專利名稱：：余甘子葉或果實抗癌中藥及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤(抗癌)的中藥，特別是從余甘子提取的化合物中制備具有抗腫瘤(抗癌)作用的藥物的方法。
背景技術(shù)：
：余甘子樹(p/^〃aw^ne附W/cflL.)是大卓戈禾斗(Euphorbiaceae)口十下珠屬(phyllanthus)落葉小喬木或灌木，余甘子樹在我國主要分布在福建、廣東、云南、貴州、四川、海南、廣西等省區(qū)，資源豐富，余甘子果自古以來即被我國人民視為具有保健作用而加以利用，果實生食酸甜酥脆，初食時味酸澀，食用后回味甘甜爽口，故名余甘，據(jù)報道，目前全世界約有17個國家的傳統(tǒng)藥物體系中使用了余甘子；在我國約有16個民族使用該藥，其中以漢族和藏族等尤為習(xí)用。國內(nèi)部分省市早巳開始了對余甘子資源的開發(fā)利用，一些地方已優(yōu)選優(yōu)良品種，并大面積經(jīng)濟栽培。余甘子是一味重要的傳統(tǒng)民族藥，己被載入1995年、2000年和2005年版《中華人民共和國藥典》，余甘子過去為我國少數(shù)民族常用藥材，已被《中國藥典》收載。該植物的果實、根、樹皮、葉均可供藥用。余甘子性昧甘、酸、澀、涼，歸肺、胃經(jīng)。其功能與主治為清熱涼血，消食健胃，生津止咳；用于血熱血瘀、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛及口干。有人分析余甘子的主要化學(xué)成分含有維生素C、多種氨基酸和鞣質(zhì)，其中包括葡萄糖投食子鞣質(zhì)(glucogallin)、沒食子酸(gallicacid)、鞣料云實精(carilagin)、原訶子酸(terchebin)、訶子酸(chebulinicacid)、粘酸(mucicacid)、油柑酸(phyllemblicacid)等。近年來，人們對余甘子進行了多方面研究，并用有機溶劑對其有效成分進行提取，發(fā)現(xiàn)提取物中有一些抗菌活性成分，對葡萄球菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、大腸桿菌及痢疾桿菌均有抑制作用，在民族藥學(xué)研究中，亞洲的一些國家如斯里蘭卡、緬甸、巴基斯坦、尼泊爾等國均有采用余甘子治療眼部疾病、痢疾、腸胃炎，有的用于治療淋病等。我國民間則有利用余甘果抗菌、生津止咳及治療急慢性咽喉炎的歷史，經(jīng)現(xiàn)代檢測技術(shù)還發(fā)現(xiàn)，余甘子果實中含多種抗氧化成分維生素C，鞣質(zhì)，維生素E，還含超氧化物歧化酶(SOD)。因此很多醫(yī)學(xué)工作者對余甘子進行了多方面的研究。近年來公開文獻報道了一些余甘子化學(xué)成分以及藥理研究的內(nèi)容，例如廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，廣東省果蔬深加工重點實驗室的陳智毅、劉學(xué)銘、吳繼軍、李升鋒、鄒宇曉在刊名中國南方果樹.2004,33(1).-58-61公開了"余甘子的藥理研究和利用綜述"，研究認(rèn)為余甘子提取物具有抗誘變、抗致畸、防腫瘤可對抗環(huán)境化學(xué)因子對哺乳類動物細胞的誘變作用，該作用強于同等劑量的維生素C;在模擬胃液條件下，余甘子鮮果汁能有效地阻斷N—亞硝基嗎啉合成，其阻斷率為90.17，而同濃度維生素C阻斷率僅23.9;余甘子果汁、果粉對大鼠體內(nèi)對N—亞硝基脯氨酸(NPRO)合成的阻斷率分別達100和96.29，余甘果汁較維生素C的阻斷作用更為明顯。作者觀察了余甘子果汁對我圍胃癌高發(fā)區(qū)受試者內(nèi)源性亞硝化的阻斷作用，結(jié)果表明，受試者體內(nèi)過高的亞硝化潛力已被余甘子果汁完全阻斷，并認(rèn)為在胃癌高發(fā)區(qū)合理飲用新鮮余甘子果汁就可對體內(nèi)過高的亞硝化水平有較好的阻斷作用，可以有效地降低胃癌及其腫癌的發(fā)病一。北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院、北京微量化學(xué)研究所的張?zhí)m珍、趙文華等在《中國中藥雜志》.2003,28(10).-940-943研究藏藥余甘子的化學(xué)成分。方法各種色譜法分離純化，理化和現(xiàn)代波譜法鑒定結(jié)構(gòu)。結(jié)果分離鑒定出ll個化合物，分別為沒食子酸(I)，鞣花酸(II)，i-o-沒食子?；?e-D-葡萄糖(m)，3，6-二-0-沒食子?；?D-葡萄糖(IV)，訶子酸(V)，槲皮素(VI)，訶黎勒酸(Vn)，鞣云實精(VID)，3-乙基沒食子酸(3-ethoxy-4，5-dihydroxy-bellzcicacid，IX)，isoscrtiniin(X)，1，6-二-0-沒食子酰基-D-葡萄糖(XI)。結(jié)論3-乙基沒食子酸(3-ethoxy-4，5-dihydroxy-benzoicacid)為一新化合物，isostrietiniin為首次從余甘子中得到的化合物。提取分離取去核余甘子干果粗粉2000g，70%丙酮滲漉提取，40°C以下減壓濃縮成粉狀得提取物820g。取200g粗提物用水分散，醋酸乙酯反復(fù)萃取，萃取液濃縮得醋酸乙酯部分42g，水液減壓回收，濃縮至小體積。醋酸乙酯和水部分分別上ToyopearlHW—40(c)色譜柱，H20及稀EtOH梯度洗脫，各組分經(jīng)聚酰胺TLC和HPLC檢測，合并相同組分，分別再經(jīng)SephadexLH-20,MCIgelC1IP20P，ToyopearlHW—40(F)色譜柱反復(fù)純化，從醋酸乙酯部分得到化合物1(105mg)，11(78nag)，VI(45mg)，IX(32mg)。從水部分得到化合物I11(32mg)，IV(57nag)，V(16mg)，VD(46rag)，VII(79mg)，X(65mg)，Xl(47rag)。廣西中醫(yī)學(xué)院的李萍、謝金鮮、林啟云在《中國民族民間醫(yī)藥雜志.》2003(3).-161-164研究了民族藥余甘子對D—半乳糖胺致小鼠急性肝損傷的影響，實驗利用D—半乳糖胺(D—Gah"N)—次性腹腔注射(ip)誘發(fā)小白鼠急性肝損傷模型，通過測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及肝糖元、肝臟系數(shù)，觀察余甘子水提醇沉物對肝損傷的保護作用。結(jié)果余甘子水提醇沉物各劑量組成均降低血清ALT、AST、ALP、MDA含量和肝臟系數(shù)，提高血清SOD活性及促進肝糖元合成，并可改善肝臟組織病理損傷，其作用呈劑量依賴性。結(jié)論余甘子水提醇沉物有一定程度抗自由基與抗脂質(zhì)過氧化作用，對D-Gal^N所致的急性損傷具有明顯的保護作用。