專利名稱：具有芷香酮亞結(jié)構(gòu)的vr1香草素受體拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及香草素受體拮抗劑，特別是TRPV1拮抗劑。
背景技術(shù)：
瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1 (TRPV1)在炎癥后的痛覺(jué)過(guò)敏的發(fā)展中起關(guān)鍵作用；因而，TRPV1配體在臨床上可用作鎮(zhèn)痛和抗炎藥。
已知的TRPV1配體。其中，Retvanil(維甲酸的香草酰胺)是一種有效的激動(dòng)劑1
OMe
Ber. der Deutschen Chem. Gesellschaft， 70巻，1009-1012頁(yè)中公開(kāi)了下列化合物的合成
WO 03/024920提到了維曱類在治療關(guān)節(jié)炎和炎性皮膚病中的用途。C7^附.ZViflr附.5m//. 43(1) 100-107 (1995)中公開(kāi)了特別是下列化合物:<formula>formula see original document page 5</formula>
其中R是H且R，是H或曱基，
以及它們的維甲酸活性(retinoidal activity)。
WO 03/049702 、 JOC 48巻，第 1期，2005， 71-卯頁(yè)和Neuropharmacology, 46巻，第1期，2004， 133-149頁(yè)中公開(kāi)了 N-芳基肉桂酰胺，其包含一個(gè)可表示為如下的基團(tuán)
其中A是被取代的芳基。這些化合物是香草素受體的拮抗劑并可用于治療許多炎性病癥。
發(fā)明描述本發(fā)明涉及式(I)的TRPV1抑制劑
<formula>formula see original document page 5</formula>
(I)
其中
Y是下式的基團(tuán)
其中
R，選自氫、鹵素、羥基、(C廣C6)烷基、(QrC6)鏈烯基、(C3-C6)炔基、(C廣C6)烷氧基、(d-C6)烷基氨基、苯基、萘基、苯氧基、萘氧基或苯基氨基，其中的芳環(huán)任選地被一個(gè)或多個(gè)囟素、羥基、(Q-Ct)烷基、(C廣C4)烷氧基和三氟甲基取代；R是甲基或氫；
n是0或1;
X選自苯基、吡咬基、萘基、會(huì)啉基和異奮啉基，其任選地被一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、羥基、(d-Ct)烷基、(d-C4)烷氧基和三氟曱基的基團(tuán)取代;其中不包括下列化合物
依據(jù)第一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及式(I)化合物，其中n是0且X是5-異會(huì)啉基。其中，特別優(yōu)選的是其中R是氫且Y是下式的基團(tuán)的化合物
其中R，如上文所定義，更優(yōu)選地是氫、甲氧基或如上文所示的任選地被取代的苯氧基。
式(I)化合物的實(shí)例如下
(2J HV-(4-氯苯基)-3-(2,6，6-三甲基環(huán)己-l-烯基)丙烯酰胺；(2^)-7V-(4-氯千基)-3-(2，6，6-三曱基環(huán)己-l-烯基)丙烯酰胺；(2^)-yV-(異查"^"5-基)J-(2々々-三甲基環(huán)己-l-烯基)丙烯酰胺；(2J5)-iV-(4-氯苯基)-3-(2，6，6-三甲基環(huán)己-2-烯基)丙烯酰胺；(2J )-3-(2，6，6-三曱基環(huán)己-l-烯基)-iV-(萘-l-基)丙烯酰胺；(2E")-7V-(4-氯苯基)-3-(2，6，6-三甲基-3-苯氧基環(huán)己-l-烯基)丙烯酰胺；(2^)-A43-曱氧基苯基)-3-(2，6，6-三甲基環(huán)己-l-烯基)丙烯酰胺；
6(2￡>^-(5-氯吡咬-2-基)-3-(2，6，6-三甲基環(huán)己-l-烯基)丙烯酰胺； (2^)-7V-(4-氯苯基)-3-(2，6，6-三甲基環(huán)己-l，3-二烯基)丙烯酰胺； (2"-7V-(4-(三氟甲基)苯基)-3-(2，6，6-三甲基環(huán)己-l-烯基)丙烯酰胺； (2^-3-(2,6，6-三甲基環(huán)己-l-烯基)-A4會(huì)淋-3-基)丙烯酰胺； (2"-3-(2,6，6-三甲基環(huán)己-l-烯基)-AH會(huì)淋-5-基)丙烯酰胺； (2^-A4異會(huì)啉-5-基)-3-(3-曱氧基-2，6，6-三甲基環(huán)己-l-烯基)丙烯酰胺； (2^)-7V-(異壹啉-5-基)-3-(2，6，6-三甲基-3-苯氧基環(huán)己-l-烯基)丙烯酰胺； (2￡>7\4異奮啉-5_基)-3-(3-(3-甲氧基苯基)-2，6，6-三甲基環(huán)己-l-烯基)丙 烯酰胺；
