專利名稱：從禽畜血中提取血紅蛋白和超氧化物歧化酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從禽畜血中提取血紅蛋白和超氧化物歧化酶的方法，屬于農副 產品深加工和生化制品生產領域。
背景技術：
禽畜血營養(yǎng)豐富，蛋白含量高達20%左右，有"液體肉"之稱。禽畜血可以 通過離心分離得到血槳和血球，血漿中主要含有白蛋白，血球中含有血紅蛋白、 超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶等，其中血紅蛋白占血球總蛋白量的90% 以上，SOD占0.3% 0.5%。 SOD是體內特異清楚超氧自由基，降低機體的氧化 壓力，具有抗輻射、抗衰老、消炎等多種生理作用。SOD廣泛被用于保健品、 化妝品和藥品，特別是大寶SOD，推出20來年，以其良好的效果，深受廣大消 費者喜愛。血紅蛋白可用于生產血紅素和脫色血球蛋白等食品添加劑，也可以 做成魚蝦等水產的高營養(yǎng)飼料添加劑。
目前，己經有兩種方法提取SOD， 一種方法使用有機溶劑萃取SOD，該方 法處理量比較小，生產成本高，無法大規(guī)模生產；另一種方法使用銅鹽沉淀血 紅蛋白純化SOD，該方法生成的血紅蛋白含有大量的銅離子，無法被再利用， 浪費了大量珍貴的蛋白資源，而且這些蛋白排放還會造成環(huán)境污染。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種成本低廉，高效回收各種蛋白質資源的從禽畜血 中提取血紅蛋白和超氧化物歧化酶的方法。
本發(fā)明的從禽畜血中提取血紅蛋白和超氧化物歧化酶的方法，包括以下步
驟
1) 新鮮禽畜血抗凝處理后，離心取血球，加入1倍 5倍體積的水，攪拌混 勻后繼續(xù)攪拌至溶血，得溶血血球；
2) 溶血血球加入單價金屬鹽，至單價金屬鹽終濃度為0.01M 3M，調節(jié)pH 至3.0 7.5，不斷攪拌，加熱到50 75。C，保溫30min 180min，過濾，干燥濾 渣，得血紅蛋白粉，濾液為超氧化物歧化酶粗提液；
3) 在超氧化物歧化酶粗提液中加入可溶性銅鹽，至銅離子終濃度為0.01 mM 20mM，加熱至55 85°C，保溫10 120min后，過濾去渣，超濾，得到 超氧化物歧化酶濃縮液；
4) 調節(jié)超氧化物歧化酶濃縮液的pH至4.0 8.5，然后加入濃縮液體積0.5 l.O倍的丙酮，離心取上清液；在上清液中繼續(xù)加入丙酮，兩次加入的丙酮總體 積為原濃縮液體積的Ll 2.0倍，離心取沉淀，沉淀即為超氧化物歧化酶粗品； 或者將超氧化物歧化酶粗品用水溶解，離心去不溶物，通過陰離子交換劑吸附 處理，除去殘余雜蛋白，制得超氧化物歧化酶精品。
本發(fā)明中，單價金屬鹽的作用是減弱超氧化物歧化酶和血紅蛋白的相互作 用，使血紅蛋白更容易沉淀去除。上述的單價金屬鹽可以是氯化鈉、氯化鉀或 兩者的混合物。
本發(fā)明中，所說的可溶性銅鹽可以是硫酸銅，氯化銅或硝酸銅等。
本發(fā)明中，步驟3)所說的超濾包括濃縮、脫鹽和脫游離銅離子，步驟如下 先超濾膜濃縮；然后不斷加水稀釋同時超濾膜濃縮脫鹽；脫鹽后的濃縮液加入 EDTA，至EDTA終濃度為0.01 100mM，不斷加水稀釋同時繼續(xù)超濾膜濃縮， 至透過液無色；上述的超濾膜為截留分子量在1 000 30 000之間的超濾膜。
EDTA可為乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉或乙二胺四乙酸四鈉。
