專利名稱：：抗ephb4抗體及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體的說，本發(fā)明關(guān)注抗EphB4抗體及其用途。
背景技術(shù)：
：維管聯(lián)結(jié)(vascularsupply)的發(fā)育是許多生理性和病理性過程的基本要求?；钴S生長中的組織諸如胚胎和腫瘤要求充足的血液供應(yīng)。它們通過生成促血管發(fā)生因子來滿足這一需要，所述促血管發(fā)生因子經(jīng)由稱為血管發(fā)生(angiogenesis)的過程促進(jìn)新血管形成。血管的管形成是復(fù)雜但有序的生物學(xué)事件，涉及所有或許多以下步驟a)自已有的內(nèi)皮細(xì)胞(EC)增殖出EC或自祖細(xì)胞分化出EC;b)EC遷移并接合以形成索樣結(jié)構(gòu)；c)血管索然后發(fā)生管發(fā)生(tubulogenesis)以形成具有中央內(nèi)腔的血管；d)已有的索或血管伸出芽以形成次生血管；e)初級血管叢發(fā)生進(jìn)一步重塑(remodeling)和整形(reshaping);及f)內(nèi)皮周細(xì)胞(peri-endothelialcell)被募集來包圍內(nèi)皮管，為血管提供維持和調(diào)控功能，此類細(xì)胞包括用于小毛細(xì)血管的周細(xì)胞(pericyte)、用于大血管的平滑肌細(xì)胞、和心臟中的心肌細(xì)胞。Hanahan,Science277:48-50(1997);Hogan&Kolodziej,Nat.Rev.Genet.3:513-23(2002);Lubarsky&Krasnow,Cell112:19-28(2003)?，F(xiàn)在完全確立了血管發(fā)生涉及多種病癥的發(fā)病機(jī)理。這些包括實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移、動脈粥樣硬化、晶狀體后纖維組織增生、血管瘤、慢性炎癥、眼內(nèi)新血管疾病諸如增殖性-f見網(wǎng)膜病例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜組織和其它組織的免疫排斥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、和銀屑病。Folkman等，J.Biol,Chem.267:10931-34(1992);Klagsbrun等，Annu.Rev.Physiol.53:217-39(1991);GarnerA.，"Vasculardiseases",于PathobiologyofOcularDisease.ADynamicApproach,GarnerA和KlintworthGK編，第2版，MarcelDekker，NY,1994，pp1625-1710。在腫瘤生長的情況中，血管發(fā)生(angiogenesis)對于自增生至瘤形成的轉(zhuǎn)換，及為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)似乎是至關(guān)重要的。Folkman等，Nature339:58(1989)。新血管形成(neovascularization)讓肺瘤細(xì)胞獲得了與正常細(xì)胞相比的生長優(yōu)勢和增殖自治。腫瘤通常開始于單個異常細(xì)胞，由于與可利用毛細(xì)管床的距離，該細(xì)胞只能增殖至幾立方毫米的尺寸，而且它能在較長的一段時間里保持"休眠，，狀態(tài)而不進(jìn)一步生長和傳播。有些腫瘤細(xì)胞然后轉(zhuǎn)向血管發(fā)生表型以啟動內(nèi)皮細(xì)胞，所述內(nèi)皮細(xì)胞增殖并成熟成新的毛細(xì)血管。這些新形成的血管不僅讓原發(fā)性腫瘤繼續(xù)生長，而且讓轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞傳播并再建群(recolonization)。因而，在腫瘤切片中的微血管密度與乳腺癌及數(shù)種其它腫瘤的患者存活之間觀察到了相關(guān)性。Weidner等，N.Engl.J.Med.324:1-6(1991);Horak等,Lancet340:1120-24(1992);Macchiarini等,Lancet340:145-46(1992)。尚未完全了解控制血管發(fā)生轉(zhuǎn)換的精確機(jī)制，但是認(rèn)為腫瘤塊的新血管形成源自眾多血管發(fā)生刺激物與抑制物的凈平衡。Folkman,Nat.Med.1(1):27畫31(1995)。血管發(fā)育過程受到嚴(yán)密調(diào)節(jié)。迄今為止，多種分子，多為由周圍細(xì)胞生成的分泌性因子，已顯示出調(diào)節(jié)EC分化、增殖、遷移和接合成索樣結(jié)構(gòu)。例如，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)已鑒定為涉及刺激血管發(fā)生和誘導(dǎo)血管通透性的關(guān)鍵因子。Ferrara等，Endocr.Rev.18:4-25(1997)。甚至單個VEGF等位基因的遺失導(dǎo)致胚胎致死的發(fā)現(xiàn)指向此因子在血管系統(tǒng)的發(fā)育和分化中所發(fā)揮的不可代替的作用。此外，VEGF已顯示為與肺瘤和眼內(nèi)病癥有關(guān)的新血管形成的關(guān)鍵介導(dǎo)物。Ferrara等，Endocr.Rev.見上文。VEGFmRNA在多數(shù)所檢查的人腫瘤中過表達(dá)。Berkman等，J.Clin.Invest.91:153-59(1993);Brown等，HumanPathol.26:86-91(1995);Brown等，CancerRes.53:4727-35(1993);Mattem等，Brit.J.Cancer73:931-34(1996);Dvorak等,Am.J.Pathol.146:1029-39(1995)。同樣，眼部液體中VEGF的濃度水平與糖尿病性和其它缺血相關(guān)性視網(wǎng)膜病患者中的活躍的血管增殖的存在高度相關(guān)。Aiello等，N.Engl.J.Med.331:1480-87(1994)。此外，研究證明了VEGF在AMD患者脈絡(luò)膜新血管膜中的定位。Lopez等，InvestOphthalmol.Vis.Sci.37:855-68(1996)。抗VEGF中和性抗體在棵鼠中遏制多種人腫瘤細(xì)胞系的生長(Kim等，Nature362:841-44(1993);Warren等，J.Clin.Invest.95:1789-97(1995);Borgstr6m等，CancerRes.56:4032-39(1996);Melnyk等，CancerRes.56:921-24(1996)),而且在缺血性視網(wǎng)膜病癥模型中還抑制眼內(nèi)血管發(fā)生(Adamis等，Arch.Ophthalmol.114:66-71(1996))。因此，抗VEGF單克隆抗體或其它VEGF作用抑制劑是有希望用于治療腫瘤和多種眼內(nèi)新血管病癥的候選物。此類抗體記載于例如1998年1月14日公開的EP817,648和1998年10月15日公開的W098/45331和W098/45332。一種抗VEGF抗體，貝伐單抗(bevacizumab)，已獲FDA批準(zhǔn)與化療方案聯(lián)合用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌(CRC)。而且，貝伐單抗正在許多進(jìn)行中的治療各種癌癥適應(yīng)證的臨床試驗(yàn)中接受研究。EphB4受體("EphB4"或"EphB4R")是eph受體家族的一個成員，該家族構(gòu)成人類基因組中最大的酪氨酸激酶受體家族(綜述見Dodelet,Oncogene,19:5614-5619,2000)。人eph受體酪氨酸激酶根據(jù)序列同一性分成A類和B類，其具有稱為ephrin(s)的相應(yīng)A型和B型配體。信號傳導(dǎo)可以以正向方式發(fā)生，其中受體酪氨酸激酶受到配體的活化，或者以反向方式發(fā)生，其中跨膜ephrinB配體受到與受體相互作用的活化。eph受體配體相互作用已經(jīng)與廣泛的生物學(xué)功能聯(lián)系起來，包括軸突導(dǎo)向、組織邊界形成、維管發(fā)生(vasculogenesis)、和細(xì)胞運(yùn)動(Kullander等，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol"3:475-486,2002;Cheng等，CytokineGrowthFactorRev"13:75-85，2002;Coulthard等，Int.J.Dev.Biol"46:375-384,2002)。EphB4結(jié)合諸如ephrin-Bl、ephrin-B2、和ephrin-B3的配體。EphB4受體具有胞外區(qū)，該胞外區(qū)有富含半胱氨酸的基序，延伸跨越其氨基端部分，接著是兩個纖連蛋白II型基序。還有特征為保守激酶區(qū)的胞內(nèi)域和跨膜域。顯然仍然需要具有最適于開發(fā)成治療劑的臨床屬性的藥劑。本文記載的發(fā)明滿足了該需要并提供了其它好處。通過參考完整收入本文中引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利申請和出版物。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于多種EphB4結(jié)合劑(諸如免疫偶聯(lián)物、抗體、及其片段)的鑒定。EphB4呈現(xiàn)為重要且有利的治療靶，而且本發(fā)明提供了以結(jié)合EphB4為基礎(chǔ)的組合物和方法。如本文所述，本發(fā)明的EphB4結(jié)合劑為靶向與EphB4-EphB4配體途徑的表達(dá)和/或活性有關(guān)的病理狀況提供了重要的治療劑和診斷劑供使用。因而，本發(fā)明提供了與EphB4結(jié)合有關(guān)的方法、組合物、試劑盒和制品。本發(fā)明提供了與EphB4結(jié)合(諸如特異性結(jié)合)的抗體。一方面，本發(fā)明提供了分離的抗EphB4抗體，其中全長IgG形式的所述抗體以約50pM或更好的結(jié)合親和力(bindingaffinity)特異性結(jié)合人EphB4。正如本領(lǐng)域完全確立的，配體對其受體的結(jié)合親和力可使用多種測定法中的任一種來測定，并以各種定量數(shù)值形式表示。因而，在一個實(shí)施方案中，結(jié)合親和力以Kd值表示，反映內(nèi)在結(jié)合親和力(例如具有最小化的親合力效應(yīng)(avidityeffect))。普遍且優(yōu)選的是，結(jié)合親和力在體外測量，例如無論是無細(xì)胞的環(huán)境或細(xì)胞相關(guān)環(huán)境下進(jìn)行。本領(lǐng)域已知的許多測定法中的任一種，包括那些本文所描述的，都可用于獲取結(jié)合親和力的測量值，包括例如Biacore、放射免疫測定法(RIA)和ELISA。一方面，本發(fā)明提供了與EphB4的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合的分離的抗體。在有些實(shí)施方案中，所述分離的抗體與包含EphB4胞外結(jié)構(gòu)域、或由其組成、或基本上由其組成的多肽結(jié)合。一方面，本發(fā)明提供了與EphB4配體竟?fàn)嶦phB4結(jié)合的分離的抗EphB4抗體。一方面，本發(fā)明提供了抑制、降低、和/或阻斷EphB4活性的分離的抗EphB4抗體。在有些實(shí)施方案中，EphB4的自磷酸化受到抑制、降低、和/或阻斷。一方面，本發(fā)明的抗EphB4抗體包含(a)至少一個、兩個、三個、四個或五個選自下組的高變區(qū)(HVR)序列(i)HVR-L1，其包含序列Al-All，其中A1-A11為RASQDVSTAVA(SEQIDNO:9),(ii)HVR-L2，其包含序列B1-B7，其中B1-B7為SASFLYS(SEQIDNO:11)，(iii)HVR-L3，其包含序列C1-C9，其中C1-C9為QESTTTPPT(SEQIDNO:15)，(iv)HVR-H1，其包含序列D1-D10，其中D1-D10為GFSISNYYLH(SEQIDNO:2)，(v)HVR-H2,其包含序列E1-E18,其中E1-E18為GGIYLYGSSSEYADSVKG(SEQIDNO:4)，和(vi)HVR-H3，其包含序列F1-F17，其中F1-F17為ARGSGLRLGGLDYAMDY(SEQIDNO:7);及(b)至少一個變異的HVR，其中所述變異的HVR序列包含SEQIDNO:1-17所示序列的至少一個殘基的修飾。一方面，本發(fā)明提供了包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR的抗體，其中每個HVR包含選自SEQIDNO:l-17的序列、或由其組成、或基本上由其組成，且其中SEQIDNO:9或10對應(yīng)于HVR-L1，SEQIDNO:ll或12對應(yīng)于HVR-L2，SEQIDNO:13、14、15、16、或17對應(yīng)于HVR-L3，SEQIDNO:1或2對應(yīng)于HVR-H1，SEQIDNO:3、4、5、或6對應(yīng)于HVR-H2，和SEQIDNO:7或8對應(yīng)于HVR-H3。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3，其中每個依次包含SEQIDNO:9、11、13、1、3、7。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3，其中每個依次包含SEQIDNO:10、12、14、1、3、8。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3，其中每個依次包含SEQIDNO:9、11、15、2、4、7。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3，其中每個依次包含SEQIDNO:9、11、16、1、5、7。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2、和HVR-H3，其中每個依次包含SEQIDNO:9、11、17、1、6、7。本發(fā)明抗體中的變異的HVR可以具有HVR內(nèi)一個或多個(諸如兩個、三個、四個、五個、或更多個)殘基的修飾。在一個實(shí)施方案中，HVR-Ll變體在任意組合的下列位置中包含l-5(1、2、3、4或5)處替代A6(V或S)、A7(S或E)、A8(T或I)、A9(A或F)、和AIO(V或L)。在一個實(shí)施方案中，HVR-L2變體在任意組合的下列位置中包含l-2(1、或2)處替代B4(F或N)和B6(Y或E)。在一個實(shí)施方案中，HVR-L3變體在任意組合的下列位置中包含l-7(1、2、3、4、5、6或7)處替代C2(Q、E、或K)、C3(S或T)、C4(Y、N、T、E、或A)、C5(T、A、或Q)、C6(T、V、或I)、C8(P、L、或E)、和C9(T或S)。在一個實(shí)施方案中，HVR-Hl變體在任意組合的下列位置中包含l-3(1、2、或3)處替代D3(T或S)、D6(G或N)、和D9(I或L)。在一個實(shí)施方案中，HVR-H2變體在任意組合的下列位置中包含l-5(1、2、3、4或5)處替代E5(P、或L)、E7(S或G)、E8(G或S)、E10(T、S、或R)、和Ell(D、E、或G)。在一個實(shí)施方案中，HVR-H3變體在下列位置中包含1處替代F3(G或S)。每個位置后面括號中的字母指示例示替代(即置換)氨基酸；對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可使用本領(lǐng)域已知的和/或本文描述的技術(shù)常規(guī)評估其它氨基酸在本文所述背景中作為替代氨基酸的適宜性。一方面，本發(fā)明提供了包含HVR-H1區(qū)的抗體，所述HVR-H1區(qū)包含SEQIDNO:l或2的序列。一方面，本發(fā)明提供了包含HVR-H2區(qū)的抗體，所述HVR-H2區(qū)包含SEQIDNO:3、4、5、或6的序列。一方面，本發(fā)明提供了包含HVR-H3區(qū)的抗體，所述HVR-H3區(qū)包含SEQIDNO:7或8的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含HVR-L1區(qū)的抗體，所述HVR-L1區(qū)包含SEQIDNO:9或10的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含HVR-L2區(qū)的抗體，所述HVR-L2區(qū)包含SEQIDNO:11或12的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含HVR-L3區(qū)的抗體，所述HVR-L3區(qū)包含SEQIDNO:13、14、15、16、或17的序列。一方面，本發(fā)明提供了包含至少一個、至少兩個、或所有三個以下序列的抗體(i)HVR-H1序列，其包含SEQIDNO:2的序列；(ii)HVR-H2序列，其包含SEQIDNO:4的序列；(iii)HVR-H3序列，其包含SEQIDNO:7的序列。一方面，本發(fā)明提供了包含至少一個、至少兩個、或所有三個以下序列的抗體(i)HVR-L1序列，其包含SEQIDNO:9的序列；(ii)HVR-L2序列,其包含SEQIDNO:ll的序列；(iii)HVR-L3序列，其包含SEQIDNO:15的序列。如圖1所示，SEQIDNO:l-17的氨基酸序列針對各個HVR(即H1、H2或H3)而言進(jìn)行了編號，編號方式與如下所述的Kabat編號系統(tǒng)是一致的。一方面，本發(fā)明提供了包含圖1所示重鏈HVR序列的抗體。一方面，本發(fā)明提供了包含圖1所示輕鏈HVR序列的抗體。本發(fā)明抗體的有些實(shí)施方案包含下文SEQIDNO:18所示人源化4D5抗體(huMAb4D5畫8)(HERCEPTIN,Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA，USA)(還可參見美國專利No.6,407,213和Leeetal.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5):1073-93)的輕鏈可變域。1AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinAspVal加ThrAlaValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeulieTyrSerAlaSerPheLeuTyrSerGlyValProSerArgPheSerGlySer*SerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGin歷sTyrThrThrProProThrPheGlyGinGlyThrLysValGluHeLys107(SEQIDNO:18)(HVR殘基標(biāo)有下劃線)在一個實(shí)施方案中，所述huMAb4D5-8輕鏈可變域序列在第30、66或91位(在上文中分別以粗體/斜體標(biāo)示的Asn、Arg和His)中的一個或多個處有修飾。在一個實(shí)施方案中，所述經(jīng)過修飾的huMAb4D5-8序列在第30位包含Ser,在第66位包含Gly，和/或在第91位包含Ser。因而，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變域，其包含下文SEQIDNO:52所示序列1AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinAspValThrAlaValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeulieTyrSerAlaSerPheLeuTyrSerGlyValProSerArgPheSerGlySerGfySerGlyThrAspPheThrLeuThrHeSerProThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys107(SEQIDNO:52)(HVR殘基標(biāo)有下劃線)相對于huMAb4D5-8的替代殘基在上文中以4l體/斜體標(biāo)示。本發(fā)明的抗體可包含任何合適的框架可變域序列，倘若EphB4的結(jié)合活性基本上得到保留。例如，在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含人亞組III重鏈框架共有序列。在這些抗體的一個實(shí)施方案中，所述框架共有序列在第71、73和/或78位包含替代。在這些抗體的有些實(shí)施方案中，第71位為A,第73位為T，和/或第78位為A。在一個實(shí)施方案中，這些抗體包含huMAb4D5-8(HERCEPTIN,Genentech，Inc.,SouthSanFrancisco,CA,USA)(還可參見美國專利No.6，407，213&5,821,337和Leeetal.，J.Mol.Biol.(2004)，340(5):1073-93)的重鏈可變域框架序列。在一個實(shí)施方案中，這些抗體進(jìn)一步包含人Kl輕鏈框架共有序列。在一個實(shí)施方案中，這些抗體包含huMAb4D5-8的輕鏈HVR^歹'J(美國專利No.6，407，213&5,821,337)。在一個實(shí)施方案中，這些抗體包含huMAb4D5-8(HERCEPTIN,Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA,USA)(還可參見美國專利No.6,407,213&5,821,337和Leeetal.,J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-93)的輕鏈可變域序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域，其中所述框架序列包含SEQIDNO:19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、和/或37的序列，而且HVRH1、H2和H3序列分別為SEQIDNO:9、11、和/或15。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變域，其中所述框架序列包含SEQIDNO:38、39、40和/或41的序列，而且HVRL1、L2和L3序列分別為SEQIDNO:2、4、和/或7。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域，其中所述框架序列包含SEQIDNO:46、47、48、和/或49的序列，而且HVRH1、H2和H3序列分別為SEQIDNOS:2、4、和/或7。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變域，其中所述框架序列包含SEQIDNO:42、43、44、和/或45的序列，而且HVRL1、L2和L3序列分別為SEQIDNOS:9、11、和/或15。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域，其中所述框架序列包含SEQIDNOS:46、47、51、和49的序列，而且HVRH1、H2和H3序列分別為SEQIDNOS:2、4、和/或7。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變域，其中所述框架序列包含SEQIDNOS:42、43、50、和45的序列，而且HVRL1、L2和L3序列分別為SEQIDNOS:9、11、和/或15。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是親和力成熟的，用以獲得期望的靶物結(jié)合親和力。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的親和力成熟的抗體在第H28、H31、H34、H52a、H54、H55、H57、H58、H95、L29、L30、L31、L32、L33、L53、L55、L90、L91、L92、L93、L94、L96或L97位氨基酸中的一個或多個處包含替代。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的親和力成熟的抗體包含一個或多個以下替代(a)重鏈中，T28S，G31N,I34L,P52aL，S54G，G55S，T57S或R，D58E或G，G95S，或者，(b)輕鏈中，V29S，S30E，T31I,A32F，V33L，F(xiàn)53N,Y55E,Q90E或K,S91T，Y92N、T、E或A，T93V或I，T94V或I，P96L或E，T97S。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQIDNO:53的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQIDNO:54的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域及輕鏈可變域，重鏈可變域包含SEQIDNO:53的序列，輕鏈可變域包含SEQIDNO:54的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQIDNO:55的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQIDNO:56的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域及輕鏈可變域，重鏈可變域包含SEQIDNO:55的序列，輕鏈可變域包含SEQIDNO:56的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQIDNO:57的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQIDNO:58的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域及輕鏈可變域，重鏈可變域包含SEQIDNO:57的序列，輕鏈可變域包含SEQIDNO:58的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含SEQIDNO:59的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含SEQIDNO:60的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域及輕鏈可變域，重鏈可變域包含SEQIDNO:59的序列，輕鏈可變域包含SEQIDNO:60的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域，其包含SEQIDNO:61的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變域，其包含SEQIDNO:62的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變域及輕鏈可變域，重鏈可變域包含SEQIDNO:61的序列，輕鏈可變域包含SEQIDNO:62的序列。一方面，本發(fā)明提供了與任何上述抗體竟?fàn)幗Y(jié)合EphB4的抗體。一方面，本發(fā)明提供了與上述抗體結(jié)合EphB4上相同表位的抗體。正如本領(lǐng)域已知的及下文更為詳細(xì)描述的，根據(jù)上下文和本領(lǐng)域已知的各種定義(正如下文所描述的)，界定抗體高變區(qū)的氨基酸位置/邊界可有所變化。可變域內(nèi)的有些位置可視為雜合高變位置，因?yàn)檫@些位置根據(jù)一套標(biāo)準(zhǔn)可認(rèn)為是在高變區(qū)內(nèi)，但根據(jù)一套不同的標(biāo)準(zhǔn)則認(rèn)為是在高變區(qū)外。在延伸的高變區(qū)(如下文進(jìn)一步定義的)內(nèi)也可找到一個或多個這些位置。在有些實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。在有些實(shí)施方案中，所述抗體是多克隆抗體。在有些實(shí)施方案中，所述抗體選自嵌合抗體、親和力成熟的抗體、人源化抗體、和人抗體。在有些實(shí)施方案中，所述抗體是抗體片段。在有些實(shí)施方案中，所述抗體是Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、或scFv。在一個實(shí)施方案中，所述抗體是嵌合抗體，例如將來自非人供體的抗原結(jié)合序列移植至異源的非人序列、人序列、或人源化序列(例如框架和/或恒定域序列)的抗體。在一個實(shí)施方案中，所述非人供體是小鼠。在一個實(shí)施方案中，抗原結(jié)合序列是合成的，例如通過誘變(例如噬菌體展示篩選等)得到的。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合抗體具有鼠的V區(qū)和人的C區(qū)。在一個實(shí)施方案中，所述鼠的輕鏈V區(qū)與人的K輕鏈融合。在一個實(shí)施方案中，所述鼠的重鏈V區(qū)與人的IgGlC區(qū)融合。本發(fā)明的人源化抗體包括那些在FR中具有氨基酸替代的抗體和在移植的CDR中具有改變的親和力成熟的變體。CDR或FR中的替代氨基酸不限于那些存在于供體或受體抗體中的氨基酸。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體進(jìn)一步在Fc區(qū)中的氨基酸殘基處包含導(dǎo)致效應(yīng)器功能得到改善(包括CDC和/或ADCC和B細(xì)胞殺傷功能增強(qiáng))的改變。本發(fā)明的其它抗體包括那些具有改善穩(wěn)定性的特定改變的抗體。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在Fc區(qū)中的氨基酸殘基處包含導(dǎo)致效應(yīng)器功能得到降低(例如CDC和/或ADCC功能降低和/或B細(xì)胞殺傷降低)的改變。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的特征為與天然殺傷(NK)細(xì)胞上的人補(bǔ)體因子Clq和/或人Fc受體的結(jié)合降低(諸如結(jié)合缺失)。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的特征為與人FcyRI、FcyRIIA、和/或FcyRIIIA的結(jié)合降低(諸如結(jié)合缺失)。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是IgG類的(例如IgGl或IgG4)，而且在E233、L234、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331和/或P329中包含至少一個突變(編號方式依照EU索引)。在有些實(shí)施方案中，所述抗體包含突變L234A/L235A或D265A/N297A。一方面，本發(fā)明提供了抗EphB4多肽，其包含本文中所提供的任何抗原結(jié)合序列，其中所述抗EphB4多肽與EphB4特異性結(jié)合。本發(fā)明的抗體與EphB4結(jié)合(諸如特異性結(jié)合)，而且，在有些實(shí)施方案中，可調(diào)控EphB4相關(guān)效應(yīng)的一個或多個方面，包括但不限于EphB4活化、EphB4下游分子信號傳導(dǎo)、EphB4配體活化、EphB4配體下游分子信號傳導(dǎo)、對配體(例如ephrin-Bl、ephrin-B2、和/或ephrin-B3)與EphB4結(jié)合的破壞、EphB4磷酸化和/或EphB4多聚化、和/或EphB4配體磷酸化、和/或?qū)θ魏紊飳W(xué)相關(guān)EphB4和/或EphB4配體生物學(xué)途徑的破壞、對血管發(fā)生的抑制、和/或?qū)δ[瘤、細(xì)胞增殖性病癥或癌癥的治療和/或預(yù)防、和/或?qū)εcEphB4表達(dá)和/或活性(諸如EphB4表達(dá)和/或活性升高)相關(guān)的病癥的治療或預(yù)防。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與EphB4特異性結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，所述抗體與EphB4胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)特異性結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，所述抗體與由EphB4胞外結(jié)構(gòu)域組成或基本上由其組成的多肽特異性結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，所述抗體以約50pM或更強(qiáng)的KD與EphB4特異性結(jié)合。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在體內(nèi)和/或在體外降低、抑制、和/或阻斷EphB4活性。在有些實(shí)施方案中，所述抗體降低、抑制、和/或阻斷EphB4自磷酸化。在有些實(shí)施方案中，所述抗體竟?fàn)幣cEphB4配體的結(jié)合(降低和/或阻斷EphB4配體與EphB4結(jié)合)。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明抗體在制備用于諸如癌癥、腫瘤、和/或細(xì)胞增殖性病癥的病癥的治療性和/或預(yù)防性處理的藥物中的用途。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是神經(jīng)病或神經(jīng)變性疾病。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明抗體在制備用于抑制血管發(fā)生的藥物中的用途。一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種本發(fā)明抗體和載體的組合物。在一個實(shí)施方案中，所述載體是制藥學(xué)可接受的。一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明抗EphB4抗體的核酸。一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸的載體。一方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種本發(fā)明核酸和載體的組合物。在一個實(shí)施方案中，所述載體是制藥學(xué)可接受的。一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核酸或載體的宿主細(xì)胞。載體可以是任何類型的，例如重組載體，諸如表達(dá)載體?？梢允褂枚喾N宿主細(xì)胞中的任一種。在一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，例如大腸桿菌。在一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。一方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明抗體的方法。例如，本發(fā)明提供了制備抗EphB4抗體(如本文中所定義的，包括全長及其片段)或免疫偶聯(lián)物的方法，所述方法包括在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述抗體(或其片段)的本發(fā)明重組載體，并回收所述抗體。一方面，本發(fā)明提供了包含容器和裝在該容器內(nèi)的組合物的制品，其中所述組合物包含一種或多種本發(fā)明的抗EphB4抗體。在一個實(shí)施方案中，所述組合物包含本發(fā)明的核酸。在一個實(shí)施方案中，包含抗體的組合物進(jìn)一步包含載體，其在有些實(shí)施方案中是制藥學(xué)可接受的。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的制品進(jìn)一步包含關(guān)于對受試者施用組合物(例如抗體)的說明書(諸如關(guān)于本文所述任何方法的說明書)。一方面，本發(fā)明提供了包含第一容器和第二容器的試劑盒，所述第一容器中裝有包含一種或多種本發(fā)明抗EphB4抗體的組合物，所述第二容器中裝有緩沖劑。在一個實(shí)施方案中，所述緩沖劑是制藥學(xué)可接受的。在一個實(shí)施方案中，包含抗體的組合物進(jìn)一步包含載體，其在有些實(shí)施方案中是制藥學(xué)可接受的。在一個實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包含關(guān)于對受試者施用所述組合物(例如所述抗體)的說明書。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明抗EphB4抗體在制備用于諸如癌癥、肺瘤、和/或細(xì)胞增殖性病癥的病癥的治療性和/或預(yù)防性處理的藥物中的用途。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是神經(jīng)病或神經(jīng)變性疾病。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明核酸在制備用于諸如癌癥、腫瘤、和/或細(xì)胞增殖性病癥的病癥的治療性和/或預(yù)防性處理的藥物中的用途。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是神經(jīng)病或神經(jīng)變性疾病。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明載體在制備用于諸如癌癥、腫瘤、和/或細(xì)胞增殖性病癥的病癥的治療性和/或預(yù)防性處理的藥物中的用途。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是神經(jīng)病或神經(jīng)變性疾病(神經(jīng)退化性疾病)(neurodegenerativedisease)。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是與血管發(fā)生有關(guān)病理^)犬況。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明宿主細(xì)胞在制備用于諸如癌癥、腫瘤、和/或細(xì)胞增殖性病癥的病癥的治療性和/或預(yù)防性處理的藥物中的用途。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是神經(jīng)病或神經(jīng)變性疾病。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明制品在制備用于諸如癌癥、腫瘤、和/或細(xì)胞增殖性病癥的病癥的治療性和/或預(yù)防性處理的藥物中的用途。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是神經(jīng)病或神經(jīng)變性疾病。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況。一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明試劑盒在制備用于諸如癌癥、腫瘤、和/或細(xì)胞增殖性病癥的病癥的治療性和/或預(yù)防性處理的藥物中的用途。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是神經(jīng)病或神經(jīng)變性疾病。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況。本發(fā)明提供了可用于調(diào)控與EphB4表達(dá)和/或活性(諸如表達(dá)和/或活性升高或降低、或不想要的表達(dá)和/或活性)有關(guān)的疾病狀態(tài)的方法或組合物。