專利名稱：：一種ghgkhknk八肽的制備工藝及醫(yī)藥用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明提供一種GHGKHKNK八肽的制備工藝，本發(fā)明還公開了其在抗腫瘤轉(zhuǎn)移方面的醫(yī)藥用途，屬于生物化學中的多肽藥物
技術領域：
。技術背景近年來，隨著研究的深入，多肽對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用逐漸引起人們的重視。國內(nèi)外學者通過從動植物中提取、噬菌體肽庫篩選以及化學合成等方法，得到了一些具有抗腫瘤活性的小分子多肽，這些小肽可以針對腫瘤細胞的生長、發(fā)展的不同環(huán)節(jié)，特異性殺傷、抑制腫瘤細胞的浸潤及轉(zhuǎn)移。1990年Alino等發(fā)現(xiàn)5肽YIGSR(酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸)可使肺癌轉(zhuǎn)移能力下降(AlinoSF,UndaFJ，Perez-YarzaG.Lamininsurfacebindingsitesandmetastaticpotentialof3LLtumorcells,increasedbyindomethacin[J].BiochemBiophysResCommun,1990，167(2):731-738.)。抗腫瘤的小分子多肽分子量小、活性高，對多藥抗性的腫瘤細胞系也具有良好的抑制活性。同時小分子多肽可以多種方式給藥，不易引起免疫反應，且人工化學合成的生產(chǎn)成本較低，這些都預示著小分子抗腫瘤肽在臨床方面有很好的應用前景。最近，研究發(fā)現(xiàn)人的高分子激肽原第5結(jié)構域中富含組氨酸的區(qū)域能夠選擇性的抑制人臍靜脈和毛細血管上皮細胞的增殖并抑制小鼠角膜新血管的形成，也能夠作為一個抗粘附蛋白與VN競爭,與尿激酶受體結(jié)合，進而抑制上皮細胞的侵襲與粘附。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開一種GHGKH認K八肽的制備工藝，具有工藝穩(wěn)定，原輔材料來源方便，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低的特點。本發(fā)明還公開了GHGKHKNK八肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明涉及的GHGKHKNK八肽具有下列一級結(jié)構Gly-His-Gly化ys-His-Lys-Asn-Lys本發(fā)明GHGKH認K八肽的具體制備工藝如下以2-氯-三苯甲基樹脂、4-甲基三苯甲基樹脂、4-甲氧基三苯甲基樹脂或三苯甲基樹脂為起始原料，按固相合成的方法依次連接具有保護基團的氨基酸，獲得保護八肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團，用TBTU或HBTU及H0BT為縮合劑進行接肽反應，同歩進行脫側(cè)鏈保護基團及切肽，獲得該八肽化合物粗品。再經(jīng)C18(或C8)柱分離純化，冷凍干燥后，制得精品。按照本發(fā)明，依次連接具有保護基團的氨基酸，獲得保護八肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團的具體歩驟包括(1)制備Fmoc-Lys(Boc)-樹脂將以2-氯-三苯甲基樹脂、4-甲基三苯甲基樹脂、4-甲氧基三苯甲基樹脂或三苯甲基樹脂，用DMF浸泡10-60分鐘，使樹脂充分溶脹，加DIPEA或DMPA和Fmoc-Lys(Boc)-OH，1015。C反應1~24小時；再加入甲醇105(TC反應1~20小時，氮氣吹干，樹脂用DMF洗滌，獲得Fmoc-Lys(Boc)-樹脂；所說的樹脂取代量為0.3-1.5mmol/g;粒徑為100400目；Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~5倍；DIPEA或DMPA的摩爾數(shù)為樹脂的220倍；脫帽試劑的加入量以樹脂的重量為基準為5-20ml/g;甲醇的摩爾系數(shù)為樹脂的2~20倍；(2)制備Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在歩驟(1)的Fmoc-Lys(Boc)-樹脂中，加入脫帽試劑，1050。C反應10-60分鐘，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，1050'C反應1~5小時，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，得到Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂；所說的脫帽試劑為PIP:DMF=1:25,體積比；脫帽試劑的加入量以樹脂的重量為基準為5-20ml/g;混合物中Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的2~5倍；TBTU/HBTU和HOBT的摩爾系數(shù)為樹脂的2~5倍；所說的接肽試劑為NMM:DMF-h5~15，體積比；接肽試劑中，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的2~5倍；"TBTU/HBTU禾卩HOBT"指的是TBTU與HOBT的混合4勿，或者是HBTU與HOBT的混合物；(3)制備Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)誦樹脂在歩驟(2)的Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂；混合物中Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的2~5倍。其余操作以及工藝條件同歩驟(2);(4)制備Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在步驟(3)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-His(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)隱樹脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的2~5倍。其余操作以及工藝條件同步驟(2);(5)制備Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在步驟(4)的Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂；混合物中Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的2~5倍。其余操作以及工藝條件同步驟(2);(6)制備Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)陽Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在步驟(5)的Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Gly-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂；混合物中Fmoc-Gly-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的25倍。