專利名稱：修飾的生長激素多肽的制作方法
修飾的生長激素多肽本發(fā)明涉及修飾的生長激素融合蛋白和包含所述融合蛋白的二聚體；編碼所述蛋 白的核酸分子和使用所述蛋白的治療方法。生長激素(GH)是對(duì)于兒童期線性生長和成年正常機(jī)體組成來說重要的合成代謝 的細(xì)胞因子激素。GH活性的調(diào)節(jié)復(fù)雜且涉及許多相互作用的多肽和肽激動(dòng)劑以及拮抗劑。 GH可通過結(jié)合生長激素受體直接介導(dǎo)其作用或通過刺激胰島素樣生長因子-1 (IGF-I)間 接介導(dǎo)其作用。因此，GH的主要作用是刺激肝臟產(chǎn)生IGF-I。另外，GH的分泌由兩種具有 相反活性的肽激素控制。生長激素釋放激素(GHRH)是一種由下丘腦弓狀核產(chǎn)生的44氨基 酸肽。其功能是刺激腦垂體前葉產(chǎn)生GH。促生長素抑制素是一種對(duì)抗GHRH的作用的肽激 素，由較大的前多肽原加工成14和28氨基酸形式。促生長素抑制素由下丘腦的室旁核的 神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌至與腦垂體前葉連接的下丘腦-垂直門脈系統(tǒng)中，在腦垂體前葉其抑 制GH的分泌。GH通過GH上被稱為位點(diǎn)1和位點(diǎn)2的兩個(gè)分離的位點(diǎn)順序結(jié)合兩種膜結(jié)合生長 激素受體(GHR)。位點(diǎn)1是高親和力結(jié)合位點(diǎn)，位點(diǎn)2是低親和力位點(diǎn)。單個(gè)的GH分子通 過位點(diǎn)1結(jié)合1GHR。然后通過位點(diǎn)2募集第二 GHR而形成GHR =GH =GHR復(fù)合體。然后，復(fù) 合體被內(nèi)化并激活導(dǎo)致基因表達(dá)變化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)。GHR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域作為兩種連接 的結(jié)構(gòu)域存在，各自約100個(gè)氨基酸(SD-100)，C末端SD-100結(jié)構(gòu)域(b)與細(xì)胞表面最接 近，N末端SD-100結(jié)構(gòu)域(a)與細(xì)胞表面最遠(yuǎn)。在三聚體復(fù)合體GHR-GH-GHR形成時(shí)，在激 素結(jié)合上發(fā)生這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變。GH過量與許多疾病狀況有關(guān)，例如，肢端肥大癥和垂體性巨大發(fā)育。大多數(shù)GH過 量的情況源于腦垂體前葉的生長激素細(xì)胞中的腦垂體腫瘤。這些腫瘤是良性的且逐漸增加 GH的分泌。生長激素過量的癥狀包括頌、指、趾的骨骼增厚，神經(jīng)/肌肉壓力以及胰島素抵 抗。腫瘤相關(guān)的GH過量的最初治療是手術(shù)去除腦垂體腫瘤。后來，使用GH拮抗劑抑制GH 信號(hào)傳導(dǎo)由于其非侵入特性而變成優(yōu)選治療。GH拮抗劑可以是促生長素抑制素的重組形式 或促生長素抑制素類似物(例如，奧曲肽(octreotide)，蘭瑞肽(lanreotide))或修飾的 GH。修飾的GH 拮抗劑的綜述在 Kopchick (2003) European Journal ofEndocrinology(《歐洲內(nèi)分泌學(xué)雜志》)148 ；S21-25中有提供，該文獻(xiàn)描述了可商購獲得 的稱為培維索孟(pegvisomant)的GH拮抗劑，其將在G120修飾人GH與添加聚乙二醇結(jié)合 來增加修飾的GH的分子量。與生長激素給藥有關(guān)的問題是其通過腎臟過濾和/或蛋白酶解 快速清除。添加聚乙二醇減少這種喪失。然而，已知聚乙二醇減小GH對(duì)于GHR的親和力， 并因此為補(bǔ)償該減小的親和力，有必要進(jìn)行高量修飾的GH的給藥。這可導(dǎo)致副作用。提供 修飾的GH拮抗劑是合乎需要的，所述修飾的GH拮抗劑可以在減小的劑量下給藥，由此避免 培維索孟相關(guān)問題。這可以是給藥量減小或給藥頻率減小。在我們的共同未決的申請(qǐng)W003/070765中，我們描述了修飾的GH融合蛋白，其包 括對(duì)于GH中位點(diǎn)1和位點(diǎn)2的修飾。這些修飾的GH分子與GHR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域融合。在 這里，我們公開了修飾的GH融合蛋白，其具有大大延長的血清半衰期，并形成二聚體，這可能與通過減小腎清除率或保護(hù)修飾的GH免受蛋白酶解的這些融合蛋白的改進(jìn)的藥物代謝 動(dòng)力學(xué)有關(guān)。這些生長激素融合蛋白的改進(jìn)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式(profiles)將允許不 需要多次給藥且減輕不想要的副作用的治療方案。根據(jù)本發(fā)明一方面，提供了核酸分子，其包含選自如下的核酸序列i)SEQ ID NO 1所示的核酸序列；ii)SEQ ID NO 2所示的核酸序列；iii)SEQ ID NO 4所示的核酸序列；iv) SEQ ID NO 5所示的核酸序列；v) SEQ ID NO 7所示的核酸序列；vi) SEQ ID NO 8所示的核酸序列；vii) SEQ ID NO 10所示的核酸序列；viii)SEQ ID NO 11 所示的核酸序列；ix) SEQ ID NO 13所示的核酸序列；x) SEQ ID NO 14所示的核酸序列；xi) SEQ ID NO 16所示的核酸序列；xii) SEQ ID NO 17所示的核酸序列；xiii)SEQ ID NO 19 所示的核酸序列；xiv) SEQ ID NO 20所示的核酸序列；xv) SEQ ID NO 22所示的核酸序列；xvi) SEQ ID NO 23所示的核酸序列；xvii)核酸分子，其包含在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與SEQ ID NO :1、2、4、5、7、8、10、11、13、 14、16、17、19、20、22或23雜交并編碼具有生長激素受體拮抗劑活性的多肽的核酸序列。當(dāng)兩個(gè)互補(bǔ)的核酸分子相互之間經(jīng)歷一定量氫鍵合時(shí)，發(fā)生核酸分子的雜交。