專利名稱：：一種具有抗腫瘤活性的環(huán)五肽的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術領域：
，具體涉及一種從海洋生物海藻中提取的具有抗腫瘤活性的環(huán)五肽。
背景技術：
：環(huán)肽作為肽類化合物中最有特點的一類，由于其相對穩(wěn)定的構象，因而在作用受體的選擇性和體內代謝的穩(wěn)定性方面都強于線性肽類化合物，環(huán)肽在抗真菌和殺滅腫瘤細胞等很多方面都表現(xiàn)出天然的優(yōu)勢。以往專利中環(huán)肽多來源于陸地動物、植物、微生物，資源有限，種類單一，如CN99815515.2、CN02114663.2等。海洋生物以其物種的多樣性及其代謝產物的化學結構的多樣性等優(yōu)勢，已成為生物活性物質的巨大寶庫。海洋生物不同于陸地生物，海洋生物中蘊藏著大量結構新穎、化學性質特殊、生物活性極強的物質。海洋生物所含的肽類化合物，特別是環(huán)肽類化合物，在抗腫瘤、抗病毒、抗菌以及酶抑制劑活性方面現(xiàn)實了巨大的潛力。自1980年美國學者ChrisIreland等人(Irdand，C.;Scheuer，P.J.，J.Am.Chem.Soc.，1980,102,5688-5691)報道從海鞘中分離得到第一個具有抗腫瘤活性的環(huán)肽Ulithiacyclamide以來，從1980年到1996年底，從海洋生物中分離并鑒定了許多具有獨特結構及生理活性的先導化合物，如從海兔Do/fl辦eZ/"似n"/"r/"中分離得到的Dolastatin3、Dolastatin13和Dolastatin10對白血病細胞具有抑制作用，具很強的抗腫瘤生物活性；從海綿Geo^zsp.中分離得到的環(huán)肽GeodiamolideA和GeodiamolideB，他們對L-1210細胞毒活性很強，分別為0.032ug/ml和0.0026ug/ml;從加利福尼亞海域及加勒比海中群體海鞘7VW&mm/msp.中分離出的3種環(huán)肽DidemninAC,它們都具有體內和體外抗病毒和抗腫瘤活性,其中DidemninB的活性最強，對乳腺癌、卵巢癌具明顯的抑制活性，同時,它還有明顯的免疫抑制活性,體內活性較環(huán)孢霉素A強1000倍，并且DideminB已能夠進行人工全合成，最有望成為新型抗腫瘤新藥(劉云國,李八方等，中國海洋藥物雜志,2006,24(3),51-57.)。海藻是海生資源的一大家族，全世界約有三萬余種，我國海域遼闊，海藻資源尤為豐富，而且海藻能產生多種多樣的化合物，如甾醇、萜類、脂肪族化合物等，這些化合物大多具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒等多種多樣的生理活性，因此從綠藻、紅藻等藻類中提取環(huán)肽化合物，利用前景廣闊。本發(fā)明的環(huán)五肽是首次從海洋生物海藻絲狀乳節(jié)藻(Galaxaurafilamentosa)中分離得到。絲狀乳節(jié)藻屬紅藻門乳節(jié)藻屬，國內外對于乳節(jié)藻屬的研究報道很少，目前尚未見有從乳節(jié)藻中提取環(huán)肽的報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種提取于絲狀乳節(jié)藻中的新的具有抗腫瘤活性的環(huán)五肽。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述環(huán)五肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明的環(huán)五肽是環(huán)(亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰-亮氨酰-N-甲基亮氨酰)英文縮寫表達式為cyclo-(Leu-N-Me-Leu-Leu-Leu-N-Me-Leu)，其中Leu為亮氨酸，Me為甲基，為白色針狀晶體，分子式為C32H59N505，[M+H]+m/z:594.4，mp:208210。C，[ap=_130(C=0.1，MeOH)，和13C的核磁共振如表1所示，并通過二維核磁共振譜(TOCSY、DQCOSY、HMQC和NOESY)，確定了該環(huán)五肽所有碳原子和氫原子的歸屬以及該環(huán)五肽的化學結構，其結構式如式(I)所示。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(I)表1環(huán)五肽(I)的和13C的核磁共振數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注l.該核磁共振數(shù)據(jù)是采用600MHz的核磁共振測定，樣品溶解于氖代二氯甲綜o2表1中的各側基的劃分如式(II)所示。(II)本發(fā)明的環(huán)五肽是首次從海洋生物海藻絲狀乳節(jié)藻(Galaxaumfilamentosa)中分離得到，其分離制備過程如下(1)用溶劑浸泡絲狀乳節(jié)藻得浸提物；(2)減壓濃縮上述浸提物，經有機溶劑萃取，萃取液濃縮得粗提物；(3)將上述粗提物經柱層析分離得環(huán)(亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰-亮氨酰-N-甲基亮氨酰)的粗品，再經重結晶即得環(huán)(亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰-亮氨酰-N-甲基亮氨酰)單體。上述步驟(1)中，浸泡絲狀乳節(jié)藻的溶劑為普通溶劑，優(yōu)選乙醇、甲醇、丙醇、丙酮中的一種或多種。上述步驟(1)中，絲狀乳節(jié)藻浸泡提取時間為715天，溫度為20°C40°C。