì)胞活化可以通過IgE非依賴機(jī)制發(fā)生?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的方法來測量和比較給予了或未給予本文描述的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白或肽的肥大細(xì)胞中的活化水平。例如，可通過檢測活化的肥大細(xì)胞脫粒后釋放的因子的標(biāo)準(zhǔn)測定法，來測量肥大細(xì)胞活化水平。這些因子包括例如組胺、類胰蛋白酶、絲氨酸蛋白酶類胰蛋白酶(serineproteasetryptase)、β-己糖胺酶、肝素、硫酸軟骨素Ε、前列腺素D2、白細(xì)胞三烯Β4和C4、血小板活化因子、或細(xì)胞因子釋放，包括IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、GM-CSF、TNF、CCL2、CCL3和CCL5。另外地或可選擇地，肥大細(xì)胞活化程度可以通過肥大細(xì)胞活化的特定標(biāo)志物的表達(dá)變化來測量，例如通過流式細(xì)胞術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行?？梢圆捎眠@類技術(shù)，通過本領(lǐng)域已知的由肥大細(xì)胞表達(dá)的各種表面受體的表達(dá)來鑒定肥大細(xì)胞，其包括但不限于⑶9、⑶29、⑶33、⑶43、⑶44、CD45、CD46、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD61、和CDl17、CD47、CD48、CD49d、CD53、CD60、CD63、CD81、CD82、CD84、CD87、CD92、CD97、CD98、和CD99、CD147、CD149、CD151、以及CD157。如此鑒定的肥大細(xì)胞的活化水平可以例如通過肥大細(xì)胞活化標(biāo)志物的表達(dá)來測量，所述標(biāo)志物例如CD107A(LAMP-I)、CD107B(LAMP-2)、類胰蛋白酶和PGD2。如本文所附實(shí)施例中顯示的，已確認(rèn)，給予在序列上對應(yīng)于NEDD9SH3或PHLDA1PH結(jié)構(gòu)域內(nèi)特異區(qū)域的“競爭肽”具有使肥大細(xì)胞脫敏并抑制它們在IgE交聯(lián)時(shí)活化的效果。不希望局限于特定機(jī)制，可認(rèn)為對應(yīng)于NEDD9SH3的肽通過干擾NEDD9SH3結(jié)構(gòu)域與肥大細(xì)胞內(nèi)部靶蛋白SH3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的正常結(jié)合而對肥大細(xì)胞活化起這種作用。可認(rèn)為這是改變了與位于這些肥大細(xì)胞表面受體下游的三個(gè)重要細(xì)胞內(nèi)角色Lck、Lyn和Fyn的高選擇性相互作用，由此破壞了活化途徑。類似地，可認(rèn)為對應(yīng)于PHLDAlPH結(jié)構(gòu)域的肽通過干擾PHLDAlPH結(jié)構(gòu)域與肥大細(xì)胞內(nèi)靶蛋白中存在的PH結(jié)合結(jié)構(gòu)域的正常結(jié)合而抑制肥大細(xì)胞活化。本發(fā)明人已證實(shí)，干擾NEDD9SH3結(jié)構(gòu)域和/或PHLDAlPH結(jié)構(gòu)域與肥大細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的結(jié)合提供了調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化的手段。除了示例的肽，可設(shè)計(jì)使用大量的基于NEDD9SH3結(jié)構(gòu)域或PHLDAlPH結(jié)構(gòu)域序列的肽，并且應(yīng)理解這些也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明還涉及可以通過改變含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)而發(fā)揮對個(gè)體免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)作用的試劑。這種情況下，可以通過將候選試劑存在下含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)與候選試劑不存在下含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行比較來鑒定這類試齊U。編碼含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的基因的表達(dá)可以通過試劑來增強(qiáng)，例如通過接觸基因的調(diào)節(jié)序列并由此增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄?？蛇x擇地，編碼含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的基因的表達(dá)可以被試劑減弱或抑制，例如通過以阻礙包括在該基因的轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)中的蛋白接近或防止其起作用的方式結(jié)合該基因。另外，可通過給予同源反義核酸減少或抑制含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白如NEDD9或PHLDAl的生成而實(shí)現(xiàn)對免疫反應(yīng)和肥大細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)作用。本文還提供了至少5核苷酸、一般至多約200核苷酸的這類核酸(其對編碼含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的互補(bǔ)DNA(cDNA)基因反義)的治療或預(yù)防用途。這種反義核酸能夠通過一定程度的序列互補(bǔ)而通常在高嚴(yán)緊條件下雜交至含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的RNA前體(一般為mRNA)的一部分。反義核酸可以互補(bǔ)于含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的RNA前體的編碼和/或非編碼區(qū)。不必要完全互補(bǔ)于全長RNA前體。這種形式的反義核酸可用作減弱或抑制肥大細(xì)胞活化的治療劑，并且可用在治療或預(yù)防本文描述的疾病狀態(tài)中?；パa(bǔ)于含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白如NEDD9或PHLDAl的RNA前體的反義核酸可以為至少5核苷酸，并一般為長度范圍5至約200核苷酸的寡核苷酸。例如，該反義寡核苷酸為至少10核苷酸、至少15核苷酸、至少100核苷酸、至少125核苷酸、至少150核苷酸或至少175核苷酸。該寡核苷酸可為DNA或RNA或嵌合混合物或其衍生物或修飾形式，單鏈或雙鏈的?？刹捎帽绢I(lǐng)域普遍已知的取代基修飾互補(bǔ)于RNA前體的反義核酸結(jié)構(gòu)上的任何位置。該反義核酸可以包括至少一個(gè)經(jīng)修飾的堿基部分，其選自包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙?；奏?、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(β-D-galactosylqueosine)、次黃嘌呤核苷、2，2_二甲基鳥嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(ν)、Q核苷、wybutoxosine、5-甲基_2_硫尿嘧啶、3_(3_氨基-3_N_2-羧丙基)尿嘧啶、以及2，6-二氨基嘌呤的組?；パa(bǔ)于RNA前體的反義核酸可以包括至少一個(gè)修飾的糖部分，例如阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。該反義核酸還可以包括至少一個(gè)經(jīng)修飾的磷酸骨架，選自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯和formacetal及其類似物。該反義核酸可偶聯(lián)至另一分子，例如肽、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)試劑(transportagent)或雜交觸發(fā)的切割試劑。編碼互補(bǔ)于含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白(例如NEDD9或PHLDA1)RNA前體的反義核酸的序列的表達(dá)可通過本領(lǐng)域已知的在哺乳動(dòng)物(包括人)、細(xì)胞內(nèi)起作用的任何啟動(dòng)子進(jìn)行，并且可以包括誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子。RNA干擾(RNAi)(參見，例如Chuangetal.,ProcNatlAcadSciUSA97:4985-4990(2000))可用來抑制編碼含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白如NEDD9或PHLDAl的基因的表達(dá)。干擾RNA(RNAi)片段，特別是雙鏈RNAi，可用來引起蛋白減少。與使用RNAi在有機(jī)體內(nèi)沉默基因有關(guān)的方法是已知的，例如Fireetal.，Nature391806-811(1998)；Hammondetal.,NatureRev,Genet.2110-1119(2001)；Hammondetal.,Nature404293-296(2000)；Bernsteinetal.,Nature409363-366(2001)；Elbashiretal.,Nature411:494_498(2001)；國際PCT申請WO01/29058；以及國際PCT申請WO99/32619)，通過引用將它們的公開內(nèi)容并入本文。采用保持在染色體之外或整合進(jìn)基因組的可復(fù)制載體將雙鏈RNA表達(dá)構(gòu)建體引入宿主。通過選擇適當(dāng)?shù)男蛄?，dsRNA的表達(dá)可干擾編碼IL-10同源物的內(nèi)源mRNA的積累。治療和/或預(yù)防超敏反應(yīng)一方面，本發(fā)明涉及抑制或預(yù)防超敏疾病或病癥的方法。該方法包括給予治療有效量的蛋白的步驟，所述蛋白包括以下的至少之一(i)Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域，(ii)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，(iii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域，(iv)本發(fā)明的肽。優(yōu)選地，該蛋白為NEDD9或其片段或變體。優(yōu)選地，該蛋白為PHLDAl或其片段或變體。本文還描述了治療或預(yù)防超敏疾病或病癥的方法，包括給予治療有效量的肽，該肽包含對應(yīng)于(i)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域或(ii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列。優(yōu)選地，該蛋白為NEDD9或其片段或變體。優(yōu)選地，該蛋白為PHLDAl或其片段或變體。優(yōu)選地，該肽包含選自SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO10,SEQIDN0:11、SEQIDNO:12及其變體和片段的氨基酸序列。在一實(shí)施方案中，該肽包含SEQIDNOs14-273所示的氨基酸。在另一實(shí)施方案中，該肽包含SEQIDNOs274-488任一所示的氨基酸。本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防超敏疾病或病癥的方法，包括抑制(i)NEDD9蛋白Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域(ii)PHLDAl蛋白pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域之一或二者結(jié)合肥大細(xì)胞受體。該抑制結(jié)合可以包括給予包含對應(yīng)于NEDD9蛋白Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域或PHLDAl蛋白pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列的肽。優(yōu)選地，該肽包含選自SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO10,SEQIDN0:11、SEQIDNO:12及其變體和片段的氨基酸序列。在一實(shí)施方案中，該肽包含SEQIDNOs14-273所示的氨基酸。在另一實(shí)施方案中，該肽包含SEQIDNOs274-488任一所示的氨基酸。該超敏疾病或病癥可以完全或部分地產(chǎn)生自肥大細(xì)胞活化。該肥大細(xì)胞活化可以通過IgE依賴或IgE非依賴機(jī)制發(fā)生。該超敏疾病或病癥可以包括炎性反應(yīng)。根據(jù)本文描述的方法可以預(yù)防或治療的超敏疾病或病癥的實(shí)例包括，但不限于，過敏反應(yīng)、藥物反應(yīng)、皮膚變應(yīng)性、濕疹、變應(yīng)性鼻炎、蕁麻疹、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸過敏、食物變應(yīng)性、變應(yīng)性結(jié)膜炎、昆蟲毒液變應(yīng)性以及呼吸疾病和病癥，例如哮喘、變應(yīng)性哮喘、內(nèi)源性哮喘、職業(yè)性哮喘、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(COPD)。治療或預(yù)防超敏疾病或病癥的方法還可以包括給予至少一種其它試劑。該其它試劑可以為免疫調(diào)節(jié)劑，在本發(fā)明上下文中，其指一種或多種細(xì)胞類型分泌的且在免疫反應(yīng)的活化、維持、成熟、抑制、遏制或增強(qiáng)中起作用的分子介質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，該免疫調(diào)節(jié)劑可以為I型干擾素。根據(jù)本發(fā)明的方面和實(shí)施方案，可以向需要治療的個(gè)體給予有效量的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白如NEDD9或PHLDA1，或肽(例如，SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO11,SEQIDN0:12)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，該含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白可以以物種特異方式給藥，這樣該蛋白可以源自待治療的物種。本發(fā)明的蛋白和肽可以以組合物的形式給予個(gè)體。一般而言，適合于根據(jù)本發(fā)明方法使用的組合物可以按本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法制備，因此可以包括藥物可接受載體、稀釋劑和/或佐劑。