一方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防EphB4表達(dá)和/或活性升高有關(guān)的腫瘤、癌癥、和/或細(xì)胞增殖性病癥的方法，所述方法包括對需要此類治療的受試者施用施用有效量的抗EphB4抗體。一方面，本發(fā)明提供了用于殺傷細(xì)胞(諸如癌癥或肺瘤細(xì)胞)的方法，所述方法包括對需要此類治療的受試者施用有效量的抗EphB4抗體。一方面，本發(fā)明提供了用于降低、抑制、阻斷、或阻止肺瘤或癌癥生長的方法，所述方法包括對需要此類治療的受試者施用有效量的抗EphB4抗體。一方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防神經(jīng)病或神經(jīng)變性疾病、或修復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞的方法，所述方法包括對需要此類治療的受試者施用有效量的抗EphB4抗體。一方面，本發(fā)明提供了用于促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育、增殖、維持或再生的方法，所述方法包括對需要此類治療的受試者施用有效量的抗EphB4抗體。一方面，本發(fā)明提供了用于抑制血管發(fā)生(angiogenesis)的方法，所述方法包括對需要此類治療的受試者施用有效量的抗EphB4抗體。述方法包括對需要此類治療的受試者施用有效量的抗EphB4抗體。在有些實(shí)施方案中，所述與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況是腫瘤、癌癥、和/或細(xì)胞增殖性病癥。在有些實(shí)施方案中，所述與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況是眼內(nèi)新血管疾病。本發(fā)明的方法可用于影響任何合適的病理狀態(tài)。本文中描述了例示性的病癥，包括選自下組的癌癥小細(xì)胞肺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌(CRC)、肝細(xì)胞癌。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中所靶向的細(xì)胞是癌細(xì)胞。例如，癌細(xì)胞可選自乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、乳頭狀癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌細(xì)胞、骨源性肉瘤細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、肝細(xì)胞癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、頭和頸鱗狀癌細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞、和結(jié)腸腺瘤細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中所靶向的細(xì)胞是過度增殖的(hyperproliferative)和/或過度增生(hyperplastic)的細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中所靶向的細(xì)胞是發(fā)育異常的(dysplastic)細(xì)胞。在又一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中所靶向的細(xì)胞是轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。本發(fā)明的方法還可進(jìn)一步包括別的處理步驟。例如，在一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括其中將靶細(xì)胞和/或組織(例如癌細(xì)胞)暴露于放射處理或化療劑的步驟。一方面，本發(fā)明提供了包括聯(lián)合施用有效量的抗EphB4抗體和有效量的另——一治療齊'J(諸如抗血管發(fā)生劑(anti-angiogenesisagent)的方法。例如，抗EphB4抗體與抗癌劑或抗血管發(fā)生劑聯(lián)合用于治療各種贅生性或非贅生性疾患。在一個實(shí)施方案中，所述贅生性(neoplastic)或非贅生性(non-neoplastic)疾患是與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況。在有些實(shí)施方案中，另一治療劑是抗血管發(fā)生劑、抗腫瘤劑、和/或化療劑?？笶phB4抗體可以與對那些目的有效的另一治療劑連續(xù)或聯(lián)合施用，或是在同一組合物中或是作為分開的組合物。抗EphB4抗體與另一治療劑(例如抗癌劑、抗血管發(fā)生劑)的施用可以同時進(jìn)行，例如作為單一組合物，或者作為兩種或多種不同的組合物，使用相同或不同的施用路徑?；蛘?另外，施用可以以任何次序順序進(jìn)行?；蛘?另外，所述步驟可以作為任何次序的順序進(jìn)4亍和同時進(jìn)4亍二者的纟且合來進(jìn)4亍(thestepscanbeperformedasacombinationofbothsequentiallyandsimultaneously,inanyorder)。在某些實(shí)施方案中，兩種或多種組合物的施用之間可以有范圍從數(shù)分鐘到數(shù)天、到數(shù)周、到數(shù)月的間隔。例如，可以先施用抗癌劑，接著施用抗EphB4抗體。然而，也設(shè)想了同時施用或先施用抗EphB4抗體。因而，一方面，本發(fā)明提供了包括施用抗EphB4抗體、接著施用抗血管發(fā)生劑(諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐單抗)的方法。在某些實(shí)施方案中，兩種或多種組合物的施用之間可以有時間范圍上從數(shù)分鐘到數(shù)天、到數(shù)周、到數(shù)月的間隔。在某些方面，本發(fā)明提供了通過施用有效量的抗EphB4抗體和/或血管發(fā)生抑制劑和一種或多種化療劑來治療病癥(諸如腫瘤、癌癥、和/或細(xì)胞增殖性病癥)的方法。多種化療劑可用于本發(fā)明的聯(lián)合治療方法。本文在"定義"部分提供了所設(shè)想的化療劑的例示性和非限制性列表。抗EphB4抗體與交聯(lián)劑的施用可以同時進(jìn)行，例如作為單一組合物，或者作為兩種或多種不同的組合物，使用相同或不同的施用路徑。或者/另外，施用可以以任何次序順序進(jìn)行。或者/另外，所述步驟可以作為任何次序的順序進(jìn)行和同時進(jìn)行二者的組合來進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，兩種或多種組合物的施用之間可以有時間上從數(shù)分鐘到數(shù)天、到數(shù)周、到數(shù)月的間隔。例如，可以先施用化療劑，接著施用抗EphB4抗體。然而，也設(shè)想了同時施用或先施用抗EphB4抗體。因而，一方面，本發(fā)明提供了包括施用抗EphB4抗體、接著施用化療劑的方法。在某些實(shí)施方案中，兩種或多種組合物的施用之間可以有時間上從數(shù)分鐘到數(shù)天、到數(shù)周、到數(shù)月的間隔。一方面，本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)抗血管發(fā)生劑在患有與血管發(fā)生有關(guān)的病理狀況的受試者中的功效的方法，所述方法包括對受試者聯(lián)合施用有效量的抗EphB4抗體和抗血管發(fā)生劑，由此增強(qiáng)所述抗血管發(fā)生劑的抑制活性。另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測EphB4的方法，所述方法包括在樣品中檢測EphB4-抗EphB4抗體復(fù)合物。術(shù)語"檢測"在用于本文時包括定性的和/或定量的檢測(測量水平)，有或無參照對照，另一方面，本發(fā)明^是供了用于i貪斷與方法，所述方法包括在來自患有或懷疑患有所述病癥的患者的生物學(xué)樣品中檢測EphB4-抗EphB4抗體復(fù)合物。在有些實(shí)施方案中，所述EphB4表達(dá)是升高的表達(dá)或異常的表達(dá)。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是腫瘤、癌癥、和/或細(xì)胞增殖性病癥。另一方面，本發(fā)明提供了任何本文所述抗EphB4抗體，其中所述抗EphB4抗體包含可4企測標(biāo)i己物。另一方面，本發(fā)明提供了任何本文所述抗EphB4抗體與EphB4的復(fù)合物。在有些實(shí)施方案中，所述復(fù)合物是在體內(nèi)的或在體外的。在有些實(shí)施方案中，所述復(fù)合物包含癌細(xì)胞。在有些實(shí)施方案中，所述抗EphB4抗體是可檢測標(biāo)記的。附圖簡述圖l:抗EphB4抗體的重鏈和輕鏈HVR環(huán)序列。該圖顯示了重鏈HVR^列，即H1、H2、和H3，及輕鏈HVR^列，即L1、L2、和L3。序列編號如下克隆30.35(HVR-H1為SEQIDNO:1;HVR-H2為SEQIDNO:3;HVR-H3為SEQIDNO:7;HVR-Ll為SEQIDNO:9;HVR-L2為SEQIDNO:11;HVR-L3為SEQIDNO:13);克隆30.35.1D2(HVR-Hl為SEQIDNO:1;HVR畫H2為SEQIDNO:3;HVR-H3為SEQIDNO:8;HVR-Ll為SEQIDNO:10;HVR-L2為SEQIDNO:12;HVR-L3為SEQIDNO:14);克隆30.35.2D8(HVR-H1為SEQIDNO:2;HVR-H2為SEQIDNO:4;HVR畫H3為SEQIDNO:7;HVR畫Ll為SEQIDNO:9;HVR-L2為SEQIDNO:11;HVR畫L3為SEQIDNO:15);克隆30.35.2D12(HVR-Hl為SEQIDNO:1;HVR-H2為SEQIDNO:5;HVR-H3為SEQIDNO:7;HVR-Ll為SEQIDNO:9;HVR畫L2為SEQIDNO:11;HVR-L3為SEQIDNO:16);而克隆30.35.2D13(HVR-Hl為SEQIDNO:1;HVR-H2為SEQIDNO:6;HVR-H3為SEQIDNO:7;HVR畫L1為SEQIDNO:9;HVR-L2為SEQIDNO:11;HVR-L3為SEQIDNO:17)。氨基酸序列位置依照下述Kabat編號系統(tǒng)進(jìn)行編號。圖2A和2B及圖3描繪了用于實(shí)施本發(fā)明的例示性受體人共有框架序列，序列標(biāo)識符如下重鏈可變(VH)共有框架(圖2A和2B)人VH亞組I共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO:19)人VH亞組I共有框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO:20-22)人VH亞組II共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO:23)人VH亞組II共有框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO:24-26)人亞組亞型III共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO:27)人VH亞組III共有框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO:28-30)人VH受體框架減去KabatCDR(SEQIDNO:31)人VH受體框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO:32-33)人VH受體2框架減去KabatCDR(SEQIDNO:34)人VH受體2框架減去延伸的高變區(qū)(SEQIDNO:35-37)輕鏈可變(VL)共有框架(圖3)人VLK亞組I共有框架(SEQIDNO:38)人VLK亞組II共有框架(SEQIDNO:39)人VLK亞組III共有框架(SEQIDNO:40)人VLK亞組IV共有框架(SEQIDNO:41)圖4描繪了huMAb4D5-8輕鏈和重鏈的框架區(qū)序列。上標(biāo)/粗體的數(shù)值指示依照Kabat的氨基酸位置。圖5描繪了huMAb4D5-8輕鏈和重鏈的修飾的/變異的框架區(qū)序歹寸。上標(biāo)/粗體的數(shù)值指示依照Kabat的氨基酸位置。圖6描繪了抗體克隆30.35、30.35.1D2、30.35.2D8、30.35.2D12、和20.25.2D13的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。圖7:抗EphB4單克隆抗體在基于細(xì)胞的測定法中阻斷EphB4受體信號傳導(dǎo)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了可用于例如治療或預(yù)防與EphB4表達(dá)和/或活性(諸如升高的表達(dá)和/或活性或不想要的表達(dá)和/或活性)有關(guān)的疾病狀態(tài)的抗EphB4抗體。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于治療腫瘤、癌癥、和/或細(xì)胞增殖，性病癥。另一方面，本發(fā)明的抗EphB4抗體可用作檢測和/或分離EphB4的試劑，諸如在各種組織和細(xì)胞類型中檢測EphB4。本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備抗EphB4抗體的方法、及編碼抗EphB4抗體的多核苷酸。通用技術(shù)本文中描述或提到的技術(shù)和規(guī)程一般得到了本領(lǐng)域技術(shù)人員的充分理解，而且通常利用常規(guī)方法得以采用，諸如例如下列文獻(xiàn)中記載的廣泛應(yīng)用的方法Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual3rd.edition(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y;CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel,etal.eds"(2003));叢書METHODSINENZYMOLOGY(AcademicPress,Inc.):PCR2:APRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson,B.D.HamesandG.R.Tayloreds.(1995));HarlowandLane，eds.(1988)ANTIBODIES,ALABORATORYMANUAL;及ANIMALCELLCULTURE(R.I.Freshney,ed.(1987))。定義"分離的"抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指將會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體純化至(l)根據(jù)Lowry法的測定，抗體重量超過95%,最末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選的銀染色，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備。"分離的"核酸分子指已經(jīng)鑒定且與抗體核酸的天然來源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細(xì)胞中時的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分子包括通常表達(dá)該抗體的細(xì)胞中所包含的核酸分子，例如當(dāng)所述核酸分子在所述細(xì)胞中的染色體定位不同于它在天然細(xì)胞中的染色體定位時。術(shù)語"依照Kabat的可變域殘基編號"或"依照Kabat的氨基酸位置編號"及其殳體指Kabatetal"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd-PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD.(1991)中的抗體編輯用于重鏈可變域或輕鏈可變域(variabledomain)的編號系統(tǒng)。使用此編號系統(tǒng)，實(shí)際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸，對應(yīng)于可變域FR或CDR的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包含H2殘基52后的單一氨基酸插入(依照Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat為殘基82a、82b和82c等)。給定抗體的Kabat殘基編號可通過將抗體序列與"標(biāo)準(zhǔn)"Kabat編號序列對比同源區(qū)來確定。短語"基本上相似"或"基本上相同"在用于本文時表示兩個數(shù)值(通常一個涉及本發(fā)明的抗體而另一個涉及參照/比較抗體)之間足夠高的相似程度，以致本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為在用所述數(shù)值(例如Kd值)所測量的生物學(xué)特性背景內(nèi)兩個數(shù)值之間的差異具有很小的或沒有生物學(xué)和/或統(tǒng)計學(xué)顯著性。作為參照/比較抗體該數(shù)值的函數(shù)，所述兩個數(shù)值之間的差異優(yōu)選小于約50%,優(yōu)選小于約40%，優(yōu)選小于約30%，優(yōu)選小于約20%，優(yōu)選小于約10%。"結(jié)合親和力"通常指分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強(qiáng)度。除非另有說明，在用于本文時，"結(jié)合親和力"指反映結(jié)合對的成員(例如抗體與抗原)之間l:l相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通?？捎媒怆x常數(shù)(Kd)來表述。親和力可通過本領(lǐng)域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的。低親和力抗體通常緩慢地結(jié)合抗原且趨于容易解離，而高親和力抗體通常更快速的結(jié)合抗原且趨于保持更長時間的結(jié)合。本領(lǐng)域知道測量結(jié)合親和力的多種方法，其中任一種都可用于本發(fā)明的目的。下文描述了具體的示例性實(shí)施方案。在一個實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的"Kd"或"Kd值"是通過如下測定法所述使用Fab型式的目的抗體及其抗原進(jìn)行的放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測定法(RIA)來測量的通過在存在未標(biāo)記抗原的滴定系列的條件下，用最小濃度的1251標(biāo)記抗原平4軒Fab,然后用抗Fab抗體包被的平板捕捉結(jié)合的抗原來測量Fab對抗原的溶液結(jié)合親和力(Chen，etal.,JMolBiol293:865-881(1999))。為了確定測定條件，用50mM碳酸鈉(pH9.6)中的5(ag/ml捕捉用抗Fab抗體(CappelLabs)包被微量滴定板(Dynex)過夜，隨后用PBS中的2°/。(w/v)牛血清清蛋白于室溫(約23。C)封閉2-5小時。在非吸附平板(Nunc弁269620)中，將100pM或26pM[1251]-抗原與連續(xù)稀釋的目的Fab混合(例如與Prestaetal.,CancerRes.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗體，F(xiàn)ab-12的評估一致)。然后將目的Fab保溫過夜；不過，保溫可持續(xù)更長時間(例如65個小時)以保證達(dá)到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕捉板以進(jìn)行室溫保溫(例如l小時)。然后除去溶液，并用含0.1%Tween-20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150pl/孔閃爍液(MicroScint-20;Packard),然后在Topcount伽馬計數(shù)器(Packard)上對平板計數(shù)IO分鐘。選擇各Fab給出小于或等于最大結(jié)合之20%的濃度用于竟?fàn)幮越Y(jié)合測定法。依照另一實(shí)施方案，Kd或Kd值是通過表面等離振子共振測定法使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.，Piscataway,NJ)于25。C使用固定化抗原CM5芯片在約10個響應(yīng)單位(RU)測量的。簡而言之，依照供貨商的說明書用鹽酸N-乙基-N，-(3-二曱基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧曱基化右旋糖普生物傳感器芯片(CM5，BIAcoreInc.)。用10mM乙酸鈉pH4.8將抗原稀釋至5pg/ml(約0.2pM),然后以5jil/分鐘的流速注入至獲得約10個響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。為了進(jìn)行動力學(xué)測量，于25。C以約25nl/分鐘的流速注入在含0.05%Tween-20的PBS(PBST)中兩倍連續(xù)稀釋的Fab(0.78nM至500nM)。使用簡單一對一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcoreEvaluationSoftwareversion3.2)通過同時擬合結(jié)合和解離傳感圖計算結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)。平衡解離常數(shù)(Kd)以比率koff/k。。計算。參見例如Chen,Y,,etal.，JMolBiol293:865-881(1999)。如果根據(jù)上文表面等離振子共振測定法，結(jié)合速率超過106M-1S"，那么結(jié)合速率可使用熒光淬滅技術(shù)來測定，即根據(jù)分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計(astop-flowequippedspectrophometer)(AvivInstruments)或8000系歹寸SLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯(stirredcuvette)的測量，在存在濃度漸增的抗原的條件下，測量PBS,pH7.2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25。C的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)-295nm;發(fā)射340nm，16nm帶通)的升高或降低。依照本發(fā)明的"結(jié)合速率"(on-rate,rateofassociation,associationrate)或"k。n"也可通過上文所述相同的表面等離振子共振技術(shù)使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway，NJ)于25。C使用固定化抗原CM5芯片在約10個響應(yīng)單位(RU)來測定。簡而言之，依照供貨商的說明書用鹽酸N-乙基-N，-(3-二曱基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧曱基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5,BIAcoreInc.)。用10mM乙酸鈉pH4.8將抗原稀釋至5pg/ml(約0.2(jM),然后以5pl/分鐘的流速注入至獲得約10個響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。為了進(jìn)行動力學(xué)測量，于25。C以約25(il/分鐘的流速注入在含0.050/()Tween-20的PBS(PBST)中兩倍連續(xù)稀釋的Fab(0.78nM至500nM)。使用簡單一對一朗才各謬爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcoreEvaluationSoftwareversion3.2)通過同時擬合結(jié)合和解離傳感圖計算結(jié)合速率(k。J和解離速率(k。ff)。平衡解離常數(shù)(Kd)以比率koff/k。n計算。參見例如Chen，Y.，etal.,JMolBiol293:865-881(1999)。然而，如果根據(jù)上文表面等離振子共振測定法，結(jié)合速率超過106NT1S—'，那么結(jié)合速率優(yōu)選使用焚光淬滅技術(shù)來測定，即根據(jù)分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計(AvivInstruments)或8000系歹'JSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測量，在存在濃度漸增的抗原的條件下，測量PBS，pH7.2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25。C的焚光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)二295nm;發(fā)射340nm，16nm帶通)的升高或降低。術(shù)語"載體"在用于本文時意指能夠運(yùn)輸與其連接的其它核酸的核酸分子。一類載體是"質(zhì)粒"，指其中可連接另外的DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類載體是噬菌體載體。另一類載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動物載體)可在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì)胞的基因組中，由此隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連接的基因表達(dá)。此類載體在本文中稱為"重組表達(dá)載體"(或簡稱為"重組載體")。通常，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體常常是質(zhì)粒形式。在本說明書中，"質(zhì)粒"和"載體"可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常用形式。"多核苷酸"或"核酸"在本文中可互換使用，指任何長度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)過修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物，或者是可通過DNA或RNA聚合酶或者通過合成反應(yīng)摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含經(jīng)過修飾的核苷酸，諸如曱基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對核苦酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在裝配聚合物之前或之后進(jìn)^f亍。核苦酸序列可以由非核普酸組分中斷。多核苷酸可以在合成后進(jìn)一步修飾，諸如通過與標(biāo)記物偶聯(lián)。其它類型的修飾包括例如"帽"，將一個或多個天然存在的核苷酸用類似物替代，核苷酸間修飾諸如例如具有不帶電荷連接(例如膦酸曱酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendantmoiety)諸如例如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)的修飾、具有嵌入劑(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含有烷化劑的修飾、具有經(jīng)修飾連接(例如a端基異構(gòu)核酸(anomericnucleicacid)等)的修飾、以及未修飾形式的多核普酸。另外，通常存在于糖類中的任何羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團(tuán)、磷酸(phosphate)基團(tuán)替換，用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，或活化以制備與別的核香酸的別的連接，或者可偶聯(lián)至固體和半固體支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或1-20個碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)模塊取代。其它羥基也可衍生成標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)。多核苷酸還可含有本領(lǐng)域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的類似物形式，包括例如2'-氧-曱基、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-迭氮-核糖，碳環(huán)糖類似物，a-端基異構(gòu)糖，差向異構(gòu)糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無環(huán)類似物及脫堿基核苷類似物諸如曱基核糖核苷。可用備選連接基團(tuán)替換一個或多個磷酸二酯連接。這些備選連接基團(tuán)包括但不限于以下實(shí)施方案，其中磷酸酯用P(O)S("硫代酸酯"(thioate))、P(S)S("二硫代酸酯"(d他ioate))、(0)NR2("酰胺酯"(amidate))、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2("曱縮醛，，(formacetal))替代，其中R或R'各自獨(dú)立為H或者取代或未取代的烷基(l-20個C)，任選含有醚(-O-)連接、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。前述描述適用于本文中提及的所有多核苦酸，包括RNA和DNA。"寡核苷酸"在用于本文時一般指短的多核苷酸，一般是單鏈，一般是合成的，長度一般但不是必需小于約200個核苷酸。術(shù)語"寡核苷酸"與"多核苷酸"并不互相排斥。上文關(guān)于多核苷酸的描述平等且完全適用于寡核芬酸。關(guān)于肽或多肽序列的"百分比(％)氨基酸序列同一性，，定義為對比序列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與特定肽或多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行，例如使用公眾可得到的計算機(jī)軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定用于測量對比的適宜參數(shù)，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然而，為了本發(fā)明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比較計算機(jī)程序ALIGN-2獲得的，其中下文表A中提供了ALIGN-2程序的完整源代碼。ALIGN-2序列比較計算機(jī)程序由Genentech公司編寫，下文表A所示源代碼已經(jīng)連同用戶文文件一起提交給美國版權(quán)局(USCopyrightOffice,WashingtonD.C.，20559),并以美國版權(quán)注冊號TXU510087注冊。公眾可通過Genentech公司(SouthSanFrancisco,Califomia)得到ALIGN-2程序。ALIGN2程序應(yīng)當(dāng)編譯成在UNIX操作系統(tǒng)，優(yōu)選數(shù)碼UNIXV4.0D上使用。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不變。在采用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列A相對于(to)、與(with)、或針對(against)給定氨基酸序列B的。/。氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對于、與、或針對給定氨基酸序列B的某一。/。氨基酸序列同一性的給定氨基I拼列A)如下計算分?jǐn)?shù)X/Y乘100其中X是由序列對比程序ALIGN-2在該程序的A和B對比中評分為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)，且其中Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)?？梢灶I(lǐng)會，若氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等，貝'jA相對于B的。/。氨基酸序列同一性將不等于B相對于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具體說明，本文中所使用的所有°/。氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2計算機(jī)程序獲得的。術(shù)語"EphB4"(可互換的稱為"EphB4R")，在用于本文時，除非另有明確說明或者上下文另有說明，指任何天然的或變異的(無論是天然的或合成的)EphB4多肽。術(shù)語"天然序列"明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式(例如胞外結(jié)構(gòu)域序列)、天然存在的變異形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。術(shù)語"野生型EphB4"—般指包含天然存在EphB4蛋白的氨基酸序列的多肽。術(shù)語"野生型EphB4序列，，一般指在天然存在EphB4中找到的氨基酸序列。術(shù)語"抗體"和"免疫球蛋白，，以最廣義互換使用，包括單克隆抗體(例如全長或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性)，而且還可以包括某些抗體片段(如本文中更為詳細(xì)描述的)?？贵w可以是人的、人源化的和/或親和力成熟的。術(shù)語"可變的，，指可變域中的某些部分在抗體序列間差異廣泛且用于每種特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或高變區(qū)的三個區(qū)段?？勺冇蛑懈痈叨缺Ｊ氐牟糠址Q作框架(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR區(qū)，它們大多采取|3-折迭片構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成p-折迭片結(jié)構(gòu)一部分的三個CDR連接。每條鏈中的CDR通過FR區(qū)非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的CDR一起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見Kabatdo/.,5^we"c^so/Prafe/ra。//m畫wo/og7'c"http://"/emsA第5版,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞中抗體的參與。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為"Fab"片段，各自具有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)，及一個剩余的"Fc，，片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F(ab')2片段，它具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原。"Fv"是包含完整抗原識別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在雙鏈Fv種類中，此區(qū)由緊密、非共價結(jié)合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv種類中，一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價相連，使得輕鏈和重鏈在與雙鏈Fv種類類似的"二聚體"結(jié)構(gòu)中相結(jié)合。正是在這種構(gòu)造中，各可變域的三個CDR相互作用而在VH-VL二聚體表面上確定了一個抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個CDR共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變域(或只包含對抗原特異的三個CDR的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab'-SH是本文中對其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab')2抗體片段最初是作為在Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊推動物物種的抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈，，可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡巾白(K)和拉姆達(dá)(x)。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作a、5、s、y和P。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。"抗體片段"只包含完整抗體的一部分，其中所述部分優(yōu)選保留該部分存在于完整抗體中時通常與之有關(guān)的至少一項(xiàng)、優(yōu)選大多數(shù)或所有功能?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。在一個實(shí)施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，如此保留結(jié)合抗原的能力。在另一個實(shí)施方案中，抗體片段，例如包含F(xiàn)c區(qū)的抗體片段，保留通常與Fc區(qū)存在于完整抗體中時通常與之有關(guān)的至少一項(xiàng)生物學(xué)功能，諸如FcRn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)控、ADCC功能和補(bǔ)體結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，抗體片段是體內(nèi)半衰期與完整抗體基本上相似的單價抗體。例如，這樣的抗體片段可包含一個抗原結(jié)合臂且其與能夠賦予該片段以體內(nèi)穩(wěn)定性的Fc序列相連。術(shù)語"高變區(qū)"、"HVR"或"HV"在用于本文時指抗體可變域中序列上高度可變和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個高變區(qū)三個在VH中(Hl、H2、H3),三個在VL中(Ll、L2、L3)。