其余操作以及工藝條件同步驟(2);(7)制備Fmoc-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)隱樹脂在步驟(6)的Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Fmoc-His(Trt)-OH、TBTU/HBTU禾nHOBT的混合物，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的2~5倍。其余操作以及工藝條件同步驟(2);(8)制備Boc-Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在步驟(7)的Fmoc-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干。加入用接肽試劑溶解的Boc-Gly-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Boc-Gly-His(Trt)陽Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂；混合物中Boc-Gly-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的2~5倍。其余操作以及工藝條件同步驟(2);(9)制備Gly-His(Trt)隱Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)在歩驟(8)Boc-Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂中，加入遇冷至102(TC的切肽試劑，105(TC反應15小時，減壓蒸去除溶劑，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，P20s真空干燥，獲得粗品；所說的切肽試劑的組分為TFA/EDT/HO/TIS=90-95/2-5/l-5，體積比；按照本發(fā)明優(yōu)選的技術方案，分離純化包括如下歩驟將粗品溶于醋酸銨中，過濾，濾液經(jīng)C18(或C8)柱純化，流動相0.1MNH4AC:乙腈(7.5:2.5);流動速為100650ml/min;檢測波長為280nm;用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后去鹽，凍干，獲得成品，總收率為3040%。本發(fā)明的工藝路線有下列積極效果采取切肽試劑(TFA/EDT/TIS)進行切肽，接肽收率高(每歩接肽收率為》99%)，加入乙醚沉淀粗品的方法，避免使用氟化氫等劇毒試劑，三分污染少，且提高收率，采用C18(或C8)柱分離純化，避免使用TFA進行純化，減少三廢，每歩接肽收率均在98°/。以上；總收率為25~35%。具備規(guī)?；a(chǎn)能力，工藝穩(wěn)定，原輔材料來源方便，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，三廢少，收率高，質(zhì)量穩(wěn)定，本發(fā)明以GHGKHKNK八肽作為主要活性成分制備抗腫瘤藥物，具有明顯抑制腫瘤轉(zhuǎn)移活性，其可用于治療多種腫瘤相關的疾病。以下實驗表明GHGKHKM八肽對癌癥的治療效果一、GHGK服NK八肽對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10的體外抑制作用按照Buttke等人([1]ButtkeTU，McCubrgyJA，Owen丁C.Useofanaqeoustetrazolium/JIm睡olMethods,1993,157:233—240.)所述的MTS比色法檢測GHGKHKNK八肽對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10的體外抑制作用，觀察GHGKHKNK八肽對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10的體外抑制作用。本試驗取對數(shù)生長期的小鼠黑色素瘤細胞B16-F10單細胞懸液，含10%FBSIMDM調(diào)整細胞濃度至2X107ml，以每孔100ul接種于96孔板，37°C、5%C02孵育24h。棄上清，每孔加入無血清IMDM配制的八肽100ul，藥物終濃度分別為1CT、1(T、10_6、10-7、10—"mol/L，以無血清IMDM為對照組。每組設4個復孔。37。C、50線分別培養(yǎng)24h、48h。離心去上清，加入MTS/PMS液40yl，37°C、5%C02孵育4h。離心去上清，混勻于490nm處測吸光度(A)值。按下式計算細胞抑制率。細胞抑制率=(1-給藥組A值/對照組A值)X10(^。本發(fā)明中的八肽藥物濃度為10、ol/L1(Tmol/L在體外產(chǎn)生對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10不同程度的生長抑制。GHGKHKNK八肽的濃度為1(Tmol/L時，在體外作用24h和48h后可以顯著抑制小鼠黑色素瘤細胞B16-F10的生長，具體結(jié)果如下GHGKHKNK八肽對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10的體外抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與對照組比較具有顯著性差異(P<0.05)二、GHGKHKNK八肽體外對腫瘤細胞克隆形成能力及侵襲能力的影響按照LiLiu等人(Neoplasia.2006November,8(11):917-924)所述的方法完成平板克隆形成實驗以及細胞侵襲實驗，觀察本發(fā)明的八肽體外對腫瘤細胞克隆形成能力及侵襲能力的影響。平板克隆形成實驗的方法是將對數(shù)生長期的3組細胞分別以2.5g/L胰蛋白酶消化成單個細胞懸液，并作梯度倍比稀釋，按每孔50個細胞接種于24孔板，每組細胞各接種6孔。靜止培養(yǎng)2-3周，當培養(yǎng)板出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)。PBS清洗后加純甲醇lmL固定15min，吉姆薩液染色。將培養(yǎng)板置于顯微鏡低倍數(shù)下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)，按公式計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?%)=克隆數(shù)/接種數(shù)X1000/0。細胞侵襲實驗的方法是將濃度為0.5g/LMatrigel人工基質(zhì)膠20uL鋪于Transwell侵襲小室聚碳酯微孔膜(孔徑8nm)的上表面，置37°C30min使其聚成凝膠。Transwell上室中分別加入已消化重懸的各組細胞100"L(1X107U，下室中加入600uL含趨化因子無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后取出，PBS清洗，棉簽去除濾膜上層細胞，將已經(jīng)侵入并貼附于微孔膜下層的細胞固定并吉姆薩液染色，顯微鏡下直接觀察穿過膜的細胞數(shù)。隨機計數(shù)5個視野，計數(shù)每個視野內(nèi)穿過8um微孔的細胞數(shù)。以侵襲細胞的相對數(shù)目來表示腫瘤細胞的侵襲能力。