上述步驟(2)中，萃取液為有機溶劑，優(yōu)選乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、甲醇、氯仿、石油醚、乙醚中的一種，或采用其中一種以上溶劑分別萃取，再合并萃取液。上述步驟(2)中，萃取液的濃縮溫度為20QC120°C。上述步驟(3)中，柱層析分離為硅膠層析、離子交換樹脂、大孔樹脂、C18反相色譜柱中的一種或一種以上。上述步驟(3)中，對粗品的重結晶可采用甲醇、乙酸乙酯、氯仿中的一種或一種以上。采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)對本發(fā)明的環(huán)五肽進行體外抗腫瘤活性試驗，試驗結果證明，本發(fā)明的環(huán)五肽對人肝癌細胞株HepG2、人肝癌細胞株BEL-7402、人乳腺癌細胞株MCF-7、人結腸癌細胞株LOVO、人肺癌細胞株PC84045和人鼻咽癌細胞CNE具有強的抑制作用，且能使BEL-7402肝癌細胞的細胞周期阻滯在G2/M期。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.本發(fā)明從絲狀乳節(jié)藻中提取到一種新的環(huán)五肽，該環(huán)五肽具有強的抗腫瘤活性，為研究開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了先導化合物，同時也對開發(fā)利用我國的海洋藥物資源具有重要價值；2.本發(fā)明環(huán)五肽的提取方法是通過簡單的有機溶劑分級分離制備得到的，具有制備工藝簡單，生產成本低的優(yōu)勢。具體實施方式實施例l環(huán)五肽的制備環(huán)五肽的制備方法，其具體步驟如下(1)將絲狀乳節(jié)藻于乙醇中浸泡提取，溫度為2(TC，45天后將浸泡提取液減壓濃縮；(2)將濃縮后的浸提物經乙酸乙酯溶液萃取后，2(TC減壓濃縮得粗提物-，(3)將上述粗提物經硅膠層析得環(huán)五肽的粗品，再經甲醇重結晶即得環(huán)五肽單體。該環(huán)五肽為白色針狀晶體，分子式為C32H59N505，25[M+H]+m/z:594.4，mp:208210。C，[ct〗D=—130(C-O.l，MeOH)，iH和13C的核磁共振如表1所示，并通過二維核磁共振譜(TOCSY、DQCOSY、HMQC和NOESY)，確定了該環(huán)五肽所有碳原子和氫原子的歸屬以及該環(huán)五肽的化學結構，其結構式如式(I)所示。實施例2體外抗腫瘤活性試驗采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)，將實施例l得到的環(huán)五肽(I)與人肝癌細胞株HepG2、人乳腺癌細胞株MCF-7、人肝癌細胞株BEL-7402、人結腸癌細胞株LOVO、人鼻咽癌細胞CNE和人肺癌細胞PC84045，分別作用時間72小時，結果如表2所示。表2環(huán)五肽(I)對腫瘤細胞的半數(shù)有效濃度(IC50)細胞種類HepG2MCF-7BEL-74021XDVOCNEPC84045ICso(Xl(TV)l/L)2.76.04.06.16.75.2實施例3環(huán)五肽對BEL-7402肝癌細胞周期的作用試驗采用碘化丙錠(PI)染色法，將不同濃度的環(huán)五肽(實施例1制備得到的環(huán)五肽)作用BEL-7402肝癌細胞48小時后，流式細胞儀測定細胞周期結果如表3所示，其中環(huán)五肽的濃度分別為2.5Xl(y6mol/L和5.0Xl(T6mol/L。表3不同濃度作用Bel—7402細胞周期各時相比例(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從實施例2和實施例3的結果可以看出，本發(fā)明的環(huán)五肽經體外抗腫瘤活性試驗表明其具有強的抗腫瘤活性，本發(fā)明為研究開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了先導化合物，對開發(fā)利用中國的海洋藥物資源具有重要價值。權利要求1.一種環(huán)五肽，其特征在于該環(huán)五肽的分子式為C32H59N5O5，結構式如式(I)所示。id="icf0001"file="S2008100279921C00011.gif"wi="78"he="89"top="57"left="65"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2、權利要求l所述環(huán)五肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明公開一種具有抗腫瘤活性的環(huán)五肽，該環(huán)五肽為環(huán)(亮氨酰-N-甲基亮氨酰-亮氨酰-亮氨酰-N-甲基亮氨酰)，其結構式如式(I)所示。本發(fā)明的環(huán)五肽是從我國南海海域的海藻絲狀乳節(jié)藻中分離得到的，體外試驗證明，該環(huán)五肽對人肝癌細胞株HepG2、人肝癌細胞株BEL-7402、人乳腺癌細胞株MCF-7、人結腸癌細胞株LOVO、人肺癌細胞株PC84045和人鼻咽癌細胞CNE具有強的抑制作用，且能使BEL-7402肝癌細胞的細胞周期阻滯在G2/M期。本發(fā)明為研究開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了先導化合物，對開發(fā)利用中國的海洋藥物資源具有重要價值。文檔編號C07K7/00GK101270154SQ20081002799公開日2008年9月24日申請日期2008年5月9日優(yōu)先權日2008年5月9日發(fā)明者徐石海,許文杰申請人:暨南大學