專利名稱：人armet蛋白單克隆抗體制備方法及檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種人體蛋白質(zhì)ARMET (Arginine rich, mutated in early stage of tumors,亦稱ARP、 MANF)的表達(dá)純化、單克隆抗體制備及其檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
ARMET (Arginine rich, mutated in early stage of tumors)在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中也被 禾爾為 ARP(arginine-rich protein)或 MANF (mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor),其氨基酸序列見(jiàn)圖1。最初的研究發(fā)現(xiàn)，該基因在早期腫瘤 中有單個(gè)核苷酸突變(Shridhar et al， 1996 a and 1996 b)，而隨后的研究卻發(fā)現(xiàn)， ARMET基因中出現(xiàn)的這種突變屬于正?；虻亩鄳B(tài)性，而非腫瘤所特有(Evron et al., 1997; Tanaka et al.,2000)。這一研究結(jié)果使人們一度失去了對(duì)ARMET的研 究興趣。但Petrova及同事在體外傳代的大鼠中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液中分離 得到的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子MANF，其人類的同類物就是ARMET (Petrova et al., 2003)， 分子量在20kD左右。他們的研究并發(fā)現(xiàn)，重組的人ARMET可選擇性地作用于 體外培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元，促進(jìn)其存活，在低劑量時(shí)作用優(yōu)于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 GDNF和BDNF(Petrova et al, J Mol Neurosci 2003 )。 2007年《Nature》上的 一篇報(bào)道格外引人注意，該研究發(fā)現(xiàn)，含保守序列的多巴胺能神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因 子(Conserved Dopamine Neurotrophic Factor, CDNF)對(duì)多巴胺能神經(jīng)元有保 護(hù)作用(Paivi Lindholm et al， Nature 2007)。而CDNF是ARMET (MANF)的 同類物，都屬于含8個(gè)半胱氨酸保守序列的蛋白家屬，且ARMET與CDNF的 氨基酸同源性為59%。
到目前為止，與ARMET相關(guān)的報(bào)道不超過(guò)10篇，其中早期的(90年代中 期)4篇是關(guān)于它在早期腫瘤中的單基因突變；2篇有關(guān)于它與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān) 系；2篇有關(guān)對(duì)多巴胺能神經(jīng)元影響的報(bào)道(J Mol Neurosci 2003; Neuroreport 2006);還有1篇報(bào)道是關(guān)于它的類似物CDNF對(duì)中腦多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作 用(Nature 2007)。對(duì)ARMET的研究目前世界范圍內(nèi)僅限于幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室，其功能目前還不清楚。對(duì)它的研究目前沒(méi)有廣泛開(kāi)展的原因與缺乏檢測(cè)它的方法有 關(guān)，因?yàn)榈侥壳盀橹惯€沒(méi)有市售的商品化的ARMET蛋白及相關(guān)抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人ARMET蛋白抗體制備方法及檢測(cè)試劑盒，用于 ARMET蛋白的檢測(cè)。
本發(fā)明的的技術(shù)方案如下
人ARMET蛋白抗體制備方法，包括以下步驟
(1) 、 ARMET基因克隆、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化