本發(fā)明的組合物可以制備為僅包含含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白或肽，也涉及不同的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的混合物、肽混合物以及含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和肽的組合。這類組合物可以包括在包含藥物可接受載體、佐劑和/或稀釋劑的藥物組合物中?？蛇x擇地，本發(fā)明的組合物還可以包含免疫抑制劑。本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及給予多核苷酸，該多核苷酸編碼含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白(例如NEDD9或PHLDA1)和/或包含對應(yīng)于SH3或PH結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列的肽。這種情況下，該多核苷酸通?？刹僮鞯剡B接至啟動(dòng)子，使得在向個(gè)體給予該多核苷酸之后產(chǎn)生適當(dāng)?shù)亩嚯男蛄小Ｔ摱嗪塑账峥梢栽谳d體中給予個(gè)體。該載體可以為質(zhì)粒載體、病毒載體或經(jīng)改造用于插入外源序列、將它們引入真核細(xì)胞并表達(dá)引入序列的任何其它適合載體。待給藥的核酸構(gòu)建體可以包括裸DNA，或可以為組合物的形式，連同一種或多種藥物可接受載體。該載體一般為真核表達(dá)載體，可以包含表達(dá)控制和加工序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列。采用本領(lǐng)域已知的各種基因遞送方法，可以增強(qiáng)編碼含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白如NEDD9或PHLDAl或本發(fā)明的肽的基因在個(gè)體的肥大細(xì)胞中的表達(dá)。例如，可以向個(gè)體給予包含可操作地連接至表達(dá)控制序列如誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的編碼肥大細(xì)胞活化途徑的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白調(diào)節(jié)物的核酸序列的表達(dá)載體，來增強(qiáng)所述蛋白在肥大細(xì)胞中的生成?？蛇x擇地，可以向個(gè)體給予含有編碼含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和/或本發(fā)明的肽的核酸序列的病毒載體(例如逆轉(zhuǎn)錄和腺病毒載體)，以導(dǎo)致所述蛋白的生成。也可以通過從個(gè)體提取細(xì)胞、給予含目的基因的載體并隨后再將細(xì)胞回輸個(gè)體，來實(shí)現(xiàn)編碼本文描述的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白或肽的基因的遞送。通過基因遞送技術(shù)的編碼本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白或肽的基因的表達(dá)可用作調(diào)節(jié)個(gè)體內(nèi)肥大細(xì)胞活化的手段。因此，這類方法也可以適合于治療和預(yù)防個(gè)體內(nèi)超敏疾病或病癥。篩選調(diào)節(jié)劑本發(fā)明還涉及使用含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的激動(dòng)劑和拮抗劑調(diào)節(jié)個(gè)體免疫反應(yīng)，并提供鑒定這類激動(dòng)劑和拮抗劑的方法。本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的激動(dòng)劑和拮抗劑可以根據(jù)它們對肥大細(xì)胞活化的作用而具體設(shè)計(jì)或篩選。—方面，本發(fā)明涉及鑒定調(diào)節(jié)蛋白活性的試劑的方法，該蛋白包含Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域、Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域或pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域的至少之一。該方法包括讓候選試劑在適合于允許候選試劑與該蛋白相互作用的條件下接觸該蛋白，然后分析該蛋白的活性。另一方面，本發(fā)明涉及篩選多個(gè)候選試劑以鑒定調(diào)節(jié)蛋白活性的試劑的方法，該蛋白包含Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域、Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域或pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域的至少之一。該方法包括讓多種候選試劑在適合于允許候選試劑與該蛋白相互作用的條件下接觸該蛋白，然后測定該蛋白的活性。又一方面，本發(fā)明涉及篩選多種候選試劑以鑒定調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化途徑的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白調(diào)節(jié)劑活性的試劑。該方法包括讓多種候選試劑在適合于允許候選試劑與肥大細(xì)胞活化途徑的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白調(diào)節(jié)劑相互作用的條件下與肥大細(xì)胞活化途徑的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白調(diào)節(jié)劑接觸并測定所述肥大細(xì)胞活化途徑的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白調(diào)節(jié)劑活性的步驟。優(yōu)選地，在上述方法中提到的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白為NEDD9或PHLDAl。多種適合的方法可用于確定一種候選試劑或多種候選試劑是否與含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白如NEDD9或PHLDAl相互作用或結(jié)合。非限定性方法包括雙雜交法、免疫共沉淀、親和純化、質(zhì)譜學(xué)、串聯(lián)親和純化、噬菌體展示、標(biāo)簽轉(zhuǎn)移(labeltransfer)、DNA微陣列/基因共表達(dá)和蛋白微陣列。例如，雙雜交測定法可以用于確定一種候選試劑或多種候選試劑是否與本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白相互作用或結(jié)合。該酵母雙雜交測定系統(tǒng)為基于酵母的遺傳測定法，一般用于檢測蛋白-蛋白相互作用(FieldsandSong.,Nature340245-246(1989))。該測定利用了轉(zhuǎn)錄激活因子的多結(jié)構(gòu)域性質(zhì)。例如，已知的轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以被融合至本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白且轉(zhuǎn)錄激活因子的激活結(jié)構(gòu)域被融合至候選試劑。候選試劑與含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白之間的相互作用促使轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA結(jié)合和激活結(jié)構(gòu)域緊密靠近。隨后轉(zhuǎn)錄激活因子激活的特定報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，使得能檢測相互作用。在上述技術(shù)的修飾中，可以將本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白與可檢測標(biāo)簽如堿性磷酸酶融合而構(gòu)建融合蛋白，并采用如Flanagan和Leder描述的修飾形式的免疫沉淀(FlanaganandLeder,Cell63:185-194(1990))?？蛇x擇地，免疫共沉淀可用于確定一種候選試劑或多種候選試劑是否與本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白相互作用或結(jié)合。采用這種技術(shù)，活化的肥大細(xì)胞可以在適合于保持蛋白-蛋白相互作用的非變性條件下被裂解。然后可以將得到的溶液與特異于本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的抗體一起孵育，并例如通過以連接至固體支持物的抗體結(jié)合蛋白捕獲，將其從本體溶液中免疫沉淀。以這種方法免疫沉淀含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白促進(jìn)了與該蛋白結(jié)合的試劑的免疫共沉淀?？刹捎枚喾N本領(lǐng)域已知的方法來建立對結(jié)合試劑的鑒定，所述方法包括但不限于SDS-PAGE、western印跡和質(zhì)譜學(xué)?？蛇x擇地，噬菌體展示技術(shù)可以用來確定一種候選試劑或多種候選試劑是否與本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白相互作用或結(jié)合。噬菌體展示為通過將來自基因庫的多種基因整合進(jìn)噬菌體而篩選蛋白相互作用的測試。在這種方法下，重組DNA技術(shù)被用于將多種基因表達(dá)為與噬菌體的外殼蛋白的融合蛋白，這樣每一基因的肽或蛋白產(chǎn)物都展示在病毒顆粒的表面。以此方式，可以產(chǎn)生噬菌體展示目的肽或蛋白產(chǎn)物的整個(gè)文庫。然后，可以就結(jié)合本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的能力而篩選所得到的噬菌體展示肽或蛋白產(chǎn)物的文庫。從相互作用的噬菌體提取的DNA含有相互作用蛋白的序列?？蛇x擇地，親和層析可用于確定一種候選試劑或多種候選試劑是否與本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白相互作用或結(jié)合。例如，含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白可以固定在支持物(例如瓊脂糖)上并讓細(xì)胞裂解物穿過柱。然后可以從柱洗脫結(jié)合至固定的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的蛋白并例如通過N-末端氨基酸測序進(jìn)行鑒定。確定候選試劑與本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白相互作用或結(jié)合是否調(diào)節(jié)所述蛋白活性的方法，可以通過測量刺激后肥大細(xì)胞活化程度來確定。例如，可以測量給予了候選試劑的肥大細(xì)胞的活化水平，并與未給予候選試劑的肥大細(xì)胞活化水平進(jìn)行比較。肥大細(xì)胞對候選試劑的攝取可以通過天然擴(kuò)散發(fā)生，或者可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法誘導(dǎo)，包括但不限于顯微注射、電穿孔、蛋白與一種或多種病毒蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs)融合以及陽離子脂質(zhì)遞送?？蛇x擇地，可以在肥大細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)候選試劑的產(chǎn)生，例如通過將含有編碼候選試劑的基因的質(zhì)粒表達(dá)載體或病毒引入肥大細(xì)胞來進(jìn)行。以質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域是公知的，包括例如磷酸鈣共沉淀、DEAE葡聚糖協(xié)助的轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射和陽離子脂質(zhì)體。然后，可以通過各種方法誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化，例如通過與IgE—起孵育并隨后以DNP/白蛋白交聯(lián)。也可以使用各種其它的IgE非依賴肥大細(xì)胞活化觸發(fā)劑，可以例如經(jīng)由FcyR,Toll樣受體(TLRs)或通過給予離子霉素來誘導(dǎo)活化?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法實(shí)現(xiàn)對給予了或未給予候選試劑肥大細(xì)胞的活化水平的測量和比較。肥大細(xì)胞活化的水平可以通過標(biāo)準(zhǔn)測定法來測量，它們檢測活化的肥大細(xì)胞脫粒后釋放的因子，例如組胺、類胰蛋白酶、絲氨酸蛋白酶類胰蛋白酶、β-己糖胺酶、肝素、硫酸軟骨素Ε、前列腺素D2、白細(xì)胞三烯Β4和C4、血小板活化因子、或細(xì)胞因子釋放，包括IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、GM-CSF、TNF、CCL2、CCL3和CCL5?？蛇x擇地，肥大細(xì)胞活化程度可以通過肥大細(xì)胞活化的特定標(biāo)志物的表達(dá)變化來測量，例如通過流式細(xì)胞術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行。可以采用這類技術(shù)，通過本領(lǐng)域已知的由肥大細(xì)胞表達(dá)的各種表面受體的表達(dá)來鑒定肥大細(xì)胞，其包括但不限于⑶9、⑶29、⑶33、⑶43、⑶44、CD45、CD46、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD61、和CDl17、CD47、CD48、CD49d、CD53、CD60、CD63、CD81、CD82、CD84、CD87、CD92、CD97、CD98、和CD99、CD147、CD149、CD151、以及CD157。如此鑒定的肥大細(xì)胞的活化水平可以例如通過肥大細(xì)胞活化標(biāo)志物的表達(dá)來測量，所述標(biāo)志物例如CD107A(LAMP-I)、CD107B(LAMP-2)、類胰蛋白酶和PGD2。應(yīng)理解，上文描述的方法僅為用來鑒定能夠與本文描述的本發(fā)明含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白(例如NEDD9和PHLDA1)相互作用或調(diào)節(jié)其活性的試劑的方法類型實(shí)例。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道其它的適當(dāng)方法，它們也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。采用上文描述的方法，可以鑒定作為本發(fā)明的SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域激動(dòng)劑的試劑。作為激動(dòng)劑的試劑增強(qiáng)本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的一種或多種生物學(xué)活性。