(2^-3-(3-(4-氯苯氧基)-2，6，6-三甲基環(huán)己-l-烯基)-N-(異會(huì)啉-5-基)丙烯 酰胺；
(2￡>3-(3-(4-氟苯氧基)-2，6，6-三甲基環(huán)己-l-烯基)-N-(異會(huì)啉-5-基)丙烯 酰胺；
(2￡>3_(3-(3-氟苯氧基)-2，6，6-三甲基環(huán)己-l-烯基)-N-(異奮啉-S-基)丙烯 酰胺；
(2^)-3-(3-(3，4-二氟苯氧基)-2，6，6-三甲基環(huán)己-l-烯基)-N-(異查啉-S-基) 丙烯酰胺。
式(I)化合物可用常規(guī)方法制備，例如通過(guò)式(II)化合物
Y O
(")
其中Y和R如上文所定義且使羧基適當(dāng)?shù)鼗罨赃M(jìn)行酰胺化反應(yīng) 與商購(gòu)可得的式(III)化合物的反應(yīng)來(lái)制備
X(CH2)nNH2 (I")
其中x如上文所定義。
本發(fā)明將通過(guò)下列實(shí)施例和方案來(lái)闡明。實(shí)施例
所有商購(gòu)可得的化合物均購(gòu)自Aldrich且未經(jīng)進(jìn)一步純化直接使用。 反應(yīng)進(jìn)程通過(guò)硅膠薄層色譜(預(yù)涂覆F254 Merck板)監(jiān)測(cè)，使用紫外燈檢測(cè) 斑點(diǎn)并用KMn04水溶液顯色?？焖偕玦普使用Merck硅膠(230-240目)完成。 H-NMR語(yǔ)以TMS為內(nèi)標(biāo)通過(guò)Varian 400 MHz波語(yǔ)儀記錄。質(zhì)譜通過(guò) Waters-Micromass ZMD波譜儀獲得。熔點(diǎn)通過(guò)Buchi-Tottoli儀器確定且 未經(jīng)校正。
實(shí)施例1 (2^VN-(異奮啉-5-基)-3-(2,6，6-三甲基環(huán)己-l-烯基)丙烯酰胺Ia (方
通過(guò)文獻(xiàn)2中所述的卣仿反應(yīng)用商購(gòu)可得的P-芷香酮制備酸l。將l.O
mmol (194 mg)的酸l溶于8 ml的無(wú)水DMF中。將EDCI(1.2當(dāng)量，1.2 mmol， 230 mg)、 HOBt(1.2當(dāng)量，1.2 mmol， 162 mg)和5-^J^異奮啉(1.2 當(dāng)量，1.2 mmol, 173 mg)在0。C依次加入。在室溫將反應(yīng)混合液攪拌20 小時(shí)。減壓蒸發(fā)溶劑并將殘余物溶于50 ml乙酸乙酯中。用水(2 X 20 ml) 和飽和的氯化鈉溶液(l X 10 ml)洗滌有才M目，經(jīng)硫酸鈉干燥并在真空下濃 縮。殘余物粗品經(jīng)柱色譜(珪膠，3/7乙酸乙酯/己烷隨后用乙酸乙酯洗脫) 純化，最后從乙醚中重結(jié)晶得到150mg淺褐色固體。收率=47%。 Mp:(乙 醚)131-133。C。 NMR (CDC13， 400 MHz) S 1.10 (6H， s)， 1.49 (2H， m)， 1.62 (2H， m)， 1.81 (3H， s)， 2.05 (2H， m)， 6.18 (1H， d)， 7.62 (2H， m)， 7.70 (2H， m)， 7.81 (1H， d)， 8.38 (1H， bs), 8.53 (1H, d， J = 5.6 Hz)， 9.25 (1H, s); [M+1
321.7 (C21H24N20計(jì)算值320.43)。
實(shí)施例2 (2i5VN-(異壹^-5-基)-3-(3-曱氧基-2,6,6-三甲基環(huán)己-l-烯基、丙烯 酰胺Ib (方案2) 制備例1
(2^)-3-(3-曱氧基-2,6，6-三曱基環(huán)己-1-烯基)丙烯酸曱酯3的合成3
將酯2 (8 mmol, 1.66 g)和N-溴代琥珀酰亞胺(l.l當(dāng)量，8.8 mmol， 1.56g)