根 據(jù)核酸周圍的環(huán)境條件、雜交方法的性質(zhì)以及所使用的核酸分子的組成和長度，雜交的 嚴(yán)謹(jǐn)性可不同。關(guān)于達(dá)到特定程度的嚴(yán)謹(jǐn)性所需要的雜交條件的計(jì)算在如下文獻(xiàn)中討 論Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手 冊(cè)》(紐約冷泉港，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，2001)；和Tijssen，Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic AcidProbes (生物 化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-使用核酸探針雜交，第I部分，第二章)(紐約愛思唯爾， 1993)。Tm是50%的給定的核酸分子鏈與其互補(bǔ)鏈雜交的溫度。下列是一系列示例的雜交 條件，不限于極高嚴(yán)謹(jǐn)性(允許共有至少90%同一性的序列雜交)雜交5XSSC，65°C，16小時(shí)洗滌兩次2 X SSC,室溫(RT)，各I5分鐘洗滌兩次0.5XSSC，65°C，各 20 分鐘高嚴(yán)謹(jǐn)性(允許共有至少80%同一性的序列雜交)雜交:5X-6XSSC,65°C_70°C，16-20 小時(shí)洗滌兩次2X SSC, RT,各5-20分鐘洗滌兩次1X SSC, 550C -70°C，各 30 分鐘
低戶謎(介Λ糊辟Φ 50%胃一性請(qǐng)歹丨丨棘)雜交6XSSC，RT-55°C,16-20 小時(shí)洗滌至少兩次2X_3XSSC，RT_55°C，各20-30 分鐘。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID NO 1所 示的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID NO :2所 示的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID NO 4所 示的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID N0:5所 示的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID N0:7所 示的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID NO :8所 示的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID N0:10所 示的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID N0:11所 示的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID N0:13所 示的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID N0:14所 示的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID N0:16所 示的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID N0:17所 示的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID N0:19所 示的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID N0:20所 示的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID N0:22所 示的核酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子包含或其組成為SEQ ID NO :23所 示的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明一方面，提供了由根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼的多肽。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了包含選自以下的氨基酸序列的多肽i)SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列；ii)SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列；
iii)SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列；iv) SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列；v) SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列；vi) SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列；vii) SEQ ID NO 21所示的氨基酸序列；viii) SEQ ID NO 24所示的氨基酸序列；ix) SEQ ID NO 25所示的氨基酸序列；x) SEQ ID NO 26所示的氨基酸序列；xi) SEQ ID NO 27所示的氨基酸序列；xii) SEQ ID NO 28所示的氨基酸序列；xiii) SEQ ID NO 29所示的氨基酸序列；xiv) SEQ ID NO 30所示的氨基酸序列；xv) SEQ ID NO 31所示的氨基酸序列；xvi) SEQ ID NO :32所示的氨基酸序列，其中，所述多肽具有生長激素受體拮抗劑 活性。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 3所示的
氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 6所示的
氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 9所示的
氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 12所示的
氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 15所示的
氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 18所示的
氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 21所示的
氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 24所示的
氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 25所示的
氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 26所示的
氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 27所示的
氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 28所示的
氨基酸序列。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 29所示的
氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 30所示的
氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 31所示的
氨基酸序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽包含或其組成為SEQID NO 32所示的
氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其 組成為 SEQ ID NO :3ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其 組成為 SEQ ID NO :6ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其 組成為 SEQ ID NO :9ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其 組成為 SEQ ID NO :12ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其 組成為 SEQ ID NO :15ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其 組成為 SEQ ID NO :18ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其 組成為 SEQ ID NO :21ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其 組成為 SEQ ID NO :24ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其 組成為 SEQ ID NO :25ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其 組成為 SEQ ID NO :26ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其 組成為 SEQ ID NO :27ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其 組成為 SEQ ID NO :28ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其 組成為 SEQ ID NO :29ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其 組成為 SEQ ID NO :30ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其 組成為 SEQ ID NO :31ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其組成為 SEQ ID NO :32ο根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的載體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體是適于表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的 表達(dá)載體。包含根據(jù)本發(fā)明的核酸的載體不需要包含啟動(dòng)子或其他調(diào)控序列，特別是在載體 被用于將核酸導(dǎo)入細(xì)胞以重組至基因組中進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的情況。優(yōu)選地，載體中的核酸可 操作地與合適的啟動(dòng)子或用于在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的其他調(diào)控元件連接。載體可以是在多種 宿主中起作用的雙功能表達(dá)載體?！皢?dòng)子”是指轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游且含有轉(zhuǎn)錄所需的所有 調(diào)控區(qū)域的核苷酸序列。合適的啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、可誘導(dǎo)啟動(dòng) 子、發(fā)育啟動(dòng)子或其他用于在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子?！翱刹僮鞯剡B接”是指作為 相同核酸分子的部分而加入，合適地定位和取向以用于自啟動(dòng)子起始的轉(zhuǎn)錄。可操作地連 接啟動(dòng)子的DNA是在啟動(dòng)子的“轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控下”。