可選擇地，上文描述的方法可以鑒定作為本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的拮抗劑的試齊U。作為拮抗劑的試劑妨礙本發(fā)明的SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域的一種或多種生物學(xué)活性。通過各種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可以生成含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白如NEDD9或PHLDAl的活性的潛在調(diào)節(jié)劑，用于通過以上方法進(jìn)行篩選。例如，諸如X射線晶體學(xué)和核磁共振光譜學(xué)的方法可以被用于對本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的結(jié)構(gòu)建模，因此有助于采用基于計(jì)算機(jī)的建模設(shè)計(jì)潛在調(diào)節(jié)劑。各種形式的組合化學(xué)也可以用于生成推斷的調(diào)節(jié)劑。抗體可以用作本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的激動(dòng)劑或拮抗劑。優(yōu)選地，從含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白多肽的不連續(xù)區(qū)域或片段制備適合的抗體?？乖缘暮琒H2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域多肽含有至少約5氨基酸并優(yōu)選至少約10氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地知道產(chǎn)生適合抗體的方法。例如，可以采用Antibodies-ALaboratoryManual(抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊)，HarlowandLane,eds.,ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(1988)中描述的雜交瘤技術(shù)制備通常含F(xiàn)ab部分的特異于本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白或肽的單克隆抗體。本質(zhì)上，對于制備針對本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白或肽的單克隆抗體，任何用于通過培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)都可以使用。這些包括最初由Kohleretal.,Nature,256495-497(1975)開發(fā)的雜交瘤技術(shù)，以及三瘤體技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozboretal.,ImmunologyToday，4:72(1983))，以及產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Coleetal.,inMonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,pp.77-96,AlanR.Liss,Inc.,(1985))?？赏ㄟ^不同于融合的技術(shù)生成永生的抗體產(chǎn)生細(xì)胞系，例如以癌基因DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞或以Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)染。參見，例如M.Schreieretal.,"HybridomaTechniques(雜交瘤技術(shù))，，ColdSpringHarborLaboratory,(1980)；Hammerlingetal.,"MonoclonalAntibodiesandT-cellHybridomas(單克隆抗體與T細(xì)胞雜交瘤)，，Elsevier/North-HollandBiochemicalPress,Amsterdam(1981)；Kennettetal.,"MonoclonalAntibodies()PlenumPress(1980)?？傊a(chǎn)生從其產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤的手段，將骨髓瘤或其它自身永存細(xì)胞系與獲得自經(jīng)其識(shí)別因子結(jié)合部分、或識(shí)別因子或來源特異的其DNA結(jié)合部分超免疫的哺乳動(dòng)物脾的淋巴細(xì)胞融合。通過與當(dāng)前識(shí)別因子免疫作用的能力以及抑制靶細(xì)胞中特定轉(zhuǎn)錄活性的能力，鑒定產(chǎn)生可用于實(shí)施本發(fā)明的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的單克隆抗體可通過起始單克隆雜交瘤培養(yǎng)物來產(chǎn)生，該單克隆雜交瘤培養(yǎng)物包含含有分泌具有適當(dāng)抗原特異性的抗體分子的雜交瘤的營養(yǎng)培養(yǎng)基。在足以讓雜交瘤向培養(yǎng)基分泌抗體分子的條件和時(shí)間段下維持培養(yǎng)。然后收集含抗體的培養(yǎng)基。接著可通過公知的技術(shù)進(jìn)一步分離該抗體分子。類似地，本領(lǐng)域已知各種可用于產(chǎn)生單克隆抗體的操作。為了產(chǎn)生針對本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白如NEDD9或PHLDAl或本發(fā)明的肽的多克隆抗體，可通過注射蛋白免疫各種宿主動(dòng)物，包括但不限于兔、雞、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。另外，多肽或其片段或類似物可以偶聯(lián)至免疫原性載體，例如牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)。各種佐劑也可以用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐劑，礦物凝膠如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂(rysolecithin)，復(fù)合多元醇，聚陰離子，肽、油乳劑、鑰孔戚血藍(lán)素、二硝基酚以及可能有用的人佐劑，如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)0篩選期望的抗體也可通過本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)來完成。測定抗體的免疫特異性結(jié)合可以包括但不限于放射免疫測定、ELISAs(酶聯(lián)免疫吸附測定)、夾心法免疫測定、免疫放射測定、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定、原位免疫測定、Western印跡、沉淀反應(yīng)、凝集測定、補(bǔ)體結(jié)合測定、免疫熒光測定、蛋白A測定以及免疫電泳測定，等等(參見例如Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology(i^H^fLf夫JS禾呈)，Vol.1，JohnWiley&Sons,Inc.，NewYork(1994))可通過初級抗體上的可檢測標(biāo)簽來檢測抗體結(jié)合?？蛇x擇地，抗體可以通過其與適當(dāng)標(biāo)記的次級抗體或試劑結(jié)合來檢測。在免疫測定中檢測結(jié)合的各種方法在本領(lǐng)域是已知的，并包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。針對本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白或肽而產(chǎn)生的抗體(或其片段)對該蛋白有結(jié)合親和性。優(yōu)選地，該抗體(或其片段)具有高于約IO5M-1的結(jié)合親和性或親和力(avidity)，更優(yōu)選高于約ΙΟΙ1，還更優(yōu)選高于約IO7M.1，且最優(yōu)選高于約108ΜΛ就獲得適當(dāng)量的本發(fā)明抗體而言，可以采用無血清培養(yǎng)基成批發(fā)酵制備抗體。發(fā)酵后，可以通過包括層析和病毒滅活/去除步驟在內(nèi)的多步操作純化抗體。例如，可以先通過蛋白A親和層析分離抗體，接著以溶劑/去垢劑處理來滅活任何脂質(zhì)包被的病毒。進(jìn)一步的純化(一般為陰離子和陽離子交換層析)可以用來除去殘余蛋白、溶劑/去垢劑和核酸。經(jīng)純化的抗體還可以采用凝集過濾柱進(jìn)一步純化并配制在0.9%鹽水中。所配制的大量制劑隨后可以被滅菌、病毒過濾和分發(fā)。診斷超敏素質(zhì)在另一方面，本發(fā)明涉及診斷個(gè)體出現(xiàn)超敏相關(guān)疾病或病癥的素質(zhì)的方法。該方法包括從個(gè)體獲得核酸樣品并分析核酸樣品在編碼本發(fā)明含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的核酸內(nèi)是否存在至少一個(gè)突變的步驟。優(yōu)選地，該含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白為NEDD9或PHLDAl。可以通過本發(fā)明方法診斷的超敏相關(guān)疾病或病癥包括但不限于，過敏反應(yīng)、藥物反應(yīng)、皮膚變應(yīng)性、濕疹、變應(yīng)性鼻炎、蕁麻疹、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸過敏、食物變應(yīng)性、變應(yīng)性結(jié)膜炎、昆蟲毒液變應(yīng)性以及與呼吸道感染相關(guān)的呼吸疾病。該呼吸道感染相關(guān)的呼吸疾病可以包括但不限于哮喘、變應(yīng)性哮喘、內(nèi)源性哮喘、職業(yè)性哮喘、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(COPD)。用于診斷的核酸可以從源自個(gè)體各種來源的細(xì)胞獲得，這些來源包括但不限于血液、尿、唾液、組織活檢和尸檢材料。多種技術(shù)已被用于鑒定核酸的序列變化。例如，高分辨率熔解曲線分析(Hi-ResMelting)，一種用于勻質(zhì)突變掃描和基因分型的PCR后技術(shù)(Hi-ResLightScanner)，檢測核苷酸序列中由于突變或改變產(chǎn)生的限制性位點(diǎn)的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析(參見Kanetal.，Lancet2(8096):910，(1978))，通過電泳凝膠中帶泳動(dòng)率的改變鑒定核苷酸序列差異的變性梯度凝膠電泳和單鏈DNA電泳遷移率研究(參見，Myersetal.,Nature313495,(1985)；Oritaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2766，(1989))，鑒定異源雙鏈DNA中錯(cuò)配位點(diǎn)的化學(xué)切割分析(參見Cotton，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4397，(1988))，以及鑒定RNA-DNA或RNA-RNA異源雙鏈中錯(cuò)配位點(diǎn)的RNA酶切割分析(參見Myersetal.，Science230:1242，(1985)；Maniatisetal.，U.S.Pat.No.4，946，773)?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的各種技術(shù)在DNA水平檢測突變。基因組DNA可以被直接用于檢測，或者可以在分析之前采用聚合物鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(Saikietal.，Nature324163-166(1986))酶學(xué)擴(kuò)增。RNA或cDNA也可以用于該目的。舉例而言，互補(bǔ)于編碼本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的核酸的PCR引物可被用于鑒定并分析突變。例如，通過與野生型基因型相比的擴(kuò)增產(chǎn)物大小差異可以檢測刪除和插入?？梢酝ㄟ^讓擴(kuò)增的DNA與編碼含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的放射標(biāo)記RNA或可選擇地放射標(biāo)記的反義DNA序列雜交來鑒定點(diǎn)突變。通過RNA酶A消化或通過解鏈溫度差異可將完全匹配的序列與錯(cuò)配雙鏈體區(qū)分開。也可以通過核酸片段或蛋白在含有或不含變性劑的凝膠中的電泳遷移率變化來檢測突變。小的序列刪除和插入可以通過高分辨率凝膠電泳來觀察。不同序列的核酸片段可以在變性甲酰胺梯度凝膠上區(qū)分開，其中不同片段的遷移根據(jù)它們的特異解鏈或部分解鏈溫度而被阻滯在凝膠中的不同位置(例如，參見Myersetal.,Science2301242(1985))。還可以通過諸如RNA酶和Sl保護(hù)的核酸酶保護(hù)測定或化學(xué)切割方法(例如參見Cottonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)85:4397_4401(1985))，來解釋特定位置的序列變化。因此，可通過諸如雜交、RNA酶保護(hù)、化學(xué)切割、直接DNA測序或使用限制酶(例如限制性片段長度多態(tài)性(RFLP))以及基因組DNA的Southern印跡的方法實(shí)現(xiàn)對特定DNA序列的檢測。除了多種常規(guī)凝膠電泳和DNA測序外，也可通過原位分析來檢測突變。根據(jù)本發(fā)明，可以制備這樣的試劑盒，其包括從個(gè)體獲得核酸樣品的裝置和分析該核酸樣品是否存在至少一個(gè)調(diào)節(jié)本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的活性的突變的裝置。這類試劑盒可以例如用于診斷個(gè)體出現(xiàn)變應(yīng)性疾病或狀況的素質(zhì)。本發(fā)明的試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)從個(gè)體細(xì)胞獲取核酸樣品的裝置。細(xì)胞可以來自個(gè)體的各種來源，包括但不限于血液、尿、唾液、組織活檢和尸檢材料。另外，本發(fā)明的試劑盒包括分析核酸樣品是否存在至少一個(gè)調(diào)節(jié)本發(fā)明的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白如NEDD9或PHLDAl的活性的突變的裝置。這類突變的實(shí)例包括但不限于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的刪除、插入、易位、倒位和堿基置換。本發(fā)明的試劑盒還可以包括其它進(jìn)行本發(fā)明方法所需的其它組分，例如緩沖劑和/或稀釋劑。該試劑盒一般包括用于容納各種組分的容器和在本發(fā)明方法中使用試劑盒組分的說明書。組合物和給藥途徑本發(fā)明涉及使用組合物，該組合物包含含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白如NEDD9或PHLDA1、本發(fā)明的肽、不同的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白的混合物、肽的混合物以及含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白和肽的組合。