用限制性內(nèi)切酶(Ncol/Xhol)將人ARMET蛋白的cDNA編碼序列克隆到 pET28a(+)載體上，表達(dá)C端融合6個(gè)組氨酸的重組ARMET蛋白；將pET28a (+ ) -ARMET質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，誘導(dǎo)表達(dá)ARMET蛋白，收集菌體， 純化人ARMET蛋白；
(2) 、 Anti-ARMET單克隆抗體的制備
用純化的人ARMET蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞融合方 法制備Anti-ARMET單克隆抗體，選擇滴度高的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增、凍存， 并注入BALB/c小鼠腹腔生產(chǎn)腹水型抗體；
(3) 、抗體的純化 采用辛酸-硫酸銨沉淀法及親和層析法純化單克隆抗體。 所述的人A脂ET蛋白抗體制備方法，包括以下歩驟其特征在于
(1) 、所述的ARMET基因克隆、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化是指
用限制性內(nèi)切酶(NcoI/Xho1 )將人ARMET的cDNA編碼序列克隆到pET28a(+) 載體上，表達(dá)C端融合6個(gè)組氨酸的重組ARMET蛋白；將pET28a( + )-ARMET 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，置37'C培養(yǎng)箱過(guò)夜，以體積比1:100的比例，接種 于新鮮的含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37。C振蕩培養(yǎng)至菌液A綱為0.6 0.8，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2-4小時(shí)；收集菌體并裂解，取上清液，加入到己預(yù)裝 好的Ni-beads柱中，用含50mmol/L imidazole的緩沖液洗去非特異結(jié)合的蛋白， 再用組份為50腿ol/L NaH2P04 pH8.0、 300謹(jǐn)ol/L NaCI、 250mmol/L imidazole 的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，并將洗脫的蛋白分裝保存在-8(TC冰箱；
(2) 、所述的Anti-ARMET單克隆抗體的制備是指① SP2/0細(xì)胞的處理復(fù)蘇凍存的SP2/0細(xì)胞，狀態(tài)穩(wěn)定后用8-AG進(jìn)行篩 選，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至將70-80%融合時(shí)，收集細(xì)胞，用無(wú)血清的DMEM懸 浮，注射于BALB/c小鼠皮下，待長(zhǎng)出實(shí)體瘤后，分離培養(yǎng)SP/20細(xì)胞，備用；
② 免疫方案將純化的人ARMET蛋白作為抗原液與等體積的弗氏完全佐劑充 分乳化，制成油包水抗原乳劑；將此乳劑于雌性BALB/c小鼠背部多點(diǎn)皮下注 射，200)ag/只；IO天后再用該抗原加等體積弗氏不完全佐劑腹部多點(diǎn)皮下注射， 200ng/只；10天后將純化的抗原液200嗎直接注射小鼠腹腔；剪鼠尾取血，用 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清抗體效價(jià)，滴度較高者備用，融合前三天 尾靜脈注射抗原液200pg/只；
③ 細(xì)胞融合沖擊免疫后第3天，無(wú)菌取脾制備脾細(xì)胞懸液；將Sp2/0骨 髓瘤細(xì)胞[(1 2)X 107個(gè)細(xì)胞]和免疫小鼠脾細(xì)胞(l X 108個(gè)細(xì)胞)混合，加入0.8 mL 50%PEG4000助融；融合2分鐘后，緩慢加入不完全培養(yǎng)基，離心，用含 20X胎牛血清的HAT培養(yǎng)液重懸，加入飼養(yǎng)細(xì)胞，分在96孔板上；37°C C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
④ 克隆轉(zhuǎn)移和檢測(cè)融合后每天仔細(xì)觀察，挑出單克隆，做好標(biāo)記，待單 克隆的孔長(zhǎng)至覆蓋2/3孔時(shí)用ELISA篩選，選取滴度較高的單克隆孔，在顯微 鏡下定位，將單個(gè)克隆細(xì)胞移入含有HT培養(yǎng)液的24孔中，用移液器吹打分散 均勻；
⑤ 選擇抗體滴度高的選擇滴度高的單克隆抗體進(jìn)行擴(kuò)增、凍存或制備腹水 型抗體。
一種檢測(cè)人ARMET蛋白的ELISA試劑盒，其特征在于該試劑盒組成為
(1) 、包被抗體采用一株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體；