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子、可誘導(dǎo)啟動(dòng)子或可調(diào)控 啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了使用根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的 細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞?？蛇x地，所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞選自真菌細(xì)胞(例如，畢赤酵母 (Pichia spp)、酵母(Saccharomyces spp)、鏈抱菌(Neurosporaspp)；昆蟲細(xì)胞(例如，夜 蛾(Spodoptera spp)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞)；植物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的多肽的藥物組合物，所述組合 物含有賦形劑或運(yùn)載體(carrier)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物與另一治療劑組合。當(dāng)給藥時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物以藥學(xué)上可接受的制劑給藥。所述制劑可常規(guī)含 有藥學(xué)上可接受的濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、相容的運(yùn)載體以及任選其他治療劑。本發(fā)明的藥物組合物可通過任何常規(guī)途徑給藥，包括注射。給藥和應(yīng)用可為例如， 口服、靜脈、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、腔內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下、局部(眼睛)、真皮(例如，至皮膚或粘膜內(nèi) 的乳膏脂溶性插入片段)、經(jīng)皮或鼻內(nèi)。本發(fā)明的藥物組合物以有效量進(jìn)行給藥?！坝行Я俊笔菃为?dú)或與另外的劑量或協(xié)同 藥物一起產(chǎn)生所需反應(yīng)的藥物/組合物的量。這可僅涉及暫時(shí)放緩疾病的進(jìn)展，但更優(yōu)選 地，其涉及永久終止疾病的進(jìn)展。這可通過常規(guī)方法監(jiān)測或可根據(jù)診斷方法監(jiān)測。給藥于個(gè)體的所述藥物組合物的劑量可根據(jù)不同參數(shù)選擇，特別地根據(jù)所使用的 給藥模式和個(gè)體的情況(即，年齡、性別)選擇。當(dāng)給藥時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物以藥學(xué)上 可接受的量和以藥學(xué)上可接受的組合物給藥。當(dāng)以藥用鹽使用時(shí)，應(yīng)該是藥學(xué)上可接受的 鹽，但非藥學(xué)上可接受的鹽可方便地用于制備其藥學(xué)上可接受的鹽且不被排除于本發(fā)明的 范圍之外。這些藥理學(xué)和藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于由下列酸制備而來的那些鹽酸、 氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。另外，藥 學(xué)上可接受的鹽可制備成堿金屬鹽或堿土金屬鹽，例如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。如果需要的話，所述藥物組合物可以與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體組合。如本文所使用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體”是指適于給藥至人體中的一種或多種相容的固體或液 體填充劑、稀釋劑或包囊物質(zhì)。術(shù)語“運(yùn)載體”是指活性成分與其組合以便于應(yīng)用的天然或 合成的、有機(jī)或無機(jī)成分。所述藥物組合物的組分還能夠以下述方式與本發(fā)明的分子共混 和相互之間共混，即，使得不存在實(shí)質(zhì)上破壞所需的藥效功效的相互作用的方式。所述藥物組合物可含有合適的緩沖劑，包括在鹽中的乙酸，在鹽中的檸檬酸、在鹽 中的硼酸以及在鹽中的磷酸。所述藥物組合物還可任選含有合適的防腐劑，例如氯化苯甲烴銨、三氯叔丁醇、 對(duì)羥苯甲酸酯以及硫柳汞。所述藥物組合物可方便地以單位劑型提供，且可通過藥學(xué)領(lǐng)域公知的任何方法制 備。所有方法均包括將活性劑與構(gòu)成一種或多種附加成分的運(yùn)載體聯(lián)合的步驟。通常，通 過均一和緊密地將活性化合物與液體載體、細(xì)粒固體載體或這兩者聯(lián)合且然后如果需要的 話使產(chǎn)物成形，來制備所述組合物。適于口服給藥的組合物可作為分離的單位提供，例如膠囊、片劑、錠劑，各自含有 預(yù)定量的活性化合物。其他組合物包括水性液或非水性液形式的混懸液，例如糖漿劑、酏劑 或乳劑。適于腸胃外給藥的組合物方便地包含無菌水性或非水性制劑，其優(yōu)選與受者血液 等滲的。該制劑可以根據(jù)已知方法使用合適的分散劑或濕潤劑以及混懸劑來配制。無菌可 注射的制劑也可以是于無毒性的腸胃外可接受的稀釋劑或溶液中的無菌可注射的溶液或 混懸液，例如作為于1，3_ 丁二醇中的溶液。在可以應(yīng)用的可接受的溶劑中有水、林格氏溶 液以及等滲氯化鈉溶液。另外，無菌非揮發(fā)性油被方便地用作溶劑或懸浮介質(zhì)。對(duì)于該目 的，任何溫和的非揮發(fā)性油可被應(yīng)用，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。另外，脂肪酸、例如 油酸可用于注射劑的制劑中。