專利名稱：1-氨基海因衍生物半抗原、抗原和抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種1-氨基海因衍生 物的半抗原、抗原和抗體的制備方法及制備得到的半抗原、抗原和抗 體和抗體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
呋喃妥因是一種廣譜抗菌藥物，對革蘭陽性及陰性菌均有一定抗 菌作用，并且對豬、魚等肉源性動物具有生長促進(jìn)作用。通過長期的 研究發(fā)現(xiàn)，呋喃妥因及其代謝物具有致癌作用，因此多國禁止用于肉
源性動物的養(yǎng)殖中。自1995年起歐盟全面規(guī)定禁止使用呋喃妥因， 在動物源性食品中呋喃類殘留物的檢出限為不得檢出。我國也規(guī)定把 呋喃妥因列為動物養(yǎng)殖中的禁藥。但因為其廉價且增產(chǎn)效果顯著，近 年來濫用現(xiàn)象時有發(fā)生。因為呋喃妥因原藥分子在體內(nèi)很快就代謝， 而蛋白結(jié)合態(tài)代謝產(chǎn)物能在組織中存留較長時間，所以在分析此類藥 物的殘留時必須分析其代謝后的產(chǎn)物1-氨基海因(AHD)。
測定動物源性食品中的AHD殘留量，目前國內(nèi)外報道的檢測方 法主要為儀器法，例如液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)和高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法 (HPLC-MS)。但儀器法具有成本高，前處理煩瑣，操作復(fù)雜等缺點。 ELISA方法因其能彌補儀器法的上述缺點，被廣泛運用于農(nóng)獸藥殘留 的檢測。
大多數(shù)藥物、毒素、環(huán)境污染物分子質(zhì)量小于1000u，屬于僅有反應(yīng)原性而無免疫原性的半抗原。目前制備小分子半抗原抗體的常規(guī) 方法為選擇具有毒理學(xué)意義的代謝產(chǎn)物或原形藥物作為待測物，設(shè) 計合成保留待測物分子結(jié)構(gòu)特征并帶有活性基團(tuán)的半抗原，通過共價 鍵使半抗原與大分子蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)，制備人工免疫原。經(jīng)動物免疫， 抗血清的純化等程序得到可用于ELISA檢測的抗體。理論上制備所有
原形藥物的小分子半抗原抗體都可以實現(xiàn)，但也需要具體的、特定的 技術(shù)方案才能實現(xiàn)按目標(biāo)藥物的特異性抗體的制備，目前尚無可用于 ELISA檢測的l-氨基海因半抗原、抗原和抗體的相關(guān)報道，使得l-氨 基海因ELIS A檢測方法暫時還未建立。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種氨基脲衍生物半 抗原，同時提供由所述半抗原偶連載體蛋白制備的人工抗原，以及免 疫實驗動物后使機體產(chǎn)生特異的針對氨基脲衍生物的抗體。
本發(fā)明的另 一個目的是提供所述半抗原、抗原和特異性抗體的制 備方法。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來予以實現(xiàn)
提供一種1-氨基海因衍生物半抗原的制備方法，是將氨基脲與 過量的帶羧基的苯甲醛衍生物在室溫條件下于甲醇中進(jìn)行氨醛縮合 反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀經(jīng)洗滌、干燥得到所述半抗原。氨醛縮合反應(yīng) 時間為過夜，大約16個小時。
所述帶羧基的苯甲醛衍生物優(yōu)選間羧基苯甲醛或2- (4-甲?；?氧基)乙酸。帶羧基的苯甲醛衍生物采用間羧基苯甲醛制備得到的1-氨基海 因衍生物半抗原具有式(I )所示結(jié)構(gòu)
帶羧基的苯甲醛衍生物采用2-(4-甲?；窖趸?乙酸制備得到
的1-氨基海因衍生物半抗原具有式(II)所示結(jié)構(gòu)
本發(fā)明提供了一種1-氨基海因衍生物抗原的制備方法，包括以
下步驟