本發(fā)明的GHGKH認K八肽體外對腫瘤細胞克隆形成能力及侵襲能力的影響結(jié)果如下所示不同劑量GHGKHKNK八肽對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10的克隆形成均有抑制作用，與對照組相比較均有顯著性差異(P<0.05);其中八肽GHGKH認K化合物10—W)l/L劑量腫瘤細胞抑制率達56.81%(見表l、圖l)。表lGHGK服NK八肽對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10克隆形成的抑制作用結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>10—Sol/L和10—^01/LGHGKH認K在體外作用48h后可以顯著抑制小鼠黑色素瘤細胞B16-F10的侵襲，穿膜細胞數(shù)與對照組比較具有顯著性差異(P<0.05)(見表2、圖2)。表2GHGKHKNK八肽小鼠黑色素瘤細胞B16-F10的侵襲抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從以上數(shù)據(jù)所示可以看出，本發(fā)明中的八肽對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10的克隆形成能力及侵襲能力具有明顯的抑制作用，而且這種抑制作用是劑量依賴性的，本發(fā)明的八肽顯著地提高了體外抑制小鼠黑色素瘤細胞B16-F10的克隆形成能力及侵襲能力的活性。三、GHGKHKNK八肽體外對腫瘤細胞黏附能力的影響按照LiLiu等人(Neoplasia.2006November,8(11):917-924)所述的免疫組化方法檢測對LN-R、ICAM-1、E-cadhesion表達情況的影響，觀察本發(fā)明的GHGKHKNK八肽體外對腫瘤細胞黏附能力的影響。實驗使用免疫細胞化學SP試劑盒(LN-R、ICAM-1、E-cadhesion)進行。首先將處于對數(shù)生長期的小鼠黑色素瘤細胞B16-F10消化成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1乂105,將準備好的玻片放置24孔培養(yǎng)板中，將細胞懸液滴至小玻片中，待細胞生長密度達到75%飽和度時，棄去培養(yǎng)基每孔加入含有不同藥物濃度的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基0.9ml，對照組加入加lml無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，37°C、5%C02孵箱孵育48h，然后PBS清洗3次，用甲醇固定10min，完畢再用PBS洗片1次晾干后，用中性樹膠固定在載玻片上，3%過氧化氫孵育8min,PBS清洗3次，滴加正常山羊血清工作液，室溫孵育15min棄去，分別滴加LN-R、ICAM-1、E-cadhesion抗體工作液，37。C放置lh，PBS清洗3次，DAB顯色后水洗，Mayer蘇木精復染，然后在顯微鏡下隨機取五個視野分別記錄100個細胞，記錄陽性細胞數(shù)。本發(fā)明中的八肽對LN-R、ICAM-1、E-cadhesion三種因子的表達情況的影響結(jié)果如下表3:GHGKHKNK八肽對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10LN-R、ICAM-1、E-cadhesion表達情況的影響結(jié)果_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>從以上數(shù)據(jù)所示可以看出，本發(fā)明中的八肽可下調(diào)LN-R、ICAM-l、E-cadhesion在小鼠黑色素瘤細胞B16-F10的表達，，這種下調(diào)作用顯示出本發(fā)明的八肽顯著地提高了體外抑制小鼠黑色素瘤細胞B16-F10黏附能力的活性。四、GHGK服M八肽對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10人工肺轉(zhuǎn)移模型的治療作用按照韓銳等人主編(抗癌藥物研究與實驗技術.北京中國協(xié)和醫(yī)科大學北京醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1997:368369.)所述的方法完成八肽對黑色素腫瘤B16-F10細胞人工肺轉(zhuǎn)移模型的治療作用實驗，觀察本發(fā)明的GHGK服NK八肽對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10人工肺轉(zhuǎn)移模型的治療作用。簡單的說，首先取對數(shù)生長期小鼠黑色素瘤細胞B16-F10,Hanks液調(diào)整細胞濃度至1X106/ml,C57BL/6J小鼠尾靜脈注射，每只0.2ml。隨機分為生理鹽水組(0.2ml/d)、GHGKH認K八肽劑量I組[500ug(kgd)—'],GHGKHKNK八肽劑量II組[50yg(kgd)—'],GHGK服NK八肽劑量III組[5"g(kgd)—']。腫瘤接種后次日經(jīng)腹腔注射各組藥物，每日一次，連續(xù)給藥20天。于給藥結(jié)束后次日脫頸椎處死小鼠，取肺，Bouin液固定，解剖顯微鏡下計數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)，并將動物肺組織進行石蠟切片，按下式計算抑制率。抑制率=(1-給藥組平均轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)/生理鹽水組平均轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù))xioo呢。本發(fā)明中的GHGK服NK八肽對黑色素腫瘤B16-F10細胞人工肺轉(zhuǎn)移模型的治療作用結(jié)果如下所示表4:GHGKHKNK八肽對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10人工肺轉(zhuǎn)移的治療作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>200810050685.5說明書第9/19頁50Ug/kg/d環(huán)磷酰銨30mg/kg/d空白對照組2.58±1.51*1.67±0.89*卜與對照組比較,P0.05#:與環(huán)磷酰銨組比較PO.05病理觀察結(jié)果顯微鏡下，生理鹽水組肺轉(zhuǎn)移瘤組織呈巢狀、片塊，多分布于血管周圍或胸膜處，呈多發(fā)、散在分布，面積較大,偶見血管內(nèi)瘤栓。給藥組肺轉(zhuǎn)移瘤組織呈圓球狀居多，多位于管周或胸膜處,但面積較小，甚至由幾個細胞構成,面積較大者，可見中央或偏位處片狀壞死。上述兩組瘤細胞形態(tài)大小基本一致。見圖3。五、ghgkhknk八肽對移植性腹水型肝癌H22小鼠生存時間的影響。按照韓銳等人主編(抗癌藥物研究與實驗技術.北京中國協(xié)和醫(yī)科大學北京醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1997:368369.)所述的方法完成GHGKHKNK八肽對H22肝癌腹水瘤荷瘤鼠實體瘤生長抑制作用及存活期的影響，觀察本發(fā)明的GHGKHKNK八肽對移植性腹水型肝癌H22小鼠生存時間的影響。試驗在無菌條件下取6-8天的腹水型肝癌H22荷瘤小鼠，處死固定，用碘酊及酒精消毒操作部位皮膚，然后切開，用無菌注射器穿過腹壁肌層抽取腹水，用Hanks液稀釋，1200rpm，10min洗滌兩次后，用Hanks液調(diào)整細胞數(shù)為1X107ml的細胞懸液，除正常對照組以外，其他的各組動物每鼠腹腔注射腹水稀釋液O.lml。