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一種從豬血中提取高純度血紅蛋白的方法

文檔序號:3572335閱讀:691來源:國知局
專利名稱:一種從豬血中提取高純度血紅蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及基于血液代用品的血紅蛋白的分離純化技術(shù),尤其涉 及一種從豬血中提取高純度血紅蛋白的方法。
背景技術(shù)
輸血往往是搶救生命的重要手段之一。在我國,各大城市的醫(yī)院 幾乎都發(fā)生過血荒, 一些手術(shù)不得不等待血液到來才能實施。血液在
低溫條件下一般只能保存21天,而且存在艾滋病、肝炎等病毒的傳染 和血型的匹配問題。因此,制備一種安全有效的血液代用品對輸血醫(yī) 學(xué)具有十分重要的意義。
血液替代品的研究迄今已有近百年的歷史,其研究方向主要有兩 個氟碳化合物和血紅蛋白Hb制品。氟碳化合物因存在使用不便及容 易引起免疫系統(tǒng)功能阻斷等毒副作用,阻礙了其進一步應(yīng)用;血紅蛋 白制品具有天然血紅蛋白的氧結(jié)合特性和正常的生理代謝途徑,且去 除了具有表面抗原的紅細(xì)胞膜,使輸血不再需要配血型,因此血紅蛋 白類血液替代品比氟碳化合物更符合人體生理需要,目前已經(jīng)成為國 內(nèi)外的研究熱點。血液代用品用于臨床輸血時,溶液中殘留的細(xì)胞膜、 雜蛋白、熱源、內(nèi)毒素等都會對患者帶來致命性的損害,因此以血紅蛋白為基礎(chǔ)的血液替代品都需要純化的血紅蛋白作為原料,如何獲得 高質(zhì)高量的純化血紅蛋白是該課題研究的關(guān)鍵。
目前,血紅蛋白的來源主要有三個第一,過期的人血,由于人 血紅蛋白來源有限,過期人血更是遠遠不能滿足擴大化生產(chǎn),還存在 人血病原體交叉污染等問題,不可能大批量制備;第二,基因重組人 血紅蛋白、人血干細(xì)胞體外培養(yǎng)人工紅細(xì)胞等基因工程技術(shù)產(chǎn)物,但 這些技術(shù)在投入工業(yè)化生產(chǎn)時,尚存在工藝復(fù)雜、產(chǎn)率較低及成本過 高等問題,限制了它在血液代用品中的應(yīng)用;第三,來源廣泛的動物 血。如有人就曾使用牛血、豬血為原料提取了血紅蛋白,并取得了好 的效果。豬血紅蛋白有85%的氨基酸殘基與人血紅蛋白同源,經(jīng)X光 晶體衍射分析顯示它與人血紅蛋白結(jié)構(gòu)極為近似,其氧親和力調(diào)節(jié)機 制與人血紅蛋白相同,且免疫原性比牛血紅蛋白低,因此豬血紅蛋白 是迄今為止發(fā)現(xiàn)的人血紅蛋白最理想的替代材料。中國是世界上第一 養(yǎng)豬大國,豬的數(shù)量遠遠超過了牛,因此采用豬血作為提純血紅蛋白 的原料,對于血液代用品的研究具有特別的意義。
目前國外提純血紅蛋白的方法應(yīng)用最廣泛的就是離子交換層析 法,需要用到高效液相色譜儀,對儀器設(shè)備要求高,無形中增加了成 本。而國內(nèi)除了用到離子交換層析、親和層析等方法以外,還較多采 用了加溫、超濾等措施。實踐證明加溫后雜蛋白量依然比較大,并 且加溫后會讓部分血紅蛋白變性沉淀,而其進一步的超濾除了增加細(xì)菌病毒污染外,還提高了生產(chǎn)成本,由于血紅蛋白分子量較大,超濾 膜很容易被堵住,超濾膜的成本也較高,這樣不易擴大生產(chǎn)規(guī)模。另 外,眾所周知,血紅蛋白溶液很不穩(wěn)定,即使在低溫下也容易氧化和 變性。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的問題是提供一種從豬血中提取高純度血紅蛋白 的方法,得到的血紅蛋白無基質(zhì),無熱源,能夠安全有效地進行進一 步修飾以制造血液代用品,而且操作簡便,成本低廉。