(2) 、固相支持物采用微孔板，用于包被抗原；
(3) 、酶標(biāo)抗體用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的不同雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆 抗體(IgG或IgM);
(4) 、陽(yáng)性對(duì)照血清或陰性對(duì)照血清；
(5) 、酶標(biāo)抗體稀釋液PBS;
(6) 、底物溶液A液:O.O簡(jiǎn)B， 0. 01MpH4. 5擰檬酸緩沖液;
B液0. 08%過(guò)氧化脲，0. 1M檸檬酸-0. 2M磷酸氫二鈉(pH5. 0)緩沖液；
(7) 、洗滌液PBS，含O. 01%吐溫-20;
(8) 、終止液2M硫酸。
本發(fā)明可既可用于對(duì)ARMET的功能研究、人體生理和病理機(jī)制的基礎(chǔ)性探討 研究，也可用于對(duì)臨床疾病的輔助診斷，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。


圖l.ARMET的氨基酸序列 圖2. ARMET的誘導(dǎo)表達(dá)
1:分子量標(biāo)記物；2: pET28a-ARMET; 3: pET28a-vector+IPTG; 4: pET28a-ARMET+IPTG 圖3. . ARMET的純化 圖4.雜交瘤細(xì)胞的融合 圖5.雜交瘤細(xì)胞株克隆的形成 圖6.不同稀釋度的抗體檢測(cè)原核細(xì)胞表達(dá)的ARMET 圖7.抗ARMET抗體檢測(cè)真核細(xì)胞中的ARMET 圖8.免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)A脂ET抗體的特異性
A:DAPI; B:抗A賜ET抗體；C:抗FLAG抗體；D: A、 B、 C疊加后的圖片。 圖9. Western Blot檢測(cè)ARMET抗體的特異性
l道轉(zhuǎn)染pCIneo-FLAG-ARMET; 2道轉(zhuǎn)染pCIneo-vector; 3道細(xì)胞中 加入Lipofectamine 2000; 4道:細(xì)胞中加入Opti-medium; 5道:未轉(zhuǎn)染及未 處理的細(xì)胞。
具體實(shí)施方式
(一)ARMET基因克隆、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化
用限制性內(nèi)切酶(NcoI/Xho1 )將人ARMET的cDNA編碼序列克隆到pET28a(+) 載體上，表達(dá)C端融合6個(gè)組氨酸的重組ARMET蛋白。將pET28a( + )-ARMET 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，置37。C培養(yǎng)箱過(guò)夜。以1:100(V:V)的比例，接種于 新鮮的含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37'C振蕩培養(yǎng)至菌液A,為0.6 0.8，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌體并裂解，取上清，加入到已預(yù)裝好的Ni-beads 柱中，用含50mmol/L imidazole的緩沖液洗去非特異結(jié)合的蛋白，再用洗脫緩沖液(50mmol/LNaH2PO4pH8.0、 300mmol/LNaCl、 25Ommol/L imidazole)洗脫目
的蛋白，并將洗脫的蛋白分裝保存在-8(TC冰箱。
SDS—PAGE電泳結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在轉(zhuǎn)化了 pET28a-ARMET
的細(xì)菌表達(dá)的蛋白中有一明顯的條帶(圖2)，蛋白分子量的大小與預(yù)期的相符。 提示IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白是目的蛋白ARMET。 ARMET經(jīng)Ni-beads柱純化后 的純度及表達(dá)量見(jiàn)圖3。
(二) Anti-ARMET單克隆抗體的制備
1. SP2/0細(xì)胞的處理復(fù)蘇凍SP2/0細(xì)胞，狀態(tài)穩(wěn)定后用8-AG進(jìn)行篩選， 繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至將70-80%融合時(shí)，收集細(xì)胞，用無(wú)血清的DMEM懸浮， 注射于BALB/c小鼠皮下，待長(zhǎng)出實(shí)體瘤后，備用。