福建安摩樂制藥實業(yè)有限公司的李昌玲在《藥學(xué)進展》2001,25(4),210-213認(rèn)為中草藥余甘子在新藥和保健食品開發(fā)方面極具應(yīng)用價值。余甘子的藥理研究表明，其具抗微生物感染、抗氧化、抗腫瘤、降血脂和血糖、降壓、補益等多種生物學(xué)活性，且無明顯毒副作用。夏泉、孔杰在《中國中藥雜志》發(fā)表了"傳統(tǒng)藥物余甘子的民族藥學(xué)研究"的文章，系統(tǒng)研究了余甘子的民族藥學(xué)，介紹了余甘子的生物學(xué)特性，地理分布格局，化學(xué)組成以及近年來所開展的藥理研究成果，并介紹了17個國家及民族在其醫(yī)療實踐中對余甘子的傳統(tǒng)使用。通過跨文化比較研究指出，作為一種重要的傳統(tǒng)藥物，余甘子與保肝，抗癌，健胃，抗誘變，抗衰老等35種功能有關(guān)，是一種具有廣闊開發(fā)前景的藥用植物。本專利權(quán)人廣西中醫(yī)學(xué)院于2005年8月22日向中國知識產(chǎn)權(quán)局申請了"具有抗癌、抗菌作用的余甘子提取物及其中藥制劑的生產(chǎn)方法"的發(fā)明專利，專利號200510036622.0名稱公開號CN1733752授權(quán)日2008年4月16日發(fā)明人鐘振國；董明姣，該發(fā)明公開了一種從余甘子的根、樹皮、葉或果實中提取的具有抗癌、抗菌作用的黃酮類化合物，其提取方法可以采用水煮法、醇提法、大孔樹脂吸附法、萃取法得到，在該專利說明書中公開了將制得的黃酮類化合物制成不同的中藥制劑，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、傷寒沙門菌、肺炎克雷伯菌、甲型鏈球菌和乙型溶血性鏈球菌即表現(xiàn)出抑制作用。對白血病細胞株L1210和P388D1、宮頸癌細胞株Hela、人胃癌細胞株SGC7901、黑色素瘤細胞株B16、神經(jīng)腫瘤細胞株NG108-15以及人肝癌細胞株Hele7404，也具有較好的抑制作用。但是該專利在2005年之前還僅僅對余甘子進行提取，得到的提取物是黃酮類化合物，直接將黃酮類化合物試驗其抗腫瘤作用，還沒有對這些黃酮類化合物進行有效成分的分離以及具體化學(xué)結(jié)構(gòu)進行鑒定，對提取的黃酮類化合物是如何抗腫瘤的作用機制還不是十分清楚。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供從余甘子葉或果實提取的化合物中分離出具體的有效成分，并用這些活性成分作為制備抗腫瘤(抗癌)作用藥物的原料，從而更好地利用我國的中草藥資源，豐富中草藥治療疾病的領(lǐng)域。本發(fā)明是在專利號200510036622.0的基礎(chǔ)上，經(jīng)過深入研究以及進一步其抗腫瘤的作用機制來完成的，發(fā)明的技術(shù)方案如下1、將余甘子葉或果實分別用95%乙醇和50%乙醇進行滲漉提取后，取50%乙醇浸膏再分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯進行部位分離，利用硅膠柱層析法對乙酸乙酯部位進行分離純化，得到純結(jié)晶化合物結(jié)晶I和結(jié)晶II;經(jīng)過檢測，得出結(jié)晶I主要的成分是沒食子酸(分子式為C7H605)，結(jié)晶II的主要的成分為沒食子酸乙酯(分子式為C9H1()05)。結(jié)晶I和結(jié)晶n也可能還有其它一些成分。2.在體外實驗，采用MTT法、細胞集落形成法測定結(jié)晶I和結(jié)晶II對人肝癌細胞株Bele7404、宮頸癌細胞株Hela、人胃癌細胞株SGC7901、黑色素瘤細胞株B16、白血病細胞株P(guān)388D卜小鼠肝癌細胞株H22和小鼠肉瘤細胞株S180的生長抑制情況，并用小鼠脾淋巴細胞對結(jié)晶I與結(jié)晶II進行免疫毒性測試，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)；3.在體內(nèi)動物實驗，建立S180小鼠實體瘤、腹水瘤和H22小鼠實體瘤、腹水瘤模型，觀察結(jié)晶I對小鼠實體瘤抑瘤率和腹水瘤生命延長率的影響；4.采用瑞氏和吉姆薩混染法、吖啶橙染色法觀察結(jié)晶I和結(jié)晶II對腫瘤細胞凋亡的影響；用FCM法觀察結(jié)晶I和結(jié)晶II對腫瘤細胞凋亡及細胞周期的影響，初步探討其抗腫瘤作用機制。以下是具體方法1、余甘子葉或果實有效成分的提取-(1)滲漉提取和分離將余甘子葉或果實用粉碎機粉碎成碎片，每kg用10升體積濃度80—95°/。的乙醇浸泡20一60小時，然后用95%乙醇滲漉提取，收集10倍量的滲漉液；后改用50%乙醇浸泡30—50小時，最后再用新鮮的50%乙醇滲漉，收集10倍量的滲漉液，回收滲漉液中的乙醇后得到50%乙醇浸膏。(2)乙醇浸膏分部位的提純用100-200目的硅膠,將50%乙醇浸膏拌勻，每1Kg50。/。乙醇浸膏用1Kg硅膠，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯回流提取，其中，石油醚、三氯甲院分別回流3次，每次1小時，乙酸乙酯部位回流時間6次,每次1小時,第1次1小時，回收溶劑，回收成分放置蒸發(fā)皿于100。C水浴揮干，得到乙酸乙酯部位浸膏。(3)有效成分的分離取上述第(2)步的余甘子葉或果實50%乙醇提取液中的乙酸乙酯部位干膏加95%乙醇溶解后用100200目的硅膠(粗孔2號硅膠，層析用，青島海洋化工廠生產(chǎn))進行拌樣并裝柱，用硅膠柱層析法分離，依次用不同比例的石油醚-乙酸乙酯(100:0，100:1,60:1,30:1，10:1，5:1,1:1，0:1)進行梯度洗脫，每瓶約30min，收集流份為每份500ml。從第392-535流分得到白色針晶狀結(jié)晶I，從第540-629流分得到淡黃色針晶狀結(jié)晶II。(1)結(jié)晶I的結(jié)構(gòu)解析a理化性質(zhì)及檢識反應(yīng)外觀為白色針晶狀結(jié)晶，遇光變棕褐色。mp:235235.5°C。溶解度:稍溶于水，溶于乙醇和乙醚，不溶于氯仿和苯。b化學(xué)檢識三氯化鐵試驗陽性(呈藍色)。氯化鈉明膠試驗陽性(出現(xiàn)白色沉淀)。C質(zhì)譜測定條件快原子轟擊d綜合解析綜合質(zhì)譜、"c核磁共振譜、核磁共振氫譜等圖譜得出結(jié)晶1的分子式為<:晶05，可推測出結(jié)晶I的結(jié)構(gòu)如下(2)結(jié)晶II的結(jié)構(gòu)解析a理化性質(zhì)及檢識反應(yīng)外觀為白色針晶狀結(jié)晶，遇光變棕褐色。mp:151154°C。溶解度溶于水。b化學(xué)檢識三氯化鐵試驗陽性(呈藍色)。氯化鈉明膠試驗陽性C綜合解析綜合質(zhì)譜、"c核磁共振譜、核磁共振氫譜等圖譜得出結(jié)晶n的分子式為c晶。