8在CCl4(30ml)中的懸浮液回流l小時(shí)。經(jīng)硅藻土過(guò)濾后，蒸發(fā)溶劑。將殘 余物溶于MeOH (20 ml)并使反應(yīng)回流過(guò)夜。蒸發(fā)溶劑并將粗產(chǎn)物溶于乙醚 (30 ml)并用水(l X 20 ml)洗滌。使有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥并在真空下濃縮。 經(jīng)色鐠柱(使用1/9乙酸乙酯/石油醚作為洗脫液)純化殘余物粗品得到 715mg的無(wú)色油狀物。收率=37.5% (兩步)。& NMR (CDC13， 400 MHz) 5 1.02 (3H， s)， 1.04 (3H， s)， 1.38 (2H， m)， 1.62 (2H， m)， 1.79 (3H, s)， 3，37 (3H， s)， 3.51 (1H， m)， 3.75 (3H， s)， 5.84 (1H， d， J = 16 Hz)， 7.33 (1H， d， J = 16 Hz); [M+1] 239.1 (C14H2203計(jì)算值238.32)。
(2￡>3-(3-甲氧基-2，6，6-三甲基環(huán)己-1-烯基)丙烯酸4的合成
在0。C將LiOH(5當(dāng)量，630 mg)加入酯3 (3 mmol， 715 mg)在3:1:1 THF/MeOH/水(15 ml)中的溶液中并在室溫將該混合液攪拌過(guò)夜。減壓除去 溶劑并用水(20 ml)稀釋殘余物。通過(guò)加入10% HC1使酸析出并用AcOEt (3 X 15 ml)萃取。經(jīng)Na2S04干燥合并的有機(jī)相，并在真空下蒸發(fā)得到600 mg 的油狀產(chǎn)物。收率=89%。 ]H NMR (CDC13， 400 MHz) S 1.03 (3H， s)， 1.05 (3H， s)， 1.39 (2H， m)， 1.62 (2H， m)， 1.80 (3H， s)， 3.38 (3H， s)， 3.52 (1H， m)， 5.86 (1H， d， J = 16 Hz)， 7.45 (1H， d， J = 16 Hz); [M+1225.5 (C13H20O3計(jì)算 值224.3)。
制備例2
將1.0 mmol (224 mg)的酸4溶于10 ml無(wú)水DMF。在0。C依次加入 EDCI(1.2當(dāng)量，1.2mmol， 230 mg)、 HOBt (1.2當(dāng)量，1.2 mmol， 162 mg) 和5-氨基異壹啉(1.2當(dāng)量，1.2 mmol, 173 mg)。在室溫下將該反應(yīng)混合液 攪拌20小時(shí)。減壓蒸發(fā)溶劑并將殘余物溶于50 ml乙酸乙酯。用水(3 X 20ml) 和飽和的氯化鈉溶液(l X 10 ml)洗滌有才M目，經(jīng)硫酸鈉干燥并在真空下濃 縮。經(jīng)色譜柱(硅膠，乙酸乙酯)純化殘余物粗品，最后從乙醚中重結(jié)晶得 到160 mg的黃色無(wú)定形固體。收率=45%。 & NMR (CDC13， 400 MHz) 5 1.07 (6H， s)， 1.42 (2H, m), 1.66 (2H， m)， 1.86 (3H， s)， 3.40 (3H， s)， 3.48 (IH，
9m)， 6.18 (1H， d)， 7.51 (1H， m)， 7.65 (3H， m)， 7.84 (1H， d)， 8.38 (1H， bs)， 8.55 (1H， d， J = 6 Hz)， 9.26 (1H， s);M+1] 351.2 (C22H26N202計(jì)算值350.45)。
實(shí)施例3 (2^)-N-(異奮啉-5-基)-3-(2,6，6-三甲基-3-苯氧基環(huán)己-l-烯基)丙烯 酰胺Ic (方案3) 制備例1
(2￡>3-(2，6，6-三甲基-3-苯氧基環(huán)己-1-烯基)丙烯酸甲酯5c 4的合成