2. 免疫方案將純化的抗原液與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，制成油 包水抗原乳劑。雌性BALB/c小鼠背部多點(diǎn)皮下注射，200pg/只。IO天后再用 該抗原加等體積弗氏不完全佐劑腹部多點(diǎn)皮下注射，200ng/只。IO天后將純化 的抗原液200嗎直接注射小鼠腹腔。剪鼠尾取血，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 檢測(cè)血清抗體效價(jià)，滴度較高者備用，融合前三天尾靜脈注射20(^g/只。
3. 細(xì)胞融合沖擊免疫后第3天，無(wú)菌取脾制備脾細(xì)胞懸液。將Sp2/0骨 髓瘤細(xì)胞[(1 2)X 107個(gè)細(xì)胞]和免疫小鼠脾細(xì)胞(l X 108個(gè)細(xì)胞)混合，加入0.8 mL 50%PEG4000助融。融合2分鐘后，緩慢加入不完全培養(yǎng)基，離心，用含 20X胎牛血清的HAT培養(yǎng)液重懸，加入飼養(yǎng)細(xì)胞，分在96孔板上。37°C C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4. 克隆轉(zhuǎn)移和檢測(cè)融合后每天仔細(xì)觀察(圖4-5)，挑出單克隆，做好標(biāo) 記，待單克隆的孔長(zhǎng)至覆蓋2/3孔時(shí)用ELISA篩選，選取滴度較高的單克隆孔， 在顯微鏡下定位，將單個(gè)克隆細(xì)胞移入含有HT培養(yǎng)液的24孔中，用移液器吹 打分散均勻。選擇抗體滴度高的陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增、凍存或制備腹水型抗體。
5.腹水型抗體的制備使用弗氏不完全佐劑對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行預(yù)處理。1 周后，收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整至2 X 1(^個(gè)細(xì)胞/mL ，給予小鼠腹腔注射。7 10d后，待小鼠腹部明顯膨大收集腹 水。腹水在4。C3 000r/min離心10min，取上清液-20。C凍存?zhèn)溆谩?br> (三) ARMET單克隆抗體稀釋度的檢測(cè)1.原核表達(dá)的ARMET:取原核表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS—PAGE電泳，將凝膠 上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(PVDF)，用5M脫脂奶的PBS室溫封閉lh，去 掉封閉緩沖液后，將PVDF膜分別放入1: 100、 1: 200、 h 500、 1: 1000、 1: 2000稀釋的腹水中室溫孵育lh，用HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫孵育lh，用ECL 顯色，暗室曝光顯影。圖6結(jié)果顯示，含有ARMET抗體的腹水按1: 2000稀 釋后仍能檢測(cè)到很強(qiáng)的信號(hào)。
2.真核表達(dá)的ARMET:將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pCIneo^FLAG-ARMET轉(zhuǎn) 染293T細(xì)胞，24h后收細(xì)胞，然后按上述方法裂解、電泳、轉(zhuǎn)膜。將含ARMET 抗體的腹水按l: 200稀釋后孵育膜lh后顯色顯影。圖7結(jié)果中有兩條帶，較小 分子量的是內(nèi)源性的ARMET，而較大的是轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒表達(dá)的融合FLAG的 A畫ET。
(四)ARMET單克隆抗體特異性檢測(cè)
1. 免疫熒光雙標(biāo)將pCIneo-FLAG-ARMET轉(zhuǎn)染293T，用適當(dāng)稀釋度的含 ARMET單克隆抗體的腹水和rabbit-anti-FLAG進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)。圖8結(jié)果顯 示，兩抗體的染色完全一致，提示ARMET單克隆抗體的特異性很好。
2. Western Blot:將pCIneo-FLAG-ARMET轉(zhuǎn)染293T，同時(shí)用空白載體和 未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作對(duì)照。24h后收獲細(xì)胞、裂解并進(jìn)行SDS—PAGE電泳。用含 ARMET單克隆抗體的腹水(1: 200稀釋)禾D rabbit-anti-FLAG分別檢測(cè)細(xì)胞中 FLAG-ARMET的表達(dá)情況。圖9結(jié)果顯示，抗FALG抗體僅能在轉(zhuǎn)染pCIneo-FLAG-ARMET的細(xì)胞中檢測(cè)到FLAG-ARMET,而抗ARMET抗體既能檢測(cè)到 FLAG-ARMET，又能檢測(cè)到內(nèi)源性的ARMET表達(dá)，且在未轉(zhuǎn)染FLAG-ARMET 的細(xì)胞中僅出現(xiàn)一條的帶，提示抗ARMET單克隆抗體是特異性的。