05，可推測出結(jié)晶n的結(jié)構(gòu)如下-3、余甘子葉或果實有效成分的藥理研究本發(fā)明人通過對余甘子葉或果實提取物沒食子酸乙酯進行研究，的實驗結(jié)果表明，在體內(nèi)外的抗癌試驗研究表明，其有良好的抗肝癌、白血病、胃癌的效果。4、抗肝癌、白血病、胃癌藥物的制備余甘子葉或果實提取物沒食子酸和沒食子酸乙酯可以制備成治療肝癌、白血病、胃癌的藥物，例如可根據(jù)需要，制備不同的劑型口服給藥制劑，如口服液、片劑、膠囊、含片、丸劑；注射給藥制劑，如注射劑等。本發(fā)明的優(yōu)點是1、滲漉法是一種較好的提取方法，該法設(shè)備簡單，操作安全，節(jié)能降耗，減少成分破壞，有煎煮法不可比擬的優(yōu)點，所以本發(fā)明采用了滲漉法進行提取，經(jīng)過對95%乙醇的石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和50%乙醇的氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位做過體外篩選，結(jié)果為50%乙醇的乙酸乙酯部位的抗腫瘤效果較好。所以，用95%乙醇滲漉將其中的脂溶性成分盡量提取完全，后再換50%乙醇進行滲漉，將其中的水溶性成分盡量提取完全，分別用石油醚、氯仿回流提取后，再用乙酸乙酯回流，得到有效部位。2、本發(fā)明采用柱層析法，用不同比例的石油醚-乙酸乙酯(100:0，100:1,60:1,30:1,10:1,5:1,1:1,0:1)將50%乙醇的乙酸乙酯部位進行梯度洗脫。其中，我們分離得到的兩個有效成分結(jié)晶I與結(jié)晶II通過做理化性質(zhì)及檢識反應(yīng)還有綜合質(zhì)譜、13C核磁共振譜、核磁共振氫譜等圖譜可知道其均為酚類，并巳確定了結(jié)晶I與結(jié)晶II的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。3、腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的一類疾病。因此,腫瘤學(xué)一直是醫(yī)學(xué)研究的重點，尋找有效的抗腫瘤藥物與方法,徹底攻克腫瘤是世界醫(yī)學(xué)界的重要研究課題。研究表明許多中藥具有抗腫瘤作用，但其作用成分復(fù)雜，尤其是復(fù)方，具有多種作用成分和通過多種作用途徑產(chǎn)生抗腫瘤作用。弄清中藥余甘子葉或果實的抗腫瘤作用途徑和靶位點對加速抗腫瘤中藥的開發(fā)具有重要意義。據(jù)文獻記載，余甘子葉或果實含余甘子酸、蛇床子醇、p-谷甾醇、并沒食子酸、沒食子酸、3，6-二沒食子酰葡萄糖、鞣料云實精、訶黎勒酸、訶子酸、葡萄糖沒食子鞣甙。我們對50%乙醇的乙酸乙酯部位進行了化學(xué)成分的預(yù)實驗，黃酮類的3項反應(yīng)為陽性，酚類的2項反應(yīng)為陽性，甾體或三萜類反應(yīng)也均為陽性反應(yīng)，與文獻報道基本一致。4、本發(fā)明首先采用柱層析的方法，用不同比例的石油醚-乙酸乙酯對50%乙醇提取液中的乙酸乙酯部位進行梯度洗脫，得到若干個樣品，我們選取了結(jié)晶I與結(jié)晶II。將得到的幾個樣品采用Bele7404、Hela、SGC7901、P388D1、B16、H22和S180七種腫瘤細胞株進行篩選，確定抗腫瘤成分為結(jié)晶I與結(jié)晶II，并用小鼠脾淋巴細胞對結(jié)晶I與結(jié)晶II進行免疫毒性測試，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。然后我們將結(jié)晶I的體內(nèi)抗腫瘤實驗，建立S180和H22小鼠移植性腫瘤模型，觀察藥物對S180和H22荷瘤小鼠的瘤體生長抑制和生存期的延長情況。最后是對結(jié)晶I與結(jié)晶II的抗腫瘤作用機制研究，觀察其對Bele7404細胞株細胞周期及細胞凋亡的影響。(具體方法見以下試驗)5、在我們的200510036622.0中國專利中，對余甘子葉或果實提取物具有抗腫瘤、抗乙肝病毒、抗菌和防止慢性支氣管炎并肺氣腫的藥理作用作過相關(guān)的研究，實驗結(jié)果表明余甘子葉提取物具有抗腫瘤、抗菌和防止慢性支氣管炎并肺氣腫作用，并且有效成分集中在50%乙醇提取液中的乙酸乙酯部位。但是，其有效成分仍然是不清楚的，所以本發(fā)明在抗腫瘤藥效實驗的跟蹤下，擬弄清其抗腫瘤有效成分及對其作用機制進行研究，這樣就為人們進一步開發(fā)余甘子提供一種科學(xué)的方法，為人類抗擊癌癥開辟一條新路。具體實施例方式實施例l、將50kg余甘子葉或果實用粉碎機粉碎成50目大小的葉子，用95%乙醇浸泡48h，48h后用新鮮的95。/。乙醇滲漉提取，收集10倍量的滲漉液；后改用50%乙醇浸泡4811，48h后用新鮮的50%乙醇滲漉，收集10倍量的滲漉液，回收滲漉液中的乙醇后得到50%乙醇浸膏5785g。用6000g硅膠(l00-200目)拌勻后，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯回流提取，回收溶劑，濃縮后得到乙酸乙酯部位干膏(228.4g)?；瘜W(xué)成分預(yù)試驗為弄清乙酸乙酯部位干膏成分的類型以便提出合理的提取分離工藝，取少量乙酸乙酯部位進行系統(tǒng)成分預(yù)試實驗。成分的預(yù)試實驗結(jié)果如下表1余甘子葉或果實50%乙醇提取液乙酸乙酯部位的成分預(yù)試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注"+"表示陽性結(jié)果，"-"陰性結(jié)果。有效成分的分離取余甘子葉或果實50%乙醇提取液中的乙酸乙酯部位加95%乙醇溶解后用100200目的硅膠進行拌樣并裝柱，用硅膠柱層析法分離，依次用不同比例的石油醚-乙酸乙酯(100:0，100:1,60:1,30:1,10:1,5:1,1:1,0:1)進行梯度洗脫，收集流份為每500ml—份。乙酸乙酯部位的提取從50kg的余甘子葉或果實得到50%乙醇提取液乙酸乙酯部位浸膏228.4g，得率為4.57%。有效成分的分離從第392-535流分得到白色針晶狀結(jié)晶I(2.649g)，從第540-629流分得到淡黃色針晶狀結(jié)晶II(6.347g)。檢測與上述技術(shù)方案的方法相同，并用質(zhì)譜測定快原子轟擊，確定是結(jié)晶I與結(jié)晶II的化合物。藥物制備實施例一取以上提取方法所得余甘子葉或果實提取的乙酸乙酯部位化合物10克，加適量的水溶解，加入60克蔗糖粉，溶解，滅菌，分裝，制得口服液100ml。每100ml口服液相當(dāng)于100g余甘子生藥材。實施例二取以上提取方法所得余甘子葉或果實提取的乙酸乙酯部位化合物10克，加純水溶解，微孔過濾，分裝入凍干瓶，冷凍干燥，供注射用。