該組合物可以包括在包含藥物可接受載體、佐劑和/或稀釋劑的藥物組合物中。另外地或可選擇地，本發(fā)明的組合物可以包含免疫抑制劑，例如抗炎化合物或支氣管擴(kuò)張化合物。在其它實(shí)施方案中，免疫抑制劑可以為環(huán)孢霉素、他克莫司、西羅莫司、嗎替麥考酚酯、氨甲喋呤、chromoglycalates、茶堿、白細(xì)胞三烯拮抗劑和抗組胺劑，或它們的組合。免疫抑制劑也可以為針對B或T淋巴細(xì)胞或介導(dǎo)它們活化的表面受體的免疫抑制藥或特異抗體。例如該免疫抑制藥可以為環(huán)孢霉素、他克莫司、西羅莫司、嗎替麥考酚酯、氨甲喋呤、chromoglycalates、茶堿、白細(xì)胞三烯拮抗劑和抗組胺劑，或它們的組合。另外，根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物還可以包含類固醇，例如皮質(zhì)類固醇。在另一實(shí)施方案中，該組合物還包含類固醇。本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防個(gè)體超敏疾病或病癥的方法，包括給予有效量的該組合物。本發(fā)明的其它實(shí)施方案提供包含Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域、Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域、pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域中至少一種的蛋白在制備治療超敏疾病或病癥的藥物中的用途。優(yōu)選地，該蛋白為NEDD9或其片段或變體。優(yōu)選地，該蛋白為PHLDAl或其片段或變體。本發(fā)明還描述了包含對應(yīng)(i)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，或(ii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列的肽在制備治療超敏疾病或病癥的藥物中的用途。優(yōu)選地，該肽包含選自SEQIDN0:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12及其變體和片段的氨基酸序列。在一實(shí)施方案中，該肽包含SEQIDSEQIDNOs14-273所示的氨基酸。在另一實(shí)施方案中，該肽包含SEQIDSEQIDNOs:274_488中任一所示的氨基酸。組合物可以通過標(biāo)準(zhǔn)途徑給藥。一般而言，該組合物可以通過胃腸外(例如，靜脈內(nèi)、脊柱內(nèi)、皮下或肌內(nèi))途徑給藥。更優(yōu)選地，該組合物可以局部、口服或鼻內(nèi)給藥。給藥可以是全身的、區(qū)域的或局部的。在任意給定時(shí)間使用的特定給藥途徑將取決于多種因素，包括待治療狀況的性質(zhì)、狀況的嚴(yán)重性和程度、待遞送的特定組合物所需劑量以及組合物的潛在副作用。就與組合物其它成分的相容性而言，載體、稀釋劑和佐劑必需是“可接受的”，并且對其接受者無害。藥物可接受載體或稀釋劑的實(shí)例為去礦物質(zhì)水或蒸餾水；鹽水溶液；基于植物的油如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，例如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；揮發(fā)性硅酮；礦物油如液體石蠟、軟石蠟或角鯊?fù)?；纖維素衍生物如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或羥丙基甲基纖維素；低級烷醇，例如乙醇或異丙醇；低級芳醇；低級聚亞烷基二醇或低級亞烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3_丁二醇或甘油；脂肪酸酯如棕櫚酸異丙酯、豆蔻酸異丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；瓊脂；黃蓍膠或阿拉伯樹膠以及凡士林。一種或多種載體一般占組合物重量的10%至99.9%。本發(fā)明的組合物可以為適合于通過注射給藥的形式，適合于口服的制劑的形式(例如膠囊、片劑、囊片、酏劑)，適合于局部給藥的軟膏、乳膏或洗劑的形式，適合于作為滴眼劑遞送的形式，適合于通過吸入給藥(例如通過鼻內(nèi)吸入或口腔吸入)的氣霧劑形式，適合于胃腸外給藥(即皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射)的形式。對于作為可注射溶液或懸浮液給藥，無毒性的胃腸外可接受稀釋劑或載體可包括Ringer溶液、等滲鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、乙醇和1，2丙二醇。適合于口服的載體、稀釋劑、賦形劑和佐劑的一些實(shí)例包括花生油、液體石蠟、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、海藻酸鈉、阿拉伯樹膠、黃蓍膠、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明膠和卵磷脂。另外，這些口服制劑可以含有適當(dāng)?shù)恼{(diào)味和著色劑。當(dāng)以膠囊形式使用時(shí)，膠囊可以涂覆有諸如甘油單硬脂酸酯或甘油硬脂酸酯這類延緩崩解的化合物。佐劑一般包括潤滑劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、殺菌劑和緩沖劑。用于口服給藥的固體形式可以含有人和獸醫(yī)藥物實(shí)踐中可接受的粘合劑，甜味齊U，崩解劑，稀釋劑，調(diào)味品，涂層劑，防腐劑，潤滑劑和/或延釋劑。適合的粘合劑包括阿拉伯樹膠、明膠、玉米淀粉、黃蓍膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素或聚乙二醇。適合的甜味劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。適合的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜兒膠、黃原膠、膨潤土、褐藻酸或瓊脂。適合的稀釋劑包括乳糖、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、高嶺土、纖維素、碳酸鈣、硅酸鈣或磷酸二鈣。適合的調(diào)味劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃、柑橘或木莓調(diào)味品。適合的涂層劑包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蠟、脂肪醇、玉米蛋白、蟲膠或麩質(zhì)。適合的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素Ε、α-生育酚、抗壞血酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。適合的潤滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石。適合的延釋劑包括甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。除了上述試劑，用于口服給藥的液體形式還可以含有液體載體。適合的液體載體包括水，油類如橄欖油、花生油、芝麻油、向日葵油、紅花油、落花生油、椰子油、液體石蠟、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、異丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或它們的混合物。用于口服給藥的懸浮劑還可以包含分散劑和/或助懸劑。適合的助懸劑包括羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸鈉或乙酰基醇。適合的分散劑包括卵磷脂，脂肪酸如硬脂酸的聚氧乙烯酯，聚氧乙烯山梨醇單或二油酸脂、硬脂酸酯或月桂酸酯，聚氧乙烯山梨聚糖單或二油酸脂、硬脂酸酯或月桂酸酯，等等。用于口服給藥的乳劑還可以包含一種或多種乳化劑。適合的乳化劑包括上文例舉的分散劑或天然膠如瓜兒膠、阿拉伯樹膠或黃蓍膠。制備可胃腸外給藥組合物的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，例如在Remington'sPharmaceuticalScience(Remington藥物禾斗學(xué))，15thed.,MackPublishingCompany,Easton,Pa.中有更詳細(xì)的說明，在此通過引用將其并入本文。本發(fā)明的局部制劑包括活性成分和一種或多種可接受的載體，以及任選地任何其它治療性成分。適合于局部給藥的制劑包括適合于透過皮膚到達(dá)需要治療部位的液體或半液體制劑，例如擦齊、洗齊、乳膏、軟膏或貼劑，以及適合于眼、耳或鼻給藥的滴劑。本發(fā)明的滴劑可以包含無菌水或油性溶液或懸浮液?？梢酝ㄟ^將活性成分溶解在殺菌劑和/或殺真菌劑和/或任何其它適合的防腐劑的水性溶液中并任選地包括表面活性劑，來制備它們。然后可通過過濾來澄清得到的溶液，轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)娜萜鞑缇缇梢赃@樣進(jìn)行高壓滅菌或在90°C-100°C維持半小時(shí)，或者通過過濾，然后通過無菌技術(shù)轉(zhuǎn)移至容器。適合于包含在滴劑中的殺菌和殺真菌劑的實(shí)例為硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002%)、苯扎氯銨(0.01%)和醋酸洗必泰(0.01%)0適合于制備油性溶液的溶劑包括甘油、稀釋的醇和丙二醇。本發(fā)明的洗劑包括適合于應(yīng)用至皮膚或眼的那些洗劑。眼的洗劑可以含有無菌水性溶液，其任選地含有殺菌劑，并且可以按類似于上文描述的與制備滴劑有關(guān)的方法來制備。應(yīng)用至皮膚的洗劑或擦劑也可以包括加速干燥和冷卻皮膚的試劑，例如醇或丙酮，和/或增濕劑如甘油，或油如蓖麻油或花生油。本發(fā)明的乳膏、軟膏或貼劑為用于外部應(yīng)用的活性成分的半固體制劑。它們可以通過將細(xì)粉或粉末形式的、單獨(dú)的或溶液中的或水性或非水性液體懸浮液中的活性成分與油脂或非油脂主成分混合來制備。該主成分可以包含烴類如硬、軟或液體石蠟、甘油、蜂蠟、金屬皂；黏膠；天然來源的油如杏仁油、玉米油、落花生油、蓖麻油或橄欖油，羊毛脂或其衍生物，或脂肪酸如硬脂酸或油酸連同諸如丙二醇或聚乙二醇的醇。該組合物可以并入任何適合的表面活性劑，例如陰離子、陽離子或非離子表面活性劑如山梨聚糖酯或其聚氧乙烯衍生物。也可以包括助浮劑如天然膠、纖維素衍生物或無機(jī)材料如硅石，以及其它成分，如羊毛脂。也可以給予脂質(zhì)體形式的組合物。脂質(zhì)體通常衍生自磷脂或其它脂質(zhì)，并且通過分散在水性介質(zhì)中的單或多薄層含水液體結(jié)晶形成?？梢允褂萌魏文軌蛐纬芍|(zhì)體的無毒、生理學(xué)上可接受的和可代謝的脂質(zhì)。脂質(zhì)體形式的組合物可以含有穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑等。優(yōu)選的脂質(zhì)為磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)，無論是天然還是合成的。形成脂質(zhì)體的方法在本領(lǐng)域是已知的，對此可具體參考Prescott，Ed.，MethodsinCellBiology(細(xì)胞生物學(xué)方法),VolumeXIV,AcademicPress,NewYork,N.Y.(1976)，p.33etseq.，通過引用將其內(nèi)容并入本文。劑量適合于用在本發(fā)明方法中的本發(fā)明組合物可以治療性或預(yù)防性地作為組合物給藥。在治療性應(yīng)用中，組合物被給予已經(jīng)患有疾病或狀況的患者，其量足以治愈或至少部分地阻止該疾病或狀況及其并發(fā)癥。該組合物應(yīng)提供足以有效治療該患者的量的藥劑。對于任意特定患者的治療有效劑量水平將依賴于多種因素，包括正治療的病癥和病癥嚴(yán)重性；所采用的化合物或藥劑的活性；所采用的組合物；患者年齡、體重、總體健康狀況、性別和飲食；給藥時(shí)間；給藥途徑；藥劑或化合物的吸收率(rateofsequestration)；治療持續(xù)時(shí)間；與該治療組合或同時(shí)使用的藥物，以及藥學(xué)中公知的其它相關(guān)因素。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定治療適當(dāng)疾病所需的藥劑或化合物的有效、無毒量。一般地，預(yù)期有效劑量范圍為每kg體重每24小時(shí)約0.OOOlmg至約IOOOmg；典型地，每kg體重每24小時(shí)約0.OOlmg至約750mg；每kg體重每24小時(shí)約0.Olmg至約500mg；每kg體重每24小時(shí)約0.Img至約500mg；每kg體重每24小時(shí)約0.Img至約250mg；每kg體重每24小時(shí)約1.Omg至約250mg。更典型地，預(yù)期有效劑量范圍為每kg體重每24小時(shí)約1.Omg至約200mg；每kg體重每24小時(shí)約1.Omg至約IOOmg；每kg體重每24小時(shí)約1.Omg至約50mg；每kg體重每24小時(shí)約1.Omg至約25mg；每kg體重每24小時(shí)約5.Omg至約50mg；每kg體重每24小時(shí)約5.Omg至約20mg；每kg體重每24小時(shí)約5.Omg至約15mg?？蛇x擇地，有效劑量可以多至約500mg/m2。一般地，預(yù)期有效劑量的范圍為約25至約500mg/m2，優(yōu)選約25至約350mg/m2，更優(yōu)選地，約25至約300mg/m2，還更優(yōu)選約25至約250mg/m2，甚至更優(yōu)選約50至約250mg/m2，且還甚至更優(yōu)選約75至約150mg/m2。在治療性應(yīng)用中，治療一般在疾病狀態(tài)或狀況持續(xù)時(shí)進(jìn)行。另外，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，個(gè)體給藥的最佳量和間隔將由正治療的疾病狀態(tài)或狀況的性質(zhì)和程度、給藥形式、途徑和部位、以及正治療的特定個(gè)體的性質(zhì)所決定。另外，這種最佳條件可以通過常規(guī)技術(shù)來確定。對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還顯而易見的是，最佳的療程，例如對于指定天數(shù)每天以組合物給藥的次數(shù)，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員采用常規(guī)的療程確定測試來確定。以下將參照具體實(shí)施例來描述本發(fā)明，這些實(shí)施例不應(yīng)以任何方式理解為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1鑒定參與肥大細(xì)胞活化的含推定的SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白基于計(jì)算機(jī)的方法被用于鑒定活化的肥大細(xì)胞中編碼細(xì)胞內(nèi)信號(hào)產(chǎn)物的新基因。這通過就從靜息和活化骨髓來源人肥大細(xì)胞獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)篩選編碼SH2和/或SH3和/或PH結(jié)構(gòu)域的基因而實(shí)現(xiàn)。