將酯2 (3.12 mmo1，650 mg)和N-溴代琥珀酰亞胺(l.l當(dāng)量，3.43 mmol, 611 mg)在CCl4(15 ml)中的懸浮液回流l小時(shí)。經(jīng)珪藻土過(guò)濾后，蒸發(fā)溶 劑。將殘余物溶于MeOH (5 ml)并將其滴加到苯酚鈉(6.24 mmol)的曱醇 (10ml)溶液中。將得到的混合液在室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)物傾至冷的5% 氬氧化鈉水溶液(15 ml)中并用乙醚(2 X 20 ml)萃取產(chǎn)物。用水(l X 10 ml) 和鹽水(lX5ml)洗滌有機(jī)層，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥并在真空下濃縮。經(jīng)色i脊 柱(使用1/9乙酸乙酯/石油醚作為洗脫液)純化粗產(chǎn)物得到350 mg的無(wú)色油 狀物。收率=37.5%(兩步)。!H醒R (CDC13， 400 MHz) 5 1.07 (3H， s)， 1.12 (3H， s)， 1.42 (2H， m)， 1.78 (2H, m), 1.86 (3H, s)， 3.78 (3H, s)， 4.57 (1H， m)， 5.92 (1H， d, J = 16.4 Hz)， 6.95 (3H， m)， 7.29 (2H， m)， 7.44 (1H， d， J = 16.4 Hz); [M+1l 301.2 ((:19112403計(jì)算值300.39)。
(2￡>3-(2，6，6-三甲基-3-苯氧基環(huán)己-1-烯基)丙烯酸6c的合成
在0。C將LiOH (5當(dāng)量，243 mg)加入酯5 (1.16 mmo1，350 mg)在3:1:1 THF/MeOH/水(12.5 ml)中的溶液中并在室溫下將該混合液攪拌過(guò)夜。減壓 蒸發(fā)溶劑并用水(20 ml)稀釋殘余物。通過(guò)加入10%HC1使酸析出并用 AcOEt (3 X 15 ml)萃取。經(jīng)Na2S04干燥合并的有機(jī)層并在真空下蒸發(fā)得到 300 mg的白色固體。收率=卯％。H NMR (CDC13， 400 MHz) 5 1.08 (3H， s)， 1.13 (3H， s)， 1.44 (2H， m)， 1.78 (2H， m)， 1.87 (3H, s)， 4.58 (1H， m)， 5.94 (1H, d， J = 16.4 Hz)， 6.96 (3H， m)， 7.29 (2H， m)， 7.52 (1H， d， J = 16.4 Hz); [M+1
287.5 ((:18112203計(jì)算值286.37)。制備例2
將0.5 mmol (143 mg)的酸6c溶于5 ml無(wú)水DMF。在0°C依次加入 EDCI(1.2當(dāng)量，0.6mmo1， 115.2 mg)、 HOBt (1.2當(dāng)量，0.6 mmol， 81 mg) 和5-tJ^異奮啉(1.2當(dāng)量，0.6mmo1， 86.51 mg)。在室溫下將該反應(yīng)混合 液攪拌20小時(shí)。減壓蒸發(fā)溶劑并將殘余物溶于30ml乙酸乙酯。用水(2X 10 ml)和飽和氯化鈉溶液(l X 10 ml)洗滌有4M目，經(jīng)石危酸鈉干燥并在真空下 濃縮。經(jīng)柱色i普(珪膠，乙酸乙酯/石油醚8:2)純化固體粗品，最后從乙醚中 重結(jié)晶得到100mg的白色固體。收率=48.5%。 Mp:(乙醚)141-143。C。 'H 醒R (CDC13， 400 MHz) S 1.14 (3H， s)， 1.17 (3H， s)， 1.47 (2H， m)， 1.78 (2H， m)， 1.95 (3H， s)， 4.60 (1H， m)， 6.41 (1H， d)， 6.97 (2H， d， J = 7.2 Hz)， 7.26 (4H， m)， 7.59 (1H， d， J = 16 Hz)， 7,80 (1H， t， J = 8 Hz)， 7.92 (1H， d， J = 8 Hz)， 8.17 (1H， m)， 8.37 (1H， m)， 8.52 (1H， bs)， 9.26 (1H， s); [M+1413.6 (<:271128]\[202計(jì)算值412.52)。
實(shí)施例4 (2J )-3-(3-(4-氯苯氧基)-2,6,6-三甲基環(huán)己-l-烯基)-N-(異奮啉-5-基) 丙烯酰胺Id (方案3)