八肽低、中、高劑量組及生理鹽水組在腫瘤接種前五天開始給藥，環(huán)磷酰胺(CPA)陽性對照組于腫瘤接種后次曰開始給藥，各組治療藥物均溶于0.2ml的生理鹽水中，腹腔注射給藥，每日l次，連續(xù)60天，或者直至動物死亡時結(jié)束。于末次給藥后24hr處死半數(shù)小鼠，每組動物于給藥后逐日觀察動物的一般情況，記錄死亡時間、生存天數(shù)、計算生命延長率。按以下公式計算生命延長率生命延長率=(實驗組平均生存天數(shù)-對照組平均生存天數(shù))/對照組平均生存天數(shù)X10(m。摘瘤稱重，以抑瘤率(TGI)判斷抑瘤效果，抑瘤率計算公式如下tgi(%)=(對照組瘤重-實驗組瘤重)/對照組瘤重xio(m。試驗重復3次，結(jié)果為3次試驗的平均值。并通過流式細胞術對腹水進行檢測，本發(fā)明的GHGKHKNK八肽對移植性腹水型肝癌H22小鼠生存時間的影響結(jié)果如下正常對照組小鼠至實驗觀察結(jié)束60天，仍全部存活。正常對照組與生理鹽水對照組相比有顯著性差異(P〈0.05)，環(huán)磷酰胺組能明顯延長腹水型肝癌H22小鼠生存時間，與生理鹽水對照組相比有顯著性差異(P<0.05)，八肽各個給藥組均能明顯延長腹水型肝癌H22小鼠的生存時間，與生理鹽水對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。八肽給藥劑量是5ug/kg時H22小鼠的生命延長率為60.25%，而且生命延長率與給藥劑量呈現(xiàn)一定的量效關系(見表)。其中給藥劑量為50ug/kg時療效最為顯著，達到60.25%。給藥劑量為500ug/kg時療效反而有所下降。以60天為觀察期限，生存時間大于60天認為長期存活。環(huán)磷酰胺組未見長期存活小鼠，而八肽各組均有長期存活小鼠。同時通過流式細胞術對各組小鼠的腹水檢測發(fā)現(xiàn)在給藥組可見明顯的細胞凋亡現(xiàn)象，尤其以中低劑量組最為明顯(如圖4，5所示)。具體結(jié)果如下表5:GHGK服NK八肽對移植性腹水型肝癌H22小鼠生存時間的影響組別藥物劑量N生存時間中位數(shù)(d)生存時間(d)生命延長(％)長期存活動動物(〉60d)高劑量500ug/kg202020.85土9.2443.521中劑量50ug/kg201920.55土11.5*60.253低劑量5ug/kg202021.90土11.7859.434環(huán)磷酰胺20mg/kg202121.60土9.46*35.63生理鹽水202121.50土9.923----正常對照206060.OO土O.00*----20*與正常對照組比較，(P<0.05=表6:GHGK服NK八肽對移植性腹水型肝癌H22小鼠腹水的細胞凋亡率組別藥物劑量細胞凋亡率％高劑量500ug/kg/d7.77±0.16中劑量50ug/kg/d3.08±0.06*低劑量5ug/kg/d5.35±0.07*生理鹽水—26.66±0.24環(huán)磷酰胺20mg/kg/d0.68±0.05*jE常對照組.—5.26±0.10*與正常對照組比較P〈0.05按照醫(yī)藥工業(yè)中已知的方法，將GHGK服NK八肽與一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑相混合，制成適于經(jīng)胃腸道或胃腸道外途徑給藥的各種不同劑型的藥物組合物。醫(yī)藥上可接受的載體包括無毒性的并且對活性成分沒有干擾作用的固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、膠囊包裹材料或任何類型的配方輔助劑。所制得藥物組合物可以經(jīng)胃腸道外、口服及局部等途徑給藥。胃腸道外途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、體腔(如腹腔、胸腔或腦脊髓腔)及器官腔(如鼻腔、口腔、直腸、陰道或子宮腔)內(nèi)，以及皮內(nèi)、皮下或眼內(nèi)等給藥途徑。為了經(jīng)胃腸道外給藥，可將本發(fā)明的GHGK服NK八肽溶解在水、鹽水、右旋糖溶液、乙醇或油中制成溶液或懸浮液。所使用的載體也可以包括防腐劑、混懸劑、增溶劑、緩沖劑等其他成分。當化合物(肽)以鞘內(nèi)途徑給藥時，也可將其溶解在腦脊液中。為了口服或經(jīng)粘膜給藥，可以將GHGK服NK八肽制成膠囊劑、丸劑、片劑、馳劑、粉末劑、懸浮劑或乳劑形成的固體或液體制劑?？墒褂盟?、乙二醇、油、醇、香味劑、防腐劑、著色劑、懸浮劑等載體或輔助成分制備液態(tài)口服制劑(如溶液、懸浮液和馳劑)；或使用淀粉、糖、造粒劑、固體稀釋劑、潤滑劑、粘結(jié)劑、崩解劑等載體或輔助劑制備固態(tài)口服制劑(如粉末劑、片劑、栓劑和膠囊劑)。必要時，可使用微膠囊或脂質(zhì)體包裹活性成分，制成能夠通過胃腸道或血腦屏障的穩(wěn)定制劑(如參見國際專利WO86/11698)。本發(fā)明的藥物組合物的給藥劑量一般為5至500ug/kg/天，每天可以以亞劑量形式分幾次給藥。但確切的用藥劑量應根據(jù)待治療疾病的性質(zhì)、疾病嚴重程度、病人的年齡和身體一般狀況，以及給藥途徑等因素由臨床醫(yī)生決定。上述體外實驗初步表明，本發(fā)明的GHGK服NK八肽對腫瘤細胞的克隆形成能力，侵襲能力以及黏附能力具有明顯的抑制作用。本發(fā)明的GHGKHKNK化合物或其藥物組合物可用于預防或治療原發(fā)或轉(zhuǎn)移的各種實體瘤或造血系統(tǒng)細胞惡性增生性疾病。當用于預防腫瘤轉(zhuǎn)移時，可單獨或與腫瘤放療或化療聯(lián)合使用。例如可在實體瘤放射治療后，聯(lián)合使用本發(fā)明的肽化合物和一種或幾種常規(guī)腫瘤化療藥物?；蛘?，在經(jīng)過手術、放療及化療后，繼續(xù)使用本發(fā)明的肽化合物，以清除體內(nèi)可能存在的微小腫瘤轉(zhuǎn)移灶，或穩(wěn)定并抑制任何殘存的原發(fā)腫瘤。圖1、GHGK服NK八肽對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10克隆形成的抑制作用結(jié)果；圖2、GHGK服NK八肽小鼠黑色素瘤細胞B16-F10的侵襲抑制作用；圖3、肺轉(zhuǎn)移腫瘤組織病理形態(tài)(HEX40);A:Lungmetastaticlesiontreatedwith50yg/kg/dpeptidecompoundGHGK服NK;B:Lungmetastaticlesiontreatedwith500yg/kg/dpeptidecompoundGHGKHKNK;C:Lungmetastaticlesiontreatedwithnormalsaline.圖4、低劑量組細胞周期分析圖；圖5、生理鹽水組細胞周期分析圖；圖6、。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發(fā)明的闡釋而非對本發(fā)明的任何形式的限制。實施例1:肽鏈Gly-His-Gly-Lys-His-Lys-Asn-Lys的合成1、合成肽鏈(1)制備Fmoc-Lys(Boc)-樹脂取2-氯-三苯甲基樹脂50克，用DMF浸泡30分鐘，使樹脂充分溶脹，加44mlDIPEA，46.9gFmoc-Lys(Boc)-0H，反應3小時，再加50ml甲醇繼續(xù)反應3小時。氮氣吹干，樹脂用DMF洗漆三次。獲得Fmoc-Lys(Boc)-樹脂；(2)制備Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂加入800ml體積濃度為20%的六氫吡啶的DMF溶液，25。C反應30分鐘，氮氣吹濾去六氫吡啶，分別用DMF、無水甲醇、DMF洗滌三次，氮氣吹干。