本文中使用且涵蓋許多高變區(qū)的敘述。Kabat互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是以序列變異性為基礎(chǔ)的，而且是最常用的(KabatWa/"5"e《wewc&so/尸rate/ra1q/"7mwwwo/og/ca//"&msf,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD.(1991))。Chothia改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(ChothiaandLesk,/Mo/.Ao/.196:901-917(1987))。AbM高變區(qū)代表KabatCDR與Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，而且得到OxfordMolecular的AbM抗體建模軟件的使用。"接觸"高變區(qū)是以對可獲得的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為基礎(chǔ)的。下文記錄了這些高變區(qū)中每一個的殘基。環(huán)KabatAbMChothia4接觸LIL24-L34L24-L34L26-L32L30-L36L2L50-L56L50-L56L50-L52L46-L55L89-L97L89-L97L89-L96mH31-H35BH26-H35BH26-H32H30-H35B(Kabat編號)HIH31-H35H26-H35H26-H32訓(xùn)-H35(Chothia編號)H2H50-H65H50-H58H53-H55H47-H58H3H95-H102H95-H102H96-H101H93-H101高變區(qū)可包括如下"延伸的高變區(qū)"VL中的24-36或24-34(Ll)、46-56或50-56(L2)和89-97(L3)及VH中的26-35(Hl)、50-65或49-65(H2)和93畫102、94-102或95-102(H3)。對于這些定義中的每一個，可變區(qū)殘基是依照Kabat等，見上文編號的。"框架"或"FR"殘基指可變域中除本文中所定義的高變區(qū)殘基外的那些殘基。非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FRA人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見Jones"a/.,A^ww321:522-525(1986);Riechmannda/"淑置332:323-329(1988);和Presta,CwwOp.5Vrw".所o/.2:593-596(l"2)。還可參見以下綜述及其引用的參考文獻(xiàn)VaswaniandHamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998》Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995);HurleandGross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。"嵌合"抗體(免疫球蛋白)中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國專利No.4,816,567;Morrison尸rac.iVaf/.^cad81:6851-6855(1984))。本文中所使用的人源化抗體是嵌合抗體的一個子集。"單鏈Fv，，或"scFv"抗體片段包含抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。一般而言，scFv多肽在VH與V^結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv能夠形成結(jié)合抗原所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pluckthun,在RosenburgandMoore編的《T7zeP/zar,co/ogyo/Mowoc/owa/爿"打7)c^/m》第113巻中，Springer-Verlag，NewYork,pp.269-315(1994)?？乖?指抗體可選擇性結(jié)合的預(yù)定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂質(zhì)、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。優(yōu)選的是，靶抗原是多肽。術(shù)語"雙抗體"指具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(vh-vl)中包含相連的重鏈可變域(vh)和輕鏈可變域(vl)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更完整的記載于例如EP404,097;WO93/11161;Hollingerea/"Prac.脂/.」cat/.園90:6444-6448(1993)。"人抗體"指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應(yīng)的氨基酸序列和/定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。"親和力成熟的"抗體指在抗體的一個或多個CDR中具有一處或多處改抗體。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領(lǐng)域已知身見程來生成。Marksea/.,^o/rec/zrto/ogy10:779-783(1992)記載了通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組進(jìn)行的親和力成熟。以下文獻(xiàn)記載了CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變Barbas&a/.，尸rac.」cad5W.L/5"v491:3809-3813(1994);Schier"a/"169:147-155(1995);Yelton^a/.，//mm,/.155:1994-2004(1995);JacksonWa/"http://Immunol/.154(7):3310-9(1995);Hawkinsetal.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。抗體"效應(yīng)器功能"指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))且隨抗體同種型而變化的生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)器功能的例子包括Clq結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)下調(diào)；和B細(xì)月包活4t。"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性"或"ADCC"指其中結(jié)合到某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型Ig使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細(xì)胞，隨后用細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性形式。該抗體"武裝"(arm)細(xì)胞毒性細(xì)胞，而且是此類殺傷作用絕對要求的。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK纟田月包，只表達(dá)FcyRffl，而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、FcyRII和FcyRIII。RavetchandKinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464頁表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC測定法，諸如美國專利No.5,500,362或5,821,337或Presta美國專利No.6,737,056中所記載的?？捎糜诖祟悳y定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。或者/另外，可在體內(nèi)評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynesetal.,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。"人效應(yīng)細(xì)胞"指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。優(yōu)選的是，該細(xì)胞至少表達(dá)FcyRIII并行使ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單個核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來源分離，例如血液。"Fc受體"或"FcR"描述結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR(Y受體)，包括FcyRI、FcyRII和FcYRIII亞類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA("活化受體")和FcyRIIB("抑制受體")，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中。活化受體FcYRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcYRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見綜述Dagron，Wev./mmw"o/.15:203-234(1997))。FcR的綜述參見RavetchandKinet,Tev./mmwwo/.9:457-492(1991);Capela/.，Immunomethods4:25-34(1994);deHaas"a/.，J丄W.C7/".Md.126:330-41(1995)。術(shù)語"FcR，，在本文中涵蓋其它FcR，包括那些未來將會鑒定的。該術(shù)語還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn，它負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(GuyerWa/.，J!/wmw"o/.117:587(1976)和Kim""/.，//mmw"o/.24:249(1994))并調(diào)節(jié)免疫球蛋白的動態(tài)平衡。WO00/42072(Presta)記載了對FcR的結(jié)合提高或降低的抗體變體。在此明確收入該專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見Shields&a/.，《/所o/.C/zew.9(2):6591-6604(2001)。測量對FcRn的結(jié)合的方法是已知的(參見例如Ghetie1997，Hinton2004)?？蓽y定人FcRn高親和力結(jié)合多肽與人FcRn的體內(nèi)結(jié)合和血清半衰期，例如在表達(dá)人FcRn的轉(zhuǎn)基因小鼠或經(jīng)轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞系中，或者在施用了Fc變體多肽的靈長類動物中。"補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性"或"CDC"指存在補(bǔ)體時對耙細(xì)胞的溶解。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的啟動是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原所結(jié)合的抗體(適宜亞類的)起始的。為了評估補(bǔ)體啟動，可進(jìn)行CDC測定法，例如如Gazzano-SantorodTwmimo/.A/^/zoA202:163(1996)中所i己載的。具有更改的Fc區(qū)氨基酸序列及提高或降低的Clq結(jié)合能力的多肽變體記載于美國專利No.6,194,551Bl和WO99/51642。在此明確收入那些專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見Idusogieetal,J,Immunol.164:4178-4184(2000)。含"Fc區(qū)多肽"指包含F(xiàn)c區(qū)的多肽，諸如抗體或免疫粘附素(見下文定義)。Fc區(qū)的C-末端賴氨酸(依照EU編號系統(tǒng)的殘基447)可以消除，例如在純化多肽的過程中或者通過重組改造編碼多肽的核酸。因此，依照本發(fā)明包含具有Fc區(qū)的多肽的組合物可包含具有K447的多肽、消除了所有K447的多肽、或具有與沒有K447殘基的多肽的混合物。"阻斷性"抗體或"拮抗性"抗體(antagonistantibody)指抑制或降低其所結(jié)合的抗原的生物學(xué)活性的抗體。優(yōu)選的阻斷性抗體或拮抗性抗體實(shí)質(zhì)或完全抑制抗原的生物學(xué)活性。"激動性抗體(agonistantibody)"在用于本文時指模擬目的多肽的至少一項(xiàng)功能性活性的抗體。34就本文目的而言，"受體人框架"是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架之氨基酸序列的框架。"衍生自，，人免疫球蛋白框架或人共有框架的受體人框架可包含與之相同的氨基酸序列，或者可包含預(yù)先存在的氨基酸序列變化。當(dāng)存在預(yù)先存在的氨基酸變化時，優(yōu)選存在不超過5個，優(yōu)選4個或更少，或者3個或更少預(yù)先存在的氨基酸變化。當(dāng)VH中存在預(yù)先存在的氨基酸變化時，優(yōu)選那些變化只位于71H、73H和78H中的三個、兩個或一個位置；例如，位于那些位置的氨基酸殘基可以是71A、73T和/或78A。在一個實(shí)施方案中，VL受體人框架在序列上與VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。"人共有框架，，指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列選集中最常見的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列選集來自可變區(qū)序列亞型。通常，序列亞型是如Kabat等人的亞型。在一個實(shí)施方案中，對于VL,亞型是如Kabat等人的亞型Kl。在一個實(shí)施方案中，對于VH，亞型是如Kabat等人的亞型III。"VH亞組III共有框架，，包含從Kabat等人的可變重鏈亞型III中的氨基酸序列獲得的共有序列。在一個實(shí)施方案中，VH亞型III共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整個全部EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQIDNO:42)-HI-WVRQAPGKGLEWV(SEQIDNO:43)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQ畫SLRAEDTAVYYC(SEQIDNO:44)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQIDNO:45)。"VL亞組I共有框架，，包含從Kabat等人的可變輕鏈K亞型I中的氨基酸序列獲得的共有序列。在一個實(shí)施方案中，VL亞型I共有框架氨基酸序列包含下列各序列的至少一部分或整個DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQIDNO:46)畫Ll-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQIDNO:47)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQIDNO:48)-L3-FGQGTKVEIK(SEQIDNO:49)。"病癥"或"疾病"指任何會受益于本發(fā)明的物質(zhì)/分子或方法的治療的疾患。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動物傾向于所討論病癥的病理狀況。本文中待治療的病癥的非限制性例子包括惡性和良性腫瘤；癌、母細(xì)月包瘤、和肉瘤。術(shù)語"細(xì)胞增殖性病癥"和"增殖性病癥"指與一定程度的異常細(xì)胞增殖有關(guān)的病癥。在一個實(shí)施方案中，細(xì)胞增殖性病癥指癌癥。"肺瘤"在用于本文時指所有腫瘤性細(xì)胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細(xì)胞和組織。術(shù)語"癌癥"、"癌性"、"細(xì)胞增殖性紊亂"、"增殖性紊亂"和"腫瘤"在本文中提到時并不互相排斥。術(shù)語"癌癥"和"癌性"指向或描述哺乳動物中特征通常為細(xì)胞生長/增殖不受調(diào)控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌、肺的鱗癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、曱狀腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、胃癌、黑素瘤、及各種類型的頭和頸癌。這些病癥包括非腫瘤性的和腫瘤性的疾患。腫瘤性病癥包括但不限于上文所描述的那些。非腫瘤性病癥包括但不限于不想要的或異常的肥大、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、銀屑病、銀屑病斑塊、結(jié)節(jié)病、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑塊、糖尿病性和其它增殖性視網(wǎng)膜病包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織增生、年齡相關(guān)黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜新血管形成、眼角的新血管形成(發(fā)紅)、眼新血管疾病、血管再狹窄、動靜脈畸形(AVM)、腦脊膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、曱狀腺增生(包括格雷夫斯氏(Graves)病)、角膜和其它組織移植、慢性炎癥、肺炎、急性肺損傷/ARDS、敗血癥、原發(fā)性肺動3永高壓、惡性肺積液(malignantpulmonaryeffiision)、腦水胂(例如與急性中風(fēng)/閉合性頭部外傷/創(chuàng)傷有關(guān)的)、滑液炎癥、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨關(guān)節(jié)炎(OA)、頑固性腹水、多嚢卵巢病、子宮內(nèi)膜異位癥、第三空間流體病(3rdspacingoffluiddiseases)(胰腺炎、間隔綜合征、燒傷、腸病)、子宮纖維瘤(uterinefibroids)、早產(chǎn)、慢性炎癥諸如IBD(克羅恩氏(Crohn)病和潰瘍性結(jié)腸炎)、腎同種異體移植物排斥、炎性腸病、腎病綜合征、不想要的或異常的組織塊生長(非癌性的)、血友病性關(guān)節(jié)、肥厚性瘢痕、毛發(fā)生長的抑制、奧-韋二氏(Osler-Weber)綜合征、膿性肉芽腫晶狀體后纖維組織增生、硬皮病、沙眼、血管粘連、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積液(諸如與心包炎有關(guān)的)和胸腔積液。在用于本文時，"治療"或"處理"指試圖改變所治療個體或細(xì)胞的自然進(jìn)程的臨床干預(yù)，可以是為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的進(jìn)程中進(jìn)行。治療的期望效果包括預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、緩解癥狀、削弱疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果、預(yù)防轉(zhuǎn)移、減緩疾病進(jìn)展的速率、改善或減輕疾病狀態(tài)、及免除或改善預(yù)后。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于延遲疾病或病癥的發(fā)生/發(fā)展。術(shù)語"神經(jīng)變性疾病"和"神經(jīng)變性病癥"以最廣義使用，包括其病理學(xué)涉及神經(jīng)原變性和/或功能障礙的所有病癥，包括但不限于周圍神經(jīng)病；運(yùn)動神經(jīng)元病癥，諸如月幾萎縮側(cè)索硬化(amylotrophiclateralsclerosis)(ALS,LouGehrig氏病)、貝耳氏(Bell)麻痹、和涉及脊髓性肌萎縮或麻痹的各種疾患；及其它人神經(jīng)變性疾病，諸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、癲癇、多發(fā)性硬化、亨廷頓氏舞蹈癥、唐氏綜合征、神經(jīng)性聾、和梅尼爾氏(Meniere)病。"周圍神經(jīng)病"指影響周圍神經(jīng)的神經(jīng)變性病癥，最常表現(xiàn)為運(yùn)動、感覺、感覺運(yùn)動、或自主功能障礙中的一項(xiàng)或組合。周圍神經(jīng)病可以是例如通過遺傳獲得的，可以源自系統(tǒng)疾病，或者可以是毒劑諸如神經(jīng)毒性藥物例如抗腫瘤劑或者工業(yè)或環(huán)境污染物誘發(fā)的。"周圍感覺神經(jīng)病"的特征為周圍感覺神經(jīng)元的變性，這可以是特發(fā)性的，可以是作為例如糖尿病(糖尿病性神經(jīng)病)、癌癥的細(xì)胞抑制藥療法(例如使用化療劑的治療，諸如長春新堿、順鉑、曱氨蝶呤、3'-迭氮-3'-脫氧胸苷、或紫杉烷，例如帕利他塞(paclitaxel)[TAXOL,Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N丄]和多西他塞(doxetaxel)[TAXOTERE,Rh6ne-PoulencRorer,Antony,France])、酒精中毒、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、或遺傳素因(geneticpredisposition)的后果而發(fā)生的。通過遺傳獲得的周圍神經(jīng)病包括例如雷弗素姆氏(Refsum)病、克臘比氏(Krabbe)病、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、法布里氏(Fabry)病、代-索二氏(Dejerine-Sottas)綜合征、無卩脂蛋白血癥、和夏科-馬里-圖思(Charcot-Marie-Tooth,CMT)病(也稱為Proneal肌萎縮或遺傳性運(yùn)動感覺神經(jīng)病(HMSN))。大多數(shù)類型的周圍神經(jīng)病緩慢發(fā)生/發(fā)展，病程數(shù)月或數(shù)年。在臨床實(shí)踐中，此類神經(jīng)病稱作慢性的。有時周圍神經(jīng)病快速發(fā)生/發(fā)展，病程數(shù)天，稱作急性的。周圍神經(jīng)病常常一起影響感覺和運(yùn)動神經(jīng)，從而引起混合型感覺和運(yùn)動神經(jīng)病，但是純感覺的和純運(yùn)動的神經(jīng)病也是已知的。"個體"指脊推動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人。哺乳動物包括，但不限于，牲畜(諸如牛)、運(yùn)動用動物、寵物(諸如貓、犬、和馬)、靈長類動物、小鼠和大鼠。為了治療的目的，"哺乳動物"指歸入哺乳類的任何動物，包括人，家畜和牲畜，及動物園、運(yùn)動或?qū)櫸飫游铮T如犬、馬、貓、牛等。優(yōu)選的是，哺乳動物指人。"有效量"指在必需的劑量和時間上有效實(shí)現(xiàn)期望的治療或預(yù)防效果的量。本發(fā)明的物質(zhì)/分子、拮抗劑或激動劑的"治療有效量"可才艮據(jù)諸如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重及該物質(zhì)/分子、激動劑或拮抗劑在個體中引發(fā)期望應(yīng)答的能力等因素而變化。治療有效量還指該物質(zhì)/分子、激動劑或拮抗劑的治療有益效果勝過任何有毒或有害后果的量。"預(yù)防有效量"指在必需的劑量和時間上有效實(shí)現(xiàn)期望的預(yù)防效果的量。通常而非必然，由于預(yù)防劑量是在疾病發(fā)作之前或在疾病的早期用于受試者的，因此預(yù)防有效量將低于治療有效量。術(shù)語"細(xì)胞毒劑，，在用于本文時指抑制或防止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y9Q、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素；化療劑，例如曱氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、長春花生物堿類(vincaalkaloids)(長春新石咸(vincristine)、長春石咸(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil),柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗腫瘤藥或抗癌藥。下文記載了其它細(xì)胞毒劑。殺腫瘤藥引起胂瘤細(xì)胞的破壞。"化療劑"指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊?alkylatingagents)，諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);石黃酸義克基酉旨類(alkylsulfonates),i者如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和p瓜泊舒凡(piposulfan);氮丙"定類(aziridines),i者》口苯佐替;泉(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替》泉(uredepa);乙撐亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamines)，包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐石克代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥曱蜜胺(trimethylolomelamine);番茶枝內(nèi)酉旨類(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));S-9-四氬大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol),MARINOL);(3-#:帕醌(lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙素類(colchicines);白樺脂酸(betulinicacid);喜樹石威(camptothecin)(包4舌合成類4以物才乇泊#齊康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-ll(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜樹堿、東莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊苦(teniposide);隱藻素類(cryptophycins)(4爭另ll是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海纟帛抑素(spongistatin);氮芥類(nitrogenmustards),i者如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮齊(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲石粦胺(trofosfamide)、尿嘧卩定氮芥(uracilmustard);亞硝'脲類(nitrosoureas),i者如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素yll和加利車霉素coll(參見例如Agnew，CTzew.五d33:183-186(1994));蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括dynemicinA;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin),放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、；也4乇t匕星(detorubicin)、6畫二氛-5-氧-L-正亮氛酸、ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、噪呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類，諸如曱氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物，諸如二曱葉酸(denopterin)、曱氨蟲萊令(methotrexate)、蟲萊羅p令(pteropterin)、三曱曲沙(trimetrexate);噪呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基噤呤(mercaptopurine)、碌^咪噤呤(thiamiprine)、硫鳥噪呤(thioguanine);嘧咬類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎月包普(azacitidine)、6-氮尿苦(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、脫氧氟尿苦(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿普(floxuridine);雄激素類，i者^口卡魯睪酉同(calusterone)、丙酸屈他名,酉同(dromostanolonepropionate)、表石克雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone);抗腎上腺類，i者^口氨魯米特(aminoglutethimide)、米4乇坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸(folinicacid);醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone);醛磷酰胺糖普(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);恩尿口密咬(eniluracil);安吖口定(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依達(dá)曲沙(edatraxate);地石粦酰胺(defosfamide);i也美可辛(demecolcine);i也吖極(diaziquone);elfornithine;依利醋按(elliptiniumacetate);》矣》皮審素(epothilone);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼達(dá)明(lonidamine);美登木素生4勿石威類(maytansinoids)，i者長o美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin);米4乇脈月宗(mitoguazone);米4乇蒽酷(mitoxantrone);莫p瓜達(dá)醇(mopidamol);二胺硝吖口定(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2匿乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK多糖復(fù)合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);才艮霉素(rhizoxin);西佐響(sizofiran);螺旋鍺(spirogermanium);纟田交鏈孢菌酮酸(tenuazonicacid);三亞胺酉昆(triaziquone);2，2'，2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、祝孢菌素(verrucarin)A、桿孑包菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN);達(dá)卡巴口秦(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);卩瓜泊溴》克(pipobroman);gacytosine;阿沖唐月包香(arabinoside)("Ara-C");塞替派(thiotepa);類紫杉醇類(taxoids)，例如TAXOL⑧帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造納米顆粒劑型帕利他塞(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE多西他塞(doxetaxel)(Rh6ne-PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR);6-石克烏噪呤(thioguanine);巰基嘌呤(mercaptopurine);曱氨蟲萊p令(methotrexate);柏類似物，諸如順鉑(cisplatin)和卡鈿(carboplatin);長春石咸(vinblastine)(VELBAN);鈾(platinum);依4乇泊普(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);長春新石威(vincristine)(ONCOVIN);奧沙利柏(oxaliplatin);亞葉酸(leucovorin);長春瑞濱(vinorelbine)(NAVELBINE);能滅瘤(novantrone);依達(dá)曲沙(edatrexate);道諾霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);伊本膦酸鹽(ibandronate);拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥氨酸(DMFO);類視黃酸類(retinoids),i者長口#見黃酉交(retinoicacid);卡J咅4也濱(capecitabine)(XELODA);任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物；以及兩種或多種上述物質(zhì)的組合，諸如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATINTM)聯(lián)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。該定義還包括起調(diào)節(jié)、降低、阻斷或抑制可促進(jìn)癌生長的激素效果作用的抗激素劑，且常常是系統(tǒng)或全身治療的形式。它們自身可以是激素。例子包括抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧他莫昔芬)、EVISTA⑧雷洛昔芬(mloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene);抗孕酮類；雌激素受體下調(diào)劑類(ERD);起抑制或關(guān)閉卵巢作用的藥劑，例如促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動劑，諸如LUPRON⑧和ELIGARD醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞4木(buserelinacetate)和曲普瑞林(triptorelin);抗名,激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);其它抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE⑧醋酸曱地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR⑧伏氯唑(vorozole)、FEMARA來曲唑(letrozole)和ARIMIDEX⑧阿那曲唑(anastrozole)。另夕卜，化療劑的這種定義包括二膦酸鹽類(bisphosphonates),諸如氯膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS⑧或OSTAC⑧)、DIDROCAL⑧依替膦酸鹽(etidronate)、NE誦58095、ZOMETA⑧唑來膦酸/唑來膦酸鹽(zoledronicacid/zoledronate)、FOSAMAX阿倫膦酸鹽(alendronate)、AREDIA⑧帕米膦酸鹽(pamidronate)、SKELID⑧替魯膦酸鹽(tiludronate)或ACTONEL⑧利塞膦酸鹽(risedronate);以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是那些抑制涉及粘著細(xì)胞增殖的信號傳導(dǎo)途經(jīng)中的基因表達(dá)的反義寡核香酸，諸如例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗，諸如THERATOPE疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗和VAXID⑧疫苗；LURTOTECAN⑧拓樸異構(gòu)酶l抑制劑；ABARELIXrmRH;lapatinibditosylate(ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016);及任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受的鹽、酸或書t生物。"生長抑制劑"在用于本文時指在體外或在體內(nèi)抑制細(xì)胞(諸如表達(dá)EphB4的細(xì)胞)生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低處于S期的細(xì)胞(諸如表達(dá)EphB4的細(xì)胞)百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞周期行進(jìn)(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春藥類(vincas)(長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine))、紫杉烷類(taxanes)、和拓樸異構(gòu)酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯G1的藥劑也溢出進(jìn)入S期停滯，例如DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達(dá)卡巴口秦(dacarbazine)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、順鉑(cisplatin)、曱氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可參見《TheMolecularBasisofCancer》，Mendelsohn和Israel編，第1章，題為"Cellcycleregulation,oncogenes,andantieioplasticdrugs",Murakaini等人，WBSaunders,Philadelphia,1995，尤其是第13頁。