依據(jù)制備例2從0.5 mmol的酸6d起始得到了 150 mg白色固體狀的化 合物Id。收率=67%。 Mp:(乙醚)168。C。 'H NMR (CDC13, 400 MHz) 5 1.11 (3H， s)， 1.14 (3H, s)， 1.45 (2H, m)， 1.66 (2H， m)， 1.86 (3H， s)， 4.76 (1H， m)， 6.61 (1H， d)， 7.06 (2H， d， J = 8.8 Hz)， 7.31 (2H， m)， 7.34 (2H， d， J = 8.8 Hz)， 7.69 (1H， t， J = 8 Hz)， 7.95 (1H， d， J = 8 Hz)， 8'04 (1H， m)， 8.27 (1H， bs)， 8.58 (1H， d， J= 6 Hz)， 9.33 (1H， s); [M+1j 448.4 (C27H27C1N202計(jì)算值 446.97)。
實(shí)施例5 (2^)-3-(3-(4-氟苯氧基)-2，6,6-三甲基環(huán)己-l-烯基)-N-(異壹^-5-基) 丙烯酰胺Ie〖方案3)
依據(jù)制備例2從0.5 mmol的酸6e起始得到了 100 mg白色固體狀的化 合物Ie。收率=46%。 Mp:(乙醚)135國(guó)137。C。 ^ NMR (CDC13， 400 MHz)5 1.11 (3H， s)， 1.15 (3H， s)， 1.44 (2H， m)， 1.71 (2H， m)， 1.92 (3H， s), 4.50 (1H，m)， 6.21 (1H， d), 6.91 (2H， m)， 6.98 (2H， m)， 7.54 (1H， d， J = 15.6 Hz)， 7.72(3H， m)， 7.87 (1H, d)， 8.41 (1H， bs)， 8.55 (1H， d， J = 6.4 Hz)， 9.28 (1H， s);[M+1431.6 (<:27112^>^02計(jì)算值430.51)。
實(shí)施例6 (20-3-(3-(3-氟苯氧基)-2,6,6-三甲基環(huán)己-l-烯基)-N-(異喹啉-5-基)丙烯酰胺If(方案3)
依據(jù)制備例2從0.5 mmol的酸6f起始得到了 90 mg白色固體狀的化合物If。收率=42%。 Mp:(乙醚)147。C。H NMR (CDC13， 200 MHz) 8 1.11(3H， s)， 1.14 (3H， s)， 1.57 (2H， m), 1.71 (2H， m)， 1.88 (3H， s)， 4.56 (1H， m)，6.20 (m， d)， 6.70 (4H， m)， 7.58 (1H， d， J = 15.6 Hz)， 7.65 (3H， m)， 7.85 (1H，d)， 8.38 (1H， bs)， 8.59 (1H， d， J = 5.8 Hz)， 9,29 (1H， s); [M+1] 431.5(C"H27FN202計(jì)算值430.51)。
(2^V3-(3-(3,4-二氟苯氧基)-2,6,6-三甲基環(huán)己-l-烯基)-N-(異喹啉-5-基)丙烯酰胺Ig (方案3)
依據(jù)制備例2從0.5 mmol的酸6g起始得到了卯mg白色固體狀的化合物Ig。收率=40%。 Mp:(乙醚)155。C。 & NMR (CDC13， 200 MHz) S 1.11(3H， s)， 1.14 (3H， s), 1.53 (2H， m)， 1.75 (2H， m)， 1.89 (3H， s)， 4.55 (1H， m)，6.20 (1H， d), 6.68 (3H， m)， 7.50 (1H， d， J = 15.6 Hz)， 7.65 (3H， m)， 7.85 (1H，d)， 8.40 (1H， bs)， 8.60 (1H， d， J = 5.8 Hz)， 9.29 (1H， s); [M+1449.7(C27H26F2N202計(jì)算值448.51)。
方案1
試劑i)EDCI
HOBt， 5-氨基異會(huì)啉，DMF
室溫
12方案2
OMe
OMe
OMe 3
OMe
IV
OMe
lb
試劑i) NBS/CC14; ii) MeOH，回流；iii) LiOH, THF/MeOH/水，室溫；iv)EDCI， HOBt， 5-氨基異奮啉，DMF，室溫
方案3
OMe
c: R，，=H
d: 1*,，=4-氯e:『=4-氟
f: R，，-3-氟
g: R，^3，4-二氟
IV
OMe
試劑i) NBS/CC14; ii) R，，PhONa, EtOH，室溫；iii) LiOH， THF/MeOH/水，室溫；iv)EDCI， HOBt, 5-氛基異奮啉，DMF，室溫生物學(xué)試驗(yàn)
寸吏用新生和成年的Sprague-Dawley大鼠( 250 g)(意大利，Harlam)。所有試驗(yàn)都遵循國(guó)家指南并經(jīng)地區(qū)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