(四) Anti-ARMET單克隆抗體的純化
采用間接ELISA法測(cè)定其效價(jià)，辛酸-硫酸銨沉淀法及親和層析法純化單克 隆抗體。誘生腹水法獲得的抗體效價(jià)在1X10" 1X10—S之間，且均有較好的特 異性，純化后的抗體效價(jià)不變且純度較高。
(五) ELISA檢測(cè)ARMET試劑盒的制備采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法。 試劑盒組成為
(1)、包被抗體采用一株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體；(2) 、固相支持物采用微孔板，用于包被抗原；
(3) 、酶標(biāo)抗體用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的不同雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆 抗體(IgG或IgM);
(4) 、陽(yáng)性對(duì)照血清或陰性對(duì)照血清；
(5) 、酶標(biāo)抗體稀釋液PBS;
(6) 、底物溶液A液:O.O訓(xùn)B， 0. 01MpH4. 5檸檬酸緩沖液;
B液0.UTO過(guò)氧化脲，0. 1M檸檬酸-O. 2M磷酸氫二鈉(pH5.0)緩沖
液；
(7) 、洗滌液PBS,含O. 01%吐溫-20;
(8) 、終止液2M硫酸。
方法舉例已獲得多個(gè)分泌高滴度單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，現(xiàn)以克隆
B7和F6為例，簡(jiǎn)述試劑盒制備方法將克隆B7產(chǎn)生的單克隆抗體稀釋為系列 不同濃度后包被ELISA板，洗滌后加入稀釋成一定濃度的ARMET蛋白或含 ARMET的樣本與B7型單抗結(jié)合，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。用HRP標(biāo)記的F6克隆 株產(chǎn)生的單抗與樣本中的ARMET蛋白結(jié)合，以形成雙抗體夾心，然后加入底物 顯色，最后用酶標(biāo)儀測(cè)量OD450nm值。
(六)ARMET檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的建立與評(píng)價(jià)為了進(jìn)一步優(yōu)化上述檢測(cè)方法，對(duì)不同 個(gè)體的血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，將各組的敏感性、特異性和交叉反應(yīng)性平行比較，以 探討檢測(cè)方法的最適條件、血清最適稀釋度，從而實(shí)現(xiàn)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化。最后對(duì) 試劑盒成品的重復(fù)性、檢測(cè)效率、穩(wěn)定性和檢測(cè)費(fèi)用進(jìn)行評(píng)估，以期作為產(chǎn)品化 的試劑盒。
權(quán)利要求
1、人ARMET蛋白單克隆抗體制備方法，包括以下步驟
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的人ARMET蛋白抗體制備方法，包括以下步驟其特征 在于(1) 、所述的ARMET基因克隆、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化是指用限制性內(nèi)切酶(NcoI/Xho1 )將人ARMET的cDNA編碼序列克隆到pET28a(+) 載體上，表達(dá)C端融合6個(gè)組氨酸的重組ARMET蛋白；將pET28a( + ) -ARMET 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，置37'C培養(yǎng)箱過(guò)夜，以體積比1:100的比例，接種 于新鮮的含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37'C振蕩培養(yǎng)至菌液A6W)為0.6 0.8，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2-4小時(shí)；收集菌體并裂解，取上清液，加入到己預(yù)裝 好的Ni-beads柱中，用含50mmol/L imidazole的緩沖液洗去非特異結(jié)合的蛋白， 再用組份為50mmol/L NaH2P04 pH8.0、 300mmol/L NaCl、 250mmol/L