紫杉烷類(紫杉醇(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel))是衍生自紫杉樹的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他賽(TAXOTERE⑧，Rhone-PoulencRorer)是紫杉醇(TAXOL⑧，Bristol-MyersSquibb)的半合成類似物。紫杉醇和多西他賽促進(jìn)由微管蛋白二聚體裝配成微管并通過防止解聚使;微管穩(wěn)定，導(dǎo)致對細(xì)胞中有絲分裂的抑制。"多柔比星(Doxorubicin)"是蒽環(huán)類抗生素。多柔比星的完整化學(xué)名是(8S-順式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脫氧-a-L-來蘇-吡喃己糖基)氧基]-7，8,9，10-四氬-6,8,11-三羥基-8-(羥基乙酰基)-1-曱氧基-5,12-萘二酮。(8S隱cis)一10-[(3-amino-2，3,6-trideoxy-a—L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]陽7,8,9，10-tetrahydro畫6,8，11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-naphthacenedione術(shù)語"抗腫瘤組合物"指可用于治療癌癥的組合物，其包含至少一種活性治療劑，例如"抗癌劑"。治療劑(抗癌劑，在本文中也稱為"抗肺瘤劑，，)的例子包括但不限于例如化療劑、生長抑制劑、細(xì)胞毒劑、放射療法中所使用的藥劑、抗血管發(fā)生劑、凋亡劑、抗微管蛋白劑、毒素、和其它用于治療癌癥的藥劑例如抗VEGF中和性抗體、VEGF拮抗劑、抗HER-2、抗CD20、表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪氨酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑、erlotinib、COX-2抑制劑(例如塞來考昔(celecoxib))、干擾素、細(xì)胞因子、能與ErbB2、ErbB3、ErbB4、或VEGF受體中的一種或多種靶物結(jié)合的拮抗劑(例如中和性抗體)、血小板衍生生長因子(PDGF)和/或干細(xì)胞因子(SCF)的受體酪氨酸激酶的抑制劑(例如曱磺酸伊馬替尼(imatinibmesylate)(GleevecNovartis))、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有機(jī)化學(xué)劑等。術(shù)語"前體藥物"在用于本申請時指與母藥(parentdrug)相比對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小并能夠酶促活化或轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚阅杆幮问降乃幱没钚晕镔|(zhì)的前體或書t生物形式。參見例如Wilman"ProdrugsinCancerChemotherapy",BiochemicalSocietyTransactions,14，pp.375-382，615thMeetingBelfast(1986)和Stella等"Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery",DirectedDrugDelivery,Borchardt等，編，pp.247-267，HumanaPress(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽/酯前體藥物、含硫代磷酸鹽/酯前體藥物、含硫酸鹽/酯前體藥物、含肽前體藥物、D-氨基酸修飾前體藥物、糖基化前體藥物、含(3-內(nèi)酰胺前體藥物、含任選取代苯氧基乙酰胺的前體藥物或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物、可轉(zhuǎn)化為更具活性而無細(xì)胞毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明使用的前體藥物形式的細(xì)胞毒性藥物的例子包括但不限于上文描述的那些化療劑。"抗血管發(fā)生劑，，或"血管發(fā)生抑制劑，，指或直接或間接抑制血管發(fā)生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物質(zhì)、多核苷酸、多肽、分離的蛋白質(zhì)、重組蛋白、抗體、或其偶聯(lián)物或融合蛋白。例如，抗血管發(fā)生劑是上文定義的血管發(fā)生劑的抗體或其它拮抗劑，例如VEGF的抗體、VEGF受體的抗體、阻斷VEGF受體信號傳導(dǎo)的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(sunitinibmalate)、AMG706)。抗血管發(fā)生劑還包括天然血管發(fā)生抑制劑，例如血管他丁(angiostatin)、內(nèi)皮4也丁(endostatin)等。參見例戈口KlagsbrunandD，Amoreiev.戶/y^'o/.53:217-39(1991);StreitandDetmarO"coge"e22:3172-3179(2003)(例如列舉惡性黑素瘤中抗血管發(fā)生療法的表3);Ferrara&Alitalo淑,MWc/"e5(12):1359-1364(1999);Tonini等O腳g騰22:6549-6556(2003)(例如列舉抗血管發(fā)生因子的表2);SatoCY/".(9"co/.8:200-206(2003)(例如列舉臨床試驗(yàn)中所使用的抗血管發(fā)生劑的表1)。本發(fā)明的組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涵蓋包含抗EphB4抗體的組合物，包括藥用組合物；及包含抗EphB4抗體編碼序列的多核苷酸。在用于本文時，組合物包含一種或多種結(jié)合EphB4的抗體，和/或一種或多種包含編碼一種或多種結(jié)合EphB4的抗體的序列的多核苷酸。這些組合物可進(jìn)一步包含合適的載體，諸如制藥學(xué)可接受的賦形劑，包括緩沖劑，它們是本領(lǐng)域眾所周知的。本發(fā)明還涵蓋分離的抗體和多核苷酸的實(shí)施方案。本發(fā)明還涵蓋基本上純的抗體和多核苷酸的實(shí)施方案。本發(fā)明的抗EphB4抗體優(yōu)選是單克隆的。本發(fā)明的范圍還涵蓋本文中所提供的抗EphB4抗體的Fab、Fab'、Fab'-SH和F(ab')2。這些抗體片段可通過常規(guī)手段來創(chuàng)建，諸如酶促消化，或者可以通過重組技術(shù)來生成。此類抗體片段可以是嵌合的或人源化的。這些片段可用于下文所列的診斷和治療目的。單克隆抗體是由一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的，即構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變。由此，修飾語"單克隆"指明抗體的特征，即不是不同的或多克隆的抗體的混合物。本發(fā)明的抗EphB4單克隆抗體可使用最初由Kohler"a/.,A^ww256:495(1975)記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法(美國專利No.4,816,567)來制備。在雜交瘤方法中，免疫小鼠或其它適宜的宿主動物，諸如倉鼠，以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體將特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)。EphB4的抗體一般通過在動物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射EphB4和佐劑來生成。EphB4可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法來制備，其中有些方法在本文中有描述。例如，EphB4的重組生產(chǎn)在下文中有描述。在一個實(shí)施方案中，將動物用包含EphB4胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)且其融合至免疫球蛋白重鏈Fc部分的EphB4書f生物免疫。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，將動物用EphB4-IgGl融合蛋白免疫。動物通常針對EphB4的免疫原性偶聯(lián)物或衍生物用單磷酰脂質(zhì)A(MPL)/trehalosedicrynomycolate(TDM)(RibiImmunochem.Research,Inc.,Hamilton,MT)進(jìn)行免疫，溶液皮內(nèi)注射于多個部位。2周后，對動物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。7-14天后，對動物采血，并測定抗EphB4滴度。對動物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滴度達(dá)到平臺(plateaus)?；蛘?，可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding,Mo"oc/o"a/7V/w一/esaw/尸rac"ce,pp.59-103，AcademicPress,1986)。將如此制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，若親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤鳥噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT),則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的將含有次黃噤呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水平生成抗體、并對諸如HAT培養(yǎng)基的培養(yǎng)基敏感的。在這些細(xì)胞中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，諸如那些可從索爾克研究所細(xì)胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego，California,USA)獲得的MOPC-21和MPC-ll小鼠腫瘤及可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville，Maryland,USA)獲得的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也已記載用于生成人單克隆抗體(Kozbor,/m騰wo/.133:3001(1984);Brodeurda/"Mowoc/owa/Jw"7o辦/Voc/wWow7^c/m一es(3w<i^p/Zc加'ora，pp.51-63，MarcelDekker，Inc.,NewYork,1987)?？蓪﹄s交瘤細(xì)胞正在其中生長的培養(yǎng)液測定針對EphB4的單克隆抗體的生成。優(yōu)選的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定法，諸如放射免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA),測定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。單克隆4元體的纟吉合親禾口力可通過例^口MunsonC"/.，^"a/.107:220(1980)的Scatchard分析來測定。在鑒定得到生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，該克隆可通過有限稀釋規(guī)程進(jìn)行亞克隆并通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，Mowoc/ow"/^w打》c^w/V/w一/es朋dPraWce，pp,59-103，AcademicPress,1986)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可在動物中作為腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)?？赏ㄟ^常規(guī)免疫球蛋白純化規(guī)程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)液、腹水或血清適當(dāng)分開。本發(fā)明的抗EphB4抗體可以通過使用組合庫篩選具有期望活性的合成抗體克隆來創(chuàng)建。在原理上，通過篩選噬菌體文庫來選擇合成抗體克隆，所述噬菌體文庫含有展示融合至噬菌體外殼蛋白的各種抗體可變區(qū)(Fv)片段的噬菌體。通過針對所需抗原的親和層析淘選此類噬菌體文庫。表達(dá)能夠結(jié)合所需抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，從而與文庫中不結(jié)合的克隆分開。然后將結(jié)合的克隆從抗原上洗脫，而且可以通過額外的抗原吸附/洗脫循環(huán)進(jìn)一步富集。本發(fā)明的任何抗EphB4抗體可以如下獲得，即設(shè)計合適的抗原篩選規(guī)程來選擇感興趣的噬菌體克隆，接著使用來自感興趣的噬菌體克隆的Fv序歹寸和Kabatetal"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991)，vols,l-3中記載的合適的恒定區(qū)(Fc)序列構(gòu)建全長抗EphB4抗體克隆?？贵w的抗原結(jié)合域由兩個約110個氨基酸的可變(V)區(qū)形成，分別來自重鏈(VL)和輕鏈(VH),都呈現(xiàn)三個高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?？勺冇蚩梢怨δ苄缘恼故驹谑删w上，或是作為單鏈Fv(scFv)片段(其中VH和VL通過短的、柔性的接頭共價相連)，或者作為Fab片段(其中它們各自與恒定域融合且非共i"介相互作用)，如Winteretal.，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。在用于本文時，編碼scFv的噬菌體克隆和編碼Fab的噬菌體克隆統(tǒng)稱為"Fv噬菌體克隆"或"Fv克隆"。VH和VL基因的全集可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分開克隆，并在噬菌體文庫中隨機(jī)重組，然后可以搜索抗原結(jié)合克隆，如Winteretal.，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。來自經(jīng)免疫來源的文庫能提供對免疫原有高親和力的抗體，無需構(gòu)建雜交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于為廣泛的非自身的及自身的抗原提供單一人抗體來源，無需任何免疫，如Griffithsetal.，EMBOJ，12:725-734(1993)所述。最后，未免疫的文庫還可以以合成方式來構(gòu)建，即從干細(xì)胞克隆未重排的V基因，并使用包含隨機(jī)序列的PCR引物來編碼高度可變的CDR3區(qū)及用來在體外實(shí)現(xiàn)重排，如HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol"227:381-388(1992)所述。通過與次要外殼蛋白pIII融合，使用絲狀噬菌體來展示抗體片段。抗體片段可以展示為單鏈Fv片段，其中VH與VL結(jié)構(gòu)域通過柔性多肽間隔物在同一多肽鏈上相連，例如如Marksetal.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者展示為Fab片段，其中一條鏈與pIII融合，另一條鏈分泌到細(xì)菌宿主細(xì)胞周質(zhì)中，在此裝配Fab-外殼蛋白結(jié)構(gòu)，其通過取代一些野生型外殼蛋白而展示在p藍(lán)菌體表面上，侈寸^口^口Hoogenboometal.，Nucl.AcidsRes.,19:4133-4137(1991)所述。酸。如果希望文庫偏向抗EphB4克隆，那么可以給受試者免疫EphB4以產(chǎn)生文庫構(gòu)建。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，如下得到了偏向抗EphB4克隆的人抗體基因片段文庫，即在攜帶功能性人免疫球蛋白基因陣列(且缺乏功能性內(nèi)源抗體生成系統(tǒng))的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生抗EphB4抗體應(yīng)答，使得EphB4免疫產(chǎn)生生成針對EphB4的人抗體的B細(xì)月包。生成人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的生成在下文中有描述?？梢匀缦芦@得抗EphB4反應(yīng)性細(xì)胞群的進(jìn)一步富集，即使用合適的篩選規(guī)程來分離表達(dá)EphB4特異性膜結(jié)合抗體的B細(xì)胞，例如通過用EphB4親和層析進(jìn)行的細(xì)胞分離或者細(xì)胞對熒光標(biāo)記的EphB4的吸附及后續(xù)的熒光激活細(xì)胞分選CFACS;)。能的抗體全集的更佳展現(xiàn)，而且還容許使用EphB4在其中沒有抗原性的動物(人或非人的)物種構(gòu)建抗體文庫。為了構(gòu)建摻入體外抗體基因的文庫，從受試者收獲干細(xì)胞以提供編碼未重排抗體基因區(qū)段的核酸?？梢詮亩喾N動物物種(諸如人、小鼠、大鼠、兔類、luprine、犬、貓、豬、牛、馬、和禽類等)獲得感興趣的免疫細(xì)胞。從感興趣的細(xì)胞回收編碼抗體可變基因區(qū)段(包括VH和VL區(qū)段)的核酸并擴(kuò)增。就重排的VH和VL基因文庫而言，可以如下獲得所需DNA，即從淋巴細(xì)胞分離基因組DNA或mRNA，接著用與重排的VH和VL基因的5'和3'末端匹配的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，如Orlandietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:3833-3837(1989)所述，由此構(gòu)建多樣性V基因全集供表達(dá)?？梢詮腸DNA和基因組DNA擴(kuò)增V基因，反向引物位于編碼成熟V結(jié)構(gòu)域的外顯子的5'末端，正向引物基于J區(qū)段內(nèi)部，如Orlandietal.(1989)和Wardeta1.，Nature,341:544-546(1989)所述。然而，為了從cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，反向引物還可基于前導(dǎo)外顯子內(nèi)，如Jonesetal.,Biotechnol.，9:88-89(1991)所述，正向引物基于恒定區(qū)內(nèi)，如Sastryetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86:5728-5732(1989)所述。為了使互補(bǔ)性最大化，引物中可以摻入簡并性，如Orlandietal.(1989)或Sastryeta1.(1989)所述。優(yōu)選的是，如下將文庫多樣性最大化，即使用靶向每個V基因家族的PCR引物來擴(kuò)增免疫細(xì)胞核酸樣品中存在的所有可獲得的VH和VL重排，例如如Marksetal.,J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)或Orumetal.，NucleicAcidsRes.,21:4491-4498(1993)所述。為了將所擴(kuò)增的DNA克隆到表達(dá)載體中，可以在PCR弓1物的一端引入罕見的限制性位點(diǎn)作為標(biāo)簽，如Orlandietal.(1989)所述，或者用帶標(biāo)簽的引物進(jìn)行進(jìn)一步的PCR擴(kuò)增，如Clacksonetal.，Nature,352:624-628(1991)所述。合成重組的V基因全集可以在體外從V基因區(qū)段衍生。大多數(shù)人VR4因區(qū)段已經(jīng)克隆和測序(Tomlinsonetal"J.Mol.Biol.,227:776-798(1992)),并定位(Matsudaetal.，NatureGenet"3:88-94(1993》;這些克隆的區(qū)段(包括H1和H2環(huán)的所有主要構(gòu)造)可用于生成多樣性VR&因全集，用到編碼序列和長度多樣性的H3環(huán)的PCR引物，如HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。VH全集還可如下生成，所有序列多樣性集中于單一長度的長H3環(huán)，如Barbasetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457-4461(1992)所述。人VK和VX區(qū)段已經(jīng)克隆和測序(WilliamsandWinter,Eur.J.Immunol.,23:1456-1461(1993))，而且可用于生成合成的輕鏈全集。基于一系列VH和VL折疊結(jié)構(gòu)及L3和H3長度的合成V基因全集將編碼具有可觀結(jié)構(gòu)多樣性的抗體。擴(kuò)增編碼V基因的DNA后，依照HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.，227:381-388(1992)的方法，可以在體外重排種系V基因區(qū)段?？贵w片段全集可以如下構(gòu)建，即以數(shù)種方式將VH與VL基因聯(lián)合在一起?？梢栽诓煌d體中創(chuàng)建各個全集，并在體外重組載體，例如如Hogrefeetal.,Gene,128:119-126(1993)所述，或者在體外通過組合感染來重組載體，例如Waterhouseetal.，Nucl.AcidsRes.,21:2265-2266(1993)中記載的loxP系統(tǒng)。體內(nèi)重組方法利用Fab片段的雙鏈性質(zhì)來克服因大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率施加的庫容量限制。分開克隆未免疫的VH和VL全集，一個克隆入噬菌粒，另一個克隆入噬菌體載體。然后通過用噬菌體感染含噬菌粒的細(xì)菌使得每個細(xì)胞包含一種不同組合來聯(lián)合兩個文庫，庫容量只受細(xì)胞存在數(shù)的限制(約1012個克隆)。兩種載體都包含體內(nèi)重組信號，使得VH與VL基因重組到單一復(fù)制子上，并共包裝成噬菌體病毒粒。這些巨型文庫提供了大量的具有優(yōu)良親和力(KcT1為約1(T8M)的多樣性抗體。或者，可以將全集依次克隆入同一載體，例如如Barbasetal.,Proc.Natl.Acad.Sd.USA,88:7978-7982(1991)所述，或者通過PCR裝配到一起，然后克隆，如Clacksonetal.,Nature,352:624-628(1991)所述。PCR裝配還可用于將VH和VLDNA與編碼柔性肽間隔物的DNA連接以形成單鏈Fv(scFv)全集。在另一種技術(shù)中，"細(xì)胞內(nèi)PCR裝配"用于通過PCR在淋巴細(xì)胞內(nèi)聯(lián)合VH與VL基因，然后克隆所連接基因的全集，如Embletonetal.，Nucl.AcidsRes.，20:3831-3837(1992)所述。未免疫文庫(天然的或合成的)生成的抗體可具有中等親和力(Kd"為約106-107M-1),但還可以如下在體外模擬親和力成熟，即構(gòu)建和再次選擇次生文庫，如Winteretal.(1994),見上文所述。例如，在Hawkinsetal.,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)的方法或Grametal.，Proc.Natl.Acad.SciUSA,89:3576-3580(1992)的方法中，使用易錯聚合酶在體外隨機(jī)引入突變(Leungetal.，Technique,1:11-15(1989))。另夕卜，可以通過隨機(jī)突變一個或多個CDR來進(jìn)行親和力成熟，例如在選定的個別Fv克隆中使用攜帶跨越感興趣CDR的隨^L序列的引物進(jìn)行PCR并篩選更高親和力的克隆。WO9607754(>^開于19%年3月14日)記載了用于在免疫球蛋白輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)中誘導(dǎo)突變以創(chuàng)建輕鏈基因文庫的方法。另一種高效方法是將通過噬菌體展示選出的VH或VL篩選更高親和力，如Marksetal.，Biotechnol.，10:779-783(1992)所述。此技術(shù)容許生成親和力在1(T9M范圍的抗體和抗體片段。EphB4核酸和氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的。編碼EphB4的核酸序列可以使用所需EphB4區(qū)域的氨基酸序列來設(shè)計?；蛘撸梢允褂胏DNA序列(或其片段)，GenBank編號為NM—004444的或者披露于美國專利No.5，635，177的。編碼EphB4的DNA可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法來制備。這些方法包括但不限于通過Engelsetal.,Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.，28:716-734(1989)中記載的任何方法，諸如三酯、亞磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphommidite)和H-膦酸酯法進(jìn)行的化學(xué)合成。在一個實(shí)施方案中，編碼EphB4的DNA的設(shè)計中使用表達(dá)宿主細(xì)胞所優(yōu)選的密碼子?；蛘?，編碼EphB4的DNA可以從基因組或cDNA文庫分離。構(gòu)建編碼EphB4的DNA后，將DNA分子與表達(dá)載體，諸如質(zhì)粒中的表達(dá)控制序列可操作連接，其中所述控制序列受到該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的識別。一般而言，質(zhì)粒載體包含復(fù)制和控制序列，其衍生自與宿主細(xì)胞相容的物種。載體通常攜帶復(fù)制位點(diǎn)，以及編碼能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的蛋白質(zhì)的序列。適于在原核和真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體是本領(lǐng)域已知的，有些在本文中有進(jìn)一步描述?？梢允褂谜婧松矬w，諸如酵母或衍生自多細(xì)胞生物體諸如哺乳動物的細(xì)胞。任選的是，編碼EphB4的DNA與分泌前導(dǎo)序列可操作連接，導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中。分泌前導(dǎo)序列的例子包括stll、ecotin、lamB、皰滲GD、lpp、堿性磷酸酶、轉(zhuǎn)化酶、和a-因子。適用于此處的還有蛋白A的36個氨基酸的前導(dǎo)序列(Abrahmsenetal.，EMBOJ.，4:3901(1985))。宿主細(xì)胞用上文所述本發(fā)明的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染，優(yōu)選轉(zhuǎn)化，并在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基可以為了誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子、或擴(kuò)增編碼所需序列的基因而適當(dāng)修改。轉(zhuǎn)染指宿主細(xì)胞攝取表達(dá)載體，無論編碼序列事實(shí)上是否表達(dá)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員直到許多轉(zhuǎn)染方法，例如CaP04沉淀和電穿孔。若宿主細(xì)胞內(nèi)存在此載體運(yùn)轉(zhuǎn)的任何指示，則認(rèn)為轉(zhuǎn)染成功。用于轉(zhuǎn)染的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，有些在本文中有描述。轉(zhuǎn)化指將DNA導(dǎo)入生物體，使得DNA可進(jìn)行復(fù)制，或是作為染色體外元件，或是通過染色體整合。根據(jù)所用宿主細(xì)胞，使用適于所述細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，有些在本文中有描述。用于生成EphB4的原核宿主細(xì)胞可以如Sambrooketal.,見上文一般所述進(jìn)行培養(yǎng)。用于生成EphB4的哺乳動物宿主細(xì)胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基是本領(lǐng)域眾所周知的，有些在本文中有描述。此公開書中涉及的宿主細(xì)胞涵蓋體外培養(yǎng)的細(xì)胞以及宿主動物內(nèi)的細(xì)胞。EphB4的純化可以使用本領(lǐng)域公認(rèn)的方法來實(shí)現(xiàn)，本文描述了其中一些。純化的EphB4可以附著于合適的基質(zhì)，諸如瓊脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纖維素、各種丙烯酸共聚物、羥基曱基丙烯酸酯凝膠、聚丙烯酸和聚曱基丙烯酸共聚物、尼龍、中性和離子栽體、諸如此類，用于噬菌體展示克隆的親和層析分離。EphB4蛋白對基質(zhì)的附著可以通過MethodsinEnzymology,vol.44(1976)中記載的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。將蛋白質(zhì)配體附著于多糖基質(zhì)，例如瓊脂糖、右旋糖苷或纖維素的常用技術(shù)涉及用卣化氰活化載體，隨后將肽配體的脂肪族或芳香族伯胺偶聯(lián)至活化后的基質(zhì)?；蛘?，EphB4可用于包被吸附板的孔，在附著至吸附板的宿主細(xì)胞上表達(dá)，或用于細(xì)胞分選，或者偶聯(lián)至生物素以用鏈霉親合素包被的珠捕捉，或者用于本領(lǐng)域已知的用于淘選噬菌體展示庫的任何其它方法。在適于至少部分噬菌體顆粒結(jié)合吸附劑的條件下，使噬菌體文庫樣品接觸固定化的EphB4。正常情況下，選擇包括pH、離子強(qiáng)度、溫度等等的條件來模擬生理學(xué)條件。結(jié)合至固相的噬菌體進(jìn)行清洗，然后用酸洗脫，例如如Barbasetal.,Proc.Natl.Acad.SciUSA,88:7978-7982(1991)所述，或者用石威洗脫，例如如Marksetal.，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者通過EphB4抗原竟?fàn)幭疵摚缭谂cClacksonetal.,Nature,352:624-628(1991)的抗原竟?fàn)幏愃频囊?guī)程中。噬菌體在單輪選擇中可以富集20-l,000倍。此外，富集的噬菌體可以在細(xì)菌培養(yǎng)物中進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行更多輪選擇。選擇的效率取決于許多因素，包括清洗過程中解離的動力學(xué)，及單個噬菌體上的多個抗體片段是否能同時結(jié)合抗原。具有較快解離動力學(xué)(和弱結(jié)合親和力)的抗體可以通過使用短時間的清洗、多價噬菌體展示、及固相中的高抗原包被密度來保留。高密度不僅通過多價相互作用而穩(wěn)定了噬菌體，而且有利于已解離的噬菌體的再結(jié)合。具有較慢解離動力學(xué)(和強(qiáng)結(jié)合親和力)的抗體的選擇可以通過使用長時間的清洗和單價噬菌體展示(如Bassetal.，Proteins,8:309-314(19卯)和WO92/09690所述)及低抗原包被密度(如Marksetal.,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述)來促進(jìn)。有可能在對EphB4具有不同親和力的噬菌體抗體之間進(jìn)行選擇，甚至是親和力略有差異的。然而，選定抗體的隨機(jī)誘變(例如如有些上文所述親和力成熟技術(shù)進(jìn)行)有可能產(chǎn)生許多突變體，多數(shù)結(jié)合抗原，少數(shù)具有更高的親和力。通過限制EphB4，罕見的高親和力噬菌體能竟?fàn)巹俪觥榱吮Ａ羲休^高親和力的突變體，可以將噬菌體與過量的生物素化EphB4—起溫育，但是生物素化EphB4的摩爾濃度低于EphB4的目標(biāo)摩爾親和常數(shù)。然后用鏈霉親合素包被的順磁珠捕捉高親和力的結(jié)合噬菌體。此類"平衡捕捉"容許依照結(jié)合親和力來選擇抗體，其靈敏性容許從大大過量的低親和力噬菌體中分離出親和力只高出2倍的突變體克隆。還可以操作清洗結(jié)合至固相的噬菌體的條件來進(jìn)行基于解離動力學(xué)的區(qū)分?？笶phB4克隆可以進(jìn)行活性選擇。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了阻斷EphB4配體(諸如ephrin-Bl、ephrin-B2和/或ephrin-B3)與EphB4之間的結(jié)合但不阻斷EphB4配體與第二蛋白質(zhì)(諸如EphBl、EphB3、EphB4、EphB5和/或EphB6)結(jié)合的抗EphB4抗體。對應(yīng)于此類抗EphB4抗體的Fv克隆可以如下選出(1)如上所述從噬菌體文庫分離抗EphB4克隆，并任選通過在合適的細(xì)菌宿主中培養(yǎng)來擴(kuò)增所分離的噬菌體克隆群；(2)選出分別想阻斷和不阻斷其活性的EphB4和第二蛋白質(zhì)；(3)使抗EphB4噬菌體克隆吸附至固定化的EphB4;(4)使用過量的第二蛋白質(zhì)來洗脫任何不想要的、識別EphB4結(jié)合決定簇(其與第二蛋白質(zhì)的結(jié)合決定簇交疊或共享)的克隆；并(5)洗脫在步驟(4)后仍然吸附的克隆。任選的是，具有期望的阻斷/不阻斷特性的克隆可以通過一次或多次重復(fù)本文所述選擇規(guī)程來進(jìn)一步富集。編碼本發(fā)明雜交瘤衍生單克隆抗體或噬菌體展示Fv克隆的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程分離和測序(例如通過使用設(shè)計成自雜交瘤或噬菌體DNA模板特異性擴(kuò)增感興趣的重鏈和輕鏈編碼區(qū)的寡核苷酸引物)。一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到原本不生成免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中，諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得所需單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述性論文包括Skerraetal.，Curr.OpinioninImmunol"5:256(1993)及Pluckthun,Immunol.Revs,130:151(1992)。編碼本發(fā)明Fv克隆的DNA可以聯(lián)合編碼重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)的已知DNA序列(例如適宜的DNA序列可得自Kabatetal.,見上文)以形成編碼全長或部分重鏈和/或輕鏈的克隆。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，任何同種型的恒定區(qū)都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定區(qū)，而且此類恒定區(qū)可以得自任何人或動物物種。衍生自一種動物(諸如人)物種的可變域DNA，然后與另一動物物種的恒定區(qū)DNA融合以形成"雜合的"全長重鏈和/或輕鏈的編碼序列的Fv克隆包括在本文所用"嵌合"和"雜合"抗體的定義中。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，衍生自人可變DNA的Fv克隆與人恒定區(qū)DNA融合以形成完全人的、全長或部分重鏈和/或輕鏈的編碼序列。還可以修飾編碼衍生自本發(fā)明雜交瘤的抗EphB4抗體的DNA，例如通過替代，即用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列代替衍生自雜交瘤抗體的同源鼠源序列(例如如Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984)中的方法)?？梢赃M(jìn)一步修飾編碼雜交瘤或Fv克隆衍生抗體或片段的DNA，通過共價接合免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列?？梢砸栽摲绞街苽渚哂斜景l(fā)明的Fv克隆或雜交瘤克隆衍生抗體的結(jié)合特異性的"嵌合"或"雜合"抗體。抗體片段本發(fā)明涵蓋抗體片段。在某些情況中，使用抗體片段有優(yōu)勢，而不是完整抗體。片段的較小尺寸容許快速清除，而且可導(dǎo)致更易于接近實(shí)體瘤。已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如Morimotoetal.，JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992》Bren腿etal.,Science229:81(1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片段。Fab、Fv和scFv抗體片段都可在大腸桿菌中表達(dá)及由大腸桿菌分泌，如此容許容易地生成大量的這些片段。可從上文討論的噬菌體抗體庫中分離抗體片段。或者，可直接從大腸桿菌回收Fab'-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab')2片段(Carteretal.,Bio/Technology10:163-167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離F(ab')2片段。包含補(bǔ)救受體結(jié)合表位殘基、具有延長的體內(nèi)半衰期的Fab和F(ab')2片段記載于美國專利No.5,869,046。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對于熟練從業(yè)人員將是顯而易見的。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO93/16185;美國專利No.5,571,894;及5,587,458。Fv和sFv是具有完整結(jié)合位點(diǎn)、缺少恒定區(qū)的唯一類型；如此，它們適于在體內(nèi)使用時降低非特異性結(jié)合?？