加入Fmoc-Asn(Trt)-0H(MV:596.7，200畫1)119.9g，TBTU(MW:321，200腿o1)64.2g，HOBT(MW:153，200畫1)30.6g，畫44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，將混合物25。C反應1小時。氮氣吹干，函F，無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。加入500ml體積濃度為20%的六氫吡啶的DMF溶液，25。C反應30分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、無水甲醇、DMF洗滌三次，氮氣吹干。(3)制備Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)_Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MV:468.5，200畫1)93.7g，TBTU(麗321,200mmo1)64.2g，HOBT(MW:153，200誦o1)30.6g，蘭M44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，將混合物25。C反應1小時。氮氣吹干，DMF,無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。加入500ml體積濃度為20。/。的六氫吡啶的DMF溶液，25。C反應30分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、無水甲醇、DMF洗滌三次，氮氣吹干。(4)制備Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-His(Trt)-0H(MV:619.7，200薩o1)123.9g，TBTU(,:321，200mmo1)64.2g，HOBT(MW:153，200mmo1)30.6g，NMM44.4ml(麗101.2)，400mlDMF，具體方法同步驟(3)。(5)制備Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MV:468.5，200mmol)93.7g，TBTU(MW:321，200mniol)64.2g，HOBT(MW:153，200,ol)30.6g，NMM44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具體方法同步驟(3)。(6)制備Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-Gly-OH(MV:297.3，200國1)59.5g，TBTU(MW:321，200mmol)64.2g，HOBT(MW..153,200醒o1)30.6g，N畫44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF,具體方法同歩驟(3)。(7)制備Fmoc-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-His(Trt)-OH(MV:619.7，200mmol)123.9g，TBTU(羅321，200鵬o1)64.2g，HOBT(MW:153，200咖o1)30.6g，剛M44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具體方法同歩驟(3)。(8)制備Boc-Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Boc-Gly-OH(MV:175.2，200mmol)35.4g，TBTU(MW:321,200mmol)64.2g，HOBT(麗153，200mmol)30.6g，NMM44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF,具體方法同歩驟(3)。再用無水甲醇洗滌三次。抽干后，放入真空干燥器中干燥，稱重，得八肽樹脂約90g。(匿=906.2，43畫1),接肽總收率約為86%。2、切肽取88.9g八肽樹脂轉(zhuǎn)移到茄形瓶子中，冷切下加入切肽試劑(TFA/水/乙二硫醇/苯甲硫醚^650ml/17ml/17m/34ml)，25。C攪拌2小時。過濾，抽干，濾液加無水乙醚沉淀，過濾收集沉淀得約35g八肽粗品。3、純化濾液分批經(jīng)C18柱純化，流動相0.1MNH4AC:乙腈(7.5:2.5);流動速為380ml/min;檢測波長為280nm;樣品峰合并后去鹽，凍干，約得13.9g白色疏松塊狀物成品(匿906.2，15.3mmo1);收率30.6%。用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液實施例2:1、合成肽鏈(1)制備Fmoc-Lys(Boc)-樹脂取4-甲基三苯甲基樹脂50克，用DMF浸泡30分鐘，使樹脂充分溶脹，加44mlDIPEA，46.9gFmoc-Lys(Boc)-0H，反應3小時，再加50ml甲醇繼續(xù)反應3小時。氮氣吹干，樹脂用DMF洗滌三次。獲得Fmoc-Lys(Boc)-樹脂；(2)制備Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂加入800ml體積濃度為20%的六氫吡啶的DMF溶液，25。C反應30分鐘，氮氣吹濾去六氫吡啶，分別用DMF、無水甲醇、DMF洗滌三次，氮氣吹干。加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MV:596.7，200,1)119.9g，TBTU(證:321，200,1)64.2g，HOBT(MW:153，200rano1)30.6g，麗M44.4ml(麗101.2)，400mlDMF，將混合物25。C反應1小時。氮氣吹干，DMF，無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。加入500ml體積濃度為20%的六氫吡啶的DMF溶液，25'C反應30分鐘，氮氣吹干，分別用匿F、無水甲醇、隨F洗滌三次，氮氣吹干。(3)制備Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MV:468.5，200腿o1)93.7g，TBTU(MW:321，200rnrno1)64.2g，HOBT(薩153，200咖o1)30.6g，廳M44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，將混合物25。C反應1小時。氮氣吹干，DMF，無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。加入500ml體積濃度為20%的六氫吡啶的DMF溶液，25'C反應30分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、無水甲醇、DMF洗滌三次，氮氣吹干。(4)制備Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-His(Trt)-OH(MV:619.7，200隱o1)123.9g，TBTU(隨:321,200mmol)64.2g，HOBT(薩:153，200mmol)30.6g，薩44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具體方法同步驟(3)。