按Liuetal.(J.AllergyClinImmunol118:496-503，(2006))中所述產(chǎn)生骨髓來源肥大細(xì)胞(BMMC)，從靜息和IgE交聯(lián)刺激的BMMC分離mRNA，并按Luietal.(JAllergyClinImmunol118:496_503，(2006))中闡釋的Affymetrix標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行基因表達(dá)陣列分析。采用用于基因序列掃描的基于LINUX的平臺(tái)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域序列查詢，以鑒定BMMC表達(dá)的含SH2/SH3/PH結(jié)構(gòu)域蛋白。在肥大細(xì)胞中被表達(dá)的近15000Affymetrix探針中，207個(gè)基因編碼具有SH2、SH3和/或PH結(jié)構(gòu)域的蛋白，其中的23個(gè)(11%)被發(fā)現(xiàn)在FcεRl交聯(lián)后上調(diào)或下調(diào)?；趫?bào)道的基因序列特征和在其它細(xì)胞類型中的生物學(xué)功能，多個(gè)編碼之前未被鑒定為肥大細(xì)胞IgE信號(hào)途徑成員的分子的基因被認(rèn)為可能在肥大細(xì)胞活化過程中起作用。其中，NEDD9(神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育下調(diào)基因9)和PHLDAl基于它們的結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)活性而被選擇用于進(jìn)一步的研究。實(shí)施例2:NEDD9和PHLDAl在肥大細(xì)胞活化中的作用(i)NEDD9，一種參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的高選擇性錨定蛋白人NEDD9基因(神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)的發(fā)育下調(diào)基因9)(GenBank,IDsNM_006403.2和NM_182966.2，EnsemblID:ENSG00000111859,Entrez基因ID4739和UniprotIDQ14511)，也稱為CasL(Crk相關(guān)底物淋巴細(xì)胞類型)和HEFl(人成絲增強(qiáng)子1)，編碼表達(dá)未加工的834氨基酸前體蛋白。NEDD9含有SH3結(jié)構(gòu)域和富含SH2結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域。NEDD9同工型1具有UniProt識(shí)別號(hào)Q14511，與同工型CRA_b(UniProt識(shí)別號(hào)Q5T9R4)相同。NEDD9同工型1在位置10-64處具有SH3結(jié)構(gòu)域，在位置633-656處具有CC基序，在位置92、166、177和189處具有三個(gè)磷酸化位點(diǎn)，并且在位置363處具有切割位點(diǎn)。同工型CRA_a(UniProt識(shí)別號(hào)Q5T9R4)也為834氨基酸蛋白，與同工型1的區(qū)別在于序列位置2、3和4。它屬于Cas家族，如同所有的家族成員，以N末端SH3結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣?，該結(jié)構(gòu)域包含對應(yīng)REFSEQ登錄號(hào)NM_006403.2(其為同工型1(Q14511))所定義的序列中殘基7至66的60個(gè)氨基酸。它還含有包含多個(gè)可能的SH2結(jié)合位點(diǎn)的中心結(jié)構(gòu)域和具有不同螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)基序的C末端結(jié)構(gòu)域。推測該SH2結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合CRK、NCK和ABLSH2結(jié)構(gòu)域。HLH基序賦予了與HLH蛋白ID2、E12和E47的特異相互作用。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的加工導(dǎo)致的翻譯后修飾從同工型1產(chǎn)生了4種蛋白pll5、pl05、p65和p55。蛋白同工型1pll5產(chǎn)生于同工型1pl05磷酸化，在細(xì)胞周期中較晚出現(xiàn)。同工型1p55作為caspase切割相關(guān)位點(diǎn)處切割的結(jié)果產(chǎn)生于同工型1pl05，特定出現(xiàn)在有絲分裂中。人NEDD9基因轉(zhuǎn)錄本的剪接差異可以產(chǎn)生蛋白同工型2(UniProt:Q5XKI0)、同工型CRA_c(REFSEQ:EAW55302.1)和同工型CRA_d(REFSEQ:EAW55303.1)。HEFl蛋白同工型CRA_c包含800個(gè)氨基酸，類似于同工型1和CRA_a，差別在于中心富含SH2基序結(jié)構(gòu)域中丟失了小量潛在的配體基序。CRA_d的轉(zhuǎn)錄本編碼缺乏N末端SH3結(jié)構(gòu)域的688氨基酸蛋白。相比之下，同工型2為僅174氨基酸蛋白，與HEFl同工型1的1至154N末端殘基相同，基本上僅為SH3結(jié)構(gòu)域和大大減少的SH2配體結(jié)構(gòu)域。其它的人NEDD9編碼蛋白變體列在UniProt數(shù)據(jù)庫中，包括殘基Pro-148后截短的蛋白(UniProt:Q5TI59)，其基本上是同工型2的稍稍縮小的形式。除了CRA_d同工型外，N末端SH3結(jié)構(gòu)域存在于上文提到的每一NEDD9同工型中。NEDD9為參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳播的多功能錨定蛋白，在多種組織的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和如高爾基體和板狀偽足的結(jié)構(gòu)中被表達(dá)。NEDD9的SH3結(jié)構(gòu)域(aa2-64)和卷曲螺旋(coiled-coil)結(jié)構(gòu)域(aa633-656)賦予以高選擇性與三種細(xì)胞表面受體下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Lck、Lyn和Fyn相互作用的可能性。其它的蛋白相互作用基序?yàn)楦缓z氨酸結(jié)構(gòu)域(aa400-558)和含螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)基序的保守C末端結(jié)構(gòu)域(aa710-760)。NEDD9的SH3折疊由成直角的兩反向平行β片層組成。在該折疊內(nèi)有兩可變環(huán)，稱為Rl^Pn-Src環(huán)。當(dāng)SH3結(jié)合其配體時(shí)，富含脯氨酸配體采取聚L-脯氨酸II型螺旋構(gòu)象，其中PPII螺旋結(jié)構(gòu)被結(jié)合螺旋轉(zhuǎn)角的SH3結(jié)構(gòu)域表面上的一對凹槽所識(shí)別。該SH3凹槽由一系列幾乎平行的、高度保守的芳香殘基構(gòu)成。已鑒定NEDD9與幾種參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用。表1描述了相互作用蛋白、相互作用類型和用于鑒定的實(shí)驗(yàn)方法。表1相互作用者名稱實(shí)臉類型類型—ABL__體內(nèi)、體夕卜__直接乳腺癌抗雌激素抗性3_jM__直接CRK__體內(nèi)、體夕卜__直接CRK相關(guān)底物__體內(nèi)、酵母雙雜交__直接CRKL__體內(nèi)、體夕卜__直接鈣粘蛋白ι___直接CasL相互作用分子__體內(nèi)、體外_直接膽堿乙酰轉(zhuǎn)移醇____直接FAK_體內(nèi)、體外、酵母雙雜交直接DNA結(jié)合抑制劑2_體內(nèi)、酵母雙雜交__直接癢同源物E3泛素蛋白連接酵__體內(nèi)、體外、酵母雙雜交直接Lck____直接Lyn__體內(nèi)__直接NCKl__體內(nèi)、體夕卜__直接PTK2B蛋白酪氨酸激酶2β____直接樁蛋白(Paxillin)__^__直接蛋白酪氨酸碌酸酶非受體類型12____直接SH2D3CI體內(nèi)、體外丨直接SHP2_I體內(nèi)、體外_直接SMAD,母親抗DPP同源物2(果蠅)體內(nèi)直接SMAD3_體內(nèi)、體外、酵母雙雜交直接Sma和Mad相關(guān)蛋白1_體內(nèi)、酵母雙雜交__直接曱狀腺激素受體相互作用者6__酵母雙雜交__直接轉(zhuǎn)錄因子3__酵母雙雜交__直接斑聯(lián)蛋白_體內(nèi)、體外、酵母雙雜交直接成絲增強(qiáng)子1_體內(nèi)、體外、酵母雙雜交直接睪精子結(jié)合蛋白1酵母雙雜交~HSA9761__酵母雙雜交__直接Fyn__體內(nèi)、體夕卜__直接i嘌呤核苷酸釋放因子2I體內(nèi)、體外I直接(ii)PHLDAl，一種參與受體結(jié)合下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的分子人PHLDAl基因(Entrez基因ID22822；Pleckstrin同源樣結(jié)構(gòu)域家族A成員1)，也稱為TDAG51(T細(xì)胞死亡相關(guān)基因51)，編碼表達(dá)5913核苷酸轉(zhuǎn)錄本，NCBIREFSEQ登錄號(hào)NM_007350，有報(bào)道稱cDNA序列可以翻譯為401(REFSEQ:NP_031376)或400(REFSEQEAW97312.1)氨基酸的蛋白。PHLDAl基因編碼蛋白的首選名稱為Pleckstrin同源樣結(jié)構(gòu)域家族A成員1(PHLDAl)，具有UniProt識(shí)別號(hào)Q8WV24。PHLDAl在多種組織的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)囊泡膜、細(xì)胞核和和核仁中被表達(dá)，以N末端pleckstrin同源或PH結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣?，該結(jié)構(gòu)域包含對應(yīng)REFSEQ登錄號(hào)NP_031376所定義的序列中殘基9至141的133個(gè)氨基酸。PHLDAl還含有15(脯氨酰谷氨酰胺酰_)重復(fù)序列，朝向C末端緊接有14(脯氨酰組氨酰_)重復(fù)序列。該P(yáng)H結(jié)構(gòu)域自身包括15(NP_031376)或14(EAW97312.1)殘基聚(谷氨酰氨)元件。UniProt知識(shí)庫中列出的蛋白沒有翻譯后修飾。UniProt知識(shí)庫僅描述了圈定為變體的259氨基酸蛋白(Q8WV24)，在Entrez數(shù)據(jù)庫中為PHLDAlCRA_a(例如REFSEQAAH18929.3、ΑΑΙ10821·1和ΑΙ26426.2)。該蛋白缺乏所預(yù)測的較長形式的N末端起的141殘基序列，且與ΝΡ_031376的區(qū)別在于在PH結(jié)構(gòu)域中聚(谷氨酰氨)重復(fù)序列開始處具有單谷氨酰氨殘基缺失，在這種形式中其為14殘基長度。蛋白名稱PHLDAl—般指這種259殘基的較短形式。預(yù)測cDNA序列(REFSEQ:AAI30428)編碼312殘基的蛋白，其PH結(jié)構(gòu)域包括在殘基62至194中。該P(yáng)H結(jié)構(gòu)域存在于以上描述的所有同工型中，并通常地包含約100個(gè)氨基酸。PH結(jié)構(gòu)域具有由兩垂直的反平行β片層和其后的C末端兩親螺旋構(gòu)成的共同結(jié)構(gòu)。連接β鏈的環(huán)在長度上有很大區(qū)別，使得PH結(jié)構(gòu)域的檢測相對困難。存在有pleckstrin同源樣結(jié)構(gòu)域家族A的三個(gè)成員，PHLDAl至PHLDA3，它們中的每一個(gè)在組成部分PH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列上差異顯著。PHLDAl不同于其它的A家族成員，因?yàn)槠湓诃h(huán)中包含了另外的43氨基酸插入，所述環(huán)包括聚(谷氨酰氨)元件。表2列出了一些已知與PHLDAl基因產(chǎn)物PHLDAl相互作用的分子，以及相互作用類型和用于鑒定的實(shí)驗(yàn)方法。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>實(shí)施例3=IgE刺激后人和小鼠肥大細(xì)胞的NEDD9的表達(dá)動(dòng)力學(xué)在IgE刺激人和小鼠肥大細(xì)胞(衍生自人或小鼠骨髓干細(xì)胞)后評估NEDD9的表達(dá)動(dòng)力學(xué)。讓細(xì)胞與抗DNP/IgE單抗(10-500ng/ml)—起孵育2小時(shí)，并通過與DNP/白蛋白溶液(lOOng/ml)交聯(lián)特定時(shí)長(O至4小時(shí))進(jìn)行FcεRI活化。采用用于兩物種的NEDD9特異引物通過定量實(shí)時(shí)PCR測量基因表達(dá)，并采用相對定量的比較Ct法進(jìn)行分析(參見LivakandSchmittgen,Methods25:402-408，(2001))。在人肥大細(xì)胞IgE交聯(lián)后早期，NEDD9上調(diào)，2.5小時(shí)時(shí)達(dá)到峰值，5小時(shí)后下降至僅高于基線表達(dá)的穩(wěn)態(tài)表達(dá)(圖1A)。在人肥大細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)PHLDAl的表達(dá)水平應(yīng)答IgE交聯(lián)而上調(diào)，IgE刺激后5小時(shí)時(shí)達(dá)到峰值(圖1B)。類似地，在小鼠肥大細(xì)胞IgE刺激后不久，觀察到NEDD9和PHLDAl表達(dá)的早期上調(diào)，對于NEDD9在IgE刺激后1小時(shí)達(dá)到峰值，對于PHLDAl為30分鐘，二者都在6小時(shí)前降至基線(圖IC和圖1D)。實(shí)施例4:RBL-2H3細(xì)胞中應(yīng)答FcεRI交聯(lián)和離子霉素刺激的NEDD9和PHLDAl表達(dá)動(dòng)力學(xué)在表達(dá)FcεRI的大鼠肥大細(xì)胞系RBL-2H3細(xì)胞中評估NEDD9和PHLDAl的表達(dá)動(dòng)力學(xué)。采用每一基因的特異引物通過基于SYBR綠的定量實(shí)時(shí)PCR測量基因表達(dá)。對每一引物采用三次重復(fù)來測定每一實(shí)驗(yàn)樣品，包括用作內(nèi)標(biāo)的肌動(dòng)蛋白特異引物。缺乏cDNA模板的陰性對照與每次測定一起進(jìn)行以評估特異性。引物表達(dá)軟件(AppliedBiosystems)被用于引物設(shè)計(jì)。對每一樣品確定閾值循環(huán)數(shù)(Ct)。將終點(diǎn)時(shí)顯示非特異產(chǎn)物的PCR測定排除在進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析之外。采用比較Ct法的相對定量被用于結(jié)果分析(參見LivakandSchmittgen,Methods25402-408,(2001))。NEDD9和PHLDAl的表達(dá)應(yīng)答通過FcεRI交聯(lián)的細(xì)胞活化而顯著上調(diào)(圖2Α和圖2C)。簡言之，讓5X106RBL-2H3細(xì)胞與抗DNP/IgE單抗(lOOng/ml)在補(bǔ)充了5%胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素的F15組織培養(yǎng)基中一起孵育2小時(shí)。