(1) 將l-氨基海因衍生物半抗原與縮合劑N，N， -二環(huán)己基碳二 亞胺(DCC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)反應(yīng)形成活潑酯；
(2) 將活潑酯滴加入蛋白溶液中反應(yīng)；
(3) 步驟(2)反應(yīng)得到的偶聯(lián)有氨基脲衍生物半抗原的蛋白經(jīng) 透析純化得到目標(biāo)抗原。
步驟(1)所述反應(yīng)時間過夜；
步驟(2)所述蛋白溶液的濃度為5mg/mL，反應(yīng)時間為12小時; 步驟(3)所述的透析純化時間為3天。選用式(i)所示半抗原制備得到的抗原具有式(ni)所示結(jié)構(gòu):
<formula>formula see original document page 7</formula>(III)
選用式(II )所示半抗原制備得到的抗原具有式(IV)所示結(jié)構(gòu):
<formula>formula see original document page 7</formula>(IV)
本發(fā)明同時提供了一種1-氨基海因衍生物抗體的制備方法，包 括以下步驟
(a) 將l-氨基海因衍生物抗原與弗氏佐劑免疫實驗動物；
(b) 免疫后抽取血液，分離血清； (C)血清經(jīng)辛酸硫酸銨純化得到抗體。
步驟(a)所述1-氨基海因衍生物抗原濃度為lmg/mL，氨基脲衍 生物抗原與弗氏佐劑按l: l比例免疫實驗動物。 步驟(b)所述免疫次數(shù)為4次。
本發(fā)明還提供了所述抗體的應(yīng)用，應(yīng)用于呋喃西林及其代謝物氨 基脲(SEM)的ELISA方法免疫化學(xué)分析中。
本發(fā)明是通過設(shè)計最適的半抗原制備相應(yīng)的人工抗原，從而獲得 對目標(biāo)分析物具有特異性識別的抗體，用于快速分析肉源性食品中氨基脲的殘留量，從而達(dá)到監(jiān)控呋喃西林非法使用情況的目的。本發(fā)明 的有益效果是所述半抗原和氨基脲衍生物結(jié)構(gòu)相似，突出了此獸藥 分子特異性抗原決定簇，并可通過活潑酯法偶聯(lián)載體蛋白制備抗原， 使用所述抗原免疫實驗動物可獲得效價高，特異性好的針對氨基脲衍 生物的抗體，所述抗體可用于動物源性食品中氨基脲殘留量的快速檢 測，檢測下限可達(dá)0.09 ng/mL。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。 實施例1 1-氨基海因衍生物半抗原MCPSEM的制備方法
在50ml圓底燒瓶中加入間羧基苯甲醛1. 15g，緩慢加入甲醇直 至對間羧基苯甲醛完全溶解，攪拌中加入0.3g氨基脲，室溫攪拌過 夜；反應(yīng)結(jié)束，過濾，水洗兩遍，甲醇洗兩遍，干燥，得0.62 g白 色粉末，其結(jié)構(gòu)如式(I )所示。半抗原MCPSEM的APCI-MS分 子離子峰為207， HNMR(600MHz， ^rDMSO,TMS)W 10.35(s, 1H); 8.14 (s， 1H); 8.03 (d, /:7.8Hz， 1H); 7.93 (s， 1H); 7.90 (d， J-7.8Hz, 1H); 7.52(t，J=7.2Hz, 1H,)。以上波譜數(shù)據(jù)均能正確歸屬，與MCPSEM結(jié) 構(gòu)一致，說明半抗原MCPSEM合成成功。實施例2 1-氨基海因衍生物半抗原CEPSEM的制備方法
圓底燒瓶中加入2-(4-甲酰基苯氧基)乙酸1. 06g，緩慢加入甲醇 直至對2-(4-甲?；窖趸?乙酸完全溶解，攪拌中加入0. 4g氨基脲， 室溫攪拌過夜，反應(yīng)結(jié)束，過濾，水洗兩遍，甲醇洗兩遍，干燥，得 0. 90g白色粉末，其結(jié)構(gòu)式如式(II )所示。CEPSEM波譜數(shù)據(jù):APCI-MS m/z:237[M+H] + ; 1H醒R(600MHz， d6-DMS0， TMS) : S 10.09(s， 1H); 7. 78(s， 1H); 7.64(d， J二9. OHz, 2H) : 6. 91 (d， J二9. 0Hz， 2H) ; 4.71(s， 2H)。以上波譜數(shù)據(jù)均能正確歸屬，與CEPSEM結(jié)構(gòu)一致，說明半抗原 CEPSEM合成成功。
實施例3免疫原CEPSEM-BSA的制備方法