(5)制備Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入F獄-Lys(Boc)-0H(MV:468.5，200國o1)93.7g，TBTU(MW:321，200rano1)64.2g，HOBT(MW:153，200mmo1)30.6g，剛M44.4ml(讓101.2)，400mlDMF，具體方法同步驟(3)。(6)制備Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂:在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-Gly-OH(MV:297.3，200鵬o1)59.5g，TBTU(MW:321，200ramo1)64.2g，HOBT(MW:153，200mmo1)30.6g，NMM44.4ml(MW:101.2)，400ralDMF,具體方法同步驟(3)。(7)制備Fmoc-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-His(Trt)-OH(MV:619.7，200mmol)123.9g,TBTU(MW:321,200mmol)64.2g，HOBT(MW:153，200mmol)30.6g，NMM44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF,具體方法同步驟(3)。(8)制備Boc-Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Boc-Gly-OH(MV:175.2，200mmol)35.4g，TBTU(麗321，200mmol)64.2g，HOBT(麗153，200mmol)30.6g，N畫44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具體方法同歩驟(3)。再用無水甲醇洗滌三次。抽干后，放入真空干燥器中干燥，稱重，得八肽樹脂約92g。(MW=906.2，43mmol)，接肽總收率約為88%。2、切肽取92.lg八肽樹脂轉(zhuǎn)移到茄形瓶子中，冷切下加入切肽試劑..(TFA/水/乙二硫醇/苯甲硫醚^650ral/17ml/17m/34ml)，25'C攪拌2小時。過濾，抽干，濾液加無水乙醚沉淀，過濾收集沉淀得約37g八肽粗品。3、純化濾液分批經(jīng)C18柱純化，流動相0.1MNHAC:乙腈(7.5:2.5);流動速為380ml/min;檢測波長為280nm;樣品峰合并后去鹽，凍干，約得14.5g白色疏松塊狀物成品(MW:906.2，15.3mmo1);收率32.0%。用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液。實施例3:1、合成肽鏈(1)制備Fmoc-Lys(Boc)-樹脂取4-甲氧基三苯甲基樹脂50克，用DMF浸泡30分鐘，使樹脂充分溶脹，加44mlDIPEA，46.9gFmoc-Lys(Boc)-0H,反應3小時，再加50ml甲醇繼續(xù)反應3小時。氮氣吹干，樹脂用DMF洗滌三次。獲得Fmoc-Lys(Boc)-樹脂；(2)制備Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂加入800ml體積濃度為20%的六氫吡啶的DMF溶液，25。C反應30分鐘，氮氣吹濾去六氫吡啶，分別用DMF、無水甲醇、DMF洗滌三次，氮氣吹干。加入Fmoc-Asn(Trt)-0H(MV:596.7，200mmo1)119.9g，TBTU(MW:321，200mmo1)64.2g，HOBT(MW:153，200mmo1)30.6g,NMM44.4ml(MW:101.2),400mlDMF，將混合物25。C反應1小時。氮氣吹干，DMF,無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。加入500ml體積濃度為20%的六氫吡啶的DMF溶液，25"C反應30分鐘，氮氣吹千，分別用DMF、無水甲醇、DMF洗滌三次，氮氣吹干。(3)制備Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)_Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-Lys(Boc)-0H(MV:468.5，200國o1)93.7g，TBTU(MW:321，200mmo1)64.2g，HOBT(麗153，200mmo1)30.6g，畫M44.4ml(匿101.2)，400mlDMF，將混合物25。C反應1小時。氮氣吹干，DMF，無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。加入500ml體積濃度為20%的六氫吡啶的DMF溶液，25C反應30分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、無水甲醇、DMF洗滌三次，氮氣吹干。(4)制備Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-His(Trt)-OH(MV:619.7，200腦o1)123.9g，TBTU(麗321,200mmol)64.2g，HOBT(MW:153，200mmol)30.6g，N鹿44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具體方法同步驟(3)。(5)制備Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MV:468.5，200咖o1)93.7g，TBTU(MW:321，200ramol)64.2g，HOBT(MW:153，200mmol)30.6g,函M44.4ml(麗:101.2)，400mlDMF，具體方法同步驟(3)。(6)制備Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-Gly-OH(MV:297.3，200nimol)59.5g，TBTU(MW:321，200畫1)64.2g，HOBT(MW:153，200mmol)30.6g，酬44.4ml(MW:101.2)，400ml隨F，具體方法同步驟(3)。(7)制備Fmoc-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-His(Trt)-OH(MV:619.7，200隱o1)123.9g，TBTU(MW:321，200,ol)64,2g，HOBT(MW:153，200mmol)30.6g，固M44.4tnl(MW:101.2),400mlDMF，具體方法同歩驟(3)。(8)制備Boc-Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)—Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Boc-Gly-OH(MV:175.2，200mmol)35.4g，TBTU(麗321，200mmol)64.2g，HOBT(MW:153，200mmol)30.6g，畫M44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具體方法同步驟(3)。再用無水甲醇洗滌三次。抽干后，放入真空干燥器中干燥，稱重，得八肽樹脂約88.Og。(MW=906.2，43畫1)，接肽總收率約為84%。2、切肽取88.Og八肽樹脂轉(zhuǎn)移到茄形瓶子中，冷切下加入切肽試劑(TFA/水/乙二硫醇/苯甲硫醚二650ml/17ml/17m/34ral)，25。C攪拌2小時。過濾，抽干，濾液加無水乙醚沉淀，過濾收集沉淀得約34.5g八肽粗品。