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采用的工藝步驟是(1) 將抗凝豬全血經(jīng)離心去除血漿、白細(xì)胞及血小板,用生理鹽水 洗滌紅細(xì)胞2 4次,低速離心后得到壓積紅細(xì)胞;(2) 用2 8倍于壓積紅細(xì)胞體積的低滲溶液溶解壓積紅細(xì)胞,通入 惰性氣體,在溶血液中加入抗氧化劑,調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0 7.4,再加入 保護劑至終濃度為1 5%,加入抑菌藥物,充分?jǐn)嚢? 4小時,高速離心 10 30分鐘后取上清得到粗制血紅蛋白溶液;(3) 往粗制血紅蛋白溶液中加入體積是粗制血紅蛋白溶液1/10 1/4 的甲苯,震蕩搖勻后低溫條件下萃取2 6小時,取下層血紅蛋白溶液;(4) 將血紅蛋白溶液裝入透析袋中,在加有保護劑和抑菌藥物的透析 液中透析36 72小時,中間更換1 3次透析液,去除殘留甲苯和小分子 物質(zhì);(5) 將透析后的血紅蛋白溶液加入保護劑,冷凍真空干燥成干粉后再 溶解成高濃度、小體積的液體,上樣于葡聚糖凝膠層析柱純化,收取分子 量均一的高純度血紅蛋白;(6) 將高純度血紅蛋白經(jīng)過濾除菌去熱原,加入保護劑,然后冷凍 真空干燥,得到高純度、無基質(zhì)、無熱源的血紅蛋白干粉。以上各步驟均在2 6'C溫度條件下進行。在上述步驟(2)制備粗制血紅蛋白溶液的過程中,加入抗氧化 劑和通入惰性氣體,對紅細(xì)胞膜裂解后游離出來的血紅蛋白有保護作 用,減少無載氧活性的高鐵血紅蛋白metHb的生成。細(xì)胞膜上有超氧 化物歧化酶S0D、過氧化氫酶Cat、谷光甘肽等還原系統(tǒng),用低滲溶 液破壞了細(xì)胞膜之后,血紅蛋白就失去了還原系統(tǒng)的保護,很容易被 氧化為metHb。膜分離過程中,血紅蛋白溶液受攪拌剪切力的影響, 會產(chǎn)生局部升溫和氧傳遞速度與溶氧量的增加,容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性 失活。因此,通入惰性氣體可以使血紅蛋白處于脫氧狀態(tài),再加入抗 氧化劑如還原型谷光甘肽GSH、半胱氨酸Cys、維生素C、亞硫酸鈉等, 保護劑如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇等,使血紅蛋白在破膜的過 程中不易發(fā)生氧化和變性。這樣就使得延長破膜時間成為可能,從而 讓血紅蛋白充分釋放出來。其次,高速離心去除細(xì)胞膜碎片的過程中, 離心時間對于樣品純度有影響,因此我們選用高速離心10 30分鐘, 然后取上清得到粗制血紅蛋白溶液。步驟(3)中,采用有機溶劑甲苯萃取血紅蛋白,可以有效除去 溶液中未除干凈的膜脂和其它雜蛋白。經(jīng)比較多種有機溶劑萃取及加 溫法純化血紅蛋白,發(fā)現(xiàn)用甲苯萃取的效果較好,得到的SDS-聚丙烯 酰胺電泳條帶更加單一,萃取后產(chǎn)生的乳化層也較少,血紅蛋白損失 量減小,是一種比較理想的純化溶劑。而甲苯帶來的安全隱患可以通 過延長萃取時間、透析以及后面的凝膠層析得到解決。透析時間與透 析液的保護措施是經(jīng)過實驗得出的,這對于殘留甲苯和小分子的去除 比較重要。步驟(5)將透析后的血紅蛋白冷凍之前加入適量保護劑,在一 定溫度下冷凍后真空干燥,不會影響血紅蛋白的活性,使產(chǎn)品具有疏 松、溶解度好等優(yōu)點。然后溶解成高濃度、小體積液體通過葡聚糖凝 膠柱層析進一步分離純化。葡聚糖凝膠的優(yōu)點在于它在水、鹽溶液、 有機溶劑、堿和弱酸性溶液中都是穩(wěn)定的,且不溶于一切溶劑,可重 復(fù)使用。它除了可用于制備性色譜過程,也可用于批量工藝,可在較 低的壓力下獲得較高的流速,不需要高壓液相色譜儀等昂貴設(shè)備。葡 聚糖凝膠作為一種分子篩,大分子物質(zhì)只能在膠??障堕g流動,所受 膠粒的膽力小,流速快,首先被洗脫下來;小分子物質(zhì)直徑小于膠粒 網(wǎng)孔,可以在膠粒內(nèi)外流動,受到的阻力大,流速慢而與前者分離開。 因此我們可以選取其中分子量均一的部分進行收集,血紅蛋白的顏色 明顯,且具有紫外光譜特征,很容易收集到純度高的血紅蛋白溶液。步驟(6)通過濾膜一次性除菌去熱源,不再經(jīng)過透析、超濾等 增加污染的步驟。最后與前述條件一樣冷凍真空干燥成血紅蛋白干 粉,它比血紅蛋白溶液穩(wěn)定得多,更有利于血紅蛋白的保存和進一步 的修飾,即取即用,這樣就可以把血紅蛋白的純化與修飾兩個環(huán)節(jié)分 開來。