取半抗原CEPSEM 0. lmmol溶于2mlDMF中，攪拌加入DCC 27. 5mg 和NHS14.4mg。 4""C下磁力攪拌反應(yīng)過夜，離心后上清夜為A液；稱 取BSA 140mg溶于10ml濃度為0. lmol/L的PBS(m8.0)中，加入 DMFlml，攪拌溶解制備B液；磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4°C 下反應(yīng)12h，離心后，取上清夜，4"C下用生理鹽水透析3d，每天更 換3次透析液。得到的全抗原以lmg/ml的濃度分裝于0. 5ml離心管 中，凍存于-2(TC冰箱中，供免疫用。
制備的氨基脲衍生物免疫原具有式(V)所示結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 10</formula>(V)
免疫原鑒定對載體蛋白BSA，半抗原CEPSEM和免疫原 CEPSEM-BSA進(jìn)行紫外掃描測定(200 400nm)，發(fā)現(xiàn)免疫原 CEPSEM-BSA與BSA和CEPSEM相比，吸收曲線有明顯改變，說明半抗 原CEPSEM與BSA偶聯(lián)成功。三硝基苯黃酸法(TNBS)測得半抗原IV 與BSA的偶聯(lián)比為16:1。 實施例4包被原CEPSEM-OVA的制備方法
取半抗原CEPSEM 0. lmmol溶于2ml DMF中，攪拌加入DCC 27. 5mg 和NHS 14.4mg。 4"下磁力攪拌反應(yīng)過夜，離心后上清夜為A液；稱 取OVA 140mg溶于10ml濃度為0. lmol/L的PBS (PH8. 0)中，加入DMF lml，攪拌溶解制備B液；磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4。C下 反應(yīng)12h，離心后，取上清夜，4-C下用生理鹽水透析3d，每天更換 3次透析液，得到的全抗原以lmg/ml的濃度分裝于0. 5ml離心管中， 凍存于-2(TC冰箱中，供呋喃西林及其代謝物氨基脲(SEM)的ELISA方 法免疫化學(xué)分析中包被酶標(biāo)板用。
制備的包被原CEPSEM-OVA結(jié)構(gòu)如式(VI)所示<formula>formula see original document page 11</formula> (VI)
包被原鑒定對載體蛋白0VA，半抗原CEPSEM和包被原 CEPSEM-OVA進(jìn)行紫外掃描測定(200 400nm)，發(fā)包被原CEPSEM-OVA 與載體蛋白OVA及CEPSEM相比，吸收曲線有明顯改變，說明半抗原 CEPSEM與載體蛋白OVA偶聯(lián)成功。TNBS法測得半抗原CEPSEM與載體 蛋白OVA的偶聯(lián)比為13:1。
實施例5多克隆抗體的制備方法及抗體效價測定
多克隆抗體的制備:將免疫原慢慢解凍，然后加入等量的佐劑(第 1次免疫用弗氏完全佐劑，以后加強免疫均用弗氏不完全佐劑)。完 全乳化后，采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳緣靜脈多種注 射方式免疫6只體重為2.5 3 kg的健康新西蘭大白兔。第4次加 強免疫后1周耳緣靜脈采血，并利用間接ELISA測定血清效價。當(dāng) 效價不再上升時，采用耳緣靜脈免疫兔子。1周后心臟采血，室溫靜 置0.5 lh，于4'C冰箱過夜后吸取上層析出的血清?？寡宀捎昧?酸銨沉淀法純化得到多克隆抗體，透析后冷凍干燥成粉末，于-2(TC 下保存?zhèn)溆谩?br> 抗體效價的檢測間接競爭ELISA測定抗體陽性滴度以2. 1倍 于陰性血清的測定值為準(zhǔn)，測得抗體的陽性滴度為1:640000。實施例6 —抗體親和性及特異性試驗
將不同濃度的氨基脲的鄰硝基苯甲醛的衍生物NPSEM與抗體一 起進(jìn)行間接競爭ELISA反應(yīng)，測定其抑制率，以確定抗體對NPSEM 的親和性。其ICso為O. 12 ng/mL，檢測限為0.09 ng/mL。
將NPSEM、鄰硝基苯甲醛、苯甲醛、硝基苯、NPAOZ (AOZ的硝基 苯甲醛縮合物)、NPAMOZ (AMOZ的硝基苯甲醛縮合物)、和NPAHD (AHD 的硝基苯甲醛縮合物)配成不同濃度溶液，測定其交叉反應(yīng)率，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)與同類藥物無交叉反應(yīng)，見表1。