每瓶相當(dāng)于10g余甘子生藥材。實施例三取以上提取方法五所得余甘子葉或果實提取的乙酸乙酯部位化合物，加適量淀粉制粒，壓成片劑，基片重0.3g，或包衣，每片相當(dāng)于4g余甘子生藥材。實施例四制備實施例三所得顆粒，裝入零號膠囊，每囊裝0.6克，每粒膠囊相當(dāng)于8g余甘子生藥材。實施例五提取方法所得余甘子葉或果實提取的乙酸乙酯部位化合物100克，加1400克白糖粉，制成顆粒，分裝成每袋重15克的顆粒劑。每袋相當(dāng)于10g余甘子生藥材。本發(fā)明的余甘子黃酮類化合物具體藥理和藥效學(xué)臨床試驗。為了進一步確定余甘子葉葉或果實的抗腫瘤有效成分和其作用機制，本研究共分為四個部分完成。首先采用柱層析的方法，用不同比例的石油醚-乙酸乙酯對50%乙醇提取液中的乙酸乙酯部位進行梯度洗脫，得到六個樣品，其中包括結(jié)晶i與結(jié)晶n。第二部分將得到的六個樣品采用Bele7404、Hela、SGC7901、P388D!、B16、H22和S180七種腫瘤細胞株進行篩選，確定抗腫瘤成分為結(jié)晶i與結(jié)晶n，并用小鼠脾淋巴細胞對結(jié)晶i與結(jié)晶n進行免疫毒性測試，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。第三部分為結(jié)晶I的體內(nèi)抗腫瘤實驗，建立S180和H22小鼠移植性腫瘤模型，觀察藥物對S180和H22荷瘤小鼠的瘤體生長抑制和生存期的延長情況。第四部分為結(jié)晶I與結(jié)晶II的抗腫瘤作用機制研究，觀察其對Bele7404細胞株細胞周期及細胞凋亡的影響。一、余甘子葉或果實提取的乙酸乙酯部位化合物體外抗腫瘤作用研究1實驗材料和方法1.1腫瘤細胞株人肝癌細胞株Bele7404、宮頸癌細胞株Hela、人胃癌細胞株SGC7901、白血病細胞株P(guān)388Di和黑色素瘤細胞株B16等均購自上海細胞生物研究所細胞庫；小鼠肝癌細胞株H22和小鼠肉瘤細胞株S180均購自廣西中醫(yī)藥研究所。1.2細胞實驗試劑MTT(四甲基噻唑藍)為德國Sigma公司產(chǎn)品，批號020609FBS(胚胎牛血清)為美國Hyclone公司產(chǎn)品，批號0407RPMI1640培養(yǎng)基為美國GIBCO公司產(chǎn)品，批號1120708Trypisn(胰蛋白酶)購自天津市景洋生物制品有限責(zé)任公司，批號200503DMSO(二甲基亞砜)購自天津匯英化學(xué)試劑有限公司，批號20030526Wright'sstain(瑞氏染色素)購自上海三愛思試劑有限公司，批號20011026Giemsa,sstain(吉氏染色素)購自上海試劑三廠，批號20000324卡那霉素，德國Sigma公司分裝L-谷氨酰胺，Araresco分裝ConAsigma分裝，廣州威佳科技有限公司生產(chǎn)LPSsigma分裝，BioSharp公司生產(chǎn)1.3實驗方法1.3.1RPM1640完全培養(yǎng)液的配置RPMI1640完全培養(yǎng)液含RPMI1640培養(yǎng)基、3%谷氨酰胺、卡那霉素750ug/ml、10%或15%FBS(臨用前加)。1.3.2MTT法在96孔培養(yǎng)板中每孔加入200ul(含有5000個/ml腫瘤細胞)10n/。FBS的RPMI640培養(yǎng)液，置37匸，10。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后(P388D!、H22、S180離心處理)，棄去舊培養(yǎng)液。實驗組分別加入新的培養(yǎng)液190ul/L，然后加入不同濃度待測樣品10ul/孔，使每孔樣品終濃度結(jié)晶I與結(jié)晶II均分別為1.25嗎/ml、2.5嗎/ml、5嗎/ml、10嗎/ml、20嗎/ml、40嗎/ml、80昭/ml，細胞對照孔則加入200ul/孔新的培養(yǎng)液，每組4平行？L,置37。C,10%<:02培養(yǎng)液培養(yǎng)4天后，棄去上清液，加入200ul/孔新鮮配置的含0.2mg/mlMTT的無血清培養(yǎng)液，37。C繼續(xù)培養(yǎng)4h。4h后棄上清夜，加入200nl/孔DMSO，振蕩混勻后，用酶標(biāo)儀(波長為570nm，參比波長為450nm)測定OD值，按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率腫瘤細胞生長抑制率=(l-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)"00%，并計算結(jié)晶I與結(jié)晶II對不同腫瘤細胞株的1<350[6]1.3.3集落形成法采用SGC7901、Bele7404、H22、S180四種腫瘤細胞株。取對數(shù)生長期的SGC7901和Bele7404腫瘤細胞株各一瓶，經(jīng)胰蛋白酶Trypisn消化后作成單個分散細胞懸液，作活細胞計數(shù)，用10y。FBSRPMI1640培養(yǎng)液配成含500個/ml細胞懸液，取35mm培養(yǎng)皿，4個為一組，陰性對照組每皿加2ml細胞懸液。實驗組分別加入結(jié)晶I與結(jié)晶II各100W，加入稀釋后的細胞懸液2ml，使結(jié)晶I與結(jié)晶II終濃度為20pg/ml，搖勻后置37"C10%(302培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，棄去培養(yǎng)液，先用瑞氏染液染色5min后，然后用Giemsa，s溶液與Sorensen磷鉬酸緩沖液以l:9混合成工作液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，染色10min。流水沖洗、晾干，在20x的顯微鏡下計數(shù)含50個細胞以上的集落，重復(fù)4次。其中H22、S180用半固體軟瓊脂集落培養(yǎng)法，取對數(shù)生長期的H22和S180腫瘤細胞株各一瓶，作活細胞計數(shù)，用15。/。FBSRPMI1640培養(yǎng)液配成含1000個/ml細胞懸液，置37'C預(yù)溫。取35mm培養(yǎng)皿，4個為一組，每個實驗組分別加入終濃度為20pg/ml結(jié)晶I與結(jié)晶n各100pl，對照組加入等體積的培養(yǎng)液，取在沸水中融化的5%瓊脂液1份，加入至IJ9份37。C含15。/。FBSRPMI1640培養(yǎng)液中，搖勻后迅速加入到培養(yǎng)皿中，每個lml，混勻后，置室溫使瓊脂凝固。取預(yù)溫的細胞懸液按每9.4ml加5。/。的瓊脂液0.6ml的比例混勻，加到已鋪底層瓊脂的培養(yǎng)皿中，每個lml,置室溫使瓊脂凝固。