3、純化濾液分批經(jīng)C18柱純化，流動相0.1MNH^C:乙腈(7.5:2.5);流動速為380ml/min;檢測波長為280nm;樣品峰合并后去鹽，凍干，約得13.2g白色疏松塊狀物成品(匿906.2，15.3畫o1);收率29.2%。用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液。實施例4:1、合成肽鏈(1)制備Fmoc-Lys(Boc)-樹脂取基三苯甲基樹脂50克，用DMF浸泡30分鐘，使樹脂充分溶脹，加44mlDIPEA，46.9gFmoc-Lys(Boc)-OH，反應3小時，再加50ml甲醇繼續(xù)反應3小時。氮氣吹干，樹脂用DMF洗滌三次。獲得Fmoc-Lys(Boc)-樹脂；(2)制備Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂加入800ml體積濃度為20%的六氫吡啶的DMF溶液，25。C反應30分鐘，氮氣吹濾去六氫吡啶，分別用DMF、無水甲醇、DMF洗滌三次，氮氣吹干。加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MV:596.7，200mmo1)119.9g，TBTU(MW:321,200mmo1)64.2g，HOBT(MW:153,200mmo1)30.6g，NMM44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，將混合物25。C反應1小時。氮氣吹干，DMF，無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。加入500ml體積濃度為20%的六氫吡啶的DMF溶液，25。C反應30分鐘，氮氣吹干，分別用DMF、無水甲醇、DMF洗滌三次，氮氣吹干。(3)制備Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MV:468.5，200mmo1)93.7g，TBTU(MW:321，200mrao1)64.2g，HOBT(麗153，200mmo1)30.6g，NMM44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，將混合物25。C反應1小時。氮氣吹干，DMF，無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮氣吹干。加入500ml體積濃度為20%的六氫吡啶的DMF溶液，25。C反應30分鐘，氮氣吹干，分別用面F、無水甲醇、DMF洗滌三次，氮氣吹干。(4)制備Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-His(Trt)-OH(MV:619.7，200mmo1)123.9g，TBTU(MW:321，200mmo1)64.2g，HOBT(MW:153,200mmo1)30.6g，剛M44.4ml(MW:101.2)，400ml面F,具體方法同歩驟(3)。(5)制備Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MV:468.5，200畫o1)93.7g,TBTU(麗321，200m鵬l)64.2g，HOBT(MW:153，200ramo1)30.6g，NMM44.4ml(麗101.2),400mlDMF，具體方法同步驟(3)。(6)制備Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂:在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-Gly-OH(MV:297.3，200mmol)59.5g，TBTU(麗321，200mmol)64.2g，HOBT(MW:153，200mmol)30.6g，剛M44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具體方法同步驟(3)。(7)制備Fmoc-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Fmoc-His(Trt)-0H(MV:619.7，200畫o1)123.9g，TBTU(MW:321，200mmo1)64.2g，HOBT(MW:153,20Ommo1)30.6g，N畫44.4ml(匿:101.2)，400mlDMF，具體方法同歩驟(3)。(8)制備Boc-Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在上述脫帽反應的樹脂中，加入Boc-Gly-OH(MV:175.2，200醒o1)35.4g，TBTU(麗321,200mmo1)64.2g，HOBT(麗153，200mmo1)30.6g，N顧44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具體方法同步驟(3)。再用無水甲醇洗滌三次。抽干后，放入真空干燥器中干燥，稱重，得八肽樹脂約91.5g。(麗=906.2，43咖o1)，接肽總收率約為87%。2、切肽取91.5g八肽樹脂轉(zhuǎn)移到茄形瓶子中，冷切下加入切肽試劑(TFA/水/乙二硫醇/苯甲硫醚二650ml/17ml/17m/34ml)，25。C攪拌2小時。過濾，抽干，濾液加無水乙醚沉淀，過濾收集沉淀得約36.6g八肽粗品。4、純化濾液分批經(jīng)C18柱純化，流動相0.1MNH4AC:乙腈(7.5:2.5);流動速為380ml/rain;檢測波長為280nm;樣品峰合并后去鹽，凍干，約得14.3g白色疏松塊狀物成品(MW:906.2，15.3mmo1);收率31.4%。用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液。權利要求1.一種GHGKHKNK八肽的制備工藝，其特征在于以2-氯-三苯甲基樹脂、三苯甲基樹脂作樹脂、4-甲基三苯甲基樹脂或4-甲氧基三苯甲基樹脂為起始原料，按固相合成的方法依次連接具有保護基團的氨基酸，獲得保護八肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團，用TBTU或HBTU及HOBT為縮合劑進行接肽反應，同步進行脫側(cè)鏈保護基團及切肽，獲得該八肽化合物粗品；再經(jīng)C18或C8柱分離純化，冷凍干燥后，制得精品；2.根據(jù)權利要求1所述的制備工藝，包括如下步驟(1)制備Fmoc-Lys(Boc)-樹脂將以2-氯-三苯甲基樹脂、4-甲基三苯甲基樹脂、4-甲氧基三苯甲基樹脂或三苯甲基樹脂，用DMF浸泡10-60分鐘，使樹脂充分溶脹，力口DIPEA或DMPA和Fmoc-Lys(Boc)-OH，1015。C反應124小時；再加入甲醇105(TC反應120小時，氮氣吹干，樹脂用DMF洗滌，獲得Fmoc-Lys(Boc)-樹脂；所說的樹脂取代量為0.3-1.5mmol/g;粒徑為100400目；Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~5倍；DIPEA或DMPA的摩爾數(shù)為樹脂的220倍；脫帽試劑的加入量以樹脂的重量為基準為5-20ml/g;甲醇的摩爾系數(shù)為樹脂的220倍；(2)制備Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在步驟(1)的Fmoc-Lys(Boc)-樹脂中，加入脫帽試劑，1050。