適于口服、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)等給藥的運(yùn)載體制劑可以見 于 Remington’ sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA(《雷明頓 藥學(xué)》，賓夕法尼亞，伊斯頓，麥克出版公司)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了治療患有生長激素過量的人個(gè)體的方法，其包括 給予有效量的至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述多肽靜脈內(nèi)給藥。在本發(fā)明的一個(gè)可選的優(yōu)選方法中，所述多肽皮下給藥。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述多肽每天給藥或以兩天間隔給藥，優(yōu)選地， 所述多肽以一周、兩周或一月間隔給藥。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述生長激素過量導(dǎo)致肢端肥大癥。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述生長激素過量導(dǎo)致巨人癥。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了治療患有癌癥(cancer)的人個(gè)體的方法，其包括 給予有效量的至少一種根據(jù)本發(fā)明的多肽。如本文所使用，術(shù)語“癌癥”是指細(xì)胞具有自主生長能力，即特征為快速增殖細(xì)胞 生長的異常狀態(tài)或異常狀況。該術(shù)語意于包括所有類型的癌性生長或致癌過程、轉(zhuǎn)移的組 織或惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或器官，而不管組織病理學(xué)類型或侵入的階段。術(shù)語“癌癥”包 括各種器官系統(tǒng)的惡性腫瘤，諸如，影響例如肺臟、乳房、甲狀腺、淋巴、胃腸以及生殖泌尿 道的那些；和腺癌，包括惡性腫瘤，諸如，大多數(shù)結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌和/或睪丸腫
12瘤、非小細(xì)胞肺癌、小腸癌以及食管癌。術(shù)語“癌(carcinoma)”是本領(lǐng)域公知的，是指上皮 組織或內(nèi)分泌組織的惡性腫瘤，包括呼吸系統(tǒng)癌、胃腸系統(tǒng)癌、生殖泌尿系統(tǒng)癌、睪丸癌、乳 癌、前列腺癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌以及黑素瘤。示例性癌包括由宮頸、肺、前列腺、乳房、頭和頸、 結(jié)腸以及卵巢的組織形成的那些。術(shù)語“癌”還包括癌肉瘤，例如包括由癌瘤性和肉瘤性組 織組成的惡性腫瘤?！跋侔笔侵秆苌韵袤w組織或其中腫瘤細(xì)胞形成可識(shí)別的腺體結(jié)構(gòu)的 癌。術(shù)語“肉瘤”是本領(lǐng)域公知的，是指間充質(zhì)衍生的惡性腫瘤。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法中，所述癌癥是前列腺癌。貫穿本申請(qǐng)的說明書和權(quán)利要求書，文字“包括(comprise) ”和“包含(contain) ” 以及其變型，例如“包括(comprising) ”和“包括(comprises) ”，意思是“包括但不限于 (including but not limited to)”，且非意于(和不)排除其他的部分、添加劑、組分、整
數(shù)或步驟。貫穿本申請(qǐng)的說明書和權(quán)利要求書，除非上下文另有需要，單數(shù)包括復(fù)數(shù)。特別 地，除非上下文另有需要，在使用不定冠詞的情況下，應(yīng)理解為本申請(qǐng)考慮了復(fù)數(shù)和單數(shù)。本發(fā)明的結(jié)合特定方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├枋龅奶卣鳌⒄麛?shù)、特性、化合物、化學(xué) 部分或基團(tuán)，應(yīng)理解為適于本文描述的任何其他方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├?，除非與之不相容?，F(xiàn)在，僅通過實(shí)施例和參照下列附圖描述本發(fā)明的實(shí)施方案。表1描述了 1Β8ν2部分的Bradford測定。圖Ia 1Β8νΟ 由通過G4Sx4連接子與GHR細(xì)胞外(結(jié)構(gòu)域1和2)連接的GH (含 有位點(diǎn)1突變)而構(gòu)成該構(gòu)建體在連接子區(qū)域周圍和3’末端含有限制酶切位點(diǎn)，圖Ib是 編碼的氨基酸序列。圖2a 1Β8ν1 該分子衍生自1Β8νΟ，但在5’和3’末端不含有外來序列，并且含有 G4Sx4連接子；圖2b是編碼的氨基酸序列。圖3a 1Β8ν2 該分子衍生自1Β8νΟ，但不含有外來序列，并且含有G4Sx5連接子； 圖3b是編碼的氨基酸序列。圖4a 1Β8ν3 該分子衍生自IBSvO，但不含有外來序列且不含有連接子；圖4b是 編碼的氨基酸序列。圖5a 1Β9νΟ 由通過G4Sx4連接子與GHR(結(jié)構(gòu)域1和2)連接的GH(含有位點(diǎn)1 和位點(diǎn)2突變)而構(gòu)成該構(gòu)建體在連接子區(qū)域周圍和3’末端含有限制酶位點(diǎn)；圖5b是編 碼的氨基酸序列。圖6a 1Β9ν1 該分子衍生自1Β9νΟ，但在5’和3’末端不含有外來序列，并且含有 G4Sx4連接子；圖6b是編碼的氨基酸序列。圖7a 1Β9ν2 該分子衍生自1Β9νΟ，但不含有外來序列，并且含有G4Sx5連接子； 圖7b是編碼的氨基酸序列。圖8a 1Β9ν3 該分子衍生自1Β9νΟ，但不含有外來序列且不含有連接子，圖8b是編 碼的氨基酸序列。圖9描述了用于將G120R分子亞克隆至哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒中的基本連接策略。

圖10描述了 1Β9νΟ的構(gòu)建。圖11描述了 1Β8ν2片段=Narl-AvrII (524bp)。新連接子區(qū)域以粗體顯示，限制酶