蓸?gòu)建sFv融合蛋白以生成效應(yīng)器蛋白質(zhì)在sFv的氨基或羧基末端的融合物。參見AntibodyEngineering,Borrebaeck編，同上。抗體片段還可以是"線性抗體"，例如如美國專利No.5，641,870中所記載的。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。人源化抗體本發(fā)明涵蓋人源化抗體。本領(lǐng)域知道用于人源化非人抗體的多種方法。例如，人源化抗體可具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱為"輸入"殘基，它們通常取自"輸入，，可變區(qū)?；旧峡勺裱璚inter及其同事的方法進(jìn)行人源化(Jonesetal.，Nature321:522-525(1986);Riechmannetal.,Nature332:323-327(1988);Verhoeyenetal"Science239:1534-1536(1988))，即用非人高變區(qū)序列替代人抗體的對應(yīng)序列。因此，此類"人源化"抗體是嵌合抗體(美國專利4，816,567)，其中顯著少于完整的人可變區(qū)用非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是如下人抗體，其中有些高變區(qū)殘基和可能的有些FR殘基用嚙齒類抗體類似位點(diǎn)的殘基替代。用于制備人源化抗體的人輕鏈和重鏈可變區(qū)的選擇對于降低抗原性是非常重要的。依照所謂的"最適(best-fit)"方法，用嚙齒類抗體的可變區(qū)序列對已知人可變區(qū)序列的整個文庫進(jìn)行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架(Simsetal"J.Immunol.151:2296(1993);Chothiaetal.,J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞類(subgroup)的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carteretal.,Proc.Natl,Acad.Sci.USA89:4285(1992);Prestaetal,，J.Immunol.151:2623(1993))。更為重要的是，抗體在人源化后保留對抗原的高親和力和其它有利的生物學(xué)特性。為了達(dá)到此目的，依照一種方法，通過使用親本序列和人源化序抗體。通?？色@得免疫球蛋白三維模型，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機(jī)程序。通過檢查這些顯示圖像能分析殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可以從受體序列和輸入序列中選出FR殘基并組合，從而得到期望的抗體特征，諸如對靶抗原的親和力升高。一般而言，高變區(qū)殘基直接且最實(shí)質(zhì)地參與影響對抗原的結(jié)合。人抗體本發(fā)明的人抗EphB4抗體可以通過如上所述聯(lián)合選自人衍生噬菌體展示庫的Fv克隆可變域序列與已知的人恒定域序列來構(gòu)建?；蛘?，可以通過雜交瘤方法來生成本發(fā)明的人單克隆抗EphB4抗體。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系已有記載，例如KozborJ.Immunol.,133:3001(1984);Brodeuretal.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63(MarcelDekker，Inc.,NewYork,1987);及Boerneretal"J.Immunol.,147:86(1991).例如，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在抗原攻擊后生成人抗體。參見例如Jakobovitsetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993);Jakobovitsetal.，Nature362:255-258(1993);Brugge腿nnetal.，YearinImmunol.7:33(1993)?；蚋慕M也可用于在體外自非人(例如嚙齒類)抗體衍生人抗體，其中人抗體具有與起始非人抗體相似的親和力和特異性。依照此方法，它也稱為"表位印記"(epitopeimprinting),如上所述通過噬菌體展示技術(shù)得到的非人抗體片段的重鏈或輕鏈可變區(qū)用人V結(jié)構(gòu)域基因全集替換，產(chǎn)生非人鏈-人鏈scFv或Fab嵌合物群。用抗原進(jìn)行的選擇導(dǎo)致非人鏈/人鏈嵌合scFv或Fab的分離，其中人鏈在一級噬菌體展示克隆中消除相應(yīng)的非人鏈后恢復(fù)了抗原結(jié)合位點(diǎn)，即表位決定(印記，imprint)人鏈配偶體的選擇。在重復(fù)該過程以替換剩余非人鏈時，得到人抗體(參見PCTWO93/06213，公開于1993年4月1曰)。與傳統(tǒng)的通過CDR移植進(jìn)行的非人抗體的人源化不同，此技術(shù)提供完全人的抗體，它們不含非人起源的FR或CDR殘基。雙特異性抗體雙特異性抗體指對至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體，優(yōu)選人抗體或人源化抗體。在本案中，結(jié)合特異性之一針對EphB4，結(jié)合特異性之另一針對任何其它抗原。例示性的雙特異性抗體可結(jié)合EphB4蛋白質(zhì)的兩種不同表位。雙特異性抗體還可用于將細(xì)胞毒劑定位于表達(dá)EphB4的細(xì)胞。這些抗體擁有EphB4結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒劑(例如肥急草毒蛋白、抗干擾素-a、長春花生物堿類、蓖麻毒蛋白A鏈、曱氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。在傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)，其中兩種重鏈具有不同的特異性(MillsteinandCuello,A^ww305:537(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨沖幾分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通4皮露于WO93/08829，^^開于1993年5月13日及Trauneckerda/.,￡M5(9/10:3655(1991)。依照一種不同且更優(yōu)選的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。優(yōu)選的是，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域進(jìn)行融合。優(yōu)選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(Ch1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時提供最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時或在該比例沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達(dá)載體。在該方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)便于將期望的雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露于WO94/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情參見例如SureshdMe^fe/"五"，o/ogy121:210(1986)。依照另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面，以將從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含至少部分抗體恒定域Ch3結(jié)枸域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈相同或相似大小的補(bǔ)償性"空腔"。這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機(jī)制。雙特異性抗體包括交聯(lián)或"異源偶聯(lián)"抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一種抗體可與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，此類抗體已經(jīng)建議用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國專利No.4,676,980)，及用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/00373和EP03089)?？蒦f吏用任何^更利的交聯(lián)方法來制備異源偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，連同許多交聯(lián)技術(shù)一起披露于美國專利No.4,676,980。文獻(xiàn)中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來制備雙特異性抗體。Brennanda/.，5We"ce229:81(1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab')2片段的規(guī)程。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab，片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸綍跛狨?TNB)衍生物。然后將Fab'-TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab'-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最新的進(jìn)展便于從大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，這些片段可化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby"/175:217-225(1992)記載了完全人源化的雙特異性抗體F(ab')2分子的生成。由大腸桿菌分開分泌每種Fab'片段，并在體外進(jìn)行定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過表達(dá)HER2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞，以及觸發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞針對人乳腺腫瘤靶物的溶解活性。還記載了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny^"/.，J/mwww/.148(5):1547-1553(1992)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger尸rac.A^/.^c"d5W.t/5^90:6444-6448(1993)記載的"雙抗體"技術(shù)提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機(jī)制。該片段包含通過接頭相連的重鏈恒定域(VH)和輕鏈恒定域(vo,所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的VH和VJ吉構(gòu)域與另一個片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報道了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見GrubereM/.,J/畫,/.152:5368(1994)。設(shè)想了具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tuttda/.，//畫畫/.147:60(1991)。多價抗體多價抗體可以比二價抗體更快的受到表達(dá)該抗體所結(jié)合抗原的細(xì)胞的內(nèi)在化(和/或異化)。本發(fā)明的抗體可以是可容易的通過編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表達(dá)而生成的、具有三個或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如四價抗體)的多價抗體(IgM類別以外的)。多價抗體可包含二聚化結(jié)構(gòu)域和三個或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域包含(或由其組成)Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)。在這種情況中，抗體將包含F(xiàn)c區(qū)及Fc區(qū)氨基末端的三個或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)。本文中優(yōu)選的多價抗體包含(或由其組成)三個至約八個，但優(yōu)選四個抗原結(jié)合位點(diǎn)。多價抗體包含至少一條多肽鏈(且優(yōu)選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個或多個可變域。例如，多肽鏈可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc,其中VD1是第一可變域，VD2是第二可變域，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一條多肽鏈，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或l。例如，多肽鏈可包含VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-Fc區(qū)鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區(qū)鏈。本文中的多價抗體優(yōu)選進(jìn)一步包含至少兩條(且優(yōu)選四條)輕鏈可變域多肽。本文中的多價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文設(shè)想的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域，且任選進(jìn)一步包含CL結(jié)構(gòu)域。抗體變體在有些實(shí)施方案中，設(shè)想了本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進(jìn)抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性?？贵w的氨基酸序列變體是通過將適宜的核苷酸變化引入抗體核酸或通過肽合成制備的。此類修飾包括例如抗體氨基酸序列內(nèi)的殘基刪除和/或插入和/或替代。可進(jìn)行任何刪除、插入和替代組合以獲得最終的構(gòu)建物，倘若最終的構(gòu)建物具有期望的特征。可在制備序列時將氨基酸改變引入主題抗體氨基酸序列。可用于鑒定抗體中作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的方法有"丙氨酸掃描誘變"，如CunninghamandWells,Science244:1081-1085(1989)中所述。這里，鑒定一個殘基或一組靶殘基(如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過在或?qū)μ娲稽c(diǎn)引入更多或其它變體，推敲對替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，盡管用于引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，然而突變本身的本質(zhì)不必預(yù)先決定。例如，為了分析指定位點(diǎn)處突變的后果，在耙密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并對所表達(dá)免疫球蛋白篩選期望的活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，長度范圍由一個殘基至包含上百或更多殘基的多肽，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N端曱硫氨酰殘基的抗體或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其它插入變體包括將抗體的N或C端與酶(如用于ADEPT)或延長抗體血清半衰期的多肽融合。多肽的糖基化典型的或是N-連接的或是O-連接的。N-連接指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。如此，多肽中這兩種三肽序列任一的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化指將糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向抗體中添加糖基化位點(diǎn)可通過改變氨基酸序列使其包含一個或多個上述三肽序列而便利的完成(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))。所述改變還可通過向原始抗體的序列中添加或替代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進(jìn)行(用于O-連接的糖基化位點(diǎn))。若抗體包含F(xiàn)c區(qū)，則可改變附著其上的碳水化合物。例如，美國專利申請US2003/0157108(Presta，L.)中記載了有缺乏巖藻糖的成熟碳水化合物結(jié)構(gòu)附著于抗體Fc區(qū)的抗體。還可參見US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd.)。WO2003/011878(Jean-Mairet等人)和美國專利第6,602,684號(Umana等人)中提到了在附著于抗體Fc區(qū)的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗體。WO1997/30087(Patel等人)中報告了在附著于抗體Fc區(qū)的寡糖中有至少一個半乳糖殘基的抗體。關(guān)于有更改碳水化合物附著于其Fc區(qū)的抗體還可參見WO1998/58964(Raju，S.)和WO1999/22764(Raju,S.)。關(guān)于具有改良糖基化的抗原結(jié)合分子還可參見US2005/0123546(Umanaetal.)。本文中的優(yōu)選糖基化變體包含F(xiàn)c區(qū)，其中附著于Fc區(qū)的碳水化合物結(jié)構(gòu)缺乏巖藻糖。此類變體具有改進(jìn)的ADCC功能。任選的是，F(xiàn)c區(qū)還包含進(jìn)一步改進(jìn)ADCC的一個或多個氨基酸替代，例如Fc區(qū)位置298、333和/或334處的替代(Eu殘基編號方式)。涉及"脫巖藻糖型，，或"巖藻糖缺乏型"抗體的出版物的例子包括US2003/0157108;WO2000/61739;WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;Okazakietal.J.Mol.Biol,336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnukietal.Biotech.Bioeng.87:614(2004)。生成脫巖藻糖化抗體的細(xì)胞系的例子包括蛋白質(zhì)巖藻糖化缺陷的Lecl3CHO細(xì)胞(Ripkaetal.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美國專利申請?zhí)朥S2003/0157108Al，Presta,L;及WO2004/056312Al，Adamsetal.，尤其是實(shí)施例1l)和敲除細(xì)胞系，諸如a-l，6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因，F(xiàn)UT8,敲除的CHO細(xì)胞(Yamane畫Ohnukietal.Biotech.Bioeng.87:614(2004))。另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個氨基酸殘基用不同殘基替代。最有興趣進(jìn)行替代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但是也設(shè)想了FR改變。表l中"優(yōu)選替代"欄顯示了保守替代。如果此類替代導(dǎo)致生物學(xué)活性變化，那么可導(dǎo)入表l中稱為"例示替代，，的更實(shí)質(zhì)變化，或如下文參照氨基酸分類進(jìn)一步所述，并篩選產(chǎn)物。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>異顯著的替代來實(shí)現(xiàn)(a)替代區(qū)域中多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如(折疊)片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。根據(jù)共同的側(cè)鏈特性，天然存在殘基可如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性、親水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gin;(3)酸性的Asp、Glu;(4)石威性的His、Lys、Arg;(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro;(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。非保守替代需要用這些類別之一的成員替換另一個類別的。一類替代變體涉及替代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或多個高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步開發(fā)的所得變體相對于產(chǎn)生它們的親本抗體將具有改良的生物學(xué)特性。用于生成此類替代變體的一種便利方法涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡而言之，將數(shù)個高變區(qū)位點(diǎn)(例如6-7個位點(diǎn))突變，在各個位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗體展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與各個顆粒內(nèi)包裝的M13基因III產(chǎn)物的融合物。然后如本文所公開的對噬菌體展示的變體篩選其生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可進(jìn)行丙氨酸掃描誘變以鑒定對抗原結(jié)合具有重要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基?；蛘?另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定抗體和抗原之間的接觸點(diǎn)可能是有益的。所述接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述的技術(shù)進(jìn)行替代的候選位點(diǎn)。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述對該組變體進(jìn)行篩選，可選擇在一種或多種相關(guān)測定法中具有優(yōu)良特性的抗體用于進(jìn)一步的開發(fā)。編碼抗體氨基酸序列變體的核酸分子可通過本領(lǐng)域知道的多種方法來制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然發(fā)生氨基酸序列變體的情況中)，或者通過對較早制備的變體或非變異型式的抗體進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變和盒式誘變來制備?？赡芟Ｍ诒景l(fā)明免疫球蛋白多肽的Fc區(qū)中引入一處或多處氨基酸修飾，由此生成Fc區(qū)變體。Fc區(qū)變體可包括在一個或多個氨基酸位置(包括鉸鏈半胱氨酸)包含氨基酸修飾(如替代)的人Fc區(qū)序列(如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū))。依照此描述和本領(lǐng)域的教導(dǎo)，設(shè)想了在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中所使用的抗體與野生型對應(yīng)抗體相比可在例如Fc區(qū)中包含一處或多處改變。與它們的野生型對應(yīng)物相比，這些抗體仍將基本上保留治療功效所需要的相同特性。例如，認(rèn)為可在Fc區(qū)中進(jìn)行將會導(dǎo)致Clq結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)改變(即或是增強(qiáng)或是削弱)的某些改變，例如W099/51642中所述。還可參見關(guān)注Fc區(qū)變體其它實(shí)例的DuncanandWinter,Nature322:738-40(1988);美國專利5,648，260;美國專利5,624，821;及W094/29351。WO00/42072(Presta)和WO2004/056312(Lowman)記載了對FcR的結(jié)合提高或降低的抗體變體。在此明確收入這些專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見Shieldsetal.J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。半衰期延長且對新生兒Fc受體(FcRn)(它負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移給胎兒)(Guyeretal.，J.Immunol.117:587(1976)及Kimetal.，J.Immunol.24:249(1994))的結(jié)合改良的抗體記載于US2005/0014934々1(Hintonetal.)。這些抗體包含具有一處或多處改進(jìn)Fc區(qū)與FcRn結(jié)合的替代的Fc。具有改變的Fc區(qū)氨基酸序列且Clq結(jié)合能力升高或降低的多肽變體記載于美國專利No.6，194,551B1,W099/51642。在此明確收入這些專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見Idusogieetal.J.Immunol.164:4178-4184(2000)?？贵w衍生物可進(jìn)一步修飾本發(fā)明的抗體以包含本領(lǐng)域知道的且易于獲得的額外非蛋白質(zhì)性質(zhì)部分。優(yōu)選的是，適于抗體衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實(shí)例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧曱基纖維素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-l，3-二氧戊環(huán)、聚-l,3,6-三D惡烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或隨機(jī)共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的穩(wěn)定性，聚乙二醇丙醛在生產(chǎn)中可能具有優(yōu)勢。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附著到抗體上的聚合物數(shù)目可以變化，而且如果附著了超過一個聚合物，那么它們可以是相同或不同的分包括但不限于待改進(jìn)抗體的具體特性或功能、抗體衍生物是否將用于指定條件下的治療等。篩選具有期望特性的抗體可通過本領(lǐng)域知道的多種測定法對本發(fā)明的抗體表征它們的物理/化學(xué)特性和生物學(xué)功能。在有些實(shí)施方案中，抗體表征了以下一項(xiàng)或多項(xiàng)降低或阻斷EphB4活化，降低或阻斷EphB4下游分子信號傳導(dǎo)，降低或阻斷EphB4配體活化，降低或阻斷EphB4配體下游分子信號傳導(dǎo)，破壞或阻斷配體(例如ephrin-Bl、印hrin-B2、和/或ephrin-B3)與EphB4的結(jié)合、EphB4磷酸化和/或EphB4多聚化、和/或EphB4配體磷酸化，和/或治療和/或預(yù)防肺瘤、細(xì)胞增殖性病癥或癌癥，和/或治療或預(yù)防與EphB4表達(dá)和/或活性(諸如EphB4表達(dá)和/或活性升高)有關(guān)的病癥。可通過一系列測定法進(jìn)一步鑒定純化的抗體，包括但不限于N端測序、氨基酸分析、非變性大小排阻高壓液相層析(HPLC)、質(zhì)譜、離子交換層析和木瓜蛋白酶消化。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，對本文中所生成的抗體分析它們的生物學(xué)活性。在有些實(shí)施方案中，對本發(fā)明的抗體測試它們的抗原結(jié)合活性。本領(lǐng)跡、放射免疫測定法、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)、"三明治"免疫測定法、免疫沉淀測定法、熒光免疫測定法和蛋白A免疫測定法等技術(shù)的任何直接或竟?fàn)幮越Y(jié)合測定法。下文在實(shí)施例部分中提供了例示性的抗原結(jié)合測定法。在又一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與30.35、30.35.1D2和/或30.35.2D8抗體竟?fàn)嶦phB4結(jié)合的抗EphB4單克隆抗體。此類竟?fàn)幮钥贵w包括所識別的EphB4表位與抗體30.35、30.35.1D2和/或30.35.2D8所識別的EphB4表位相同或交疊的抗體。此類竟?fàn)幮钥贵w可以通過對抗EphB4雜交瘤上清液篩選與經(jīng)過標(biāo)記的30.35、30.35.1D2和/或30.35.2D8抗體竟?fàn)帉潭ɑ疎phB4的結(jié)合來得到。與含有無關(guān)抗體或不含抗體的對照結(jié)合混合物中檢測到的結(jié)合的、經(jīng)過標(biāo)記的抗體的量相比，含有竟?fàn)幮钥贵w的雜交瘤上清液會減少測試竟?fàn)幗Y(jié)合混合物中檢測到的結(jié)合的、經(jīng)過標(biāo)記的抗體的量。本文所述任何竟?fàn)幗Y(jié)合測定法都適用于前述M^程。另一方面，本發(fā)明提供了包含30.35、30.35.1D2或30.35.2D8抗體的一個或多個(諸如2、3、4、5、和/或6個)HVR的抗EphB4單克隆抗體。包含30.35、30.35.1D2和/或30.35.2D8的一個或多個HVR的抗EphB4單克隆抗體可以如下來構(gòu)建，即如上所述將30.35、30.35.1D2和/或30.35.2D8的一個或多個HVR移植到模板抗體序列上，例如最接近親本抗體相應(yīng)鼠序列的人抗體序列或特定親本抗體輕鏈或重鏈亞組所有人抗體的共有序列，并在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)所得嵌合輕鏈和/或重鏈可變區(qū)序列，有或無伴隨的恒定區(qū)序列。具有本文所述獨(dú)特特性的本發(fā)明抗EphB4抗體可以如下得到，即通過任何便利的方法對抗EphB4雜交瘤克隆篩選期望特性。例如，如果需要阻斷或不阻斷EphB4配體結(jié)合EphB4的抗EphB4單克隆抗體，那么可以在結(jié)合竟?fàn)帨y定法中測試候選抗體，諸如竟?fàn)幮越Y(jié)合ELISA，其中板孔用EphB4包被，將目的Eph配體過量的抗體溶液鋪到經(jīng)過包被的板上，并酶法檢測結(jié)合的抗體，例如使結(jié)合的抗體接觸偶聯(lián)有HRP的抗Ig抗體或生物素化抗Ig抗體并顯現(xiàn)HRP顯色反應(yīng)，例如通過用鏈霉親合素-HRP和/或過氧化氫使板顯色并通過分光光度法用ELISA讀板儀在490nm檢測HRP顯色反應(yīng)。如果需要抑制或活化EphB4活性的抗EphB4抗體，那么可以在EphB4磷酸化測定法中測試候選抗體。此類測定法是本領(lǐng)域已知的，實(shí)施例部分中描述瘤一個這樣的測定法。如果需要抑制細(xì)胞生長的抗EphB4抗體，那么可以在測量細(xì)胞生長抑制的體外和/或體內(nèi)測定法中測試候選抗體。此類測定法是本領(lǐng)域已知的，本文中有進(jìn)一步的描述和例示。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)想了具有一些但非所有效應(yīng)器功能的改良抗體，這使得它在抗體體內(nèi)半衰期是重要的但某些效應(yīng)器功能(諸如補(bǔ)體和ADCC)是不必要的或有害的許多應(yīng)用中成為期望的候選物。在某些實(shí)施方案中，測量所生成免疫球蛋白的Fc活性以確保只保留了期望的特性?？蛇M(jìn)行體外和/或體內(nèi)細(xì)胞毒性測定法以確認(rèn)CDC和/或ADCC活性的降j氐/消減。例如，可進(jìn)行Fc受體(FcR)結(jié)合測定法以確認(rèn)抗體缺乏FcyR結(jié)合(因此有可能缺乏ADCC活性)但保留FcRn結(jié)合能力。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)Fcr/RI11，而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、FcyRII和FcyRIII。RavetchandKinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464頁表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的Fc錄達(dá)。美國專利No.5,500,362或5,821,337中記載了用于評估目的分子的ADCC活性的體外測定法的實(shí)例。可用于此類測定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynesetal.,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。還可進(jìn)行Clq結(jié)合測定法以確認(rèn)抗體不能結(jié)合Clq且因此缺乏CDC活性。為了評估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行CDC測定法，例如如Gazzano-Santoroetal.,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述。還可使用本領(lǐng)域知道的方法進(jìn)行FcRn結(jié)合和體內(nèi)清除/半衰期測定，例如實(shí)施例部分中所描述的。載體、宿主細(xì)胞和重組方法為了重組生產(chǎn)本發(fā)明的抗體，分離編碼它的核酸，并將其插入可復(fù)制載體，用于進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)?？墒褂贸Ｒ?guī)流程容易的分離編碼抗體的DNA并測序(如使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)。可利用許多載體。載體的選擇部分取決于將要使用的宿主細(xì)胞。通常，優(yōu)選的宿主細(xì)胞是原核或真核(通常是哺乳動物)起源的。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，任何同種型的恒定區(qū)可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定區(qū)，而且此類恒定區(qū)可以從任何人或動物物種獲得。a.使用原核宿主細(xì)胞生成抗體i.載體構(gòu)建可使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)來獲得編碼本發(fā)明抗體多肽構(gòu)件的多核苷,列。可從抗體生成細(xì)胞諸如雜交瘤細(xì)胞分離期望的多核苷酸序列并測序?；蛘?，可使用核普酸合成儀或PCR技術(shù)合成多核苷酸。一旦得到，將編碼多肽的序列插入能夠在原核宿主中復(fù)制并表達(dá)異源多核苷酸的重組載體。為了本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域可獲得的且知道的許多載體。適宜載體的選擇將主要取決于將要插入載體的核酸的大小和將要用載體轉(zhuǎn)化的具體宿主細(xì)胞。根據(jù)其功能(擴(kuò)增或表達(dá)異源多核苷酸，或二者兼之)及其與它在其中駐留的具體宿主細(xì)胞的相容性，每種載體含有多種構(gòu)件。載體構(gòu)件通常包括但不限于復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)志基因、啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、信號序列、異源核酸插入片段、和轉(zhuǎn)錄終止序列。一般而言，與宿主細(xì)胞一起使用的質(zhì)粒載體包含衍生自與這些宿主相容物種的復(fù)制子和控制序列。載體通常攜帶復(fù)制位點(diǎn)，以及能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)志序列。例如，通常用衍生自大腸桿菌物種的質(zhì)粒pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌。pBR322包含編碼氨千青霉素(Amp)和四環(huán)素(Tet)抗性的基因，由此提供輕松鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物質(zhì)?；蚴删w還可包含或經(jīng)修飾而包含可被微生物生物體用于表達(dá)內(nèi)源蛋白質(zhì)的啟動子。Carter等人，美國專利5,648，237中詳細(xì)記載了用于表達(dá)特定抗體的pBR322衍生物的實(shí)例。另外，可將包含與宿主微生物相容的復(fù)制子和控制序列的噬菌體載體用作這些宿主的轉(zhuǎn)化載體。例如，可使用噬菌體諸如人GEM.TM.-11來構(gòu)建可用于轉(zhuǎn)化易感宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌LE392的重組載體。本發(fā)明的表達(dá)載體可包含兩種或多種啟動子-順反子對，它們編碼每一種多肽構(gòu)件。啟動子是位于順反子上游(5')的非翻譯調(diào)控序列，它調(diào)控順反子的表達(dá)。原核啟動子通常分成兩類，誘導(dǎo)型的和組成性的。誘導(dǎo)型啟動子指響應(yīng)培養(yǎng)條件的變化(如營養(yǎng)物的存在與否或溫度變化)而啟動受其控制的順反子的升高水平轉(zhuǎn)錄的啟動子。