C反應1060分鐘，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，10~50°C反應15小時，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，得到Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂；所說的脫帽試劑為PIP:DMF=1:25，體積比；脫帽試劑的加入量以樹脂的重量為基準為5-20ml/g;混合物中Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的2~5倍；TBTU/HBTU和HOBT的摩爾系數(shù)為樹脂的25倍；所說的接肽試劑為NMM:DMF=1:515，體積比；接肽試劑中，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的25倍；"TBTU/HBTU和HOBT"指的是TBTU與HOBT的混合物，或者是HBTU與HOBT的混合物；(3)制備Fmoc誦Lys(Boc)陽Asn(Trt)畫Lys(Boc)-樹脂在步驟(2)的Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干；加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂；混合物中Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的25倍；其余操作以及工藝條件同步驟(2);(4)制備Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)醒樹脂在步驟(3)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干；加入用接肽試劑溶解的Fmoc-His(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗漆，吹干，獲得Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的25倍；3其余操作以及工藝條件同步驟(2);(5)制備Fmoc-Lys(Boc)隱His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在步驟(4)的Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干；加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)陽樹脂；混合物中Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的2~5倍；其余操作以及工藝條件同步驟(2);(6)制備Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)畫Lys(Boc)隱Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在步驟(5)的Fmoc畫Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)畫Lys(Boc)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干；加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Gly-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Gly-Lys(Boc)畫His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂；混合物中Fmoc-Gly-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的25倍；其余操作以及工藝條件同步驟(2);(7)制備Fmoc-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)誦His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂在步驟(6)的Fmoc畫Gly畫Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-LyS(BOC)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干；加入用接肽試劑溶解的Fmoc-His(Trt)-OH、TBTU/HBTU禾口HOBT的混合物，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Fmoc-Gly-Lys(Boc)陽His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的2~5倍；其余操作以及工藝條件同步驟(2);(8)制備Boc畫Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)畫Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹月旨在步驟(7)的Fmoc-His(Trt)畫Gly-Lys(Boc)-His(Trt)畫Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂中，加入脫帽試劑，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干；加入用接肽試劑溶解的Boc-Gly-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應，吹干，分別用DMF和乙醇洗滌，吹干，獲得Boc-Gly隱His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂；混合物中Boc-Gly-OH的摩爾系數(shù)為樹脂的25倍；其余操作以及工藝條件同步驟(2);(9)制備Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)在步驟(8)Boc-Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)隱Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-樹脂中，加入遇冷至1020。C的切肽試劑，105(TC反應15小時，減壓蒸去除溶劑，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，P20s真空干燥，獲得粗品；所說的切肽試劑的組分為TFA/EDT/HO/TIS=90-95/2-5/l-5，體積比。3、GHGK服NK八肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明公開一種GHGKHKNK八肽的制備工藝，以2-氯-三苯甲基樹脂、三苯甲基樹脂作樹脂、4-甲基三苯甲基樹脂或4-甲氧基三苯甲基樹脂為起始原料，按固相合成的方法依次連接具有保護基團的氨基酸，獲得保護八肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護基團，用TBTU或HBTU及HOBT為縮合劑進行接肽反應，同步進行脫側(cè)鏈保護基團及切肽，獲得該八肽化合物粗品；再經(jīng)C18或C8柱分離純化，冷凍干燥后，制得精品；本發(fā)明還提供了以GHGKHKNK八肽為主要活性成分在制備抗腫瘤藥物中的用途。文檔編號C07K1/06GK101270145SQ20081005068公開日2008年9月24日申請日期2008年5月7日優(yōu)先權日2008年5月7日發(fā)明者剛呂,爽姜,孫靜輝,安立萍,宋見喜,張成義,徐廣宇,坦李,杜培革,丹田,野申,笑韓申請人:北華大學