本發(fā)明中，吸附用的陰離子交換劑，如DEAE Cellulose、 DEAE Sepharose F.F.、 Q Sepharose F.F.、 DEAE Sephadex A 50等都適用，由于DEAE Sepharose F.F.具有良好的吸附效果和再生效果，優(yōu)選DEAE Sepharose F.F.為吸附劑。
本發(fā)明中的陰離子交換劑吸附處理方法有兩種， 一種就是常用的柱層析方 法，該方法需要把陰離子交換劑預先裝柱，才能使用，而且使用幾次后需要重 新裝柱才能恢復通量，操作復雜，對操作人員技術要求較高；另一種方法不裝 柱，直接把陰離子交換劑倒入SOD粗品溶液中吸附雜蛋白，然后回收交換劑， 該方法通量大，生產周期短，重復性高，操作簡單方便，便于掌握。
本發(fā)明調節(jié)超氧化物歧化酶(SOD)粗品溶液pH到4.0 8.5，即為SOD 等電點附近，使SOD在離子交換劑中吸附力較弱而沒有吸附在離子交換劑上面， 雜蛋白被吸附在離子交換劑，這樣使得離子交換吸附的通量大大增加，操作更 簡單，使SOD產量達日產公斤級規(guī)模。
本發(fā)明方法操作簡單，生產成本低廉，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產，可同時 提取禽畜血中SOD和血紅蛋白，實現了從禽畜血中高效回收多種蛋白質資源。 提取的血紅蛋白除了含有氯化鈉、氯化鉀等人體無害的鹽以外，不含有銅離子， 因此可以為人畜食用。也可用于進一步生產血紅素和脫色血球蛋白粉等血紅蛋 白產品，從而實現了禽畜血的綜合利用，無浪費。 具體實施方案 實施例1
屠宰場取新鮮豬血一噸，加預溶解3.33kg三水檸檬酸鈉、1.2kg檸檬酸、5kg 葡萄糖的水溶液抗凝處理，離心，得血球400kg，加800kg水攪拌l小時，用鹽 酸調節(jié)pH至3.0，加氯化鈉210kg，攪拌溶解后，緩慢加熱到60。C，保溫60min 后，壓濾。濾渣烘干得血紅蛋白130kg。濾液加入硫酸銅5kg，攪拌溶解后加熱 到75t:保溫30min，冷卻到室溫后，壓濾去渣，得藍色濾液1噸。濾液用截留 分子量20000的超濾膜超濾濃縮，濃縮到100kg左右時加入100kg水，繼續(xù)超 濾濃縮，重復五次，最后濃縮到體積100kg，加入0,2M的乙二胺四乙酸二鈉水 溶液100kg，繼續(xù)超濾濃縮到100kg，加水100kg后繼續(xù)超濾濃縮，重復五次， 濃縮到100kg，清夜無明顯藍色，此時脫鹽脫游離銅離子基本完全。濃縮液用 1M鹽酸調節(jié)pH至4.0，然后加入-2(TC預冷的丙酮80L，攪拌半小時后離心， 取上清液繼續(xù)加入-2(TC預冷的丙酮120L，攪拌15min后離心取沉淀即為SOD 粗品。SOD粗品用水溶解后離心去渣，然后直接通過預裝5L DEAE Sepharose F.F. 的層析柱，收集通過液即為SOD精品溶液，冷凍干燥得50g精品SOD，比活 6300U/mg蛋白(活力測定參照GB5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶 (SOD)活性的測定》，蛋白濃度測定用雙縮脲法，下同)。 實施例2