蓋上培養(yǎng)皿蓋，置37"10%(302培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，在16x的顯微鏡下計數(shù)直徑大于75pm(50個細胞以上)的集落。按下式計算集落形成率及抑制率集落形成率(Q/。)=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)><100%集落抑制率(％)=1-克隆數(shù)/對照組克隆數(shù)><100%1.3.4結(jié)晶i與結(jié)晶n對小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響1.3.4.1脾臟淋巴細胞的制備頸椎脫臼處死3只昆明種小鼠，用75%的酒精浸泡5分鐘，無菌操作取出脾臟，在RPMI1640液中將脾臟剪成l-2mm3小塊，用0.2%的胰酶37。C消化3分鐘后用200目的細胞篩濾，制成單個細胞懸液，用RPMI1640洗滌2次后離心(1000rpm,5min)，用含10%小牛血清RPMI1640完全培養(yǎng)基制成3xl()S個/ml的脾細胞懸液。1.3.4.2脾臟淋巴細胞增殖活性的檢測將懸液以160)Lil/孔加入培養(yǎng)板中，在脾細胞的培養(yǎng)板中分別加入T、B淋巴細胞增殖的刺激因子刀豆蛋白A(ConA)250嗎/ml和大腸桿菌脂多糖(LPS)200嗎/ml，每孔20W，然后待測樣品每孔加20^1，終濃度為80嗎/ml、40嗎/ml、20嗎/ml、10pg/ml、5ng/ml、2.5嗎/ml，每組4平行孔，培養(yǎng)板在37'C含5。/。C02的培養(yǎng)箱中孵育48h后，用MTT法測定T、B淋巴細胞增殖的活細胞數(shù)。MTT法測定同1.3.2。1.3.4.3結(jié)果處理丁淋巴細胞生長抑制率=(l-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)xl00%B淋巴細胞生長抑制率=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)xl00%1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用Excel軟件統(tǒng)計,兩組之間的樣本均數(shù)比較采用t檢驗。2實驗結(jié)果2.1MTT法2.1.1抗腫瘤活性成分篩選用人肝癌細胞株Bele7404、宮頸癌細胞株Hela、人胃癌細胞株SGC7901對分離出來的6種樣品樣品l、樣品2、結(jié)晶I、結(jié)晶II、樣品3與樣品4在25昭/ml-100嗎/ml的范圍內(nèi)進行初篩。在分離得出的樣品l、樣品2、結(jié)晶I、結(jié)晶II、樣品3與樣品4中，當(dāng)濃度大于25^g/ml時，結(jié)晶I與結(jié)晶II對Bele7404、Hda和SGC7901腫瘤細胞株的抑制率均大于30。/。；當(dāng)濃度為50嗎/ml時，結(jié)晶I與結(jié)晶n對Bele7404、Hela和SGC7901腫瘤細胞株的抑制率均大于6013/。，其抑制率與濃度成正比。根據(jù)初篩結(jié)果，對其中增殖抑制率大于30%的結(jié)晶I與結(jié)晶II用7種不同組織來源的細胞Bele7404、Hela、SGC7901、P388Di、B16、H22和S180進行擴大篩選，經(jīng)過觀察倒置顯微鏡下Bde7404細胞對照組的細胞成集落，細胞較豐富且形態(tài)均一且較大，呈多邊形，折光性好；結(jié)晶12.5pg/ml組，細胞集落變小，細胞大小不一，細胞散在；結(jié)晶I10嗎/ml組，細胞散在，胞體皺縮變小，折光性減弱；結(jié)晶I40嗎/ml組，細胞散在，胞體皺縮且細胞輪廓消失，并可見凋亡小體。結(jié)晶n2.5pg/ml組，細胞基本成集落，其中散在一些細胞，細胞折光性減弱；結(jié)晶niOpg/ml組，細胞散在增多，偶見成簇的細胞團，細胞變??；結(jié)晶II40嗎/ml組，細胞集落消失，可見許多彌漫較小的細胞組織。當(dāng)濃度為5pg/m塒，結(jié)晶I對Bele7404腫瘤細胞抑制率大于40V。；當(dāng)濃度為40嗎/ml時，結(jié)晶I與結(jié)晶II對Bele7404腫瘤細胞抑制率均大于60。/。?？梢娊Y(jié)晶I與結(jié)晶II對Bele7404腫瘤細胞有較強的殺傷作用，且抑制率與濃度成正比。表2結(jié)晶I與結(jié)晶II對Bde7404腫瘤細胞的抑制作用(7±s，n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注與細胞對照組比較，*p<0.01。由表2可知，結(jié)晶I對Bele7404腫瘤細胞有很強的殺傷作用，且抑瘤率與細胞對照組相比差異有顯著性(pO.Ol)，抑制率與濃度有較好的相關(guān)性，按對數(shù)回歸方程計算，結(jié)晶I(r=97.38%)，其lC5o為9.03嗎/ml。結(jié)晶II對Bele7404腫瘤細胞也有一定的抑制作用，而且抑制率與濃度有很好的相關(guān)性(r=97.94%)，其lC5o為20.5(^g/ml。提示結(jié)晶I有較強的體外抑制Bele7404腫瘤細胞作用，結(jié)晶1I對Bele7404腫瘤細胞有一定的抑制作用。2.1.3結(jié)晶I和結(jié)晶II對SGC7卯1細胞增殖的影響當(dāng)濃度為10嗎/m塒，結(jié)晶I與結(jié)晶II對SGC7901腫瘤細胞抑制率大于40。/。；且在濃度為40pg/ml時，結(jié)晶I與結(jié)晶II對SGC7901腫瘤細胞抑制率均大于60y。?？梢娊Y(jié)晶I與結(jié)晶II對SGC7901腫瘤細胞有一定的殺傷作用，且抑制率與濃度成正比。表3結(jié)晶I與結(jié)晶II對SGC7901腫瘤細胞的抑制作用(i±s，n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注與細胞對照組比較，*p<0.01。由表3可知，結(jié)晶I與結(jié)晶II對SGC7901腫瘤細胞有一定的殺傷作用，其ICso分別為15.95嗎/ml和17.66嗎/ml，且抑瘤率與細胞對照組相比差異有顯著性(pO.Ol)。其中結(jié)晶I抑制率與濃度的相關(guān)性為(!"=97.72%),結(jié)晶II為(產(chǎn)97.47%)。2丄4結(jié)晶I和結(jié)晶II對Hela細胞增殖的影響當(dāng)濃度為5嗎/ml時，結(jié)晶I對Hela腫瘤細胞抑制率大于40。/。；當(dāng)濃度為40嗎/ml時，結(jié)晶I與結(jié)晶II對Hela腫瘤細胞抑制率均大于70M?？梢娊Y(jié)晶I與結(jié)晶II對Hela腫瘤細胞有較強的殺傷作用，且抑制率與濃度成正比。