本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比,具有如下優(yōu)點1、 保證了血紅蛋白的pH值在純化的整個過程中處于生理狀態(tài), 減少了其變性失活的幾率;2、 裂解紅細(xì)胞及以后的保護措施得當(dāng)、簡便、價廉;3、 首次采用了一定量的有機溶劑甲苯萃取血紅蛋白,并在后來 純化的同時去除了殘余甲苯,達到了高效安全的目的;4、 葡聚糖凝膠可重復(fù)利用,不用高效液相等昂貴設(shè)備及復(fù)雜操 作,節(jié)約了成本;5、 不需要常規(guī)超濾,最后得到的是血紅蛋白干粉,性質(zhì)穩(wěn)定, 易于保存,純度達到99%以上,內(nèi)毒素等其它指標(biāo)檢測均合格。


圖1是本發(fā)明方法的工藝流程圖。圖2是豬血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及純化樣品的SDS-PAGE電泳圖譜,其 中N為標(biāo)準(zhǔn)品(2g/dL), 1、 2、 3為純化樣品(2g/dL)。圖3是豬血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及純化樣品的紫外光譜圖,其中A為標(biāo)準(zhǔn)品(lg/dL), B為純化樣品(lg/dL)。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明從活豬全血中提取高純度血紅蛋白,具體步驟按圖l所示工藝流 程進行,整個過程在2 6'C條件下進行1、 將加入了抗凝劑如肝素的豬動脈血離心去除血漿、白細(xì)胞、血小板,用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞2 4次,低速離心后得到壓積紅細(xì) 胞;2、 用2 8倍壓積紅細(xì)胞體積的低滲溶液如0.01M NaCl或低滲 PBS溶解壓積紅細(xì)胞,通入氮氣或氬氣等惰性氣體,在溶血液中加入 pH值為7. 0 7. 4的維生素C至溶液pH值達到7. 0 7. 4,再加入保 護劑如葡萄糖至終濃度為1 5%,加入青霉素和鏈霉素等常規(guī)抑菌藥 物,充分?jǐn)嚢? 4小時,高速離心10 30分鐘后得到粗制血紅蛋白 溶液;3、 往粗制血紅蛋白溶液中加入體積是粗制血紅蛋白溶液1/10 1/4 的甲苯,震蕩搖勻后低溫條件下萃取2 6小時,取下層血紅蛋白溶 液進行透析;4、 將血紅蛋白溶液裝入透析袋中,在加有抗氧化保護和抑菌藥 物的透析液中透析36 72小時,中間更換1 3次透析液,去除殘留 甲苯和小分子物質(zhì);5、 將透析后的血紅蛋白溶液加入適量保護劑冷凍真空干燥成干 粉后,溶解成高濃度、小體積的液體,上樣于葡聚糖凝膠層析柱純化, 收取分子量均一的高純度血紅蛋白;6、 經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌去熱原,然后冷凍干燥成高純度無 基質(zhì)無熱源的血紅蛋白干粉保存于2 8°C。由上述方法制備的血紅蛋白主要指標(biāo)檢測結(jié)果如下表所示:檢測項目結(jié)果血紅蛋白(Hb)干粉MetHb生成量〈1%血紅蛋白(Hb)純度〉99%血紅蛋白得率〉80%PH值7. 0 7. 4紫外特征吸收光譜正常內(nèi)毒素合格細(xì)菌合格熱原陰性豬血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及本發(fā)明純化樣品的SDS-PAGE電泳圖譜對比 如圖2所示,可以看出,本發(fā)明分離純化的豬血紅蛋白電泳譜帶優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)品,無大分子雜帶,分子量一致。豬血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及本發(fā)明純化樣品的紫外光譜圖對比如圖3所示,可以看出,本發(fā)明分離純化的豬血紅蛋白紫外最高吸收峰在410nm,與標(biāo)準(zhǔn)品一致,且樣品血紅蛋白在540nm和580nm處各有一 個小峰,而標(biāo)準(zhǔn)品沒有,這說明本發(fā)明純化的血紅蛋白樣品正確,其 氧合特性還優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)品,適合作為血液代用品的原料。