屠宰場取新鮮鴨血10kg，迅速加入檸檬酸鈉400g抗凝，離心后得血球4.5L， 加4.5L水攪拌1小時，用鹽酸調節(jié)pH至5.5，加氯化鉀5g，攪拌溶解后，緩慢 加熱到50'C，保溫180min后，壓濾。濾渣烘干得血紅蛋白1.4kg。濾液加入硫 酸銅2.25§，攪拌溶解后加熱到85"C保溫10min，冷卻到室溫后，壓濾去渣，得 藍色濾液8L。濾液用截留分子量3000的超濾膜超濾濃縮，濃縮到500ml 800ml 時加入800ml水，繼續(xù)超濾濃縮，重復五次，最后濃縮到體積500ml，加入乙二 胺四乙酸1.86g，攪拌溶解，加水1L后繼續(xù)超濾濃縮至500ml，重復五次，濃縮 到500ml，清夜無明顯藍色，此時脫鹽脫游離銅離子基本完全。濃縮液調節(jié)pH 到6.0后，加入4。C預冷丙酮250ml，攪拌半小時后離心，取上清液繼續(xù)加入丙 酮750ml，攪拌15min后離心取沉淀即為SOD粗品，該粗品比活為3000U/mg 蛋白。SOD粗品用水溶解后離心去渣，直接通過預裝并且用水平衡好的500ml DEAE Sepharose F.F.的層析柱，收集通過液即為SOD精品溶液，冷凍干燥得 0.6g精品SOD，比活6700U/mg蛋白。 實施例3
屠宰場取新鮮牛血500kg,草酸鉀抗凝處理，離心后得血球200kg,加1000kg 水攪拌1小時，用磷酸調節(jié)pH至3.0，加無碘食鹽700g，攪拌溶解后，緩慢加
熱到60'C，保溫180min后，過濾。濾渣烘干得血紅蛋白60kg。濾液加入1M氯 化銅溶液llml，攪拌均勻后加熱到55。C保溫120min,冷卻到室溫后，壓濾去渣， 得藍色濾液1100kg。濾液用截留分子量1000的超濾膜超濾濃縮，用實施例1相 同的方法脫鹽，脫游離銅離子后，濃縮到50kg。濃縮液調節(jié)pH至8.5，加入4'C 預冷丙酮40L，攪拌半小時后離心，取上清液繼續(xù)加入丙酮60L，攪拌半小時后 離心取沉淀即為SOD粗品。SOD粗品用水溶解后離心去渣，清液中加入預處理 好的DEAE纖維素5L，過濾回收DEAE纖維素，并用水洗滌，收集濾液跟洗滌 液合并即為SOD精品溶液，用截留分子量為3000的超濾膜濃縮然后冷凍干燥 得30g產品SOD，比活力為5000U/mg蛋白。 實施例4
屠宰場收集新鮮豬血一噸，迅速加入4kg檸檬酸鈉抗凝處理，離心得血球 400kg，加400kg水攪拌10min，用硫酸調節(jié)pH7.5，力tHM的氯化鉀溶液80L, 攪拌均勻后，緩慢加熱到75。C，保溫50min后，過濾。濾渣曬干得血紅蛋白130kg。 濾液加入lM硝酸銅溶液140ml，攪拌溶解后加熱到8(TC保溫10min，冷卻到室 溫后，壓濾去渣，得藍色濾液750kg。濾液用截留分子量為30000的中空纖維超 濾膜超濾濃縮，濃縮到100kg左右時以接近超濾清液流速的速度連續(xù)加入300kg 水同時不斷超濾，最后濃縮到體積60kg,加入200mM的乙二胺四乙酸四鈉水溶 液60kg，繼續(xù)超濾濃縮到60kg，以接近超濾清液流速的速度連續(xù)加入300kg水 同時不斷超濾，最后濃縮到60kg，清液無明顯藍色，此時脫鹽脫游離銅離子基 本完全。濃縮液調節(jié)pH值7.0，加入4'C預冷丙酮50L，攪拌30min后離心，取 上清繼續(xù)加入丙酮60L，攪拌30min后離心取沉淀。沉淀用水溶解后離心去渣， 冷凍干燥得粗品SOD的120g，比活力3000U/mg蛋白。 實施例5
屠宰場取新鮮豬血300kg，抗凝后迅速離心得血球150kg，加500kg水攪拌 半小時得溶血血球，用鹽酸調節(jié)pH至5.5，加氯化鈉5kg，氯化鉀5kg，攪拌溶 解后，緩慢加熱到65'C，保溫30min后，壓濾。濾渣烘干得蛋白粉60kg，該蛋 白粉大部分為血紅蛋白(含量70%以上)。濾液加入五水硫酸銅400g，攪拌溶解 后加熱到8(TC保溫15min，冷卻到室溫后，離心去渣，得藍色濾液。濾液用截 留分子量5000的超濾膜超濾濃縮，濃縮到50kg左右時加入100kg水，繼續(xù)超 濾濃縮，重復五次，最后濃縮到體積50kg,加入0.02mM乙二胺四乙酸四鈉的 水溶液500kg，加水200kg后繼續(xù)超濾濃縮到50kg，重復加水超濾五次，濃縮 到30kg，此時清液無明顯藍色，脫鹽脫游離銅離子基本完全。濃縮液調節(jié)pH