表4結(jié)晶I與結(jié)晶II對Hela月中瘤細胞的抑制作用(i±s，n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注與細胞對照組比較，*p<0.01。由表4可知，結(jié)晶I與結(jié)晶II對Hda腫瘤細胞有較強的殺傷作用，且抑瘤率與細胞對照組相比差異有顯著性(p<0.01)。按對數(shù)回歸方程計算結(jié)晶I抑制率與濃度的相關(guān)性為(r=94.17%)，其lC5o為9.71昭/ml;結(jié)晶II(r=97.27%)，其lC5o為11.66嗎/ml。提示結(jié)晶I與結(jié)晶II有較強的體外抑制Hela腫瘤細胞的作用。2丄5結(jié)晶J和結(jié)晶II對P388Di細胞增殖的影響當(dāng)濃度為2.5嗎/ml時，結(jié)晶I與結(jié)晶II對P388Di腫瘤細胞抑制率均大于40e/。；當(dāng)濃度為20pg/ml時，結(jié)晶II對P388D,腫瘤細胞抑制率大于70n/。，可見結(jié)晶I與結(jié)晶II對P388Dj中瘤細胞有很強的殺傷作用。表5結(jié)晶I與結(jié)晶II對P388D1腫瘤細胞的抑制作用(i±5，n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>50.564±0.006*48.392.50.654±0.009*40.131.250.697±0.009*36.14注與細胞對照組比較，*p<0.01。由表5可知，結(jié)晶I與結(jié)晶II對P388D,腫瘤細胞有很強的殺傷作用，且抑瘤率與細胞對照組相比差異有顯著性(pO.Ol)，其ICsQ分別為3.99嗎/ml和7.48嗎/ml。其中結(jié)晶II抑制率與濃度有較好的相關(guān)性，按對數(shù)回歸方程計算，結(jié)晶II(r=98.61%)。提示結(jié)晶I與結(jié)晶II有較強的體外抑制P388DJ中瘤細胞作用。表6結(jié)晶I與結(jié)晶II對B16腫瘤細胞的抑制作用(3f±s，n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注與細胞對照組比較，*p<0.01。從表6可以看出，結(jié)晶I和結(jié)晶II對B16腫瘤細胞有較強的殺傷作用，終濃度均為40.00、20.00、10.00、5.00、2.5、1.25昭/ml時，抑瘤率與細胞對照組相比差異均有顯著性(pO,Ol),按對數(shù)回歸方程計算，結(jié)晶I(r=94.67%)，其lC5o為2.35嗎/ml;結(jié)晶II(r=89.49%)，其ICso為15.18嗎/ml。2.2集落形成法綜合分析結(jié)晶I與結(jié)晶II對腫瘤細胞增殖影響的篩選結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這兩種化合物對Bele7404、SGC7卯1、H22、S180四種腫瘤細胞株有較好的抑制作用。為了進一步檢查結(jié)晶i與結(jié)晶n對這四種細胞增殖的影響，采用集落形成法對這四種細胞進行再篩選。結(jié)果見表9-表12。表9結(jié)晶I和結(jié)晶n在濃度為20pg/ml對Bele7404腫瘤細胞集落形成的影響(。/。)(^土^n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注與陰性對照組比較*p<0.01表10結(jié)晶I和結(jié)晶n在濃度為20嗎/ml對SGC790l腫瘤細胞集落形成的(x±5，n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注與陰性對照組比較*p<0.01表ll結(jié)晶I和結(jié)晶II在濃度為20ng/ml對S180腫瘤細胞集落形成的影響(％)(3f土s，n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表12結(jié)晶I和結(jié)晶II在濃度為20昭/ml對H22腫瘤細胞集落形成的影響(％)(i土s，n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>從表9-表12可以看出，結(jié)晶I對Bele7404、SGC7901、S180、H22細胞集落形成率分別為19.91%、21.62%、3.90%、3.24%，與陰性對照組比較，有顯著性差異(p〈0.01);且結(jié)晶I在濃度為20嗎/ml時，除對Bele7404禾t]SGC7901細胞的增殖抑制率分別為65.07。/。和59.55n/。外，對S180和H22的增殖抑制率均達到90。/。以上。結(jié)晶1I對Bele7404、SGC7901、S180、H22細胞集落形成率分別為29.60。/c)、29.40%、3.50%、5.11%，與陰性對照組比較，有顯著性差異(pO.01);且結(jié)晶n在濃度為20叱/m塒，除對Bele7404和SGC7卯l細胞的增殖抑制率分別為47.92和44.94外，對S180和H22的增殖抑制率均達到90%以上。2.3脾臟淋巴細胞增殖活性的檢測為了測試結(jié)晶I與結(jié)晶II對正常免疫細胞增殖的影響，檢測了其對小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響，結(jié)果見表13。表13結(jié)晶I與結(jié)晶II對脾細胞增殖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>從表13可以知道，結(jié)晶I和結(jié)晶II對脾細胞免疫毒性較小。3討論本研究通過MTT法和集落形成法證明了結(jié)晶I與結(jié)晶II的抗癌活性，表明本發(fā)明所采用的方法及方案具有可行性和科學(xué)性?？鼓[瘤藥物的篩選方法繁多，大體上分為體外和體內(nèi)方法二類。每種方法各有其優(yōu)點及局限性，用某一種簡單方法難以肯定藥物的抗癌作用。由于癌細胞生長具有相對的自主性，故可在體外建立具有無限增殖能力的細胞系。用體外細胞作抗癌藥篩選具有用藥少(5-10mg)，周期短，費用省等優(yōu)點。與非瘤性篩選體系相比，體外篩選結(jié)果與體內(nèi)實驗的相關(guān)性好，因此己被一些研究機構(gòu)作為常規(guī)的抗癌藥初篩手段[8—9]。本實驗發(fā)明采用MTT法對分離出來的六個樣品進行篩選，確定了抗腫瘤成分為結(jié)晶I和結(jié)晶II。實驗結(jié)果表明，結(jié)晶I和結(jié)晶II在一定程度上可抑制七種不同組織來源的腫瘤細胞株的繁殖。