專利名稱：：吖啶衍生物的固相合成的制作方法吖啶鋪衍生物的固相合成發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般性涉及吖啶f翁化合物以及它們的共軛物的固相合成。
背景技術(shù)：
：化學(xué)發(fā)光的吖啶酯(acridiniumesters(AE))是已經(jīng)廣泛地用于免疫測定和核酸分析中的極其有用的標(biāo)記物。Arecentreview,Pringle,M.J.,Jo"薩/丄，"纖少vol.22,第105-122頁(1999)總結(jié)了這一類的化學(xué)發(fā)光的化合物的過去和現(xiàn)在發(fā)展。McCapra,F.等人,r"ra/^^o"vol.43,#3167-3172頁(1964)和Rahut等人J,C/zewvo/.30/,第3587-3592f(1965)公開了來自吖啶鎩鹽的酯中的化學(xué)發(fā)光能夠被堿性過氧化物觸發(fā)。由于有這些早期研究，對吖啶鋪化合物的興趣日益增大，因?yàn)樗鼈兛捎米骰瘜W(xué)發(fā)光的標(biāo)記物。吖啶酯9-羧基苯基-N-曱基吖啶鋪溴化物在免疫測定中的應(yīng)用已經(jīng)由Simpson,J.S.A.等人，Naturevol.279,第646-647頁(1979)報(bào)道。這一吖啶酯是相當(dāng)不穩(wěn)定的，這是由于在吖啶鋪環(huán)和苯酚之間的酯鍵的水解，因此限制了它的工業(yè)應(yīng)用，除非采取特殊的預(yù)防措施來保護(hù)吖啶酯避免水解。例如，授權(quán)于Arnold等人的U.S.專利No.4,950,613纟皮露不穩(wěn)定的吖啶酯的水解穩(wěn)定性能夠用某些添加劑在一定程度上減輕。保護(hù)吖咬酯避免水解的新途徑已經(jīng)由Nelson等人(Biochemistryvol.35,第8429-8438頁，1996)描述在核酸分析中《吏用，其中當(dāng)標(biāo)記的核酸4建接于其目標(biāo)物上時(shí)，用不穩(wěn)定的吖啶酯標(biāo)記的核酸凈皮保護(hù)以避免水解。這一保護(hù)被認(rèn)為是由在貧水環(huán)境中在DNA雙螺旋中的吖啶酯的結(jié)合所引起的。通過改變它們的結(jié)構(gòu)來提高吖啶鎩化合物的水解穩(wěn)定性的不同策略已經(jīng)有描述。Law等人,Jc"a/o/"i^'o/w脂"escewce顯(iC/zem'7w脂"^cewce,vol.《第88-89頁(1989)描述了兩個(gè)曱基的引入從側(cè)面包圍吖。定酯結(jié)構(gòu)部分，從而通過空間效應(yīng)來使酯鍵穩(wěn)定化。所得吖啶酯，即DMAE-NHS[2，,6，-二曱基-4，-(N-琥珀酰亞胺基氧基羰基)苯基-10-甲基吖啶f翁-9-羧酸酉旨]，發(fā)現(xiàn)具有與缺少兩個(gè)甲基的吖啶酯相同的光輸出，^旦是明顯更加耐水解。DMAE-NHS的結(jié)構(gòu)顯示如下。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>美國專利No4,918,192和5,110.932描述了DMAE和它的應(yīng)用。美國專利No.5,656,426(Law等人)公開了稱作NSP-DMAE-NHS酯的DMAE的親水性變型，其中在吖啶鋪環(huán)氮上的曱基被磺丙基替代，如下所示美國專利No.6,664,043B2(Natmjan等人)公開了有親水性改性劑連接于苯酚上的NSP-DMAE衍生物。一種此類化合物的結(jié)構(gòu)描述在以下。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>在這一化合物中二氨基六(亞乙基)二醇(HEG)結(jié)構(gòu)部分連接于苯酚上以提高吖啶酯的水溶性。戊二酸結(jié)構(gòu)部分懸掛于HEG的末端，并轉(zhuǎn)化成NHS酉旨，以使得各種分子的標(biāo)記成為可能。DMAE和NSP-DMAE和它們的書亍生物目前啫卩用于SiemensMedicalSolutionsDiagnostics的ACS:180和Advia:Centaur免疫分析劑(immunoanalyzers)。不同類型的穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光的吖啶鎩化合物已經(jīng)由Kinkd等人,(1989)和Mattingly,/纏ma/Szo/w脂.wescewce"w<iC7ze,7謂/wescewcevol.《第107-114頁(1991)和U.S.5,468,646進(jìn)行描述。在這一類型的化合物中，酚酯連接鍵被磺酰胺結(jié)構(gòu)部分替代，據(jù)報(bào)道它被賦予水解穩(wěn)定性但不損失光輸出。在吖啶酯中，苯酚是"離去基團(tuán)"，而在吖啶鋪磺酰胺中，磺酰胺是在與堿性過氧化物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中的"離去基團(tuán)"?；酋０饭倌芑倪灌翁的例子如下所示，其中R!和R2表示烷基或芳基固相有機(jī)合成已經(jīng)在近十幾年來對于各種令人感興趣的分子的快速構(gòu)建贏得了巨大的名聲。有關(guān)這一主題的新近的書，OrganicSynthesisonSolidPhase(F.Z.Dorwald,Wiley-VCH,2001),詳細(xì)地綜述了已經(jīng)在文獻(xiàn)中記載的常用的固相、連接劑化學(xué)和合成反應(yīng)。