13切位點(diǎn)加下劃線。該片段與質(zhì)粒pGHsecTag-lB8Vl連接而產(chǎn)生質(zhì)粒pGHsecTag-lB8V2。圖12描述了 1Β9ν2片段=Narl-AvrII (524bp)。新連接子區(qū)域以粗體顯示，限制酶 切位點(diǎn)加下劃線。該片段與質(zhì)粒pGHsecTag-lB9Vl連接而產(chǎn)生質(zhì)粒pGHsecTag-lB9V2。圖13顯示了使用GH特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡(Western blot)，以檢測1Β8ν2 (泳 道1和泳道2)和1Β9ν2(泳道3) 二者從穩(wěn)定的CHO Flp-In細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)基的表達(dá)。 樣品具有所預(yù)期的各蛋白質(zhì)(約75kDa)的正確大小，且顯示無降解的跡象。圖14描述了在存在0. 5nM rhGH(+)的情況下，來自1Β8ν2和1Β9ν2穩(wěn)定細(xì)胞系的 培養(yǎng)基樣品能夠拮抗rhGH的作用。在不存在0. 5nM GH(-)的情況下，兩種分子均不顯示生 物活性。顯示了 GH的標(biāo)準(zhǔn)曲線(0-5nM)。圖15a顯示了通過考馬斯染色對(duì)純化的蛋白組分的SDS-PAGE分析。圖像顯示了 純化的蛋白(1Β8ν2)具有預(yù)期的正確大小(約75kDa)，且未觀察到較低分子量的降解產(chǎn)物， 圖15b顯示了 1Β9ν2的SDS-PAGE分析。圖16a 在皮下給藥后，注射后24小時(shí)1B8血清蛋白水平達(dá)到峰值。在給藥后10 天仍舊可以檢測出1B8 ；圖16b 在靜脈內(nèi)給藥后，注射后1小時(shí)1B8血清蛋白水平達(dá)到峰 值，然后急劇下降。圖17a非變性PAGE (Native-PAGE)樣品的蛋白質(zhì)印跡1 :1Β7νΟ非變性GH融合蛋 白，2 :1Β7ν1非變性GH，3 1Β7ν2非變性GH，4 :1Β7ν3非變性GH，5 :1B8修飾的GH融合蛋白。 所有樣品顯示了明顯的雙帶，其特征是單體和二聚體形成；圖17b 顯示二聚體形成的等同 的考馬斯染色凝膠。圖18描述了 5個(gè)劑量給藥的培維索孟與單劑量給藥的1B8和1B9相比較，在12 天期間紐西蘭白兔的％體重增加。圖19描述了紐西蘭白兔中1B8在250小時(shí)期間的藥物代謝動(dòng)力學(xué)(PK)。材料和方法1B8拮抗劑分子的構(gòu)建將該分子構(gòu)建成使得GH分子(G120R)的位點(diǎn)2 (低親和力位點(diǎn))中的氨基酸甘氨 酸-120突變成精氨酸。GH分子通過高親和力位點(diǎn)1與GH受體的結(jié)合不受影響，然而，通過 GH位點(diǎn)2與受體結(jié)合受到精氨酸分子的大側(cè)基抑制。預(yù)先將PCR策略用于產(chǎn)生含有G120R突變的GH分子，并且使用合適的限制酶切位 點(diǎn)，使得該分子克隆至pTrc-His表達(dá)質(zhì)粒中，以產(chǎn)生克隆pTrc-His-lA7 (G120R與GHR細(xì)胞 外B結(jié)構(gòu)域連接)。然后從該載體切除300bp Bsu36I-Not 1片段，并將其連接至哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒 pGHsecTag-lB7中(GH與GHR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域A和B連接)，以產(chǎn)生pGHsecTag_lB8 (通過GH 分泌信號(hào)指導(dǎo)分泌性表達(dá))。參見圖9。1Β9νΟ拮抗劑分子的構(gòu)建已經(jīng)將該分子構(gòu)建成使得GH分子的位點(diǎn)2和位點(diǎn)2 二者中的氨基酸均突變。這 些突變?cè)鰪?qiáng)了 GH分子通過高親和力位點(diǎn)1與GH受體的結(jié)合，而單甘氨酸至精氨酸的改變 抑制通過GH位點(diǎn)2與受體的結(jié)合。單鏈DNA位點(diǎn)指導(dǎo)的突變策略用于產(chǎn)生含有位點(diǎn)1和位點(diǎn)2突變的GH分子。合適 的限制酶切位點(diǎn)的使用允許該分子克隆至PTrc-His和pET21a(+)表達(dá)含有具有側(cè)翼Nhel和Notl位點(diǎn)的GH信號(hào)序列(GHss)的克隆。將它連接至哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì) 粒pGHsecTag-lB8vO中(GH與GHR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域A和B連接)，以產(chǎn)生pGHsecTag_lB9vO (通 過GH分泌信號(hào)指導(dǎo)分泌性表達(dá))。參見圖10。1Β8νΟ和1Β9νΟ的變體克降的構(gòu)津使用限制酶Hindlll-EcoRV消化質(zhì)粒pGHSeCTag-lB7V3，并將片段連接至質(zhì)粒 pGHsecTag-lB8vO 和 1Β9νΟ，以構(gòu)建質(zhì)粒 pGHsecTag_lB8vl 和 1Β9ν1 (這些分子在 3，引發(fā) 末端不含有任何錯(cuò)誤序列)。下一步是去除連接子區(qū)域周圍的限制酶切位點(diǎn)，以產(chǎn)生質(zhì)粒 PGHseTag-lB8v2和1Β9ν2。這使用基因合成來完成，其中原始的連接子被G4Sx5連接子替換。通過基因合成構(gòu)建以下具有側(cè)翼限制酶切位點(diǎn)NarI和AvrII的片段，并將其連接 至 pGHsecTag-lB8vl 或 1Β9ν1 中，見圖 11 和圖 12。拮抗劑變體分子的體外牛物活件使用GH特異性熒光酶報(bào)告子測定法檢測各嵌合體的體外生物活性?；旧?，人源 細(xì)胞系被人GH受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，且然后被熒光酶信號(hào)傳導(dǎo)報(bào)告子瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。該測定法檢測GH 的生理學(xué)水平，見圖14。拮抗劑分子的純化在無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)CHO Flp-In細(xì)胞系，該細(xì)胞系表達(dá)1Β8ν2和1Β9ν2作為分 泌性產(chǎn)物。