放射性配體結(jié)合試驗(yàn)
使用試驗(yàn)時(shí)體重在250-350 g之間的雄性Sprague-Dawley大鼠。對(duì)于結(jié)合試驗(yàn)而言，將麻醉的大鼠斷頭處死，取出脊髓，并在含5mMKCl、5.8 mM NaCl、 0.75 mM CaCl2、 2 mM MgCl2、 320 mM蔗糖、10 mM Hepes的冰冷的緩沖液(pH8.6)中用Polytron組織勻漿機(jī)進(jìn)行破碎5。將勻漿過(guò)的組織在4。C以1000 x g離心10分鐘并將上清液在4。C以35000 x g再離心30分鐘(Beckman Avanti J25)。將沉淀物在上述同樣的緩沖液中重懸并用于結(jié)合試驗(yàn)中。在飽和試驗(yàn)中，將來(lái)自膜懸浮液的150照蛋白質(zhì)/樣品與卩H-仙人掌毒素([3h]-RTX) (0.003-3 nM)在包含0.25 mg/ml無(wú)脂肪酸牛血清白蛋白的試驗(yàn)緩沖液中在37°C孵育60分鐘。在竟?fàn)幵囼?yàn)中，將膜與卩HRTX (0.4 nM)和濃度增加(從0.1 nM至3 jiM)的測(cè)試化合物在37。C孵育60分鐘。在l jtM RTX的存在下確定非特異性結(jié)合。孵育后將反應(yīng)混合液在0oC冷卻并與牛a 1-酸糖蛋白(200照每管)共同孵育15分鐘以減少非特異性RTX結(jié)合。通過(guò)將樣品以18500 x g離心15分鐘使膜結(jié)合的RTX與游離RTX分離。切下微量離心管帶沉淀的尖端部分并通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)(Packard 2500 TR)測(cè)定其放射性活度。依據(jù)Bio-Rad方法以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)參照物測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(Bradford， 1976)。用Ligand程序分析飽和與竟?fàn)幵囼?yàn)6。
培養(yǎng)的大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中的C^+熒光測(cè)定
將兩日齡的新生大鼠末梢麻醉并斷頭處死。取出三叉神經(jīng)節(jié)并迅速放入冷的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，然后轉(zhuǎn)移至膠原酶/分散酶(以1 mg/ml溶于無(wú)Ca2+- Mg2+的PBS)于37。C放置35分鐘7。酶處理后用無(wú)Ca2+- Mg2+的PBS將所述神經(jīng)節(jié)清洗三次，然后置于2 ml冷的補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS，熱滅活的)、2mML-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 |ng/ml鏈霉 素的DMEM中。通過(guò)用一系列注射器針頭(由23G降至25G)吹打若干次， 將神經(jīng)節(jié)分離成單個(gè)細(xì)胞。最后通過(guò)40 pm濾器過(guò)濾培養(yǎng)基和神經(jīng)節(jié)以濾 去碎片，向其中注滿8 ml DMEM培養(yǎng)基并離心(200 x g 5分鐘)。將最終的 細(xì)胞沉淀在DMEM培養(yǎng)基[補(bǔ)充有100 ng/ml小鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(小鼠 -NGF-7S)和胞嘧咬-B-D-阿糖胞苷游離堿(ARA-C) 2.5 ^M中重懸。將細(xì)胞 4甫于涂覆聚L-賴氨酸(8.3 pM)和層粘連蛋白(5 inM)的25 mm的蓋玻片上， 在37。C于充有5% C02和空氣的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5至8天。在Ca"+緩 沖液[具有以下成分(mM): CaCl2 1.4、 KC1 5.4、 MgS04 0.4、 NaCl 135、 D-葡萄糖5、 HEPES10和BSA(0.10/。)