接著以DNP/白蛋白溶液(lOOng/ml)交聯(lián)FcεRI指定時(shí)長。FcεRI交聯(lián)后的表達(dá)動(dòng)力學(xué)分析顯示兩基因在刺激后早期發(fā)揮作用，提示其參與了調(diào)節(jié)導(dǎo)致肥大細(xì)胞活化的級聯(lián)事件。盡管大多數(shù)的特異肥大細(xì)胞活化途徑包括FcεRI結(jié)合的IgE在細(xì)胞表面上的聚集，但是肥大細(xì)胞也可通過各種手段活化，包括FcyR、Toll樣受體(TLR)和其它IgE非依賴觸發(fā)物。因此，評估了NEDD9和PHLDAl是否參與了除了產(chǎn)生自FcεRI交聯(lián)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級聯(lián)之外的其它細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級聯(lián)。離子霉素為將鈣從細(xì)胞外轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)空間的離子載體，其導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離鈣增加并隨后刺激肥大細(xì)胞效應(yīng)子功能，包括釋放預(yù)先形成的顆粒內(nèi)的內(nèi)容物。讓肥大細(xì)胞與1μM離子霉素一起孵育，通過QRT-PCR在不同時(shí)間點(diǎn)分析NEDD9和PHLDAl的表達(dá)水平。兩種情況下，在所有分析的時(shí)間點(diǎn)都發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)水平應(yīng)答離子霉素而上調(diào)(30、60和120min)(圖2B和圖2D)。類似于通過FcεRI交聯(lián)的活化，對應(yīng)答離子霉素的表達(dá)動(dòng)力學(xué)的分析顯示NEDD9和PHLDAl在刺激后早期發(fā)揮作用，從而再次支持它們參與了調(diào)節(jié)導(dǎo)致肥大細(xì)胞活化的級聯(lián)事件。實(shí)施例5體外和體內(nèi)沉默NEDD9表達(dá)后增加的肥大細(xì)胞脫粒肥大細(xì)胞脫粒測定被用于評估沉默NEDD9表達(dá)是否能體外影響肥大細(xì)胞效應(yīng)子功能。讓RBL-2H3大鼠肥大細(xì)胞與DNP-IgE在3種不同的靶向NEDD9基因表達(dá)的siRNA存在下一起孵育30分鐘，這些siRNA特異設(shè)計(jì)成干擾NEDD9表達(dá)。從AMBIONSilencerValidated(沉默子驗(yàn)證)siRNA購買siRNA，采用推薦的操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染(www.ambion.com)。不靶向任何基因的其它SiRNA用作對照。與IgE/DNP孵育過夜后，通過以DNP/白蛋白偶聯(lián)物交聯(lián)活化FcεRI。然后通過己糖胺酶釋放計(jì)算肥大細(xì)胞脫粒，并將其用作應(yīng)答FcεRI交聯(lián)的肥大細(xì)胞效應(yīng)子功能的指示。如圖3所示，與SiRNA陰性對照相比，通過siRNA抑制NEDD9蛋白表達(dá)導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫粒百分比增加。然后采用被動(dòng)皮膚過敏(PCA)反應(yīng)體內(nèi)評估減弱NEDD9和PHLDAl表達(dá)的作用。以NEDD9siRNAs或PHLDAlsiRNAs(來自AMBION的沉默子驗(yàn)證siRNA)與IgE-DNP的組合，在耳根部皮下注射Lewis大鼠。對照siRNA/DNP-IgE注射在左耳內(nèi)。通過24小時(shí)后以DNP/白蛋白靜脈內(nèi)激發(fā)而誘導(dǎo)FcεRI交聯(lián)。30分鐘后通過Evan藍(lán)恢復(fù)來測量耳肥大細(xì)胞脫粒。與以siRNA對照處理的左耳相比，對右耳的局部NEDD9或PHLDAlsiRNA給藥導(dǎo)致增加的脫粒(圖4A和圖4B)。實(shí)施例6靶向NEDD9的SH3結(jié)構(gòu)域的肽在體外和體內(nèi)中和肥大細(xì)胞活化材料與方法⑴肽設(shè)計(jì)SH3結(jié)構(gòu)域識(shí)別參與了組裝細(xì)胞內(nèi)信號(hào)復(fù)合物以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞活化中的調(diào)節(jié)過程的富含脯氨酸線性基序。NEDD9的SH3結(jié)構(gòu)域在跨越人至蠅類的物種中保守(同源基因(Hom0I0gene)NCBI和圖5)，提示其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性中的重要性。N末端SH3結(jié)構(gòu)域的序列對應(yīng)REFSEQ登錄號(hào)NM_006403.2(HEF1同工型1UniProt:Q14511)定義的序列中的殘基7至66。HEFl同工型1(UniProt:Q14511.1)的殘基7-66，人NEDD9(Entrez基因ID4739)編碼的N末端SH3結(jié)構(gòu)域MARALYDNVP1(IECAEELAFRK2(IGDILTVIEQN3。TGGLEGffffLC40SLHGRQGIVP50GNRVKLLIGP60(SEQIDNO7)構(gòu)建NEDD9競爭肽以特異破壞NEDD9SH3結(jié)構(gòu)域與靶配體的結(jié)合。在AustralianNationalUniversityAustralianCancerResearchFoundationBiomolecularResourceFacility(澳大利亞國立大學(xué)澳大利亞癌癥研究基金會(huì)生物分子資源研究室)化學(xué)合成肽。采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc(9-芴甲氧羰基)方法在Symphony肽合成儀(RaininInstrumentCompanyOaklandCA)上進(jìn)行Rink樹脂(4_(2，，4，_二甲氧基苯基-Fmoc-氨基乙基)-苯氧基聚苯乙烯)上的固相合成，并通過反相HPLC純化。對純化產(chǎn)物的鑒定通過質(zhì)譜學(xué)來證實(shí)。構(gòu)建了20聚體肽(MDDl)，其對應(yīng)于圖5中顯示的NEDD9SH3結(jié)構(gòu)域的人序列(HS)的殘基3-22。該肽MDDl被首先選來用于活性測試，因?yàn)槠浒⊿H3結(jié)構(gòu)域的RT(可變)環(huán)中的帶負(fù)電殘基簇。通過針對所有物種的肽blast證實(shí)了該MDDl肽為NEDD9特異的。MDDl的序列在包括智人、小家鼠、褐家鼠、黑猩猩、歐洲牛、家犬和紅原雞在內(nèi)的哺乳動(dòng)物以及紅原雞中是保守的(圖5-參見突出顯示的序列)。也合成在錯(cuò)義序列(scrambledsequence)中含有相同氨基酸的肽(MDDlsraam)來確定保持天然序列的必要性。將它們合成為N-乙酰基α-羧胺的形式以抑制末端離子化和被外肽酶降解。也生成生物素化的形式。以下詳細(xì)列出這些肽序列MDDl肽RALYDNVPECAEELAFRK⑶(SEQIDNO:8)MDDlscramEALPGEDCAFRKDANRLVEY(SEQIDNO9)也合成兩另外的類似物，MDD1S10和MDD1A10，二者缺乏位置10處的半胱氨酸殘基。(ii)MDDl被RBL-2H3攝取讓RBL-2H3細(xì)胞在補(bǔ)加了10%胎牛血清(FCS)和抗生素的F15培養(yǎng)基中生長。用細(xì)胞刮刀小心地從培養(yǎng)瓶剝離細(xì)胞并以5XIO5細(xì)胞/孔的濃度接種在96孔微量滴定板中。細(xì)胞與各種濃度的生物素化MDDl(0.lmM、0.OlmM和0.OOlmM)一起孵育過夜。根據(jù)制造商的說明(BectonDickinson,BD)，采用鏈霉親和素-APC在經(jīng)組合的cytofix/cytoperm固定和透化溶液試劑盒預(yù)先處理的單細(xì)胞懸浮液中檢測肝細(xì)胞對生物素化MDDl的攝取。然后采用BDFACscan流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。(iii)RBL-2H3脫粒測定采用β-己糖胺酶釋放法測量肥大細(xì)胞脫粒。讓RBL-2H3細(xì)胞在補(bǔ)加了10%胎牛血清(FCS)和抗生素的F15培養(yǎng)基中生長。用細(xì)胞刮刀小心地從培養(yǎng)瓶剝離細(xì)胞，以5Χ105細(xì)胞/孔的濃度接種在96孔微量滴定板中，并在MDDl或SCR肽存在下孵育過夜。然后讓RBL-2H3細(xì)胞與500ng/ml抗DNPIgEmb(SIGMA)37°C孵育2小時(shí)。洗滌后，以100ng/mlDNP/白蛋白刺激細(xì)胞30分鐘。對于非IgE特異刺激，僅將InM離子霉素添加至培養(yǎng)物30分鐘。接著收集上清液，并采用0.1%TritonX_100制備細(xì)胞裂解液。將裂解液和上清液樣品(10μ1)轉(zhuǎn)移至96孔板，向每孔添加50μ1的含ImM對硝基苯基-N-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷的50mM檸檬酸鹽緩沖液，并在黑暗中37°C孵育1小時(shí)。通過向每孔添加100μ10.IMNaHCO3A).IMNa2CO3而終止反應(yīng)，在405nm處測量吸收值。通過下式計(jì)算脫粒百分比OD上清液/(0D上清液+OD裂解液)X100。(iii)OVA誘導(dǎo)的哮喘模型用含IOyg卵清蛋白抗原(OVA)的鹽水腹膜內(nèi)致敏C57BL/6小鼠，隔日給藥，共7次。首次致敏給藥后40天，用鼻內(nèi)OVA(每鼻孔20μ1的5mg/mlOVA鹽水溶液)激發(fā)小鼠。小鼠在第一次以O(shè)VA激發(fā)后的第3和第6天再接受兩次鼻內(nèi)OVA激發(fā)。對照小鼠以O(shè)VA致敏，但是以鹽水鼻內(nèi)激發(fā)。接受胃腸外MDDl治療的小鼠組靜脈內(nèi)注射8mg/Kg的MDDl共3次，在每次OVA激發(fā)前的6小時(shí)進(jìn)行。霧化的MDDl或MDDseram(SCR)肽在每次OVA激發(fā)前6小時(shí)給予，其通過以8ml的lmg/mlMDDl或?qū)φ针淖屆炕\5只小鼠霧化吸入。在最后的OVA激發(fā)后1天進(jìn)行肺功能分析和器官收集。在增加β-乙酰甲膽堿劑量后，在麻醉的小鼠中測量肺阻力。通過手術(shù)暴露氣管，插入導(dǎo)管并連接至嚙齒動(dòng)物呼吸機(jī)(flexivent；Scireq)。讓小鼠穩(wěn)定，以鹽水氣霧劑激發(fā)，接著增加乙酰甲膽堿的濃度。采用Buxco提供的設(shè)備和軟件，通過體積描記術(shù)測量肺阻力。肺阻力值表示為針對每一乙酰甲膽堿劑量的每組小鼠的均值。對于每只小鼠，通過對每一乙酰甲膽堿劑量計(jì)算收集數(shù)據(jù)(每5秒1次，持續(xù)5分鐘)的均值來計(jì)算各個(gè)值。免疫染色，細(xì)胞因子表達(dá)制備血涂片，并通過May-GrtowaldGiemsa染色后的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算嗜酸性細(xì)胞百分比。通過氣管插管術(shù)在輕輕按摩胸腔的同時(shí)以ImlHANKS溶液灌洗氣道兩次，來重獲支氣管肺泡灌洗液(BAL)。收集肺左下葉并勻漿。通過細(xì)胞過濾網(wǎng)過濾細(xì)胞并在染色培養(yǎng)基(PBS，含1%FCS)中制備細(xì)胞懸浮液。讓BAL和肺樣品與抗⑶lib、抗CCR3、抗⑶4和抗B220單抗標(biāo)志物一起孵育，用于采用配備了CellQuest軟件的FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。收集肺右上葉并在冰上勻漿。采用Trizol(GIBCO，Invitrogen)制備總RNA。RNA的純度通過A260/A280來確定。采用OmniscriptRT試劑盒(Qiagen)將每一樣品的5ygRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。細(xì)胞因子特異的預(yù)設(shè)計(jì)TaqMan基因表達(dá)測定(AppliedBiosystems)被用于測量細(xì)胞因子相對基因表達(dá)，其按制造商的說明進(jìn)行(AppliedBiosystems)。每一實(shí)驗(yàn)樣品以三次重復(fù)進(jìn)行測定。肌動(dòng)蛋白特異的引物用作內(nèi)標(biāo)。無空cDNA模板的陰性對照與每次測定一起操作以評估特異性。循環(huán)條件如下95°C10分鐘1個(gè)循環(huán)，接著是PCR擴(kuò)增的40個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)由95°C15秒和60°C45秒構(gòu)成。序列檢測軟件(SDSν1.2.2,AppliedBiosystems)被用于結(jié)果分析。為每一樣品確定閾值循環(huán)數(shù)(Ct)。將終點(diǎn)時(shí)顯示出非特異產(chǎn)物的PCR測定排除在進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析之外。采用比較Ct法的相對定量被用于結(jié)果分析。結(jié)果表示為相對于未過敏小鼠的值的相對倍數(shù)變化。血清Ig水平OVA特異的IgE檢測在4°C用抗小鼠IgE包被96孔maxisorp板過夜。2%脫脂乳被用于非特異結(jié)合封閉。將預(yù)先稀釋的血清樣品孵育過夜，讓板負(fù)載OVA-生物素1.5小時(shí)并采用ABTS按制造商的說明顯示比色反應(yīng)。對于OVA特異的IgG，用0.2%戊二醛預(yù)處理96孔maxisorp微量滴定板，并以含10μg/mlOVA的IOmM碳酸鹽緩沖液(pH9.6)在37°C包被3小時(shí)。在加濕室內(nèi)以含2%BSA的IOmM碳酸鹽緩沖液(pH9.6)在4°C封閉孔過夜。血清樣品于37°C孵育1小時(shí)。相繼將過氧化物酶偶聯(lián)的抗大鼠IgG和ABTS用于顯示比色反應(yīng)。采用405nm濾色片讀取酶標(biāo)板中的光密度。IgE和IgG的水平表示為OD單位。小鼠中的被動(dòng)皮膚過敏測定(PCA)左耳以DMSO處理，右耳以含0.2%MDDl或含0.1%地塞米松的DMSO處理，每天兩次，持續(xù)4天。然后以抗DNP致敏小鼠-采用胰島素注射器通過皮內(nèi)注射將20μ1IgE抗體給予耳部。通過應(yīng)答注射后24小時(shí)FcεRI交聯(lián)的染色恢復(fù)來測量局部肥大細(xì)胞活化靜脈內(nèi)注射含100μgDNP-白蛋白/1%Evans藍(lán)的PBS，并將30分鐘后取得的耳活檢組織于80°C在Iml甲酰胺中孵育2小時(shí)。在620nm測量上清液吸收值。結(jié)果(i)MDDl肽在體外有生物學(xué)活性發(fā)現(xiàn)MDDl肽滲入細(xì)胞膜。MDDl肽直接偶聯(lián)至生物素并給予至RBL-2H3肥大細(xì)胞。MDDl肽攝取通過采用將鏈霉親和素APC用作熒光染料的細(xì)胞內(nèi)FACS染色來檢測。所有的細(xì)胞都對MDDl肽呈陽性，并且觀察到水平隨肽濃度增加(圖6)。(ii)MDDl肽抑制IgE受體交聯(lián)后RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)的脫粒觀察到MDDl肽(SEQIDNO8)在IgE受體交聯(lián)后以及非特異刺激后(數(shù)據(jù)未示出)抑制肥大細(xì)胞活化。未經(jīng)MDDl肽預(yù)處理的RBL-2H3細(xì)胞在IgE受體交聯(lián)后脫粒(圖7)。