親和純化之前收獲、濃縮以及澄清培養(yǎng)基。對(duì)于純化，制備20ml與抗hGH的5E1 單克隆抗體偶聯(lián)的NHS激活的S印harose 4 Fast Flow樹脂。在純化之前，通常10倍濃縮 培養(yǎng)基樣品，并使用結(jié)合緩沖液(25mM Tris HCl/150mM NaCl,pH 7.4)1 1稀釋。將材料以2ml/min流速上樣于的柱子上。洗滌之后，使用200mM的甘氨酸(pH 2.7) 以lml/min洗脫結(jié)合蛋白，然后使用IM Tris HCl，pH9.0中和。通過SDS-PAGE (見圖15a 和圖15b)分析樣品。圖17a和圖17b描述了與非變性生長激素嵌合體相比較的1B9的二 聚體形成。1B8的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究皮下(SC，圖16a)或靜脈內(nèi)(IV，圖16b)給予6只正常健康大鼠單劑量注射的 InMol (75 μ g)蛋白。對(duì)照大鼠僅給予媒介(vehicle)。在10天期間按照時(shí)間間隔取樣，并 使用自建的GH酶聯(lián)免疫吸附測定來分析1B8的存在。
權(quán)利要求
核酸分子，其包含選自如下的核酸序列i)SEQ ID NO1所示的核酸序列；ii)SEQ ID NO2所示的核酸序列；iii)SEQ ID NO4所示的核酸序列；iv)SEQ ID NO5所示的核酸序列；v)SEQ ID NO7所示的核酸序列；vi)SEQ ID NO8所示的核酸序列；vii)SEQ ID NO10所示的核酸序列；viii)SEQ ID NO11所示的核酸序列；ix)SEQ ID NO13所示的核酸序列；x)SEQ ID NO14所示的核酸序列；xi)SEQ ID NO16所示的核酸序列；xii)SEQ ID NO17所示的核酸序列；xiii)SEQ ID NO19所示的核酸序列；xiv)SEQ ID NO20所示的核酸序列；xv)SEQ ID NO22所示的核酸序列；xvi)SEQ ID NO23所示的核酸序列；xvii)包含核酸序列的核酸分子，所述核酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22或23雜交并編碼具有生長激素受體拮抗劑活性的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID Ν0:1所 示的核酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID Ν0:2所 示的核酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID Ν0:4所 示的核酸序列。
5.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID Ν0:5所 示的核酸序列。
6.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID Ν0:7所 示的核酸序列。
7.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID Ν0:8所 示的核酸序列。
8.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID Ν0:10所 示的核酸序列。
9.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID Ν0:11所 示的核酸序列。
10.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID NO 13 所示的核酸序列。
11.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID NO 14所示的核酸序列。
12.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID NO 16 所示的核酸序列。
13.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID NO 17 所示的核酸序列。
14.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID NO 19 所示的核酸序列。
15.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID N0:20 所示的核酸序列。
16.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID N0:22 所示的核酸序列。
17.如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含或其組成為SEQID N0:23 所示的核酸序列。
18.由如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的核酸所編碼的多肽。
19.包含選自以下氨基酸序列的多肽i)SEQID NO :3所示的氨基酸序列；ii)SEQID NO 6所示的氨基酸序列；iii)SEQID NO 9所示的氨基酸序列；iv)SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列；v)SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列；vi)SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列；vii)SEQ ID NO 21所示的氨基酸序列；viii)SEQ ID NO :24所示的氨基酸序列；ix)SEQ ID NO 25所示的氨基酸序列；x)SEQ ID NO 26所示的氨基酸序列；xi)SEQ ID NO 27所示的氨基酸序列；xii)SEQ ID NO :28所示的氨基酸序列；xiii)SEQ ID NO :29所示的氨基酸序列；xiv)SEQ ID NO :30所示的氨基酸序列；xv)SEQ ID NO 31所示的氨基酸序列；xvi)SEQ ID NO :32所示的氨基酸序列；其中，所述多肽具有生長激素受體拮抗劑活性。
20.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDNO :3所示的氨基酸序列。