因此，為了進一步驗證前面篩選的結(jié)果，本發(fā)明再用集落形成法進行擴大篩選，實驗結(jié)果與MTT法的結(jié)果相一致，進一步佐證了結(jié)晶I與結(jié)晶II有抗腫瘤作用。由于在體外的抑瘤活性實驗中，結(jié)晶i與結(jié)晶n對腫瘤細胞顯現(xiàn)較強的抗癌活性，我們又進行了動物體內(nèi)實驗。目前臨床上常用的抗腫瘤藥大多經(jīng)動物移植性腫瘤篩選而發(fā)現(xiàn)的。按照我國目前的條件和情況，從天然產(chǎn)物中尋找新抗腫瘤藥物可選用S180實體型、艾氏實體型、Lewis肺癌、敗血病L1210和P358、黑色素瘤、肝癌腹水或?qū)嶓w型等動物模型進行篩選[15]。結(jié)合本實驗條件，首先選擇S180實體瘤模型和H22實體瘤模型對結(jié)晶I的體內(nèi)抗腫瘤活性進行篩選。按實體瘤實驗療效評價規(guī)定[16]:當(dāng)天然藥物對瘤體抑瘤率大于30%，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理有明顯差異時，連續(xù)3次療效穩(wěn)定，則說明藥物有一定的療效。由表14可見，結(jié)晶I對S180細胞低、中劑量組的腫瘤抑制率高達30%以上，其中高劑量組達到50.62%;由表15可見，結(jié)晶I三劑量組瘤重與腫瘤模型對照組比較，均有顯著差異，其中中、高劑量組抑瘤率均大于30%。結(jié)果表明結(jié)晶I能抑制小鼠S180、H22肉瘤的生長，且其抑瘤率也隨劑量增大而升高，說明其抑制作用有一定的劑量依賴性。同時，化療藥物環(huán)磷酰胺(CTX)的抗腫瘤效果雖然較高，但在實驗過程中可觀察到小鼠的體重下降，活動性差、皮毛脫落等毒副作用，且對小鼠的肝臟和脾臟等免疫器官抑制作用較大，也就是說環(huán)磷酰胺在發(fā)揮抗腫瘤作用的過程中同時對機體的免疫力有較大的破壞，導(dǎo)致體重異常下降，免疫器官受損；而本實驗中的結(jié)晶I在發(fā)揮抗腫瘤作用過程中，小鼠活動性強，皮毛光滑，體重較正常，沒有表現(xiàn)出明顯的毒副作用。篩選腫瘤藥物的給藥途徑應(yīng)與推薦臨床用藥的途徑相同，一般初篩時均用腹腔注射(i.p.),靜脈給藥者可用腹腔注射代替，口服可用灌胃的方法[17]。為檢驗結(jié)晶I口服的效果，我們進行了腹水瘤小鼠灌胃實驗,以生命延長率作為衡量指標(biāo)。結(jié)果顯示，由表16可知在對S180小鼠生命延長率的實驗中，結(jié)晶I在125mg/kg和250mg/kg組小鼠平均生存期與對照組比較，差異有顯著性意義，表明結(jié)晶I對S180有一定的抑制作用，能明顯提高S180小鼠的生命延長率；且由表17可知，結(jié)晶I高、中、低三個劑量組小鼠平均生存期與對照組比較，有非常顯著差異性意義，表明結(jié)晶I對H22有一定的抑制作用，能明顯提高H22小鼠的生命延長率。二、本發(fā)明結(jié)晶n抗腫瘤作用機制研究i實驗材料和方法i.i實驗材料i丄i實驗動物昆明種純系健康小鼠，6周齡，18-22g，購自廣西中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。l丄2細胞株Bele7404細胞株購自上海細胞生物研究所細胞庫1.1.3實驗儀器流式細胞儀，美國產(chǎn)(Beckman)，型號Epricsxl穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠，型號DYY-6B倒置熒光顯微鏡(Nikon)，日本產(chǎn)，型號TE2000-UVortex上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠，型號XW-80Al丄4實驗試劑吖啶橙sigma分裝蛋白酶K:Beyotime產(chǎn)品編號C0007-2裂解液Beyotime產(chǎn)品編號C0007-lTris平衡苯酚北京市雙翔達生化試劑儀器經(jīng)營部生產(chǎn)，批號:20060412氯仿北京化學(xué)試劑公司，AR，批號020404LPS醋酸銨Beyotime產(chǎn)品編號C0007-3無水乙醇成都市科龍化工試劑廠，批號20061103TE:Beyotime產(chǎn)品編號C0007-4瓊脂糖購自上海伯奧生物科技有限公司，批號20000822RnaseA:sigma分裝,上海申能博彩生物科技有限公司PI:sigma分裝l丄5PBS的配置PBS(0.01M,PH7.2-7.4):KH2PO40.345g,NaHP04.H201.56g,NaC18.0g,KC10.2g加水定容至1000ml，高壓滅菌。1.2實驗方法1.2.1形態(tài)學(xué)檢測L2丄l瑞氏和吉姆薩混染法取對數(shù)生長期Bele7404細胞，用含10。/。小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配成lxl()S個/ml的細胞懸液，接種在放置有載玻片的培養(yǎng)皿中。其中，在實驗組分別加入結(jié)晶I與結(jié)晶II藥物，使藥物終濃度均為20嗎/ml，對照組加入等體積的培養(yǎng)液，置含10。/。CO23/C溫箱中培養(yǎng)3天。三天后，取出載玻片，用甲醇固定10min。先用Wright's染液染色lmin,然后用Giemsas溶液與Sorensen磷酸緩沖液以l:9混合成工作液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，染色10min。流水沖洗、涼干，鏡檢。1.2丄2吖啶橙(AO)染色法取對數(shù)生長期Bele7404細胞，用含10%小牛血清的RPMIl640培養(yǎng)基配成1x1()S個/ml的細胞懸液，分裝于培養(yǎng)瓶中。其中，在實驗組分別加入結(jié)晶I與結(jié)晶II藥物，使藥物終濃度均為20pg/ml，對照組加入等體積的培養(yǎng)液，置含10%<:0237。C溫箱中培養(yǎng)3天。三天后，用胰酶消化，制備細胞懸液，分別取各實驗組和對照組95pl細胞懸液，均加入5)al吖啶橙儲存液,混勻。取l滴混合液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，3/C下染色10min，置于熒光顯微鏡下紫外光激發(fā)，40x熒光物鏡觀察，隨機計數(shù)100個細胞，計數(shù)Bele7404細胞凋亡率，并選取一個形態(tài)典型的視野拍照。凋亡率(％)4周亡陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)xl00n/01.2.2細胞凋亡的FCM檢測(PI和Hoechst33342雙染色法取對數(shù)生長期Bele7404細胞，用含10Q/。