眾所周知受到多種潛在宿主細(xì)胞識別的大量啟動子。通過限制酶消化切下源DNA中的啟動子并將分離的啟動子序列插入本發(fā)明的載體，由此可將選擇的啟動子與編碼輕鏈或重鏈的順反子DNA可操作連接。天然啟動子序列和許多異源啟動子都可用于指導(dǎo)靶基因的擴(kuò)增和/或表達(dá)。在有些實(shí)施方案中，使用異源啟動子，因?yàn)榕c天然靶多肽啟動子相比，它們通常容許所表達(dá)耙基因的更高轉(zhuǎn)錄和更高產(chǎn)量。適用于原核宿主的啟動子包括PhoA啟動子、P-半乳糖普酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、和雜合啟動子諸如tac或trc啟動子。然而，在細(xì)菌中有功能的其它啟動子(諸如其它已知的細(xì)菌或噬菌體啟動子)也是合適的。它們的核苷酸序列已經(jīng)發(fā)表，由此熟練工作人員能夠使用提供任何所需限制位點(diǎn)的接頭或銜接頭將它們與編碼靶輕鏈和重鏈的順反子可操作連接(Siebenlistetal.,Cell20:269(1980))。在本發(fā)明的一個方面，重組載體內(nèi)的每個順反子都包含指導(dǎo)所表達(dá)多肽穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)的分泌信號序列構(gòu)件。一般而言，信號序列可以是載體的構(gòu)件，或者它可以是插入載體的靶多肽DNA的一部分。為了本發(fā)明而選擇的信號序列應(yīng)當(dāng)是受到宿主細(xì)胞識別并加工(即被信號肽酶切除)的信號序列。對于不識別并加工異源多肽的天然信號序列的原核宿主細(xì)胞，將信號序列用選自例如下組的原核信號序列替代堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或熱穩(wěn)定的腸毒素II(STII)前導(dǎo)序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)的兩個順反子中都使用的信號序列是STII信號序列或其變體。在另一方面，依照本發(fā)明的免疫球蛋白的生成可在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生，因此不需要在每個順反子內(nèi)存在分泌信號序列。在那點(diǎn)上，免疫球蛋白輕鏈和重鏈在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)、折疊和裝配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌抹(如大腸桿菌trxB-菌抹)提供有利于二硫鍵形成的細(xì)胞質(zhì)條件，從而容許所表達(dá)蛋白質(zhì)亞基的正確折疊和裝配。ProbaandPluckthun,Gene159:203(1995))。適于表達(dá)本發(fā)明抗體的原核宿主細(xì)胞包括古細(xì)菌(Archaebacteria)和真細(xì)菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體。有用細(xì)菌的實(shí)例包括埃希氏菌屬(Escherichia)(如大腸埃希氏菌E.coli)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(如枯草芽孢桿菌B.subtilis)、腸桿菌屬(Enterobacterial假單胞菌屬(Pseudomonas)(如銅綠假單胞菌P.aeruginosa)物種、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、4'占質(zhì)沙、雷氏菌(Serratiamarcescans)、克雷"f白氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、志賀氏菌屬(Shigella),根瘤菌屬(Rhizobium)、透明顫菌屬(Vitreoscilla)、或副球菌屬(Paracoccus)。在一個實(shí)施方案中，使用革蘭氏陰性細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，使用大腸桿菌細(xì)月包作為本發(fā)明的宿主。大腸桿菌菌抹的實(shí)例包括菌4朱W3110(Bachmann，CellularandMolecularBiology,第2巻，Washington,D.C.,美國微生物學(xué)學(xué)會，1987，第1190-1219頁；ATCC保藏號27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110AfhuA(AtonA)ptr3lacIqlacL8AompTA(nmpc畫fepE)degP41kanR的菌抹33D3(美國專利號5，639，635)。其它菌抹及其衍生物，諸如大腸桿菌294(ATCC31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31,537)和大腸桿菌RV308(ATCC31,608)也是合適的。這些實(shí)例只是例示而非限制。本領(lǐng)域知道用于構(gòu)建具有指定基因型的任何上述細(xì)菌衍生物的方法，參見例如Bassetal.,Proteins8:309-314(1990)。通常必需考慮復(fù)制子在細(xì)菌細(xì)胞中的可復(fù)制性來選擇適宜的細(xì)菌。例如，在使用眾所周知的質(zhì)粒諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410來提供復(fù)制子時，大腸桿菌、沙雷氏菌屬、或沙門氏菌屬物種可能適于用作宿主。通常，宿主細(xì)胞應(yīng)當(dāng)分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在細(xì)胞培養(yǎng)中摻入額外的蛋白酶抑制劑。ii.抗體生成用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)改動的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化即將DNA導(dǎo)入原核宿主，使得DNA能夠進(jìn)行復(fù)制，或是作為染色體外元件或是通過染色體成分。根據(jù)所用宿主細(xì)胞，使用適于這些細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。采用氯化釣的鈣處理通常用于具有堅(jiān)固細(xì)胞壁屏障的細(xì)菌細(xì)胞。另一種轉(zhuǎn)化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的還有一種技術(shù)是電穿孔。在本領(lǐng)域知道的且適于培養(yǎng)選定宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生成本發(fā)明多肽的原核細(xì)胞。合適培養(yǎng)基的實(shí)例包括添加了必需營養(yǎng)補(bǔ)充物的LB培養(yǎng)基(Luriabroth)。在有些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還含有根據(jù)表達(dá)載體的構(gòu)建而選擇的選擇劑，以選擇性容許包含表達(dá)載體的原核細(xì)胞生長。例如，向用于培養(yǎng)表達(dá)氨芐青霉素抗性基因的細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加氨千青霉素。除了碳、氮、和無機(jī)磷酸鹽來源以外，還可含有適當(dāng)濃度的任何必需補(bǔ)充物，或是單獨(dú)加入或是作為與另一種補(bǔ)充物或培養(yǎng)基的混合物，諸如復(fù)合氮源。任選的是，培養(yǎng)基可含有一種或多種選自下組的還原劑谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巰基乙酸鹽/酯、二硫赤蘚糖醇和二硫蘇糖醇。在合適的溫度培養(yǎng)原核宿主細(xì)胞。例如，對于培養(yǎng)大腸桿菌，優(yōu)選的溫度范圍是約20'C至約39。C,更優(yōu)選約25。C至約37'C，甚至更優(yōu)選約3(TC。主要取決于宿主生物體，培養(yǎng)基的pH可以是范圍為約5至約9的任何pH。對于大腸桿菌，pH優(yōu)選約6.8至約7.4，更優(yōu)選約7.0。如果本發(fā)明的表達(dá)載體中使用誘導(dǎo)型啟動子，那么在適于激活啟動子的條件下誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。在本發(fā)明的一個方面，使用PhoA啟動子來控制多肽的轉(zhuǎn)錄。因此，為了誘導(dǎo)，在磷酸鹽限制培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)過轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。優(yōu)選的是，磷酸鹽限制培養(yǎng)基是C.R.A.P培養(yǎng)基(參見例如Simmonsetal.,J.Immunol.Methods263:133-147(2002))。根據(jù)所采用的載體構(gòu)建物，可采用多種其它誘導(dǎo)物，正如本領(lǐng)域所知道的。在一個實(shí)施方案中，所表達(dá)的本發(fā)明多肽分泌到宿主細(xì)胞的周質(zhì)中并從中回收。蛋白質(zhì)回收通常涉及破壞微生物，通常通過諸如滲壓震擾(osmoticshock)、超聲處理或裂解等手段。一旦細(xì)胞遭到破壞，可通過離心或過濾清除細(xì)胞碎片或整個細(xì)胞?？梢酝ㄟ^例如親和樹脂層析進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)。或者，蛋白質(zhì)可能轉(zhuǎn)運(yùn)到培養(yǎng)液中并從中分離?？蓮呐囵B(yǎng)液清除細(xì)胞，并將培養(yǎng)物上清液過濾和濃縮，用于進(jìn)一步純化所生成蛋白質(zhì)?？墒褂闷毡橹赖姆椒ㄖT如聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和Westem印跡分析進(jìn)一步分離和鑒定所表達(dá)蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個方面，通過發(fā)酵過程大量進(jìn)行抗體生產(chǎn)。多種大規(guī)j莫補(bǔ)料-分批發(fā)酵流程可用于生產(chǎn)重組蛋白。大規(guī)模發(fā)酵具有至少1000升的容量，優(yōu)選約1，000至100,000升的容量。這些發(fā)酵罐使用攪拌器葉輪來分配氧和養(yǎng)分，尤其是葡萄糖(優(yōu)選的碳源/能源)。小規(guī)模發(fā)酵通常指在體積容量不超過約100升的發(fā)酵罐中進(jìn)行的發(fā)酵，范圍可以是約1升至約100升。在發(fā)酵過程中，通常在將細(xì)胞在合適條件下培養(yǎng)至期望密度(如OD550約180-220，在此階段細(xì)胞處于早期穩(wěn)定期)后啟動蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)。根據(jù)所采用的載體構(gòu)建物，可使用多種誘導(dǎo)物，正如本領(lǐng)域知道的和上文描述的?？稍谡T導(dǎo)前將細(xì)胞培養(yǎng)更短的時間。通常將細(xì)胞誘導(dǎo)約12-50小時，但是可使用更長或更短的誘導(dǎo)時間。為了提高本發(fā)明多肽的產(chǎn)量和質(zhì)量，可修改多項(xiàng)發(fā)酵條件。例如，為了改善所分泌抗體多肽的正確裝配和折疊，可使用過度表達(dá)伴侶蛋白諸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴倡活性的一種肽基脯氨酰-順式,反式-異構(gòu)酶)的額外載體來共轉(zhuǎn)化宿主原核細(xì)胞。已經(jīng)證明伴侶蛋白促進(jìn)在細(xì)菌宿主細(xì)胞中生成的異源蛋白質(zhì)的正確折疊和溶解度。Chenetal.,J.Biol.Chem.274:19601-19605(1999);Georgiou等人，美國專利6，083,715;Georgiou等人，美國專利6,027，888;BothmannandPluckthun，J.Biol.Chem.275:17100-17105(2000);RammandPluckthun,J.Biol.Chem.275:17106-17113(2000);Arieetal.，Mol.Microbiol.39:199-210(2001))。為了將所表達(dá)異源蛋白質(zhì)(尤其是對蛋白水解敏感的異源蛋白質(zhì))的蛋白水解降至最低，可將蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌抹用于本發(fā)明。例如，可修飾宿主細(xì)胞菌抹，在編碼已知細(xì)菌蛋白酶的基因中進(jìn)行遺傳突變，諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合。可以獲得有些大腸桿菌蛋白酶缺陷菌抹，參見例如Jolyetal.,(1998)見上文；Georgiou等人，美國專利5,264,365;Georgiou等人，美國專利5，508,192;Haraetal.,MicrobialDrugResistance2:63-72(1996》在一個實(shí)施方案中，在本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中使用蛋白水解酶缺陷且經(jīng)過過度表達(dá)一種或多種伴侶蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌林作為宿主細(xì)胞。iii.抗體純化可采用本領(lǐng)域知道的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法。下面的流程是合適純化流程的例示免疫親和或離子交換柱上的分餾、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或陽離子交換樹脂諸如DEAE上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀、和使用例如SephadexG-75的凝膠過濾。在一個方面，將固定在固相上的蛋白A用于本發(fā)明全長抗體產(chǎn)物的免疫親和純化。蛋白A是來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureas)的41kD細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，它以高親和力結(jié)合抗體Fc區(qū)。Lindmarketal.，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白A固定其上的固相優(yōu)選具有玻璃或石英表面的柱子，更優(yōu)選可控孔徑玻璃柱或硅酸柱。在有些應(yīng)用中，柱子以諸如甘油等試劑包被，試圖防止污染物的非特異粘附。作為純化的第一步，將衍生自如上所述細(xì)胞培養(yǎng)物的制備物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗體特異結(jié)合蛋白A。然后清洗固相以清除與固相非特異結(jié)合的污染物。最后通過洗脫從固相回收目的抗體。b.使用真核宿主細(xì)胞生成抗體載體構(gòu)件通常包括但不限于如下一種或多種信號序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)志基因、增強(qiáng)子元件、啟動子、和轉(zhuǎn)錄終止序列。(i)信號序列構(gòu)件在真核宿主細(xì)胞中使用的載體還可在目的成熟蛋白質(zhì)或多肽的N端包含信號序列或具有特異切割位點(diǎn)的其它多肽。優(yōu)選受到宿主細(xì)胞識別并加工(即被信號肽酶切除)的異源信號序列。在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)中，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導(dǎo)，例如單純皰滲病毒gD信號。將這些前體區(qū)的DNA連接到編碼抗體的DNA的讀碼框中。(ii)復(fù)制起點(diǎn)通常，哺乳動物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點(diǎn)構(gòu)件。例如，SV40起點(diǎn)通?？赡苤灰虬缙趩幼硬攀褂?。(iii)選擇基因構(gòu)件表達(dá)和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標(biāo)志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(zhì)(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，如氨千青霉素、新霉素、曱氨蝶呤或四環(huán)素；(b)補(bǔ)足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷；或(c)提供不能從復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)物。選擇方案的一個實(shí)例利用藥物來阻滯宿主細(xì)胞的生長。經(jīng)異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞生成賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)，因而幸免于選擇方案。此類顯性選擇的實(shí)例使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。適于哺乳動物細(xì)胞的選擇標(biāo)志的另一個實(shí)例是能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的細(xì)胞的選擇標(biāo)志，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白I和II優(yōu)選靈長類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。例如，首先通過將所有轉(zhuǎn)化子在含有曱氨蝶呤(Mtx,DHFR的一種竟?fàn)幮赞卓箘?的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來鑒定經(jīng)DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在采用野生型DHFR時，適宜的宿主細(xì)胞是DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系(如ATCCCRL-9096)?；蛘?，可通過在含有針對選擇標(biāo)志的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來選擇經(jīng)編碼抗體、野生型DHFR蛋白、和另一種選擇標(biāo)志諸如氨基糖苷3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(特別是包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)。參見美國專利4,965,199。(iv)啟動子構(gòu)件表達(dá)和克隆載體通常包含受到宿主生物體識別的啟動子，且與抗體多肽核酸可操作連接。已知真核細(xì)胞的啟動子序列。事實(shí)上，所有真核基因都具有富含AT區(qū)，它位于起始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)上游約25至30個堿基處。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游70至80個堿基處發(fā)現(xiàn)的另一種序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信號。所有這些序列合適的插入真核表達(dá)載體中。在哺乳動物宿主細(xì)胞中由載體轉(zhuǎn)錄抗體多肽受到例如從病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如2型腺病毒)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40))基因組獲得的、來自異源哺乳動物啟動子(如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)的、來自熱休克啟動子的啟動子的控制，倘若這些啟動子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該片段還包含SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)。方便的以HindIIIE限制性片段的形式獲得人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動子。美國專利4,419，446中公開了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達(dá)DNA的系統(tǒng)。美國專利4,601,978中記載了該系統(tǒng)的一種修改或者，可使用勞氏肉瘤病毒長末端重復(fù)序列作為啟動子。(v)增強(qiáng)子元件構(gòu)件常常通過在載體中插入增強(qiáng)子序列來提高高等真核細(xì)胞對編碼本發(fā)明抗體多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在知道來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、ot-胎蛋白和胰島素)的許多增強(qiáng)子序列。然而，通常使用來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括SV40復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的增強(qiáng)子(bp100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強(qiáng)子、多瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的增強(qiáng)子、和腺病毒增強(qiáng)子。關(guān)于激活真核啟動子的增強(qiáng)元件還可參見Yaniv,Nature297:17-18(1982)。增強(qiáng)子可剪接到載體中，位于抗體多肽編碼序列的5'或3'位置，但是優(yōu)選位于啟動子的5'位點(diǎn)。(vi)轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件在真核宿主細(xì)胞中使用的表達(dá)載體通常還包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類序列通?？蓮恼婧嘶虿《綝NA或cDNA非翻譯區(qū)的5'端和偶爾的3'端獲得。這些區(qū)域包含在編碼抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中轉(zhuǎn)錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件是牛生長激素聚腺苷酸化區(qū)。參見WO94/11026及其中公開的表達(dá)載體。(vii)宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化適于克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的宿主細(xì)胞包括本文描述的高等真核細(xì)胞，包括脊推動物宿主細(xì)胞。脊推動物細(xì)胞在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)流程。有用哺乳動物宿主細(xì)胞系的實(shí)例有經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7，ATCCCRL1651)、人胚腎系(293細(xì)胞或?yàn)閼腋∨囵B(yǎng)而亞克隆的293細(xì)胞，Grahametal.，J.Gen.Virol.36:59(1977))、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCCCCL10)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞/-0^11(CHO，Urlaubetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))、小鼠塞托利(Sertoli)細(xì)胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))、猴腎細(xì)胞(CVl，ATCCCCL70)、非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCCCRL1587)、人宮頸癌細(xì)月包(HELA，ATCCCCL2)、犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCCCCL34)、牛鼠(buffalorat)肝細(xì)胞(BRL3A，ATCCCRL1442)、人肺細(xì)胞(W138,ATCCCCL75)、人肝細(xì)胞(HepG2，HB8065)、小鼠乳瘤(MMT060562，ATCCCCL51)、TRI細(xì)胞(Matheretal.，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))、MRC5細(xì)胞、FS4細(xì)胞和人肝細(xì)胞瘤(hepatoma)系(HepG2)。為了生成抗體，用上文所述表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)改動的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。(viii)宿主細(xì)力包的i咅養(yǎng)可在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生成本發(fā)明抗體的宿主細(xì)胞。商品化培養(yǎng)基諸如Ham氏FlO(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏修改Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM,Sigma)適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，可使用下列文獻(xiàn)中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基Hametal"Meth.Enz.58:44(1979);Barnesetal"Anal.Biochem.102:255(1980);美國專利4，767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美國專利復(fù)審30,985。任何這些培養(yǎng)基可根據(jù)需要補(bǔ)充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運(yùn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、4丐、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苦酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機(jī)化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以適宜濃度含有本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何其它必需補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件諸如溫度、pH等即為表達(dá)而選擇的宿主細(xì)胞先前所用的，這對于普通技術(shù)人員是顯然的。(ix)抗體的純化在使用重組技術(shù)時，可在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，那么首先需要通過例如離心或超濾清除微粒碎片，或是宿主細(xì)胞或是裂解片段。如果抗體分泌到培養(yǎng)基中，那么通常首先使用商品化蛋白質(zhì)濃縮濾器(例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元)濃縮來自這些表達(dá)系統(tǒng)的上清液。可在任何上述步驟中包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外來污染物的生長?？墒褂美缌u磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析(優(yōu)選的純化技術(shù)是親和層析)來純化從細(xì)胞制備的抗體組合物。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人yl、丫2、或y4重鏈的抗體(Lindmarketal.，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人^(Gussetal.,EMBOJ.5:1567-1575(1986))。親和配體所附著的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但是可使用其它基質(zhì)。物理穩(wěn)定的基質(zhì)諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙晞)苯能獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時間。若抗體包含CH3結(jié)構(gòu)域，則可使用BakerbondABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)進(jìn)行純化。根據(jù)待回收的抗體，也可使用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)諸如離子交換柱上的分餾、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的層析、肝素SEPHAROSETM上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。在任何初步純化步驟之后，可將含有目的抗體和污染物的混合物進(jìn)行低pH疏水相互作用層析，使用pH約2.5-4.5的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度(如約0-0.25M鹽)進(jìn)行。免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還提供了包含偶聯(lián)有細(xì)胞毒劑的本文所述任何抗EphB4抗體的免疫偶聯(lián)物(可互換的稱為"抗體-藥物偶聯(lián)物"或"ADC")，所述細(xì)胞毒劑諸如化療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(如細(xì)菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)?？贵w-藥物偶聯(lián)物在癌癥治療中用于局部投遞毒害細(xì)胞劑或抑制細(xì)胞試劑(即用于殺死或抑制腫瘤細(xì)胞的藥物)的用途(SyrigosandEpenetos，AnticancerResearch19:605-614(1999);Niculescu-DuvazandSpringer,Adv.Drg.Del.Rev.26:151-172(1997);美國專利4，975，278)能將藥物部分輩巴向投遞至腫瘤，并在那兒進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)積累，而系統(tǒng)施用這些未經(jīng)偶聯(lián)的藥物試劑可能在試圖消除的腫瘤細(xì)胞以外導(dǎo)致不可接受的對正常細(xì)胞的毒性水平(Baldwinetal.,Lancet603-05(1986年5月15日)；Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview"，在《MonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications》中，A.Pinchera等人編，第475-506頁，1985)。由此試圖獲得最大功效及最小毒性。多克隆抗體和單克隆抗體皆有報道可用于這些策略(Rowlandetal.，CancerImmunol.Immunother.21:183-87(1986))。這些方法中所使用的藥物包括道諾霉素(daunomycin)、多柔比星(doxombicin)、曱氨蟲萊呤(methotrexate)和長春地辛(vindesine)(Rowlandetal.,1986，見上文)。抗體-毒素偶聯(lián)物中所使用的毒素包括細(xì)菌毒素諸如白喉毒素、植物毒素諸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素諸如格爾德霉素(geldanamycin)(Mandleretal.，Jour,oftheNat.CancerInst.92(19):1573-1581(2000);Mandleretal.,Bioorganic&Med.Chem.Letters10:1025-1028(2000》Mandleretal.，BioconjugateChem.13:786-791(2002))、美登木素生物堿類(EP1391213;Liuetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996))、和加利車霉素(Lodeetal.,CancerRes.58:2928(1998);Hinmanetal.,CancerRes.53:3336-3342(1993))。毒素可通過包括微管蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合或拓樸異構(gòu)酶抑制在內(nèi)的機(jī)制發(fā)揮其毒害細(xì)胞和抑制細(xì)胞的效果。有些細(xì)胞毒藥物在與大的抗體或蛋白質(zhì)受體配體偶聯(lián)時趨于失活或活性降低。ZEVALIN(ibritumomabtiuxetan，Biogen/Idec)是由4十》t在正常和惡性B淋巴細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的CD20抗原的鼠IgG1K單克隆抗體與通過硫脲接頭-螯合劑所結(jié)合的111In或90Y放射性同位素構(gòu)成的抗體-放射性同位素偶聯(lián)物(Wisemanetal.，Eur.Jour.Nucl.Med.27(7):766-77(2000);Wisemanetal.，Blood99(12):4336-42(2002);Witzigetal.，J.Clin.Oncol.20(10):2453-63(2002);Witzigetal.,J.Clin.Oncol.20(15):3262-69(2002))。盡管ZEVALIN具有針對B細(xì)胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施藥在大多數(shù)患者中導(dǎo)致嚴(yán)重且長時間的血細(xì)胞減少。MYLOTARGTM(gemtuzumabozogamicin,WyethPharmaceuticals)，即由人CD33抗體與加利車霉素連接而構(gòu)成的抗體-藥物偶聯(lián)物，在2000年批準(zhǔn)用于經(jīng)注射治療急性骨髓性白血病(DrugsoftheFuture25(7):686(2000);美國專利4970198;5079233;5585089;5606040;5693762;5739116;5767285;5773001)。Cantuz腿bmertansine(ImmunogenInc.),即由huC242抗體經(jīng)二硫化物接頭SPP與美登木素生物堿藥物部分DMl連接而構(gòu)成的抗體-藥物偶聯(lián)物，正在進(jìn)行用于治療表達(dá)CanAg的癌癥諸如結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期試驗(yàn)。MLN-2704(MillenniumPharm.,BZLBiologies,ImmunogenInc.)，即由抗前列A泉特異膜抗原(PSMA)單克隆抗體與美登木素生物堿藥物部分DMl連接而構(gòu)成的抗體-藥物偶聯(lián)物，正在進(jìn)行用于前列腺肺瘤潛在治療的開發(fā)。將多拉司他汀(dolastatin)的合成類似物auristatin肽、auristatinE(AE)和單曱基auristatin(MMAE)與嵌合單克隆抗體cBR96(對癌上的LewisY特異)和cAC10(對惡性血液腫瘤上的CD30特異)偶聯(lián)(Doroninaetal.，NatureBiotechnology21(7):778-784(2003))，且正在進(jìn)行治療性開發(fā)。本文(例如上文)描述了可用于生成免疫偶聯(lián)物的化療劑?？墒褂玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅纟錄4叚單月包菌Pseudomonasaeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A《連、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、a-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、月巴急草(sapaonariaofficinalis)抑制物、白樹毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孑包菌素(trichothecenes)。參見例如1993年10月28日公開的WO93/21232。多種放射性核素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。實(shí)例包括212Bi、1311、131In、卯Y和186Re?？贵w和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯曱酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯曱?；?己二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如l,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitettaetal.,Science238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的l-異硫氰酸苯曱基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核芬酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO94/11026。本文還設(shè)想了抗體與一種或多種小分子毒素諸如加利車霉素(calicheamicin)、美登木素生物石成類(maytansinoids)、多拉司他、汀類(dolostatins)、aurostatins、單端孢霉素(trichothecene)和CC1065及這些毒素具有毒素活性的片段的偶聯(lián)物。