21.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDNO :6所示的氨基酸序列。
22.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDNO :9所示的氨基酸序列。
23.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDΝ0:12所示的氨基酸序列。
24.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDNO 15所示的氨基酸序列。
25.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDN0:18所示的氨基酸序列。
26.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDNO :21所示的氨基酸序列。
27.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDN0:24所示的氨基酸序列。
28.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDNO 25所示的氨基酸序列。
29.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDNO 26所示的氨基酸序列。
30.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDNO :27所示的氨基酸序列。
31.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDNO 28所示的氨基酸序列。
32.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDNO 29所示的氨基酸序列。
33.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDNO 30所示的氨基酸序列。
34.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDNO :31所示的氨基酸序列。
35.如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述多肽包含或其組成為SEQIDNO 32所示的氨基酸序列。
36.包含兩個(gè)多肽的同型二聚體，所述多肽包含或其組成為SEQIDNO :3;或SEQ ID NO 6 ；SEQ ID NO 9 ；SEQ ID NO 12 ；SEQ ID NO 15 ；SEQ ID NO 18 ；或 SEQ ID NO 21 ；或 SEQ ID NO 24 ；或 SEQ IDNO 25 ；或 SEQ ID NO 26 ；或 SEQ ID NO 27 ；SEQ ID NO 28 ；SEQ IDNO 29 ；或 SEQ ID NO 30 ；或 SEQ ID NO 31 ；或 SEQ ID NO :32。
37.載體，其包含如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的核酸分子。
38.細(xì)胞，所述細(xì)胞為如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的核酸分子或如權(quán)利要求37所述 的載體所轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化。
39.藥物組合物，其包含如權(quán)利要求18-36中任一項(xiàng)所述的多肽，并含有賦形劑或運(yùn)載 體(carrier)0
40.如權(quán)利要求39所述的組合物，其中，所述組合物與另一治療劑組合。
41.治療患有生長激素過量的人個(gè)體的方法，其包括給予有效量的至少一種如權(quán)利要 求18-36中任一項(xiàng)所述的多肽。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中靜脈內(nèi)給予所述多肽。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其中皮下給予所述多肽。
44.如權(quán)利要求41-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述每日或以二天間隔給予所述多
45.如權(quán)利要求41-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中以一周間隔給予所述多肽。
46.如權(quán)利要求41-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中以兩周間隔給予所述多肽。
47.如權(quán)利要求41-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中以一月間隔給予所述多肽。
48.如權(quán)利要求41-47中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生長激素過量導(dǎo)致肢端肥大癥。
49.如權(quán)利要求41-47中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生長激素過量導(dǎo)致巨人癥。
50.治療患有癌癥的人個(gè)體的方法，其包括給予有效量的至少一種如權(quán)利要求18-36 中任一項(xiàng)所述的多肽。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述癌癥是前列腺癌。
全文摘要
本文我們描述了修飾的生長激素融合蛋白和包含所述融合蛋白的二聚體；編碼所述蛋白的核酸分子和使用所述蛋白治療生長激素過量導(dǎo)致的狀況的治療方法。
文檔編號(hào)C07K14/61GK101932600SQ200880106595
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2008年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月10日
發(fā)明者喬恩·塞耶斯, 彼得·阿蒂米克, 理查德·A·羅斯 申請(qǐng)人:埃斯特瑞恩有限公司