以上實驗結(jié)果說明由所設(shè)計半抗原制備的免疫原免疫產(chǎn)生的抗 體具有靈敏度高，特異性好等優(yōu)點。
表1交叉反應(yīng)試驗結(jié)果
競爭藥物交叉反應(yīng)率(％)
NPSEM100%
鄰硝基苯甲醛<0.01
苯甲醛<0.01
硝基苯<0-01
NPAOZ<0.01
NPAMOZ<0.01
NPAHD<0.01
權(quán)利要求
1、一種1-氨基海因衍生物半抗原的制備方法，其特征在于將氨基脲與過量的帶羧基的苯甲醛衍生物在室溫條件下于甲醇中進(jìn)行氨醛縮合反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀經(jīng)洗滌、干燥得到所述半抗原。
2、 一種權(quán)利要求1所述制備方法制備得到的1-氨基海因衍生物半抗原，其特征在于具有式(I )所示結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 2</formula>(I )
3、 一種權(quán)利要求1所述制備方法制備得到的1-氨基海因衍生物半抗原，其特征在于具有式(II)所示結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 2</formula>(II)
4、 一種1-氨基海因衍生物抗原的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1) 將權(quán)利要求1所述1-氨基海因衍生物半抗原與N， N' -二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺反應(yīng)形成活潑酯；(2) 將活潑酯滴加入蛋白溶液中反應(yīng)；(3) 步驟(2)反應(yīng)得到的偶聯(lián)有1-氨基海因衍生物半抗原的蛋白經(jīng)透析純化得到目標(biāo)抗原。
5、 一種權(quán)利要求4所述制備方法制備得到的1-氨基海因衍生物抗原，其特征在于具有式(III)所示結(jié)構(gòu)(IID
6、 一種權(quán)利要求4所述制備方法制備得到的1-氨基海因衍生物抗原，其特征在于具有式(IV)所示結(jié)構(gòu)
7、 一種1-氨基海因衍生物抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟(a) 將1-氨基海因衍生物抗原與弗氏佐劑免疫實驗動物；(b) 免疫后抽取血液，分離血清； (C)血清經(jīng)辛酸硫酸銨純化得到抗體。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述1-氨基海因衍生物抗體的制備方法，其 特征在于步驟(a)所述1-氨基海因衍生物抗原濃度為lmg/mL， 1-氨基海因衍生物抗原與弗氏佐劑按l: 1比例免疫實驗動物。
9、 一種卜氮基海因衍生物抗體的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于呋喃 西林及其代謝物氨基脲的ELISA方法免疫化學(xué)分析中。N—Protein H
全文摘要
本發(fā)明公開了1-氨基海因衍生物半抗原、抗原和抗體的制備方法，氨基脲與帶羧基的苯甲醛氨醛縮合后得到氨基脲衍生物半抗原，所述半抗原和氨基脲衍生物結(jié)構(gòu)相似，突出了此獸藥分子特異性抗原決定簇，并可通過活潑酯法偶聯(lián)載體蛋白制備抗原；使用該抗原免疫實驗動物可獲得效價高、特異性好的針對氨基脲衍生物的抗體。所述抗體可用于動物源性食品中氨基脲殘留量的快速檢測，檢測下限可達(dá)0.09ng/mL。
文檔編號C07K16/44GK101412697SQ20081021929
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日
發(fā)明者孫遠(yuǎn)明, 張世偉, 楊金易, 沈玉棟, 弘 王, 肖治理, 蔡肇婷, 雷紅濤 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)