i.美登素和美登木素生物堿類在有些實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物包含偶聯(lián)有一個或多個美登木素生物堿分子的本發(fā)明抗體(全長或片段)。美登木素生物堿類是通過抑制微管蛋白多聚化來發(fā)揮作用的有絲分裂抑制劑。美登素最初從東非灌木齒葉美登木(Maytenusserrata)分離得到(美國專利3，896,111)。隨后發(fā)現(xiàn)某些微生物也生成美登木素生物堿類，諸如美登醇和C-3美登醇酯(美國專利4，151,042)。例如下列美國專利公開了合成美登醇及其書亍生物和類似物4,137,230;4，24S，870;4,256,746;4,260,6084,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,9464,315,929;4，317，821;4，322，348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,2194,450,254;4,362,663;及4，371,533。美登木素生物堿類藥物模塊在抗體藥物偶聯(lián)物中是有吸引力的藥物模塊，因?yàn)樗鼈?i)相對易于通過發(fā)酵或發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)修飾、衍生化來制備；(ii)易于用適于通過非二硫化物接頭的偶聯(lián)的官能基衍生化；(iii)在血漿中穩(wěn)定；且(iv)有效針對多種腫瘤細(xì)胞系。治療用途美國專利5，208，020;5，416，064;及歐洲專利EP0425235Bl，明確將其公開內(nèi)容收入本文作為參考。Liuetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996)記載了包含與針對人結(jié)腸直腸癌的單克隆抗體C242連接的稱為DM1的美登木素生物堿的免疫偶聯(lián)物。發(fā)現(xiàn)該偶聯(lián)物具有針對培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞的高度細(xì)胞毒性，而且在體內(nèi)腫瘤生長測定法中顯示抗腫瘤活性。Charietal.,CancerResearch52:127-131(1992)記載了其中美登木素生物堿經(jīng)二碌u化物接頭與結(jié)合人結(jié)腸癌細(xì)胞系上抗原的鼠抗體A7或結(jié)合HER-2/neu癌基因的另一種鼠單克隆抗體TA.1偶聯(lián)的免疫偶聯(lián)物。在體外在人乳癌細(xì)胞系SK-BR-3上測試了TA.l-美登木素生物堿偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性，該細(xì)胞系每個細(xì)胞表達(dá)3xl()S個HER-2表面抗原。藥物偶聯(lián)物達(dá)到了與游離美登木素生物堿藥物相似的一定程度的細(xì)胞毒性，這可通過增加每個抗體分子偶聯(lián)的美登木素生物堿分子數(shù)目來提高。A7-美登木素生物堿偶聯(lián)物在小鼠中顯示低系統(tǒng)性細(xì)月包毒性。連接且不顯著削弱抗體或美登木素生物堿分子的生物學(xué)活性來制備。參見例如美國專利No.5,208,020，明確將其公開內(nèi)容收入本文作為參考。每個抗體分子偶聯(lián)平均3-4個美登木素生物堿分子在增強(qiáng)針對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性中顯示功效，且對抗體的功能或溶解度沒有負(fù)面影響，盡管預(yù)計甚至一個分子的毒素/抗體也將較之棵抗體的使用增強(qiáng)細(xì)胞毒性。美登木素生物堿類在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且可通過已知技術(shù)合成或從天然來源分離。例如美國專利生物堿類。優(yōu)選的美登木素生物堿類是美登醇和美登醇分子的芳香環(huán)或其它位置經(jīng)過^"飾的美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。本領(lǐng)域知道許多連接基團(tuán)可用于制備抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物，包括例如美國專利5,208,020或歐洲專利0425235Bl;Charietal.，CancerResearch52:127-131(1992);2004年10月9日提交的美國專利申請No.10/960,602中所公開的，明確將其公開內(nèi)容收入本文作為參考。包含接頭構(gòu)件SMCC的抗體-美登木素生物堿類偶聯(lián)物可以如2004年10月8日提交的美國專利申請No.10/960，602中所披露的來制備。連接基團(tuán)包括二硫化物基團(tuán)、硫醚基團(tuán)、酸不穩(wěn)定基團(tuán)、光不穩(wěn)定基團(tuán)、肽酶不穩(wěn)定基團(tuán)、或酯酶不穩(wěn)定基團(tuán)，正如上文所述專利中所公開的，優(yōu)選二硫化物和硫醚基團(tuán)。本文中描述和例示了別的連接基團(tuán)。可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體和美登木素生物堿的偶聯(lián)物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡咬基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨基曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯(SMCC)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯曱?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯曱酰基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如l，5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。特別優(yōu)選的偶聯(lián)劑包括N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlssonetal.，Biochem.J.173:723-737(1978))和N-琥珀酰亞氨基-4-(2-吡咬基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫鍵連接。根據(jù)連接的類型，可將接頭附著于美登木素生物堿分子的多個位置。例如，可使用常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)通過與羥基的反應(yīng)來形成酯鍵。反應(yīng)可發(fā)生在具有輕基的C-3位置、經(jīng)羥曱基修飾的C-14位置、經(jīng)羥基修飾的C-15位置、和具有羥基的C-20位置。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在美登醇或美登醇類似物的C-3位置形成鍵連接。ii.Auristatin和多4立司4也汀在有些實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物包含與多拉司他汀類(dolastatins)或多拉司他汀肽類似物及衍生物、auristatin類偶聯(lián)的本發(fā)明抗體(美國專利No.5,635,483;5,780,588)。多拉司他汀類和auristatin類已經(jīng)顯示出干擾微管動力學(xué)、GTP水解、及核和細(xì)胞分裂(Woykeetal(2001)Antimicrob.AgentsandChemother.45(12):3580-3584)且具有抗癌(US5，663，149)和抗真菌活性(Pettitetal(1998)Antimicrob.AgentsChemother.42:2961-2965)。多才立司他汀或auristatin藥物模塊可經(jīng)由肽藥物模塊的N(氨基)末端或C(羧基)末端附著于抗體(WO02/088172)。例示性的auristatin實(shí)施方案包括N-末端連接的單曱基auristatin藥物模塊DE和DF，披露于"MonomethylvalineCompoundsCapableofConjugationtoLigands"，US流水號No.10/983,340,2004年11月5日提交，明確將其公開內(nèi)容完整收入本文作為參考。典型的是,基于肽的藥物模塊可通過在兩個或多個氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵來制備。此類肽鍵可依照例如肽化學(xué)領(lǐng)域眾所周知的液相合成法來制備(參見E.Schr6derandK.Ltibke，ThePeptides,volume1,pp76-136，1965,AcademicPress)。auristatin/多拉司他汀藥物才莫塊可依照以下文獻(xiàn)中的方法來制備US5,635,483;US5,780,588;Pettitetal(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465;Pettitetal(1998)Anti-CancerDrugDesign13:243-277;Pettit，G.R.，etal.Synthesis,1996，719-725;Pettitetal(1996)J.Chem.Soc.PerkinTrans.15:859畫863;及Doronina(2003)NatBiotechnol21(7):778-784;"MonomethylvalineCompoundsCapableofConjugationtoLigands，，,美國5充7K號No.10/983,340,2004年11月5日提交，將其完整收入本文作為參考(披露了例如制備諸如MMAE和MMAF偶聯(lián)至接頭的單甲基纈氨酸化合物的接頭和方法)。iii.加利車霉素在其它說是反拿中，免疫偶聯(lián)物包含偶聯(lián)有一個或多個加利車霉素分子的本發(fā)明抗體。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度生成雙鏈DNA斷裂。關(guān)于加利車霉素家族偶聯(lián)物的制備參見美國專利5，712,374;5,714,586;5，739，116;5,767,285;5,770,701;5,770,710;5,773,001;5,877,296(都授予美國Cyanamid公司)?？捎玫募永嚸顾亟Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于YlI、a2I、a3I、N-乙?；?ylI、PSAG和eil(Hinmanetal.，CancerResearch53:3336-3342(1993);Lodeetal.，CancerResearch58:2925-2928(1998);及上述授予美國Cyanamid公司的美國專利)?？膳c抗體綴合的另一種抗腫瘤藥物是QFA，它是一種抗葉酸藥物。加利車霉素和QFA都具有胞內(nèi)作用位點(diǎn)，且不易穿過質(zhì)膜。因此，這些試劑經(jīng)由抗體介導(dǎo)的內(nèi)在化的細(xì)胞攝取大大增強(qiáng)了它們的細(xì)胞毒效果。iv.其它細(xì)力包毒劑可與本發(fā)明抗體偶聯(lián)的其它抗腫瘤劑包括BCNU、鏈佐星(streptozoicin)、長春新堿(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美國專利5，053,394、5，770,710中記載的統(tǒng)稱為LL-E33288復(fù)合物的試劑家族、及埃斯波霉素類(esperamicins)(美國專利5,877,296)?？捎玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa),蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)A鏈、a-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、月巴鬼草(sapaonariaofficinalis)才卬制物、白初于毒蛋白(gelonin)、絲才木霉素(mitogellin)、局卩艮曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依i若霉素(enomycin)和單端孢菌素(trichothecenes)。參見例如1993年10月28日公布的WO93/21232。本發(fā)明還設(shè)想了抗體和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶，諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成的免疫偶聯(lián)物。為了選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。實(shí)例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb^和Lu的放射性同位素。在將偶聯(lián)物用于檢測時，可包含放射性原子用于閃爍照相研究，例如Tc"m或I123，或是包含自旋標(biāo)記物用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，mri)，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、禮、錳或鐵?？梢砸阎绞綄⒎派湫曰蚱渌鼧?biāo)記物摻入偶聯(lián)物。例如，可生物合成肽，或是通過化學(xué)氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氪的合適氨基酸前體?？山?jīng)肽中的半胱氨酸殘基來附著標(biāo)記物，諸如Tc99m或I123、Rel86、Rel88和In111。可以經(jīng)賴氨酸殘基來附著釔-90。IODOGEN法(Frakeretal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57(1978))可用于摻入械-123?！禡onoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy》(Chatal,CRCPress,1989)詳細(xì)記載了其它方法?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨基曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯(SMCC)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯曱?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯曱?；?-乙二胺)、二異硫氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如l,5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitettaetal.，Science238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的l-異硫氰酸苯曱基-3-甲基二亞乙基三胺五乙WO94/11026。接頭可以是便于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒藥物的"可切割接頭"。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、光不穩(wěn)定接頭、二曱基接頭、或含二硫化物接頭(Charietal.,CancerResearch52:127-131(1992);美國專利5,208,020)。本發(fā)明的化合物明確涵蓋但不限于用下列交聯(lián)劑制備的ADC:商品化(如購自PierceBiotechnologyInc.,Rockford,IL,U.S.A.)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC畫SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亞胺基-(4-乙烯基砜)苯曱酸酯)。見2003-2004年度應(yīng)用手冊和產(chǎn)品目錄(ApplicationsHandbookandCatalog)第467-498頁。v.抗體-藥物偶聯(lián)物的制備在本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)中，將抗體(Ab)經(jīng)接頭(L)與一個或多個藥物部分(D)綴合，例如每個抗體偶聯(lián)約1個至約20個藥物部分。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)、條件和試劑通過數(shù)種路徑來制備通式I的ADC,包括(l)抗體的親核基團(tuán)經(jīng)共價鍵與二價接頭試劑反應(yīng)，形成Ab-L，隨后與藥物部分D反應(yīng)；和(2)藥物部分的親核基團(tuán)經(jīng)共價鍵與二價接頭試劑反應(yīng)，形成D-L，隨后與抗體的親核基團(tuán)反應(yīng)。本文中描述了用于制備ADC的別的方法。Ab—(L—D)pI接頭可以由一種或多種接頭構(gòu)件構(gòu)成。例示性的接頭構(gòu)件包括6-馬來酰亞胺己?；?"MC")、馬來酰亞胺丙?；?"MP")、纈氨酸-瓜氨酸("val-cit")、丙氨酸-苯丙氨酸("ala-phe")、對氨基千氧羰基("PAB")、4-(2-吡啶基硫代)戊酸N-琥珀酰亞氨基酯("SPP")、4-(N-馬來酰亞胺曱基)環(huán)己烷-l羧酸N-琥珀酰亞氨基酯("SMCC')、和(4-碘-乙?；?氨基苯曱酸N-琥珀酰亞氨基酯("SIAB")。本領(lǐng)域知道別的接頭構(gòu)件，本文也描述了一些。還可參見"MonomethylvalineCompoundsCapableofConjugationtoLigands，'，美國流水號No.10/983,340，2004年11月5日提交，將其完整內(nèi)容收入本文作為參考。在有些實(shí)施方案中，接頭可包含氨基酸殘基。例示性的氨基酸接頭構(gòu)件包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括纈氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括甘氨酸-纈氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。構(gòu)成氨基酸接頭構(gòu)件的氨基酸殘基包括那些天然存在的氨基酸，以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸類似物，諸如瓜氨酸。氨基酸接頭構(gòu)件可以在它們的特定酶(例如肺瘤相關(guān)蛋白酶，組織蛋白酶B、C和D，或纖溶酶蛋白酶)的酶促切割的選擇性方面進(jìn)行設(shè)計和優(yōu)化?？贵w的親核基團(tuán)包括但不限于(i)N末端氨基；(ii)側(cè)鏈氨基，如賴氨酸；(iii)側(cè)鏈巰基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗體中糖的羥基或氨基。氨基、巰基、和羥基是親核的，能夠與接頭部分上的親電子基團(tuán)反應(yīng)而形成共價鍵，而接頭試劑包括(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、卣代曱酸酯、和酸性卣化物；(ii)烷基和苯曱基卣化物，諸如卣代乙酰胺；(iii)醛類、酮類、羧基和馬來酰亞胺基團(tuán)。某些抗體具有可還原的鏈間二硫鍵，即半胱氨酸橋?？赏ㄟ^還原劑諸如DTT(二硫蘇糖醇)處理使抗體具有與接頭試劑綴合的反應(yīng)活性。每個半胱氨酸橋理論上將形成兩個反應(yīng)性硫醇親核體?？山?jīng)由賴氨酸與2-亞氨基硫烷(Traut氏試劑)的反應(yīng)，導(dǎo)致胺轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼迹瑥亩鴮㈩~外親核基團(tuán)引入抗體?？梢酝ㄟ^導(dǎo)入一個、兩個、三個、四個、或更多個半胱氨酸殘基(例如制備包含一個或多個非天然半胱氨酸氨基酸殘基的突變型抗體)而將反應(yīng)性硫醇基導(dǎo)入抗體(或其片段)。還可通過修飾抗體來生成本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物，即引入可與接頭試劑或藥物上的親核取代基反應(yīng)的親電子部分?？捎美绺叩馑猁}氧化劑氧化糖基化抗體的糖，從而形成可與接頭試劑或藥物部分的胺基團(tuán)反應(yīng)的醛或酮基團(tuán)。所得亞胺Schiff堿基可形成穩(wěn)定的鍵，或者可用例如硼氫化物試劑還原而形成穩(wěn)定的胺連接。在一個實(shí)施方案中，糖基化抗體的碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應(yīng)可在蛋白質(zhì)中生成羰(醛和酮)基團(tuán)，它可與藥物上的適宜基團(tuán)反應(yīng)(Hermanson，BioconjugateTechniques)。在另一個實(shí)施方案中，包含N末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的蛋白質(zhì)可與偏高碘酸鈉反應(yīng)，導(dǎo)致在第一個氨基酸處生成醛(Geoghegan&Stroh,BioconjugateChem.3:138-146(1992);US5,362,852)。此類醛可與藥物部分或接頭親核體反應(yīng)。同樣，藥物部分上的親核基團(tuán)包括但不限于胺、硫醇、羥基、酰肼、肟、肼、縮氨基硫脲、耕羧酸酯、和芳基酰肼基團(tuán)，它們能夠與接頭部分上的親電子基團(tuán)反應(yīng)而形成共價鍵，而接頭試劑包括(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、卣代曱酸酯、和酸性囟化物；(ii)烷基和苯曱基卣化物，諸如鹵代乙酰胺；(iii)醛類、酮類、羧基、和馬來酰亞胺基團(tuán)?；蛘?，可通過例如重組技術(shù)或肽合成來制備包含抗體和細(xì)胞毒劑的融合蛋白。DNA的長度可包含各自編碼偶聯(lián)物兩個部分的區(qū)域，或是;f皮此毗鄰或是由編碼接頭肽的區(qū)域分開，該接頭肽不破壞偶聯(lián)物的期望特性。在又一個實(shí)施方案中，可將抗體與"受體"(諸如鏈霉親和素)偶聯(lián)從而用于腫瘤預(yù)先靶向，其中對患者施用抗體-受體偶聯(lián)物，接著使用清除劑由循環(huán)中清除未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用與細(xì)胞毒劑(如放射性核苦酸)偶聯(lián)的"配體"(如親合素)。藥用配制劑可通過將具有期望純度的抗體與任選的生理學(xué)可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合來制備包含本發(fā)明抗體的治療用配制劑，以水溶液、凍干或其它干燥劑型的形式貯存(Wem/"gto":7Tze5Wewceam/尸ra"/ceo//Vwrmacy20thedition(2000))。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，而且包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二曱基千基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯曱醇；對羥基苯曱酸烷基酯，諸如對羥基苯曱酸曱酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間曱酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬復(fù)合物(如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。本文中的配制劑還可含有超過一種所治療具體適應(yīng)癥所必需的活性化合物，優(yōu)選活性互補(bǔ)且彼此沒有不利影響的。合適的是，此類分子以對于預(yù)定目的有效的量組合?；钚猿煞诌€可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)、在膠狀藥物傳遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)、或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)公開于例如7^wV7gto":7Tze5We"cea/WPracf/ceo/P/zarmaqy20thedition(2000)。用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可容易的通過使用無菌濾膜過濾來實(shí)現(xiàn)?？芍苽涑掷m(xù)釋放配制劑。持續(xù)釋放配制劑的合適例子包括含有本發(fā)明免疫球蛋白的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)以定型產(chǎn)品的形式存在，如薄膜或微膠嚢。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利3,773，919)、L-谷氨酸和"乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠持續(xù)釋放分子IOO天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時間較短。當(dāng)膠嚢化抗體在體內(nèi)長時間維持時，它們可能由于暴露于37。C的潮濕環(huán)境而變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性損失和免疫原性可能改變?？筛鶕?jù)相關(guān)機(jī)制來設(shè)計合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是經(jīng)由硫醇-二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，那么可通過修飾巰基殘基、由酸性溶液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。用途本發(fā)明的抗體可用于例如體外、回體(exvivo)和體內(nèi)治療方法。一方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防與EphB4表達(dá)升高和/或活性升高有關(guān)的胂瘤、癌癥、和/或細(xì)胞增殖性病癥的方法，該方法包括給需要此類治療的受試者施用有效量的抗EphB4抗體。一方面，本發(fā)明提供了降低、抑制、或預(yù)防肺瘤或癌生長的方法，該方法包括給需要此類治療的受試者施用有效量的抗EphB4抗體。已經(jīng)將EphB4與發(fā)育中的胚胎中的運(yùn)動軸突導(dǎo)向和神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移聯(lián)系起來。因而，本發(fā)明的抗體還可用于治療(包括預(yù)防)其病理學(xué)涉及細(xì)胞退化/變性或功能障礙的病癥，諸如治療各種(慢性)神經(jīng)變性(退化)病癥和急性神經(jīng)細(xì)胞損傷。此類神經(jīng)變性(退化)病癥包括但不限于周圍神經(jīng)??；運(yùn)動神經(jīng)元病癥，諸如肌萎縮側(cè)索硬化(amylotrophiclateralsclerosis)(ALS,LouGehrig氏病)、貝耳氏(Bell)麻痹、和涉及脊髓性肌萎縮或麻痹的各種疾患；及其它人神經(jīng)變性疾病，諸如阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、癲癇、多發(fā)性硬化、亨廷頓氏舞蹈癥(Huntington'schorea)、唐氏綜合征(Down，ssyndrome)、神經(jīng)性耳聾、和梅尼爾氏(Meniere)??；及急性神經(jīng)細(xì)胞損傷，例如由外傷或脊髓損傷所致的。本發(fā)明的抗體還可用于抑制血管發(fā)生。在有些實(shí)施方案中，血管發(fā)生的部位就是腫瘤或癌。一方面，本發(fā)明提供了抑制血管發(fā)生的方法，該方法包括給需要此類治療的受試者施用有效量的抗EphB4抗體。一方面，本發(fā)明提供了治療與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患的方法，該方法包括給需要此類治療的受試者施用有效量的抗EphB4抗體。在有些實(shí)施方案中，所述與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患是腫瘤、癌癥、和/或細(xì)胞增殖性病癥。在有些實(shí)施方案中，所述與血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)疾患是眼內(nèi)新血管疾病。此外，本發(fā)明的至少一些抗體可結(jié)合來自其它物種的抗原。因而，本發(fā)明的抗體可用于結(jié)合特定抗原活性，例如，在包含抗原的細(xì)胞培養(yǎng)物中、在(例如黑猩猩、狒狒、狨、獼猴和恒河猴，豬或小鼠)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用于抑制抗原活性，通過使抗體與抗原接觸使得抗原活性受到抑制。優(yōu)選的是，所述抗原是人蛋白質(zhì)分子。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可用于結(jié)合患有與抗原表達(dá)升高和/或活性升高有關(guān)的病癥的受試者體內(nèi)抗原的方法，包括給受試者施用本發(fā)明的抗體使得受試者體內(nèi)的抗原得到結(jié)合。優(yōu)選的是，所述抗原是人蛋白質(zhì)分子且所述受試者是人受試者?；蛘撸茉囌呖梢允潜磉_(dá)本發(fā)明抗體所結(jié)合的抗原的哺乳動物。又或者，受試者可以是其中導(dǎo)入了抗原(例如通過施用抗原或通過表達(dá)抗原轉(zhuǎn)基因)的哺乳動物?？沙鲇谥委熌康膶⒈景l(fā)明的抗體施用于人受試者。此外，可出于獸醫(yī)目的將本發(fā)明的抗體施用于表達(dá)免疫球蛋白與之交叉反應(yīng)的抗原的非人哺乳動物(例如靈長類動物、豬或小鼠)，或是人疾病的動物模型。關(guān)于后者，此類動物模型可用于評估本發(fā)明抗體的治療功效(例如測試施藥的劑量和時程)。本發(fā)明的抗體可用于治療、抑制、延緩進(jìn)展、預(yù)防/延緩復(fù)發(fā)、改善或預(yù)防與一種或多種抗原分子的表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病、病癥、或疾患。例示性的病癥包括癌瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤、和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗狀癌)、腹膜癌、肝纟田月包癌(hepatocellularcancer)、胃癌(gastricorstomachcancer)(包4舌胃腸癌)、胰腺癌、成"交質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、尿道癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidneyorrenalcancer)、前列腺癌、外陰癌、曱狀腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、肛門癌、陰莖癌、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤和B細(xì)胞淋巴瘤、腦、以及頭頸癌、及相關(guān)轉(zhuǎn)移。在有些實(shí)施方案中，癌癥選自小細(xì)胞肺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤(neuroblastomas)、黑素瘤、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌(CRC)、和肝細(xì)胞癌。在某些實(shí)施方案中，將包含偶聯(lián)有一種或多種細(xì)胞毒劑的抗體的免疫偶聯(lián)物施用于患者。在有些實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物和/或它所結(jié)合的抗原由細(xì)胞內(nèi)在化，導(dǎo)致免疫偶聯(lián)物殺傷它所結(jié)合的靶細(xì)胞的治療功效提高。在一個實(shí)施方案中，細(xì)胞毒劑靶向或干擾靶細(xì)胞中的核酸。在一個實(shí)施方案中，細(xì)胞毒劑靶向或干擾微管聚合。此類細(xì)胞毒劑的實(shí)例包括本文所述任何化療劑(諸如美登木素生物堿類、auristatin、多拉司他汀、或加利車霉素)、放射性同位素、或核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶。在治療中，本發(fā)明的抗體可單獨(dú)使用，或者與其它組合物聯(lián)用。例如，本發(fā)明的抗體可與另一種抗體、化療劑(包括化療劑混合物)、其它細(xì)胞毒劑、抗血管發(fā)生劑、細(xì)胞因子、和/或生長抑制劑共施用。當(dāng)本發(fā)明的抗體抑制腫瘤生長時，可能特別希望將其if關(guān)合一種或多種抑制腫瘤生長的其它治療劑。或者/另外，患者可接受聯(lián)合放射療法(例如外部射束照射或使用放射性標(biāo)記藥劑諸如抗體的療法)。上文所述此類聯(lián)合療法包括聯(lián)合施藥(當(dāng)兩種或多種藥劑包含在相同或分開的配制劑中時)和分開施藥，在后一種情況中，本發(fā)明抗體的施用可發(fā)生在輔助療法的施用之前和/或之后。聯(lián)合療法如上所述，本發(fā)明提供了聯(lián)合療法，其中抗EphB4抗體與另一療法一起施用。例如，抗EphB4抗體與抗癌治療劑或抗新血管形成療法聯(lián)合使用以治療各種贅生性或非贅生性疾患。在一個實(shí)施方案中，所述贅生性或非贅生性疾患的特征在于與異常或不期望的血管發(fā)生有關(guān)的病理學(xué)病癥?？笶phB4抗體可以與對那些目的有效的另外的藥劑順次或聯(lián)合施用，或是在同一組合物中或是作為分開的組合物?；蛘?另外，可以施用EphB4的多種抑制劑?？笶phB4抗體的施用可以同時進(jìn)行，例如作為單一組合物或者作為兩種或多種不同的組合物，使用相同或不同的施用路徑?；蛘?另外，施藥可以以任一次序順次進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，兩種或多種組合物的施用之間可以有時間范圍為數(shù)分鐘、數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月的時間間隔。例如，可以先施用抗癌劑，接著是EphB4抑制劑。然而，也設(shè)想了同時施用或先施用抗EphB4抗體。與抗EphB4抗體聯(lián)合施用的治療劑的有效量取決于醫(yī)師或獸醫(yī)的判斷。完成劑量施用和調(diào)整以實(shí)現(xiàn)對待治療疾患的最大控制。此外劑量取決于諸如待使用的治療劑的類型和所治療的特定患者等因素?？拱﹦┑暮线m劑量就是當(dāng)前所用的那些，而且可以由于抗癌劑與抗EphB4抗體的聯(lián)合作用(協(xié)同)而降低。在某些實(shí)施方案中，抑制劑的組合增強(qiáng)單一抑制劑的功效。術(shù)語"增強(qiáng)"指治療劑在其常用或批準(zhǔn)的劑量功效得到提高。典型的是，抗EphB4抗體和抗癌劑適于相同或相似的疾病以阻斷或降j氐病理學(xué)病癥，諸如腫瘤生長或癌細(xì)胞時的生長。在一個實(shí)施方案中，所述抗癌劑是抗血管發(fā)生劑。與癌癥有關(guān)的抗血管發(fā)生療法是致力于抑制為支持腫瘤生長而提供養(yǎng)分所需要的腫瘤血管發(fā)育的癌癥治療策略。因?yàn)檠馨l(fā)生涉及原發(fā)性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移二者，所以本發(fā)明提供的血管發(fā)生治療不但能夠在原發(fā)性位點(diǎn)抑制腫瘤的贅生性生長，而且能夠預(yù)防胂瘤在繼發(fā)性位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移，從而容許由其它治療劑攻擊腫瘤。本領(lǐng)域已經(jīng)鑒定和知道許多抗血管發(fā)生劑，包括本文所列的那些，例如定義中所列的，還可參見例如CarmelietandJain,Nature4(X7:249-257(2000);Ferraraetal.,NatureReviews:DrugDiscovery,3:391-400(2004》SatoInt.J.Clin.Oncol.,8:200-206(2003)。還可參見美國專利申請US20030055006。在一個實(shí)施方案中，抗EphB4抗體與抗VEGF中和性抗體(或片段)和/或另外的VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑(包括但不限于例如可溶性VEGF受體(例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、neuropillins(例如NRP1、NRP2))片段)、能夠阻斷VEGF或VEGFR的適體、中和性抗VEGFR抗體、VEGFR酪氨酸激酶(RTK)的低分子量抑制劑、VEGF的反義策略、針對VEGF或VEGF受體的核酶、VEGF的拮抗性變體、及其組合聯(lián)合使用。或者/另外，任選的是，可以在VEGF拮抗劑和其它藥劑外對患者共施用兩種或多種血管發(fā)生抑制劑。在某些實(shí)施方案中，可以與抗EphB4抗體、VEGF拮抗劑和抗血管發(fā)生劑聯(lián)合施用一種或多種別的治療劑，例如抗癌劑。在本發(fā)明的某些方面，可用于抗EphB4抗體的聯(lián)合腫瘤療法的其它治療劑包括其它癌癥療法(例如手術(shù)、放射學(xué)治療(例如涉及照射或施用放射性物質(zhì))、化療、本文所列和本領(lǐng)域知道的抗癌劑的治療、或其組合)?；蛘?另外，結(jié)合本文披露的相同抗原或兩種或多種本文"t皮露的不同抗原的兩種或多種抗體可以共施用于患者。有時，還對患者施用一種或多種細(xì)胞因子可能是有益的?；焺┰谀承┓矫?，本發(fā)明提供了阻斷或降低腫瘤生長或癌細(xì)胞生長的方法，其通過對易感于或診斷有癌癥的患者施用有效量的EphB4拮抗劑和/或血管發(fā)生抑制劑和一種或多種化療劑來實(shí)現(xiàn)。多種化療劑可用于本發(fā)明的聯(lián)合治療方法。本文在"定義，，中提供了所設(shè)想的化療劑的例示性和非限制性列表。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會理解的，化療劑的適宜劑量一般在單獨(dú)或聯(lián)合其它化療劑施用該化療劑的臨床療法中早就采用的那些劑量附近變動。根據(jù)所治療的疾患，劑量有可能發(fā)生變化。施行治療的醫(yī)師能夠?yàn)槭茉囌邆€體確定適宜的劑量。復(fù)發(fā)性腫瘤生長本發(fā)明還提供了用于抑制或預(yù)防復(fù)發(fā)性腫瘤生長或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長的方法和組合物。