權(quán)利要求
1. 一種從豬血中提取高純度血紅蛋白的方法,其特征在于包括以下步驟,各步驟均在2~6℃溫度條件下進行(1)將抗凝豬全血經(jīng)離心去除血漿、白細(xì)胞及血小板,用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞2~4次,低速離心后得到壓積紅細(xì)胞;(2)用2~8倍于壓積紅細(xì)胞體積的低滲溶液溶解壓積紅細(xì)胞,通入惰性氣體,在溶血液中加入抗氧化劑,調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0~7.4,再加入保護劑至終濃度為1~5%,加入抑菌藥物,充分?jǐn)嚢?~4小時,高速離心10~30分鐘后取上清得到粗制血紅蛋白溶液;(3)往粗制血紅蛋白溶液中加入體積是粗制血紅蛋白溶液1/10~1/4的甲苯,震蕩搖勻后低溫條件下萃取2~6小時,取下層血紅蛋白溶液;(4)將血紅蛋白溶液裝入透析袋中,在加有保護劑和抑菌藥物的透析液中透析36~72小時,中間更換1~3次透析液,去除殘留甲苯和小分子物質(zhì);(5)將透析后的血紅蛋白溶液加入保護劑,冷凍真空干燥成干粉后再溶解成高濃度、小體積的液體,上樣于葡聚糖凝膠層析柱純化,收取分子量均一的高純度血紅蛋白;(6)將高純度血紅蛋白經(jīng)過濾除菌去熱原,加入保護劑,然后冷凍真空干燥,得到高純度、無基質(zhì)、無熱源的血紅蛋白干粉。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬血中提取高純度血紅蛋白的方法,其特征在于步驟(1)中所取豬全血為活豬動脈血,生理鹽水是濃度為0. 9Q/。的NaCl溶液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬血中提取高純度血紅蛋白的方 法,其特征在于步驟(2)中所述低滲溶液為0.01mol/L的NaCl溶液或 低滲PBS溶液,所述惰性氣體為氮氣或氬氣。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬血中提取高純度血紅蛋白的方 法,其特征在于步驟(2)中所述抗氧化劑是pH值為7.0 7.4的維生素 C,步驟(2)和步驟(4)中所述的抑菌藥物是100U/ml的青霉素或/和 鏈霉素。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬血中提取高純度血紅蛋白的方 法,其特征在于步驟(2)中所述的保護劑是葡萄糖。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬血中提取高純度血紅蛋白的方 法,其特征在于步驟(5)和步驟(6)中所述的保護劑是蔗糖。
全文摘要
一種從豬血中提取高純度血紅蛋白的方法,在2~6℃條件下依次進行如下操作首先用抗凝豬全血制備得壓積紅細(xì)胞;用低滲溶液溶解壓積紅細(xì)胞并通入惰性氣體,加入抗氧化劑并調(diào)節(jié)溶液pH值,加入保護劑和抑菌藥物,高速離心后得粗制血紅蛋白溶液;往粗制血紅蛋白溶液中加入甲苯,低溫下萃取后取下層血紅蛋白溶液進行透析;透析后的血紅蛋白溶液冷凍干燥后再溶解成高濃度小體積的液體并上樣于葡聚糖凝膠層析柱純化,收取分子量均一的高純度血紅蛋白經(jīng)過濾除菌去熱原,然后冷凍真空干燥,得高純度無基質(zhì)無熱源的血紅蛋白干粉。用本發(fā)明方法得到的血紅蛋白無基質(zhì)無熱源,能安全有效地進行進一步修飾以制造血液代用品,操作簡便,成本低廉。
文檔編號C07K1/34GK101289493SQ20081006957
公開日2008年10月22日 申請日期2008年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日
發(fā)明者劉建倉, 劉良明, 濤 李, 李東紅, 婷 胥 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所
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