， pH 7.4]中使鋪好的神經(jīng)細(xì)胞負(fù)載 Fura-2-AM-ester (3 nM),于37。C放置40分鐘。然后將鋪好的神經(jīng)細(xì)胞用 Ca"+緩沖液洗滌兩次并轉(zhuǎn)移至Nikon Eclipse TE300倒置顯孩i鏡臺(tái)上的槽 中。在340 nM和380 nM激發(fā)Fura-2-AM-ester,通過(guò)用動(dòng)態(tài)圖像分析系 統(tǒng)(Laboratory Automation 2.0， RCS意大利，佛羅倫薩)記錄F340/F380比 值以指示相對(duì)Ca2、變化，將鋪好的神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至槽中后，在該實(shí)驗(yàn)開(kāi) 始前使其達(dá)到(至少10分鐘)穩(wěn)定的熒光。用含F(xiàn)ura-2-AM-ester和確定濃
度的游離Ca"的緩沖液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后用該曲線將由F34o/F38o比值得
到的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為[Ca2+]i (nM)8。研究用抗辣^U威(CPZ)、 SB366791和式(I) 化合物預(yù)處理對(duì)由0.1 ^tM辣^^產(chǎn)生的[Ca^]i增加的影響。
大鼠中由辣4M誘導(dǎo)的繼發(fā)的異常性疼痛
在用乙醚麻醉的大鼠右爪光滑皮膚的跖面注射辣#^(20 nmols/50 ^1/ 爪)(Chaplan等人，1994)。在辣椒堿注射前兩小時(shí)經(jīng)口施用化合物Id (10mg/kg)。辣^u^刺激卯分后評(píng)價(jià)觸覺(jué)異常性疼痛。
藥物和試劑
藥物和試劑從所標(biāo)明的公司購(gòu)得[SH]-仙人掌毒素(Perkin Elmer， Boston, MA)、 SB-366791 (Tocris, UK)、辣#^、抗辣#^、離子霉素、層粘連蛋白、聚L-賴氨酸、P物質(zhì)(Sigma,意大利)；小鼠NGF-7S和膠原 酶/分散酶(Roche Diagnostics,意大利)；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基 (DMEM)、熱滅活的胎牛血清(FBS)、 L-谷氨酰胺(200 mM)、青霉素/鏈霉 素(IO，OOO IU/ml ± 10,000 UG/ml) (Gibco，意大利)；Fura-2-AM-ester (Socie^ Italiana Chimici，意大利)。在50% DMSO和50%吐溫80中配制 辣椒堿(10 mM)、抗辣椒堿(10 mM)、 SB-366791 (1 mM)和式(I)化合物的儲(chǔ) 備液濃度。將Fura-2-AM-ester和離子霉素溶于100%的DMSO。將所有 其它藥物溶于蒸餾水。然后在Krebs緩沖液中配制到適合的稀釋度。
結(jié)果
放射性配體結(jié)合試驗(yàn)
卩H卜RTX對(duì)大鼠脊g達(dá)的TRPV1的飽和曲線顯示K。值為0.21 (0.16-0.27)且Bmax值為57 (53-62) fmol/mg蛋白質(zhì)。斯卡查德圖基本上呈線 性且對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行的計(jì)算機(jī)分析表明只存在 一類的高親和性結(jié)合位點(diǎn)。 卩H-RTX的竟?fàn)幗Y(jié)合試驗(yàn)表明化合物Ia、 Ib、 Ic、 Id、 Ie、 If、 Ig和對(duì)照 化合物(￡>3-(4-氯苯基)-^3-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SB-366791)的Kj值分別 為66 (56-78) nM、 26.2 (21.1-32.6) nM、 4.93 (3.40-7.16) nM、 27 (23-32) nM、 14.8 (10.2-21.5) nM、 8.14 (6.87-9.65) nM、 10.3 (7.9-13.4) nM和36 (30-43) nM。
Ca2+焚光