復(fù)發(fā)性肺瘤生長或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長用于描述正在接受一種或多種當(dāng)前可用療法(例如癌癥療法，諸如化療、放療、手術(shù)、激素療法和/或生物學(xué)療法/免疫療法、抗VEGF抗體療法，特別是特定癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療方案)或用一種或多種當(dāng)前可用療法治療過的患者在臨床上不足以治療該患者或不再由該療法取得任何有益效果使得這些患者需要別的有效療法的狀況。在用于本文時，該表述還指"無響應(yīng)/頑固性(non-responsive/refractory)"患者的狀況，例如描述患者對療法有響應(yīng)但遭受副作用、形成抗性、對療法不響應(yīng)、對療法的響應(yīng)不令人滿意等。在各種實(shí)施方案中，癌癥是復(fù)發(fā)性肺瘤生長或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長，其中癌細(xì)胞數(shù)目沒有令人滿意的減少，或者增多了，或者腫瘤尺寸沒有顯著的縮小，或者增大了，或者癌細(xì)胞的尺寸或數(shù)目未能進(jìn)一步縮小或減少。確定癌細(xì)胞是否是復(fù)發(fā)性腫瘤生長或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長可以在體內(nèi)或在體外進(jìn)行，通過本領(lǐng)域知道的用于測定治療對癌細(xì)月包有效性的任何方法，在這樣的語境中使用本領(lǐng)域公認(rèn)的"復(fù)發(fā)性"或"頑固性"或"無響應(yīng)"的含義。對抗VEGF治療有抗性的肺瘤是復(fù)發(fā)性腫瘤生長(relapsetumorgrowth)的一個例子。本發(fā)明提供了在受試者中阻斷或降低復(fù)發(fā)性腫瘤生長或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長的方法，其通過施用一種或多種抗EphB4抗體以阻斷或降低受試者中的復(fù)發(fā)性腫瘤生長或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長來實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中，可以在癌癥治療劑之后施用所述拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，與癌癥療法同時施用抗EphB4抗體?；蛘?另外，抗EphB4抗體療法與另一癌癥療法交替施行，這可以以任意次序進(jìn)行。本發(fā)明還涵蓋施用一種或多種抑制性抗體來預(yù)防癌癥在有癌癥傾向的患者中發(fā)作或復(fù)發(fā)的方法。在一個實(shí)施方案中，癌癥療法是使用抗血管發(fā)生劑的治療，例如VEGF拮抗劑?？寡馨l(fā)生劑包括本領(lǐng)域知道的那些和本文定義中所列的那些。在一個實(shí)施方案中，抗血管發(fā)生劑是抗VEGF中和性抗體或片段(例如人源化的A4.6.1、AVASTIN(Genentech,SouthSanFrancisco,CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3等)。參見例如美國專利6,582,959,6,884,879，6,703,020;W098/45332;WO96/30046;WO94/10202;EP0666868B1;美國專利申請20030206899，20030190317，20030203409，20050112126;Popkovetal.,JournalofImmunologicalMethods288:149-164(2004);及W02005012359。別的藥劑可以與VEGF拮抗劑和抗EphB4抗體聯(lián)合施用以阻斷或降低復(fù)發(fā)性腫瘤生長或復(fù)發(fā)性癌細(xì)胞生長，例如見本文中標(biāo)題為"耳關(guān)合療法"的部分。皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)和鼻內(nèi)，以及損傷內(nèi)(如果希望局部治療的話)施用。胃腸外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用。另外，脈沖輸注抗體也是合適的，特別是以抗體劑量逐漸減小的形式?？赏ㄟ^任何合適路徑服藥，例如通過注射，諸如靜脈內(nèi)或皮下注射，這部分取決于施藥是短期的還是長期的?？梢耘c優(yōu)良醫(yī)學(xué)實(shí)踐一致的方式配制、劑量給藥和施用本發(fā)明的抗體組合物。在此內(nèi)容中考慮的因素包括所治療的具體病癥、所治療的具體哺乳動物、患者個體的臨床狀況、病癥的起因、投遞藥劑的部位、施藥的方法、施藥的日程安排、和醫(yī)學(xué)從業(yè)人員知道的其它因素。不是必需而是任選將抗體與目前用于預(yù)防或治療所討論病癥的一種或多種藥劑一起配制。此類其它藥劑的有效量取決于配制劑中存在的本發(fā)明抗體的量、病癥或治療的類型、和上文討論的其它因素。這些通常是以與上文所用相同劑量和施用路徑使用，或是迄今所用劑量的大約1-99%。對于疾病的預(yù)防或治療，本發(fā)明抗體的適宜劑量(當(dāng)單獨(dú)使用或者與其它藥劑諸如化療劑聯(lián)用時)取決于待治療疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴(yán)重程度和病程、施用抗體是用于預(yù)防還是治療目的、先前的療法、患者的臨床史和對抗體的應(yīng)答、及主治醫(yī)師的判斷。將抗體一次性或者在一系列治療中適當(dāng)?shù)氖┯糜诨颊?。根?jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，大約lpg/kg到15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗體是施用于患者的初始候選劑量，無論是例如通過一次或多次分開施用，或者是通過連續(xù)輸注。典型每日劑量的范圍可以為大約l嗎/kg到100mg/kg或者更多，取決于上述因素。對于持續(xù)數(shù)天或更長時間的重復(fù)給藥，根據(jù)疾患，治療維持到直至發(fā)生期望的疾病癥狀抑制?？贵w的例示性劑量的范圍為大約0.05mg/kg到大約10mg/kg。如此，可以給患者施用大約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意組合)的一劑或多劑。所述劑可以間歇施用，例如每周或每三周(一次)(例如使得患者接受大約2到大約20劑，例如大約6劑抗體)?？梢允┯靡粍┹^高的加載劑(loadingdose)，繼之以一劑或多劑較低的劑量。一種例示性的劑量給藥方案包括施用一劑大約4mg/kg的加載劑，繼之以每周一劑的大約2mg/kg抗體的維持劑。然而，其他劑量方案可能也是有用的?？梢苑奖愕赝ㄟ^常規(guī)技術(shù)和測定法來監(jiān)測這種療法的進(jìn)展。本發(fā)明的抗EphB4抗體可用于檢測特定細(xì)胞或組織中的EphB4表達(dá)的測定法(諸如診斷或預(yù)后測定法)，其中所述抗體如下所述進(jìn)行標(biāo)記和/或固定在不溶性基質(zhì)上。另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測EphB4的方法，該方法包括檢測樣品中的EphB4-抗EphB4抗體復(fù)合物。術(shù)語'"險測"在用于本文時包括定性和/或定量才全測(測量水平)，有或無參照對照。另一方面，本發(fā)明提供了診斷與EphB4表達(dá)和/或活性有關(guān)的病癥的方法，該方法包括對來自患有或懷疑患有所述病癥的患者的生物學(xué)樣品檢測EphB4-抗EphB4抗體復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，EphB4表達(dá)是增加的表達(dá)或異常(不期望)的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述病癥是腫瘤、癌癥、和/或細(xì)胞增殖性病癥。另一方面，本發(fā)明提供了本文所述任何抗EphB4抗體，其中所述抗EphB4抗體包含可4企測的標(biāo)記物。另一方面，本發(fā)明提供了本文所述任何抗EphB4抗體與EphB4的復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合物是體內(nèi)的或體外的。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合物包含癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，抗EphB4抗體是可4企測標(biāo)記的?？笶phB4抗體可用于大量公知檢測測定法中任一種的EphB4檢測。例如，可以如下對生物學(xué)樣品測定EphB4，即從期望來源獲得樣品，將樣品與抗EphB4抗體混合以允許抗體與混合物中存在的任何EphB4形成抗體/EphB4復(fù)合物，并檢測混合物中存在的任何抗體/EphB4復(fù)合物。可以通過本領(lǐng)域已知的適于特定樣品的方法制備生物學(xué)樣品供測定使用。根據(jù)所使用的測定法的類型來選擇混合樣品與抗體的方法和檢測抗體/EphB4復(fù)合物的方法。此類測定法包括免疫組織化學(xué)、竟?fàn)幮院腿髦?夾心式測定法、和空間阻抑測定法(stericinhibitionassay)。EphB4的分析方法均使用一種或多種以下試劑經(jīng)過標(biāo)記的EphB4類似物、固定化的EphB4類似物、經(jīng)過標(biāo)記的抗EphB4抗體、固定化的抗EphB4抗體和空間偶聯(lián)物。經(jīng)過標(biāo)記的試劑還稱為"示蹤劑"。使用的標(biāo)記物是不干擾EphB4與抗EphB4抗體結(jié)合的任何可檢測官能團(tuán)(functionality)。許多標(biāo)記物已知用于免疫測定法，例子包括可以直接檢測的模塊，諸如熒光染料、化學(xué)發(fā)光和放射性標(biāo)記物，以及必須反應(yīng)或衍生化才能檢測的模塊，諸如酶。此類標(biāo)記物的例子包括使用的標(biāo)記物是不干擾EphB4與抗EphB4抗體結(jié)合的任何可檢測官能團(tuán)。許多標(biāo)記物已知用于免疫測定法，例子包括可以直接檢測的模塊，諸如熒光染料、化學(xué)發(fā)光和放射性標(biāo)記物，以及必須反應(yīng)或衍生化才能檢測的模塊，諸如酶。此類標(biāo)記物的例子包括放射性同位素、、"C、1251、311和13'1，熒光團(tuán)諸如稀土螯合物或熒光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰，傘形酮，螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶(美國專利No.4,737,456),螢光素，2,3-二氫酞溱二酮，辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶，P-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖類氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，雜環(huán)氧化酶諸如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，偶聯(lián)有使用過氧化氫來氧化染料前體的酶諸如HRP，乳過氧化物酶，或微過氧化物酶，生物素/親合素，自旋標(biāo)記物，噬菌體標(biāo)記物，穩(wěn)定自由基，等等。已經(jīng)有將這些標(biāo)記物共價結(jié)合至蛋白質(zhì)或多肽的常規(guī)方法。例如，偶聯(lián)劑諸如二醛、碳化二亞胺、雙馬來酰亞胺、雙亞氨酸酯、雙重氮化聯(lián)苯胺等可用于給抗體標(biāo)記上上述焚光、化學(xué)發(fā)光和酶標(biāo)記物。參見例如美國專利No.3,940,475(焚光測定法)和3,645，090(酶)；Hunteretal.，Nature,144:945(1962);Davidetal.,Biochemistry,13:1014-1021(1974);Painetal.，J.Immunol.Methods,40:219-230(1981);和Nygren,J.Histochem.andCytochem.,30:407-412(1982)。本文中優(yōu)選的標(biāo)記物是酶，諸如辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。將此類標(biāo)記物(包括酶)與抗體偶聯(lián)對于熟悉免疫測定技術(shù)的普通技術(shù)人員來說是一種標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。參見例如O'Sullivanetal.，"MethodsforthePreparationofEnzyme-antibodyConjugatesforUseinEnzymeImmunoassay,"于MethodsinEnzymology,ed.J.J.LangoneandH.VanVunakis,Vol.73(AcademicPress,NewYork,NewYork,1981),pp.147-166。某些測定法需要試劑的固定化。固定化能夠?qū)⒖笶phB4抗體與仍然在溶液中游離的任何EphB4分開。為此，或是通過吸附至不溶于水的基質(zhì)或表面(Bennichetal.,U.S.3,720,760)、通過共價偶聯(lián)(例如利用戊二醛交聯(lián))在測定法步驟前使抗EphB4抗體或EphB4類似物不溶解，或是例如通過免測沉淀，在測定法步驟之后使抗EphB4抗體或EphB4類似物不溶解?？梢岳妹庖呓M織化學(xué)和染色方案來檢查樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)。組織切片的免疫組織化學(xué)染色已經(jīng)證明是一種評估或檢測樣品中蛋白質(zhì)存在的可靠方法。免疫組織化學(xué)("IHC")技術(shù)利用抗體來探查和顯現(xiàn)原位細(xì)胞抗原，通常通過生色或者熒光方法。對于樣品制備，可以使用來自哺乳動物(典型的是人類患者)的組織或細(xì)胞樣品。樣品的例子包括但不限于癌細(xì)胞，諸如結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤、和白血病癌細(xì)胞。可以通過本領(lǐng)域已知的多種規(guī)程來獲得樣品，包括但不限于手術(shù)切除、抽吸或活;險。組織可以是新鮮的或冷凍的。在一個實(shí)施方案中，樣品是固定和包埋在石蠟或類似物中的?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法來固定(即保存)組織樣品。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將領(lǐng)會，固定劑的選擇由樣品是用于組織學(xué)染色還是其它分析的目的來決定。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還將領(lǐng)會，固定時長取決于組織樣品的大小和所使用的固定劑。IHC可以與別的技術(shù)諸如形態(tài)學(xué)染色和/或熒光原位雜交一起實(shí)施?，F(xiàn)有兩種常用的IHC方法直接和間接測定法。根據(jù)第一種測定法，直接測定抗體與靶抗原(例如EphB4)的結(jié)合。這種直接測定法使用經(jīng)過標(biāo)記的試劑，諸如熒光標(biāo)簽或酶標(biāo)記的第一抗體，其不需要進(jìn)一步的抗體相互作用就能顯現(xiàn)。在一種典型的間接測定法中，未偶聯(lián)的第一抗體結(jié)合至抗原，然后經(jīng)過標(biāo)記的第二抗體結(jié)合至第一抗體。若第二抗體偶聯(lián)有酶標(biāo)記物，則添加生色底物或熒光底物以提供抗原的顯現(xiàn)。因?yàn)閿?shù)種第二抗體可以與第一抗體上的不同表位反應(yīng)，所以發(fā)生信號放大。用于免疫組織化學(xué)的第一和/或第二抗體通常用可檢測模塊進(jìn)行標(biāo)記?，F(xiàn)有多種標(biāo)記物，它們通?？梢苑殖上铝蓄愋驮谏衔挠懻摰臉悠分苽湟?guī)程外，可能還需要在IHC之前、期間或之后對組織切片進(jìn)行進(jìn)一步的處理。例如，可以實(shí)施表位修復(fù)法，諸如在檸檬酸鹽緩沖液中對組織樣品進(jìn)行加熱(參見例如Leongetal.Appl.Immunohistochem.4(3):201(1996))。在任選的封閉步驟后，組織切片在合適條件下暴露于第一抗體足夠時間，使得第一抗體結(jié)合至組織樣品中的靶蛋白抗原。實(shí)現(xiàn)這一目的的適宜條件可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定?？贵w與樣品的結(jié)合程度通過使用上文討論的任一種可4全測標(biāo)記物來測定。優(yōu)選的，標(biāo)記物是酶標(biāo)記物(例如HRPO)，其催化生色底物諸如3,3'-二氨基聯(lián)苯胺色原體(chromogen)的化學(xué)變化。優(yōu)選的是，將酶標(biāo)記物偶聯(lián)至特異性結(jié)合第一抗體的抗體(例如第一抗體是兔多克隆抗體，第二抗體是山羊抗兔抗體)?？梢詫⑷绱酥苽涞臉?biāo)本放置好并蓋上蓋玻片。然后進(jìn)行載玻片評估，例如利用顯微鏡，并且可以采用本領(lǐng)域常規(guī)使用的染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)。染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)可以如下評估表2<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>典型的，在IHC測定法中得分為約2+或更高的染色樣式是診斷性和/或預(yù)后性的。在有些實(shí)施方案中，得分為約l+或更高的染色樣式是診斷性和/或預(yù)后性的。在其它實(shí)施方案中，得分為約3或更高的染色樣式是診斷性和/或預(yù)后性的。應(yīng)當(dāng)理解，在使用IHC檢查來自腫瘤或結(jié)腸腺瘤的細(xì)胞和/或組織時，一般測定或評估腫瘤細(xì)胞和/或組織(而非樣品中可能存在的基質(zhì)或周圍組織)中的染色。其它測定法，稱為竟?fàn)幮曰蛉髦?夾心式測定法，已經(jīng)明確建立并廣泛用于商業(yè)診斷工業(yè)。竟?fàn)幮詼y定法依賴于示蹤劑EphB4類似物與測試樣品EphB4竟?fàn)幱邢迶?shù)目的抗EphB4抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的能力。通常在竟?fàn)幥盎蚓範(fàn)幒笫箍笶phB4抗體不溶解，然后將結(jié)合至抗EphB4抗體的示蹤劑和EphB4與未結(jié)合的示蹤劑和EphB4分開。通過傾倒(其中預(yù)先使結(jié)合配對物不溶解)或者通過離心(其中在竟?fàn)幮苑磻?yīng)后使結(jié)合配對物沉淀)來實(shí)現(xiàn)這種分離。測試樣品中EphB4的量與結(jié)合的示蹤劑的量成反比，所述結(jié)合的示蹤劑的量通過標(biāo)記物質(zhì)的量來測量。繪制已知量的EphB4的劑量-應(yīng)答曲線，與測試結(jié)果進(jìn)行比較以定量確定測試樣品中存在的EphB4的量。當(dāng)使用酶作為可檢測標(biāo)記物時，這些測定法稱為ELISA系統(tǒng)。另一種竟?fàn)幮詼y定法，稱為"均相"測定法(homogeneousassay),不需要相分離。此處，制備并使用酶與EphB4的偶聯(lián)物，使得在抗EphB4抗體結(jié)合EphB4時，抗EphB4抗體的存在改變酶活性。在這種情況中，EphB4或其免疫學(xué)活性片段用雙功能有機(jī)橋偶聯(lián)至酶諸如過氧化物酶。選擇偶聯(lián)物與抗EphB4抗體一起使用，使得抗EphB4抗體的結(jié)合抑制或增強(qiáng)標(biāo)記物的酶活性。此方法本身被廣泛實(shí)踐，稱作EMIT?？臻g偶聯(lián)物(stericconjugate)用于均相測定法的空間位阻法(sterichindrancemethod)。通過將低分子量半抗原共價連接至小EphB4片段來合成這些偶聯(lián)物，使得針對半抗原的抗體基本上不能與抗EphB4抗體同時結(jié)合偶聯(lián)物。在此測定法M4i下，測試樣品中存在的EphB4將結(jié)合抗EphB4抗體，從而允許抗半抗原結(jié)合偶聯(lián)物，導(dǎo)致偶聯(lián)物半抗原特性的變化，例如當(dāng)半抗原是熒光團(tuán)時熒光的變化。三明治/夾心式測定法特別可用于EphB4或抗EphB4抗體的測定。在順次三明治測定法(s叫uentialsandwichassay)中，固定化抗EphB4抗體用于吸附測試樣品EphB4，通過清洗去除測試樣品，所結(jié)合的EphB4用于吸附經(jīng)過標(biāo)記的第二抗EphB4抗體，然后將所結(jié)合的物質(zhì)與殘余的示蹤劑分開。結(jié)合的示蹤劑的量與測試樣品EphB4成正比。在"同步"三明治測定法(simultaneoussandwichassay)中，在添加經(jīng)過標(biāo)記的抗EphB4前不分離測試樣品。使用抗EphB4單克隆抗體作為一種抗體和多克隆抗EphB4抗體作為另一種抗體的順次三明治測定法可用于對樣品測試EphB4。上文僅僅是EphB4的例示性檢測測定法。現(xiàn)在或者此后開發(fā)的使用抗EphB4抗體測定EphB4的其它方法均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，包括本文所述的生物測定法。制品在本發(fā)明的另一個方面，提供了包含可用于治療、預(yù)防和/或診斷上文所述紊亂的物質(zhì)的制品。制品包括容器和貼在所述容器上或與其相關(guān)連的標(biāo)簽或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器中裝有其自身或在聯(lián)合其它組合物時有效治療、預(yù)防和/或診斷疾患的組合物，而且可具有無菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射針頭可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小管)。組合物中的至少一種活性劑是本發(fā)明的抗體。標(biāo)簽或包裝插頁指示該組合物用于治療選擇的疾患，諸如癌癥。此外，制品可包括(a)其中裝有組合物的第一容器，其中該組合物包含本發(fā)明的抗體；和(b)其中裝有組合物的第二容器，其中該組合物包含其它細(xì)胞毒劑。本發(fā)明此實(shí)施方案中的制品還可包括指示第一和第二抗體組合物可用于治療特定疾患如癌癥的包裝插頁?；蛘?另外，制品還可包括第二(或第三)容器，其中裝有制藥學(xué)可接受的緩沖劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它還可包括商業(yè)和用戶立場上所需的其它物質(zhì)，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。下面是本發(fā)明方法和組合物的實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)上文提供的一般描述，可實(shí)施各種其它實(shí)施方案。實(shí)施例實(shí)施例l:抗EphB4抗體的生成抗EphB4抗體是使用噬菌體展示生成的，其中使用EphB4-His蛋白來選擇噬菌體。本領(lǐng)域知道多種方法可用于生成噬菌體展示庫，從中可以得到目的抗體。一種生成目的抗體的方法是通過如Leeetal.,J.Mol,Biol.(2004)，340(5):1073-93所述使用噬菌體抗體庫。使用噬菌體展示選擇的克隆使用噬菌體ELISA針對EphB4-His蛋白進(jìn)行篩選。選擇獨(dú)特克隆用于通過噬菌體竟?fàn)嶦LISA和阻斷測定法進(jìn)一步表征，以確定該噬菌體抗體克隆能否阻斷EphB4-ephrinB2相互作用?？寺?0.35表現(xiàn)很好，因而被選擇用于進(jìn)一步的分析。為了改善克隆30.35的親和力，在YW30.35的背景中生成噬菌體展示庫，每個靶向所選HVR進(jìn)行軟式或硬式隨機(jī)化(softorhardrandomization)-所選克隆通過噬菌體ELISA進(jìn)行篩選，然后表達(dá)成Fab蛋白并使用Biacore測定其親和力。所選克隆重定格式成全長IgG，并使用Biacore測定其親和力。親本克隆30.35和親和力成熟克隆的序列如圖1所示。實(shí)施例2:抗EphB4抗體的表征為了測定抗EphB4單抗的結(jié)合親和力，使用BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway，NJ)進(jìn)行表面等離振子共振(SRP)測量。簡言之，依照供應(yīng)商的說明書用鹽酸N-乙基-N，-(3-二曱基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基Inc.)。用10mM乙酸鈉pH4.8將抗EphB4抗體稀釋至5(ig/ml，然后以5(il/分鐘的流速注入至獲得約500個響應(yīng)單位(responseunitRU)的偶聯(lián)抗體。接著，注入1M乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。為了進(jìn)行動力學(xué)測量，于25。C以約25)il/分鐘的流速注入在含0.05%Tween-20的PBS中兩倍連續(xù)稀釋的人或鼠EphB4-His分子(0.7nM-500nM)。使用簡單一對一朗格繆爾結(jié)合模型(BIAcoreEvaluationSoftwareversion3.2)計算結(jié)合速率(k。n)和解離速率(koff)。平衡解離常數(shù)(Kd)以比率kofl/k。n計算。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表3所示。"NA，，表示未進(jìn)行測表3:抗EphB4抗體對人和小鼠EphB4的結(jié)合親和力和動力學(xué)<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>在不同實(shí)驗(yàn)中，測試了抗EphB4抗體克隆30.35針對其它EphB受體的交叉反應(yīng)性。簡言之，COS7細(xì)胞用表達(dá)全長人EphBl、人EphB2、人EphB4或人EphB6的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時，細(xì)胞進(jìn)行FACS分析以檢測抗EphB4抗體的結(jié)合，如果有的話?？笶phB4克隆30.35不與人EphBl、人EphB2、人EphB3或人EphB6交叉反應(yīng)。實(shí)施例3:抗EphB4抗體在基于細(xì)胞的測定法中阻斷EphB4受體信號傳導(dǎo)為了證明抗EphB4抗體阻斷膜結(jié)合EphrinB2和EphB4的相互作用的能力，我們進(jìn)行了基于細(xì)胞的測定法，其中由不同細(xì)胞類型呈現(xiàn)EphB4和EphrinB2。過表達(dá)人EphrinB2的3T3細(xì)胞用于刺激表達(dá)高水平EphB4但低水平EphrinB2的HUYEC細(xì)胞，測試了抗EphB4抗體抑制EphB4活化的能力。過表達(dá)人EphrinB2的3T3細(xì)胞如下制備人全長EphrinB2克隆入pcDNA5/FRT載體(Invitrogen),隨后用于與3T3.Flp細(xì)胞(Invitrogen)—起依照制造商的手冊生成穩(wěn)定細(xì)胞系。過表達(dá)人EphrinB2的3T3細(xì)胞鋪在HUVEC細(xì)胞之上達(dá)15或30分鐘，此時存在或不存在抗EphB4抗體。EphB4受體的活化如下評估，即免疫沉淀EphB4蛋白，然后使用抗磷酸-酪氨酸抗體(抗體4G10;Upstate)通過westem印跡檢測受體酪氨酸磷酸化的存在與否。簡言之，細(xì)胞用RIPA緩沖液裂解。細(xì)胞裂解物通過離心澄清，以5(ig/樣品添加抗EphB4抗體35.2D8。于4。C溫育2小時后，免疫復(fù)合物使用蛋白A瓊脂糖電泳。EphB4磷酸化通過Western印跡使用抗磷酸酪氨酸抗體4G10(Upstate)以l嗎/ml的濃度進(jìn)行分析。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖7所示。3T3細(xì)胞鋪在HUVEC細(xì)胞之上造成顯著的EphB4酪氨酸磷酸化(第4和5道)。HUVEC與抗EphB4抗體(克隆35.2D8，5嗎/ml)的30分鐘預(yù)溫育有效消除3T3-EphrinB2細(xì)胞覆蓋誘導(dǎo)的EphB4酪氨酸磷酸化(第6道)。相反，用單獨(dú)的抗EphB4抗體處理HUVEC細(xì)胞在HUVEC中不引起EphB4活化(第2和3道)，而且未處理的HUVEC細(xì)胞不展示EphB4活化。這些結(jié)果確立了抗EphB4抗體在直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸的環(huán)境中阻斷配體-受體相互作用。盡管為了清楚理解的目的已經(jīng)通過舉例說明的方式較為詳細(xì)地描述了上述方面，但說明書和實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制發(fā)明范圍。權(quán)利要求1.分離的抗EphB4抗體，其包含(a)至少一個、兩個、三個、四個或五個選自下組的高變區(qū)(HVR)序列(i)HVR-L1，其包含序列A1-A11，其中A1-A11為RASQDVSTAVA(SEQIDNO9)，(ii)HVR-L2，其包含序列B1-B7，其中B1-B7為SASFLYS(SEQIDNO11)，(iii)HVR-L3，其包含序列C1-C9，其中C1-C9為QESTTTPPT(SEQIDNO15)，(iv)HVR-H1，其包含序列D1-D10，其中D1-D10為GFSISNYYLH(SEQIDNO2)，(v)HVR-H2，其包含序列E1-E18，其中E1-E18為GGIYLYGSSSEYADSVKG(SEQIDNO4)，和(vi)HVR-H3，其包含序列F1-F17，其中F1-F17為ARGSGLRLGGLDYAMDY(SEQIDNO7)；及(b)至少一個變異的HVR，其中所述變異的HVR序列包含SEQIDNO1-17所示序列的至少一個殘基的修飾。2.權(quán)利要求l的抗體，其中HVR-Ll變體在任意組合的下列位置中包含l-5(1、2、3、4或5)處替代A6(V或S)、A7(S或E)、A8(T或I)、A9(A或F)、和A10(V或L)。3.權(quán)利要求l的抗體，其中HVR-L2變體在任意組合的下列位置中包含l-2(1、或2)處替4戈B4(F或N)和B6(Y或E)。4.權(quán)利要求l的抗體，其中HVR-L3變體在任意組合的下列位置中包含l-7(1、2、3、4、5、6或7)處替代C2(Q、E、或K)、C3(S或T)、C4(Y、N、T、E、或A)、C5(T、A、或Q)、C6(T、V、或I)、C8(P、L、或E)、和C9(T或S)。5.權(quán)利要求l的抗體，其中HVR-Hl變體在任意組合的下列位置中包含l-3(1、2、或3)處替代D3(T或S)、D6(G或N)、和D9(I或L)。6.權(quán)利要求l的抗體，其中HVR-H2變體在任意組合的下列位置中包含l-5(1、2、3、4或5)處替代E5(P、或L)、E7(S或G)、E8(G或S)、E10(T、S、或R)、和Ell(D、E、或G)。7.權(quán)利要求l的抗體，其中HVR-H3變體在下列位置中包含1處替代F3(G或S)。8.分離的抗EphB4抗體，其包含一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR，其中每個HVR包含選自SEQIDNO:l-17的序列、或由其組成、或基本上由其組成，且其中SEQIDNO:9或10對應(yīng)于HVR-L1，SEQIDNO:ll或12對應(yīng)于HVR-L2，SEQIDNO:13、14、15、16、或17對應(yīng)于HVR-L3，SEQIDNO:1或2對應(yīng)于HVR-H1，SEQIDNO:3、4、5、或6對應(yīng)于HVR-H2，和SEQIDNO:7或8對應(yīng)于HVR-H3。9.權(quán)利要求8的抗體，其中所述抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR畫H2和HVR-H3，其中HVR-L1包含SEQIDNO:9，HVR-L2包含SEQIDNO:ll,HVR-L3包含SEQIDNO:13，HVR-H1包含SEQIDNO:l,HVR-H2包含SEQIDNO:3和HVR-H3包含SEQIDNO:7。10.權(quán)利要求8的抗體，其中所述抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，其中HVR-L1包含SEQIDNO:10，HVR-L2包含SEQIDNO:12，HVR-L3包含SEQIDNO:14，HVR-H1包含SEQIDNO:l，HVR-H2包含SEQIDNO:3和HVR國H3包含SEQIDNO:8。11.權(quán)利要求8的抗體，其中所述抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3,其中HVR-L1包含SEQIDNO:9，HVR-L2包含SEQIDNO:11，HVR-L3包含SEQIDNO:15,HVR隱H1包含SEQIDNO:2，HVR畫H2包含SEQIDNO:4和HVR國H3包含SEQIDNO:7。12.權(quán)利要求8的抗體，其中所述抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR畫H2和HVR-H3,其中HVR-L1包含SEQIDNO:9，HVR-L2包含SEQIDNO:ll,HVR-L3包含SEQIDNO:16,HVR-H1包含SEQID包含SEQIDNO:9、11、16、1、5、和7。13.權(quán)利要求8的抗體，其中所述抗體包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR畫H2和HVR-H3,其中HVR-L1包含SEQIDNO:9,HVR-L2包含SEQIDNO:ll,HVR-L3包含SEQIDNO:17，HVR-H1包含SEQIDNO:1，HVR-H2包含SEQIDNO:6和HVR-H3包含SEQIDNO:7。14.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的抗體，其中至少部分框架序列是人共有框架序列。15.權(quán)利要求l的抗體，其中所述修飾是替代、插入或刪除。16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體包含人K亞組共有框架序列。17.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體包含重鏈人亞組III共有框架序列。18.權(quán)利要求17的抗體，其中所述抗體在第73、73或78位中的一個或多個位置處包含替代。19.權(quán)利要求18的抗體，其中所述替代是R71A、N73T、或N78A中的一個或多個。20.多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的抗體。21.載體，其包含權(quán)利要求20的多核苷酸。22.權(quán)利要求21的載體，其中所述載體是表達(dá)載體。23.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求21或22的載體。24.權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是原核的。25.權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是真核的。26.權(quán)利要求25的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動物的。27.制備抗EphB4抗體的方法，所述方法包括(a)在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求22的載體，并(b)回收所述抗體。28.制備抗EphB4免疫偶聯(lián)物的方法，所述方法包括(a)在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求22的載體，并(b)回收所述抗體。29.權(quán)利要求27或28的方法，其中所述宿主細(xì)胞是原核的。30.權(quán)利要求27或28的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真核的。31.檢測EphB4的方法，所述方法包括在生物學(xué)樣品中檢測EphB4-抗EphB4抗體復(fù)合物，其中所述復(fù)合物中的所述抗EphB4抗體是權(quán)利要求l-19任一項(xiàng)的抗EphB4抗體。32.診斷與EphB4表達(dá)有關(guān)的病癥的方法，所述方法包括在來自患有或懷疑患有所述病癥的患者的生物學(xué)樣品中檢測EphB4-抗EphB4抗體復(fù)合物，其中所述復(fù)合物中的所述抗EphB4抗體是權(quán)利要求l-19任一項(xiàng)的抗EphB4抗體。33.權(quán)利要求31或32的方法，其中所述抗EphB4抗體是可檢測標(biāo)記的。34.組合物，其包含權(quán)利要求l-19任一項(xiàng)的抗EphB4抗體。35.組合物，其包含權(quán)利要求20-22任一項(xiàng)的多核苷酸。36.權(quán)利要求34或35的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含載體。37.抑制血管發(fā)生的方法，所述方法包括對需要此類治療的受試者施用有效量的權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的抗EphB4抗體。38.權(quán)利要求37的方法，所述方法進(jìn)一步包括對所述受試者施用有效量的抗血管發(fā)生劑。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗血管發(fā)生劑在施用所述抗EphB4抗體之前或之后施用。40.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗血管發(fā)生劑與所述抗EphB4抗體同時施用。41.權(quán)利要求38-40任一項(xiàng)的方法，其中所述抗血管發(fā)生劑是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的拮抗劑。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述VEGF拮抗劑是抗VEGF抗體。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述抗VEGF抗體是貝伐單抗。44.權(quán)利要求37-43任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括施用有效量的化療劑。45.治療癌癥、腫瘤、和/或細(xì)胞增殖性病癥的方法，所述方法包括對需要此類治療的受試者施用有效量的權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的抗EphB4抗體。46.權(quán)利要求l-19任一項(xiàng)的抗EphB4抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于病癥的治療性和/或預(yù)防性處理。全文摘要本發(fā)明提供了抗EphB4抗體、包含這些抗體的組合物及使用這些抗體的方法。文檔編號C07K16/28GK101395183SQ200780007824公開日2009年3月25日申請日期2007年1月4日優(yōu)先權(quán)日2006年1月5日發(fā)明者嚴(yán)民宏,雁吳申請人:健泰科生物技術(shù)公司