至5.5，加入-2(TC預冷丙酮15L，攪拌15min后離心，上清繼續(xù)加入丙酮16.5L， 攪拌15min后離心取沉淀即為SOD粗品。SOD粗品用水溶解后離心去渣，在粗 品溶液中直接1L處理好的DEAESephdex凝膠，靜置十分鐘或過濾回收凝膠， 并且用水洗滌凝膠，濾液跟洗滌液，濃縮，冷凍干燥得15g精品SOD，比活力 7000U/mg蛋白。
權利要求
1.從禽畜血中提取血紅蛋白和超氧化物歧化酶的方法，其特征是包括以下步驟1)新鮮禽畜血抗凝處理后，離心取血球，加入1倍～5倍體積的水，攪拌混勻后繼續(xù)攪拌至溶血，得溶血血球；2)溶血血球加入單價金屬鹽，至單價金屬鹽終濃度為0.01M～3M，調節(jié)pH至3.0～7.5，不斷攪拌，加熱到50～75℃，保溫30min～180min，過濾，干燥濾渣，得血紅蛋白粉，濾液為超氧化物歧化酶粗提液；3)在超氧化物歧化酶粗提液中加入可溶性銅鹽，至銅離子終濃度為0.01mM～20mM，加熱至55～85℃，保溫10～120min后，過濾去渣，超濾，得到超氧化物歧化酶濃縮液；4)調節(jié)超氧化物歧化酶濃縮液的pH至4.0～8.5，然后加入濃縮液體積0.5～1.0倍的丙酮，離心取上清液；在上清液中繼續(xù)加入丙酮，兩次加入的丙酮總體積為原濃縮液體積的1.1～2.0倍，離心取沉淀，沉淀即為超氧化物歧化酶粗品；或者將超氧化物歧化酶粗品用水溶解，離心去不溶物，通過陰離子交換劑吸附處理，除去殘余雜蛋白，制得超氧化物歧化酶精品。
2. 根據權利要求1所述的從禽畜血中提取血紅蛋白和超氧化物歧化酶的方 法，其特征是所說的單價金屬鹽為氯化鈉、氯化鉀或兩者的混合物。
3. 根據權利要求1所述的從禽畜血中提取血紅蛋白和超氧化物歧化酶的方 法，其特征是所說的可溶性銅鹽是硫酸銅，氯化銅或硝酸銅。
4. 根據權利要求1所述的從禽畜血中提取血紅蛋白和超氧化物歧化酶的方 法，其特征是步驟3)所說的超濾包括濃縮、脫鹽和脫游離銅離子，步驟如下 先超濾膜濃縮；然后不斷加水稀釋同時超濾膜濃縮脫鹽；脫鹽后的濃縮液加入 EDTA，至EDTA終濃度為0.01 100mM，不斷加水稀釋同時繼續(xù)超濾膜濃縮， 至透過液無色；上述的超濾膜為截留分子量在1 000 30 000之間的超濾膜。
全文摘要
本發(fā)明公開的從禽畜血中提取血紅蛋白和超氧化物歧化酶的方法，步驟包括新鮮禽畜血抗凝處理后，離心收集血球，溶血后加熱處理提取血紅蛋白和SOD粗提液；SOD粗提液經熱變性，超濾濃縮，丙酮分級沉淀和離子交換劑吸附處理獲得SOD精品。本發(fā)明方法操作簡單，生產成本低廉，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產，可同時提取禽畜血中SOD和血紅蛋白，實現了從禽畜血中高效回收多種蛋白質資源。提取的血紅蛋白除了含有氯化鈉、氯化鉀等人體無害的鹽以外，不含有銅離子，因此可以為人畜食用，也可用于進一步生產血紅素和脫色血球蛋白粉等血紅蛋白產品。
文檔編號C07K1/00GK101353370SQ20081012096
公開日2009年1月28日 申請日期2008年9月9日 優(yōu)先權日2008年9月9日
發(fā)明者葉躍國, 曾冬云, 勇 秦, 酈劍勇, 龔興國 申請人:浙江大學