小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配成2xl(^個/ml的細胞懸液，分裝于培養(yǎng)瓶中。其中，在實驗組分別加入結(jié)晶i與結(jié)晶n藥物，使藥物終濃度均為20嗎/ml，對照組加入等體積的培養(yǎng)液，置含10%(20237"C溫箱中培養(yǎng)3天。三天后，用胰酶消化，制備細胞懸液。離心收集細胞，PBS洗一次，離心棄PBS，再用PBS充分混勻細胞，加入冰冷的70%乙醇，混勻，用封口膜封口，4。C過夜。棄去70%乙醇，PBS洗兩次，用剩余的約0.5mlPBS混勻固定的細胞，加入RnaseA(終濃度為50嗎/ml)，37C消化lh后加入PI(終濃度為50嗎/ml)禾B2mmol/LHoechst33342，4。C染色lh。上機。在FACS420流式細胞計上測定；氬離子激光器488或514nm波長光激發(fā)；阻斷濾片為620nm長波通濾片。2實驗結(jié)果2.1瑞氏和吉姆薩混染法以20嗎/ml濃度(以下同)培養(yǎng)人肝癌細胞株Bele7404，在加藥72h后，用瑞氏和吉姆薩染液染色后，在倒置顯微鏡下觀察，細胞經(jīng)用瑞氏和吉姆薩染液染色后，倒置顯微鏡下觀察可見，陰性對照組的細胞膜較完整，胞質(zhì)透明，核膜完整，核大而圓；而給藥組的細胞則凋亡變圓變小，核質(zhì)固縮。2.2吖啶橙(AO)染色法以終濃度均為20pg/ml的結(jié)晶I和結(jié)晶II培養(yǎng)人肝癌細胞株Bele7404，72h后，用吖啶橙染色，在熒光顯微鏡下紫外光激發(fā)，40x熒光物鏡觀察，隨機計數(shù)100個細胞，計算細胞凋亡率，即凋亡指數(shù)(AI)，并選取一個形態(tài)典型的視野拍照。表18結(jié)晶I和結(jié)晶II處理72h細胞凋亡指數(shù)(AI)(%)(i±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注與陰性對照組比較PO.01從表18可知，在倒置顯微鏡40x下觀察隨機計數(shù)100個細胞，計算細胞凋亡率(AI)，結(jié)晶I的凋亡率為12.5，結(jié)晶II的凋亡率為41.3，兩者的凋亡指數(shù)與陰性對照組相比較有顯著性差異(pO.Ol)。陰性對照組的細胞染色均勻，熒光很強；結(jié)晶I和結(jié)晶II處理組可看見凋亡細胞，細胞核中有鮮綠色的斑點，細胞有裂解現(xiàn)象。表19流式細胞儀分析的各組細胞周期分布和凋亡指數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>注與陰性對照組比較PO.01由流式細胞儀分析結(jié)果可知結(jié)晶l20嗎/ml處理，胃癌細胞Bde7404的凋亡率為10.7%，結(jié)晶Il20嗎/ml處理，凋亡率為39.2%(如圖32)。由各周期時相變化(表19)可知結(jié)晶I處理的Bele7404G0/Gl期和S期細胞減少，而G2/M期細胞增加；而結(jié)晶II處理的Bde7404G0/Gl期和G2/M期細胞增加，而S期細胞明顯減少。3討論目前，惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的頑疾，給人類帶來巨大的精神壓力和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。隨著腫瘤診斷治療技術(shù)的不斷完善，治療水平不斷提高，中醫(yī)藥在腫瘤治療中的地位和綜合優(yōu)勢愈顯重要[22]?？鼓[瘤中草藥的發(fā)掘和篩選已向縱深發(fā)展，近年來,從天然植物中尋找新的抗腫瘤藥物己成為新藥研究的主要發(fā)展方向之一[23]。研究從余甘子葉或果實提取物中分離并篩選出抗腫瘤活性成分，已初步確定結(jié)晶I和結(jié)晶II有抗腫瘤活性，其誘導(dǎo)細胞凋亡是抗腫瘤機制之一，引起凋亡的原因可能跟阻滯細胞周期有關(guān)。六、臨床效果因本發(fā)明尚未獲得新藥臨床批件，不能進入臨床研究，因此只在4例志愿者身上進行臨床應(yīng)用實驗。例一黃XX，女，廣西南寧市人，43歲，查出患胃癌3個月，予上述制備實例三所得片劑口服，每日三次，每次4片，半年期間病情沒有惡性發(fā)展。例二莫XX，男，廣西南寧市人，37歲例行體檢時查出淋巴細胞增值。予上述制備實例二所得口服液口服，每日三次，每次50ml，5個月病情有所好轉(zhuǎn)。例三黃XX，男，廣西橫縣農(nóng)民，52歲，肺癌病人。因經(jīng)濟困難中斷醫(yī)院正常治療，改為服用制備實例六所得膠囊30天，期間病情沒有惡性發(fā)展。例四董XX，男，廣西恭城縣農(nóng)民，60歲，患白血病。因病況反復(fù)發(fā)作，加上經(jīng)濟困難而中斷醫(yī)院正常治療，改為服用制備實例五所得顆粒劑40天，病情有所好轉(zhuǎn)。權(quán)利要求1.一種具有抗癌作用的化合物，其特征在于它是從余甘子葉或果實中提取得到的沒食子酸和沒食子酸乙酯，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下(1)沒食子酸(2)沒食子酸乙酯2、如權(quán)利要求1所述的具有抗癌作用的化合物的制備方法，其特征在于將余甘子葉或果實分別用95%乙醇和50%乙醇進行滲漉提取后，取50%乙醇浸膏再分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯進行部位分離，利用硅膠柱層析法對乙酸乙酯部位進行分離純化，得到結(jié)晶化合物沒食子酸和沒食子酸乙酯。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抗癌作用的化合物的制備方法，其特征在于將提取的抗癌化合物化合物做成以下制劑或劑型口服給藥制劑口服液、片劑、膠囊、含片、丸劑；注射給藥制劑注射劑；噴霧給藥制劑。4、如權(quán)利要求1所述的具有抗癌作用的化合物在制備治療肝癌、白血病、胃癌方面的應(yīng)用。(2)沒食子酸乙蹈全文摘要本發(fā)明公開了一種從余甘子葉或果實中提取的具有抗癌、抗菌作用的活性成分，將余甘子葉或果實分別用95％乙醇和50％乙醇進行滲漉提取后，取50％乙醇浸膏再分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯進行部位分離，利用硅膠柱層析法對乙酸乙酯部位進行分離純化，得到純結(jié)晶化合物結(jié)晶I和結(jié)晶II，用該化合物制成不同的中藥制劑，有較好的抗肝癌、宮頸癌、胃癌、黑色素瘤、白血病的作用。文檔編號C07C65/00GK101391961SQ20081007386公開日2009年3月25日申請日期2008年10月28日優(yōu)先權(quán)日2008年10月28日發(fā)明者李學(xué)堅,董明姣,鐘振國申請人:廣西中醫(yī)學(xué)院