在大多數(shù)(95。/。)大鼠三叉神經(jīng)元細(xì)胞中辣椒堿(0.1 ^M)均引起[Ca"]增 加，由此可確定這些三叉神經(jīng)元為TRPV1表達(dá)神經(jīng)元。抑制由辣^U^誘 導(dǎo)的[Ca2+i活化的Ia、 Ib、 Ic、 Id、 Ie、 If和Ig的ICso值分別為44 (11-184) nM、 28.4 (25.2-31.9) nM、 2.12 (1.44-2.82) nM、 18.2 (4-98) nM、 5.25 (4.11-6.70) nM、 0.38 (0.36-0.40)和0.65 (0.62-0.68) nM。抗辣椒堿和 SB-366791 (對(duì)照TRPV1拮抗劑)抑制辣豐權(quán)堿響應(yīng)的ICso值分別為9站 (676-1330) nM和8.7 (3.4-17.3) nM。結(jié)果表示為平均值和95%置信區(qū)間。
16大鼠中由辣^U^誘導(dǎo)的繼發(fā)的異常性疼痛
辣椒堿刺激90分鐘后，化合物Id顯示了對(duì)辣椒喊的促異常性疼痛作 用有顯著的預(yù)防作用。
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1權(quán)利要求
1. 式(I)化合物其中Y是下式的基團(tuán)其中R’選自氫、鹵素、羥基、(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、(C3-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基氨基、苯基、萘基、苯氧基、萘氧基或苯基氨基，其中的芳環(huán)任選地被一個(gè)或多個(gè)鹵素、羥基、(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基和三氟甲基取代；R甲基或氫；n是0或1；X選自苯基、吡啶基、萘基、喹啉基和異喹啉基，其任選地被一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、羥基、(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基和三氟甲基的基團(tuán)取代；其中不包括下列化合物
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中n是0且X是5-異查啉基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的化合物，其中R是氫且Y是下式的基團(tuán):其中R，如權(quán)利要求1所定義。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中R，選自氫、甲氧基或如權(quán)利要求l 所述任選地被取代的苯氧基。
5. 用作藥物的權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)的化合物。
6. 包含根據(jù)權(quán)利要求1至4任意一項(xiàng)中的化合物和一種或多種載體和/ 或賦形劑的藥物組合物。
7. 權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)的化合物在制備止痛和/或抗炎的藥物中的用
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)化合物，其中Y、R、n和X如說(shuō)明書所定義，它們的制備方法和包含它們的藥物組合物。式(I)化合物抑制在炎癥后痛覺(jué)過(guò)敏的發(fā)展中起關(guān)鍵作用的瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(TRPV1)，因而它們可用作止痛和抗炎的藥物。
文檔編號(hào)C07D217/02GK101490007SQ200780025946
公開(kāi)日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2007年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月10日
發(fā)明者F·弗魯塔羅羅, M·G·帕瓦尼, M·特雷維薩尼, P·A·博雷亞, P·G·巴拉爾迪, P·杰佩蒂 申請(qǐng)人:法梅斯特有限公司