但是，觀察到以MDDl肽預(yù)處理RBL-2H3細(xì)胞會(huì)抑制IgE受體交聯(lián)時(shí)的脫粒(圖7)。以錯(cuò)義肽MDDlseram(SEQIDNO9)預(yù)處理RBL-2H3細(xì)胞僅對IgE受體交聯(lián)后的脫粒有較次要的抑制作用(圖7)。(iii)MDDl肽改善以β-乙酰甲膽堿激發(fā)后OVA致敏小鼠中的肺功能在肥大細(xì)胞活化驅(qū)使的小鼠哮喘模型中測試MDDl肽在控制哮喘反應(yīng)中的功效。這種模型中的肺炎癥和哮喘反應(yīng)依賴于肥大細(xì)胞活化，因?yàn)闊o肥大細(xì)胞的小鼠不出現(xiàn)這種疾病。與以對照肽處理的小鼠相比，在接觸抗原時(shí)以MDDl處理的OVA致敏小鼠在β-乙酰甲膽堿激發(fā)后具有改善的肺功能(圖8)。在增加β-乙酰甲膽堿劑量后測量以MDDl肽或?qū)φ?SRC)肽處理的OVA致敏小鼠的肺阻力。與以對照肽處理的小鼠相比，以MDDl肽處理的小鼠肺阻力(RL)減小。當(dāng)肽靜脈內(nèi)給予(圖8Α)或采用霧化的鼻內(nèi)途徑局部給予肺(圖8β)時(shí)觀察到這種作用。(iv)MDDl肽減弱以β-乙酰甲膽堿激發(fā)后OVA致敏小鼠哮喘反應(yīng)期間的炎性反應(yīng)MDDl肽減弱哮喘反應(yīng)中的總體炎性反應(yīng)，這通過與對照處理的小鼠相比減少的血液中嗜酸性粒細(xì)胞增多(圖9α)、支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)(圖9β)、炎性病灶中的細(xì)胞因子產(chǎn)生(圖9CA)和過敏小鼠血清中抗原特異的IgE水平(圖9D)來證實(shí)。在一些測試的參數(shù)中MDDl肽表現(xiàn)好于地塞米松治療(2mg/kgi.p.)(圖9)。(ν)局部給予MDDl肽減弱變應(yīng)性反應(yīng)特應(yīng)性皮炎和其它變應(yīng)性皮膚狀況被認(rèn)為是肥大細(xì)胞反應(yīng)所驅(qū)動(dòng)的。局部給予MDDl肽被證實(shí)會(huì)穩(wěn)定皮膚肥大細(xì)胞。在以抗DNPIgE抗體IgE局部致敏之前，將0.2%MDDl肽/DMSO制劑局部涂至每只小鼠的一耳。來自經(jīng)MDDl肽/DMSO處理耳的活檢組織中的肥大細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)在IgE受體交聯(lián)后具有降低的活化水平，這通過與僅以DMSO處理的對側(cè)耳相比的染料外滲來確認(rèn)(圖10)。MDDl局部起作用，具有最小的全身效應(yīng)，而局部地塞米松處理導(dǎo)致全身免疫抑制。實(shí)施例7=PHLDAl基因產(chǎn)物的PH結(jié)構(gòu)域的肽競爭者中和肥大細(xì)胞活化材料與方法⑴肽設(shè)計(jì)PHLDAl的PH結(jié)構(gòu)域包含133個(gè)氨基酸，范圍為REFSEQ登錄號(hào)ΝΜ_006403.2定義的序列中氨基酸殘基9至141。該序列在哺乳動(dòng)物中是高度保守的。該P(yáng)HLDAlPH結(jié)構(gòu)域包括大環(huán)插入序列，其如以下所示(參見加粗斜體序列殘基37至79)。PHLDAl(UniProt:Q8WV24.1)的殘基9-141，人PHLDAl(Entrez基因ID22822)編碼的ph結(jié)構(gòu)域AlkegvlekriqSdgllqlwkk20kccilteegl30llippkqlqh40QQQQQQQQQQsoqqqqpgqgpa6oepsqpsgpav70asleppvklk肌Elhfsnmktv90Dcverkgkym100Yftvvmaegk110εidfrcpqdq120gwnaeιTlqm130vqy(seqidno:10)兩人同工型中以及哺乳動(dòng)物物種之間的序列變異位于聚(谷氨酰胺)元件側(cè)翼，并且均聚序列的長度也是可變的。為了特異干擾PHLDAl的PH結(jié)構(gòu)域的活性，設(shè)計(jì)并合成了兩競爭肽序列(MPX741、MPX742和MPX743)。競爭肽的設(shè)計(jì)基于聚(谷氨酰胺)重復(fù)元件上游(即N-末端)和下游(即C末端)的序列。MPX741對應(yīng)于聚(谷氨酰胺)元件N末端的序列(預(yù)測的用于磷脂酰脂質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn))，MPX742對應(yīng)于大概位于PHLDA1PH結(jié)構(gòu)域中心的序列，而MPX743對應(yīng)于聚(谷氨酰胺)元件C末端序列。將這些肽合成為N-乙?；?羧胺的形式以抑制末端離子化和被外肽酶降解。以下詳細(xì)列出這些肽。ΜΡΧ741KRSDGLLQLWKKKCCILTEEGLLLIPPK(SEQIDNO11)ΜΡΧ742LEPPVKLKELHFSNMKTVD(SEQIDNO12)ΜΡΧ743PQDQGffNAEITLQMVQY(SEQIDNO13)ΜΡΧ741對應(yīng)SEQIDNO11所示的PH結(jié)構(gòu)域的殘基9至36，其組成氨基酸中的15個(gè)與其它PHLDA家族成員的PH結(jié)構(gòu)域存在差異。MPX742對應(yīng)SEQIDNO12所示的PH結(jié)構(gòu)域的殘基73至91，其組成氨基酸與其它PHLDA家族成員的PH結(jié)構(gòu)域僅共有4氨基酸。MPX742的N末端5氨基酸對應(yīng)獨(dú)特的PHLDAl環(huán)插入序列的C末端(這為PHLDAl的PH結(jié)構(gòu)域所特有)。MPX743對應(yīng)SEQIDNO:13所示的PH結(jié)構(gòu)域的殘基117至130，其組成氨基酸與其它PHLDA家族成員的PH結(jié)構(gòu)域有11氨基酸的差異。在AustralianNationalUniversityAustralianCancerResearchFoundationBiomolecularResourceFacility(澳大利亞國立大學(xué)澳大利亞癌癥研究基金會(huì)生物分子資源研究室)化學(xué)合成肽。采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc(9-芴甲氧羰基)操作在Symphony肽合成儀(RaininInstrumentCompanyOaklandCA)上進(jìn)行Rink樹月旨(4-(2，，4，-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基乙基)-苯氧基聚苯乙烯)上的固相合成，并通過反相HPLC純化。對純化產(chǎn)物的鑒定通過質(zhì)譜學(xué)來證實(shí)。(ii)RBL-2H3脫粒測定采用β-己糖胺酶釋放法測量肥大細(xì)胞脫粒。讓RBL-2H3細(xì)胞在補(bǔ)加了10%胎牛血清(FCS)和抗生素的F15培養(yǎng)基中生長。用細(xì)胞刮刀小心地從培養(yǎng)瓶剝離細(xì)胞，以5Χ105細(xì)胞/孔的濃度接種在96孔微量滴定板中，并在ΜΡΧ741肽或ΜΡΧ742肽存在下孵育過夜。然后讓RBL-2H3細(xì)胞在37°C與500ng/ml抗DNPIgEmb(SIGMA)一起孵育2小時(shí)。洗滌后，以lOOng/mlDNP/白蛋白刺激細(xì)胞30分鐘。對于非IgE特異刺激，僅將InM離子霉素添加至培養(yǎng)物30分鐘。接著收集上清，并采用0.1%TritonX_100制備細(xì)胞裂解液。將裂解液和上清液樣品(10μ1)轉(zhuǎn)移至96孔板，向每一孔添加50μ1的含ImM對硝基苯基-N-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖苷的50mM檸檬酸鹽緩沖液，并在黑暗中于37°C孵育1小時(shí)。通過向每一孔添加100μ10.IMNaHC03/0.IMNa2CO3而終止反應(yīng)，在405nm處測量吸收值。通過下式計(jì)算脫粒百分比0D上清液/(OD上清液+OD裂解液)X100。結(jié)果(i)MPX741和MPX742中和肥大細(xì)胞活化觀察到MPX743(SEQIDNO13)溶解性差，因此在進(jìn)一步測試前需要進(jìn)行修飾。證實(shí)MPX741(SEQIDNO11)和MPX742(SEQIDNO12)顯著減弱IgE受體交聯(lián)后的脫粒(圖11)。因此，以MPX741或MPX742處理RBL-2H3細(xì)胞會(huì)顯著抑制肥大細(xì)胞活化。實(shí)施例8另外的NEDD9SH3結(jié)構(gòu)域競爭肽在本文中肽MDDl被證實(shí)為肥大細(xì)胞活化的抑制劑，因此給予該肽提供了治療和/或預(yù)防超敏反應(yīng)的手段。如上文實(shí)施例6中所描述的，MDDl為對應(yīng)NEDD9SH3結(jié)構(gòu)域的人序列(顯示在圖5中)的殘基3-22的競爭肽。涉及通過修飾MDDl肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而產(chǎn)生的變體將在很多情況下能仿效或改善該肽的一種或多種性能，例如使肥大細(xì)胞脫敏的能力、溶解性、化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性、細(xì)胞攝取、毒性、免疫原性和降解產(chǎn)物的排泄。通過鑒定MDDl肽序列中可能為一種或多種特定目的性能的負(fù)面或正面決定基的一個(gè)或多個(gè)特定氨基酸，來設(shè)計(jì)具有類似或改善性能的MDDl肽的變體?？刹捎妙愃朴谝陨蠈?shí)施例6中描述的方法以及本領(lǐng)域公知的其它方法來測試那些MDDl肽變體的功能活性。例如，側(cè)鏈截?cái)嗫捎糜谝员彼嵫豈DDl肽的序列一次置換一個(gè)氨基酸(例如Gautametal.1995,"Bindingofaninvariant-chainpeptide,CLIP,toI-AmajorhistocompatibilitycomplexclassIImolecules(恒定鏈肽CLIP與I-A組織相容性復(fù)合物II類分子的結(jié)合)”procNatlAcadSciUSA,92:335_9中描述的)。待通過這種方法測試的MDDl肽變體包括示于SEQIDNOs33-49中的那些序列。另外，丙氨酸可沿MDDl肽置換多個(gè)殘基，特別是存在帶負(fù)電殘基的位置(參見SEQIDN0s:24-26)。還涉及增加或減小MDDl肽的長度也將在很多情況下能仿效或改善該肽的一種或多種性能。因此將采用本文描述的方法和/或本領(lǐng)域公知的其它方法測試減小長度的MDDl變體對肥大細(xì)胞活化和超敏性的作用。這類MDDl肽變體的示例性序列示于SEQIDNOs18-19和122-144)。設(shè)計(jì)了并將測試其它的MDDl肽變體，這些變體包括MDDl肽序列的10位半胱氨酸殘基被絲氨酸(SEQIDNO16)或丙氨酸(SEQIDNO17)置換的那些。還采用SEQIDNOs20-23和145-184所示的序列測試在殘基10處包含絲氨酸或丙氨酸置換的MDDl肽的長度變體(即SEQIDN0:16禾口SEQIDN0:17的長度變體)。另外，根據(jù)SEQIDNOs:90_121所示的序列，將測試具有10位半胱氨酸殘基置換(如SEQIDNO16或SEQIDNO:17中)以及沿該鏈其它一個(gè)或多個(gè)殘基處的單/多丙氨酸置換的其它系列的MDDl變體肽。還涉及對應(yīng)全長NEDD9SH3結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO7)以及NEDD9SH3結(jié)構(gòu)域中其它特定區(qū)域的競爭肽將能夠調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化，因此影響到超敏反應(yīng)。采用類似于上文實(shí)施例6中描述的方法和/或本領(lǐng)域公知的其它方法測試一系列重疊的20聚體肽(SEQIDNOs14、15和185-225)和12聚體肽(SEQIDNOs:226_273)。那些肽的具有沿該鏈的單/多丙氨酸置換的變體包括具有SEQIDNOs50-89)所示序列的變體。對應(yīng)于NEDD9SH3結(jié)構(gòu)域(及其變體)的至少一部分的示例性肽序列示于SEQIDNOs:14-273，將合成它們并測試對肥大細(xì)胞活化的作用/對超敏反應(yīng)的影響。實(shí)施例9衍生自NEDD9SH3結(jié)構(gòu)域的其它競爭肽肽MPX741和MPX742在本文中被證實(shí)為肥大細(xì)胞活化抑制劑，因此給予這些肽提供了治療和/或預(yù)防超敏反應(yīng)的手段。如在上文實(shí)施例7中描述的，MPX741和MPX742為分別對應(yīng)PHLDAlPH結(jié)構(gòu)域的人序列PH結(jié)構(gòu)域的殘基9_36和殘基73-91的競爭肽。涉及通過修飾MPX741和MPX742肽之一中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而產(chǎn)生的變體將在很多情況下能仿效或改善該肽的一種或多種性能，例如使肥大細(xì)胞脫敏的能力、溶解性、化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性、細(xì)胞攝取、毒性、免疫原性和降解產(chǎn)物的排泄。通過鑒定MPX741和MPX742肽序列中可能為一種或多種特定目的性能的負(fù)面或正面決定基的一個(gè)或多個(gè)特定氨基酸殘基，來設(shè)計(jì)具有類似或改善性能的MPX741和MPX742肽的變體?？刹捎妙愃朴谝陨蠈?shí)施例6中描述的方法以及本領(lǐng)域公知的方法來測試這些MPX741和MPX742肽變體的功能活性。例如，側(cè)鏈截?cái)嗫捎糜谝员彼嵫豈PX741和MPX742肽的序列一次置換一個(gè)氨基W.(M女口Gautametal.1995,"Bindingofaninvariant-chainpeptide,CLIP,toI-AmajorhistocompatibilitycomplexclassIImolecules(恒定鏈妝CLIP與I-A組織相容性復(fù)合物II類分子的結(jié)合)"procNatlAcadSciUSA,92:335_9中描述的)。待通過這種方法測試的MPX741和MPX742肽變體包括示于SEQIDNOs274-320的那些序列。另外，丙氨酸可沿MPX741和MPX742肽置換多個(gè)殘基，特別是存在帶負(fù)電殘基的位置。還涉及增加或減小MPX741和MPX742肽的長度也將在很多情況下仿效或改善該肽的一種或多種性能。因此將采用本文描述的方法和/或本領(lǐng)域公知的其它方法測試減小長度的MPX741和MPX742變體對肥大細(xì)胞活化和超敏性的作用。這類MDDl肽變體的示例性序列示于SEQIDNOs:321-374。還涉及對應(yīng)全長PHLDAlPH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:10)以及PHLDA1PH結(jié)構(gòu)域中其它特定區(qū)域的競爭肽將能夠調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化，因此影響到超敏反應(yīng)。采用類似于上文實(shí)施例6中描述的方法和/或本領(lǐng)域公知的其它方法測試一系列重疊的20聚體肽(SEQIDNOs14、15和185-225)和12聚體肽(SEQIDNOs=375-488)。也將測試這些肽的具有沿該鏈的單/多丙氨酸置換的變體。對應(yīng)于PHLDAlPH結(jié)構(gòu)域的示例性肽序列(及其變體)示于SEQIDNOs=274-488,將合成它們并測試其對肥大細(xì)胞活化/超敏性的作用。實(shí)施例10組合物(i)可注射的胃腸外組合物可通過將0.005mg至5g的再一種適合的藥劑或本發(fā)明的化合物混合進(jìn)10%體積比的丙二醇和水中，來制備適合于注射給藥形式的本發(fā)明藥物組合物。