imidazole 的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，并將洗脫的蛋白分裝保存在-8(TC冰箱；(2) 、所述的Anti-ARMET單克隆抗體的制備是指① SP2/0細(xì)胞的處理復(fù)蘇凍存的SP2/0細(xì)胞，狀態(tài)穩(wěn)定后用8-AG進(jìn)行篩 選，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至將70-80%融合時(shí)，收集細(xì)胞，用無(wú)血清的DMEM懸 浮，注射于BALB/c小鼠皮下，待長(zhǎng)出實(shí)體瘤后，分離培養(yǎng)SP/20細(xì)胞，備用；② 免疫方案將純化的人ARMET蛋白作為抗原，并與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，制成油包水抗原乳劑；將此乳劑于雌性BALB/c小鼠背部多點(diǎn)皮下 注射，200pg/只；IO天后再用該抗原加等體積弗氏不完全佐劑腹部多點(diǎn)皮下注 射，200嗎/只；10天后將純化的抗原液(200嗎)直接注射小鼠腹腔；剪鼠尾 取血，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清抗體效價(jià)，滴度較高者備用；在 取脾臟前三天尾靜脈注射抗原液200pg/只；③ 細(xì)胞融合沖擊免疫后第3天，無(wú)菌取脾制備脾細(xì)胞懸液；將Sp2/0骨 髓瘤細(xì)胞[(1 2)X107個(gè)細(xì)胞]和免疫的小鼠脾細(xì)胞(1X108個(gè)細(xì)胞)混合，加入 0.8mL50XPEG4000助融；融合2分鐘后，緩慢加入不完全培養(yǎng)基，離心，用 含20%胎牛血清的HAT培養(yǎng)液重懸，加入飼養(yǎng)細(xì)胞，種在96孔板上；37°C C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。④ 克隆轉(zhuǎn)移和檢測(cè)融合后每天仔細(xì)觀察，挑出單克隆，做好標(biāo)記，待單 克隆的孔長(zhǎng)至覆蓋2/3孔時(shí)用ELISA篩選，選取滴度較高的單克隆孔，在顯微 鏡下定位，將單個(gè)克隆細(xì)胞移入含有HT培養(yǎng)液的24孔中，用移液器吹打分散 均勻；⑤ 選擇抗體滴度高的單克隆抗體進(jìn)行擴(kuò)增、凍存或制備腹水型抗體。
3、 一種檢測(cè)人A謂ET蛋白的ELISA試劑盒，其特征在于該試劑盒組成為(1) 、包被抗體采用一株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體；(2) 、固相支持物采用微孔板，用于包被抗原；(3) 、酶標(biāo)抗體用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的不同雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆 抗體(IgG或IgM);(4) 、陽(yáng)性對(duì)照血清或陰性對(duì)照血清；(5) 、酶標(biāo)抗體稀釋液PBS;(6) 、底物溶液A液:0.01%TMB， 0.01MpH4.5擰檬酸緩沖液;B液0.08%過(guò)氧化脲，0. 1M檸檬酸-0. 2M磷酸氫二鈉(pH5.0)緩沖液；(7) 、洗滌液PBS，含O. 01%吐溫-20;(8) 、終止液2M硫酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是人ARMET蛋白單克隆抗體制備方法及檢測(cè)試劑盒，用限制性內(nèi)切酶(NcoI/XhoI)將人ARMET蛋白的cDNA編碼序列克隆到pET28a(+)載體上，表達(dá)C端融合6個(gè)組氨酸的重組ARMET蛋白；將pET28a(+)-ARMET質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，誘導(dǎo)表達(dá)ARMET蛋白，收集菌體，純化人ARMET蛋白；同時(shí)制備了抗ARMET的單克隆，建立了檢測(cè)ARMET的試劑盒。本發(fā)明可用于對(duì)ARMET的功能研究、人體生理和病理機(jī)制的基礎(chǔ)性研究；也可用于對(duì)臨床疾病的輔助診斷。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101434653SQ20081024310
公開(kāi)日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者余永強(qiáng), 孫愛(ài)民, 張晶晶, 方圣云, 沈玉先, 沈玉君, 王法財(cái), 王海萍, 黃學(xué)桂 申請(qǐng)人:安徽醫(yī)科大學(xué)