(ii)用于口服給藥的組合物可以通過將0.005mg至5g的粉末形式藥劑或化合物、IOOmg乳糖、35mg滑石粉和IOmg硬脂酸鎂填充進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的兩件式硬明膠膠囊，來制備膠囊形式的本發(fā)明的再一種適合的藥劑或本發(fā)明的化合物的組合物。(iii)吸入給藥的組合物對于容量20_30mL的氣霧劑容器將0.005mg至5g的再一種適合的藥劑或本發(fā)明的化合物、0.5-0.8%重量比的潤滑劑如聚山梨醇酯85或油酸的混合物分散在諸如氟利昂的推進(jìn)劑中，并將其裝入適當(dāng)?shù)臍忪F劑容器中用于鼻內(nèi)或口腔吸入給藥。權(quán)利要求調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化的肽，所述肽包含對應(yīng)以下結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，或(ii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域。2.如權(quán)利要求1所述的肽，所述肽包含SEQIDNO:7所示的氨基酸。3.如權(quán)利要求1所述的肽，所述肽包含SEQIDNO:8或SEQIDNOs14-273中任一所示的氨基酸。4.如權(quán)利要求1所述的肽，所述肽包含SEQIDN0:11或SEQIDNO:12所示的氨基酸。5.如權(quán)利要求1所述的肽，所述肽包含SEQIDN0:10或SEQIDNOs:274_488中任一所示的氨基酸。6.抑制或預(yù)防個(gè)體中肥大細(xì)胞活化的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體治療有效量的蛋白，所述蛋白包含以下中的至少一種(i)Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域，(ii)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，(iii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域，(iv)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的肽。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述肥大細(xì)胞活化為IgE介導(dǎo)的。8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述肥大細(xì)胞活化為非IgE介導(dǎo)的。9.治療或預(yù)防個(gè)體中超敏疾病或病癥的方法，所述方法包括向所述個(gè)體給予治療有效量的蛋白，所述蛋白包含以下中的至少一種(i)Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域，(ii)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，(iii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域，(iv)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的肽。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述超敏疾病或病癥包括肥大細(xì)胞活化。11.如權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述超敏疾病或病癥包括炎性反應(yīng)。12.如權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述超敏疾病或病癥選自過敏反應(yīng)、藥物反應(yīng)、皮膚變應(yīng)性、濕疹、變應(yīng)性鼻炎、蕁麻疹、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸過敏、食物變應(yīng)性、變應(yīng)性結(jié)膜炎、昆蟲毒液變應(yīng)性以及呼吸疾病和病癥。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述呼吸疾病或病癥選自哮喘、變應(yīng)性哮喘、內(nèi)源性哮喘、職業(yè)性哮喘、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(C0PD)。14.調(diào)節(jié)個(gè)體中免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括向所述個(gè)體給予治療有效量的蛋白，所述蛋白包含以下中的至少一種(i)Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域，(ii)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，(iii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域，(iv)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的肽。15.如權(quán)利要求6至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白為NEDD9。16.如權(quán)利要求6至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白為PHLDA1。17.抑制或預(yù)防個(gè)體中肥大細(xì)胞活化的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體治療有效量的肽，所述肽包含對應(yīng)以下結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，或(ii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域。18.治療或預(yù)防個(gè)體中超敏疾病或病癥的方法，所述方法包括給予所述個(gè)體治療有效量的肽，所述肽包含對應(yīng)以下結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，或(ii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述超敏疾病或病癥包括肥大細(xì)胞活化。20.如權(quán)利要求18或19所述的方法，其中所述超敏疾病或病癥包括炎性反應(yīng)。21.如權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述超敏疾病或病癥選自過敏反應(yīng)、藥物反應(yīng)、皮膚變應(yīng)性、濕疹、變應(yīng)性鼻炎、蕁麻疹、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸過敏、食物變應(yīng)性、變應(yīng)性結(jié)膜炎、昆蟲毒液變應(yīng)性以及呼吸疾病和病癥。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述呼吸疾病或病癥選自哮喘、變應(yīng)性哮喘、內(nèi)源性哮喘、職業(yè)性哮喘、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(C0PD)。23.調(diào)節(jié)個(gè)體中免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括向所述個(gè)體給予治療有效量的肽，所述肽包含對應(yīng)以下結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列(i)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，或(ii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域。24.如權(quán)利要求17至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述肽包含SEQIDNO7所示的氨基酸序列。25.如權(quán)利要求17至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述肽包含SEQIDNO8所示的氨基酸序列。26.如權(quán)利要求17至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述肽包含SEQIDN0:11所示的氨基酸序列。27.如權(quán)利要求17至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述肽包含SEQIDNO12所示的氨基酸序列。28.抑制肥大細(xì)胞活化的方法，所述方法包括抑制(i)NEDD9蛋白Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域(ii)PHLDAl蛋白pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域之一或二者與肥大細(xì)胞受體的結(jié)合。29.治療或預(yù)防個(gè)體中超敏疾病或病癥的方法，所述方法包括抑制(i)NEDD9蛋白Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域(ii)PHLDAl蛋白pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域之一或二者與肥大細(xì)胞受體的結(jié)合。30.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其中所述抑制包括給予包含對應(yīng)NEDD9蛋白Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域或PHLDA1蛋白pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列的肽。31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述對應(yīng)NEDD9蛋白Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域的至少一部分的肽包含SEQIDN0:7或SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述對應(yīng)PHLDA1蛋白pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域的至少一部分的肽包含選自SEQIDN0:10、SEQIDN0:11和SEQIDN0:12的氨基酸序列。33.包含(i)Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域，(ii)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，(iii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域，(iv)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的肽中的至少一種的蛋白在制備用于治療超敏疾病或病癥的藥物中的用途。34.如權(quán)利要求33所述的用途，其中所述蛋白為NEDD9。35.如權(quán)利要求33所述的用途，其中所述蛋白為PHLDA1。36.包含對應(yīng)(i)Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域，或(ii)pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域的至少一部分的氨基酸序列的肽在制備治療超敏疾病或病癥的藥物中的用途。37.如權(quán)利要求36所述的用途，其中所述肽包含選自SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDN0:11、SEQIDNO:12的氨基酸序列。38.如權(quán)利要求33至37中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述超敏疾病或病癥選自過敏反應(yīng)、藥物反應(yīng)、皮膚變應(yīng)性、濕疹、變應(yīng)性鼻炎、蕁麻疹、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸過敏、食物變應(yīng)性、變應(yīng)性結(jié)膜炎、昆蟲毒液變應(yīng)性以及呼吸疾病和病癥。39.如權(quán)利要求38所述的用途，其中所述呼吸疾病或病癥選自哮喘、變應(yīng)性哮喘、內(nèi)源性哮喘、職業(yè)性哮喘、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)以及慢性阻塞性肺病(C0PD)。40.鑒定調(diào)節(jié)包含Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域、Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域或pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域中的至少一種的蛋白的活性的試劑的方法，所述方法包括(a)使候選試劑與所述蛋白在適合于允許所述候選試劑與所述蛋白相互作用的條件下接觸；以及(b)測定所述蛋白的活性。41.篩選多種候選試劑以鑒定調(diào)節(jié)包含Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域、Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域或pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域中的至少一種的蛋白的活性的試劑的方法，所述方法包括(a)使多種候選試劑與所述蛋白在適合于允許所述候選試劑與所述蛋白相互作用的條件下接觸；以及(b)測定所述蛋白的活性。42.如權(quán)利要求40或41所述的方法，其中所述蛋白為NEDD9或PHLDA1。43.如權(quán)利要求40至42中任一項(xiàng)所述的方法，其中測定所述蛋白的活性包括測量肥大細(xì)胞活化的水平。44.如權(quán)利要求40至43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述候選試劑為所述蛋白的激動(dòng)劑。45.如權(quán)利要求40至43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述候選試劑為所述蛋白的激動(dòng)劑。全文摘要本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的肽，所述肽包含對應(yīng)于Src同源3(SH3)結(jié)構(gòu)域、Src同源2(SH2)結(jié)構(gòu)域或pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域之一的至少一部分的氨基酸序列。文檔編號(hào)C07K14/435GK101835799SQ200880113181公開日2010年9月15日申請日期2008年8月25日優(yōu)先權(quán)日2007年8月24日發(fā)明者大衛(wèi)·利納瑞斯·般丁,彼得·J·米爾伯恩,迭戈·席爾瓦申請人:麥萊克薩有限公司