與其中全部的反應(yīng)物溶于溶劑中的液相合成相反，固相合成使用固體載體，其中反應(yīng)物中的至少一種以共價(jià)鍵方式連接于該載體上。固相合成常常具有速度的優(yōu)勢并且能夠用于構(gòu)建化合物的巨大"庫"，然后能夠?qū)τ谏锘钚赃M(jìn)行徑是所謂的"平行"、和""裂分-混合(、spiit-pooi)，:途徑。在平行庫合成中，在固相上合成具有離散結(jié)構(gòu)的化合物。在牽涉到多個(gè)步驟的合成過程的結(jié)束時(shí)，在固相上的化合物的結(jié)構(gòu)被固定且是已知的。在裂分-混合合成中，在固相上合成一種結(jié)構(gòu)的幾個(gè)變型。典型地，固相將具有帶有不同結(jié)構(gòu)的幾種化合物的混合物。裂分-混合途徑具有以下優(yōu)點(diǎn)對于已知數(shù)量的合成轉(zhuǎn)變方法，能夠合成較大的化合物庫。(參見Wilson&Czarnik,Cow&力a^)"WC7ze脂、/7y.'S戸7^z、p/z.cahow,JohnWiley&SonsInc.,1997)。從平行和裂分-混合合成中產(chǎn)生的化合物庫能夠?qū)τ谏锘钚赃M(jìn)行篩選。從此類研究中能夠闡明關(guān)于生物系統(tǒng)的重要的力學(xué)和結(jié)構(gòu)信息。例如，篩選結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物的庫以便結(jié)合于酶或抗體上，能夠獲得與抗體或酶的結(jié)合部位有關(guān)的知識。如果酶的活性的抑制具有一些治療用途，則該篩選研究能夠鑒別新藥物。當(dāng)從裂分-混合合成中篩選化合物庫時(shí)，通常必須進(jìn)行稱作"去褶合(de-convolution)"的附加步驟以確定導(dǎo)致所觀察到的生物活性的一個(gè)結(jié)構(gòu)組的子組或離散結(jié)構(gòu)。常常通過用其它分子(能夠獨(dú)立地推斷其存在)"標(biāo)記(tagging)"固相來進(jìn)行去褶合。固相合成也具有其它優(yōu)點(diǎn)。因?yàn)樵诠滔嗌习l(fā)生反應(yīng)，過量的試劑能夠通過過濾被除去，因此最大程度減少不得不進(jìn)行的提純步驟的次數(shù)，因此節(jié)約時(shí)間、節(jié)省昂貴的色鐠分析載體和溶劑。另外，在固相上的反應(yīng)常常顯示出改變的反應(yīng)性和/或穩(wěn)定性模式，這些是非常有用的，將在本發(fā)明中討論。以及，對于合成肽和核酸的合成，固相合成實(shí)際上不具有有用的液相對應(yīng)物。長的肽和核酸的組裝若沒有固相合成則幾乎是不可能的。吖啶鎩化合物常常在小的和大的分子(它們常常稱作被分析物)的免疫測定中用作化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記物。當(dāng)固相如顆?；蛭⒘康味ò逵糜谠摲治鰰r(shí)，該分析常常被稱作固相分析或非均相分析。小分子的非均相分析也稱作"竟?fàn)幏治?competitiveassays)"。典型地，在竟?fàn)幏治鲋?，共軛物由所關(guān)心的被分析物和化學(xué)發(fā)光的或熒光的標(biāo)記物通過以共價(jià)鍵方式連接兩種分子來構(gòu)成。小分子被分析物能夠原樣使用或它的結(jié)構(gòu)能夠在共輒到標(biāo)記物上之前改變。具有改變的結(jié)構(gòu)的被分析物將被稱作類似物。常常需要使用被分析物的結(jié)構(gòu)類似物來允許連接標(biāo)記物與被分析物的化學(xué)過程。有時(shí)，被分析物的結(jié)構(gòu)類似物用來衰減或增強(qiáng)它結(jié)合于該結(jié)合分子如抗體上的能力。此類技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的。抗體或結(jié)合于所關(guān)心的被分析物上的結(jié)合分子常常直接地或通過二級結(jié)合相互作用如生物素-抗生物素蛋白體系而固定在固相上。此類體系在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的。被分析物在樣品中的濃度能夠通過使懷疑含有被分析物和被分析物-標(biāo)記物共軛物的樣品爭奪有限量的固定在固相上的結(jié)合分子來以竟?fàn)幏治龇ㄍ茢?。隨著在樣品中被分析物的濃度的增加，被固相上的結(jié)合分子所捕獲的被分析物-標(biāo)記物共軛物的量會減少。通過使用一系列的"標(biāo)準(zhǔn)物"，即已知濃度的被分析物，能夠構(gòu)造劑量-反應(yīng)曲線，其中來自被固相上的結(jié)合分子所捕獲的被分析物-標(biāo)記物共軛物的信號與被分析物的濃度成反比。一旦以這一方式設(shè)計(jì)了劑量-反應(yīng)曲線，同一被分析物在未知樣品中的存在和濃度能夠通過將從未知樣品獲得的信號與在劑量-反應(yīng)曲線中的信號對比來推斷。稱作示蹤劑的被分析物(尤其小分子被分析物)的吖啶f翁化合物共軛物能夠與抗體聯(lián)用以便對于這些被分析物設(shè)計(jì)免疫分析。示蹤劑通常通過^f吏用溶液相合成4支術(shù)來合成，它的例子在美國專利No.5,656,426中可以找到。固相合成用于此類吖啶酯結(jié)構(gòu)的組裝中的用途在現(xiàn)有技術(shù)中還沒有描述。固相合成用于屬于本發(fā)明主題的此類吖啶酯結(jié)構(gòu)的組裝中的用途在現(xiàn)有技術(shù)中還沒有描述。示蹤劑的固相合成，如各種染料(包括吖啶鋪磺酰胺)在固相上的連接，已經(jīng)描述在一些文章中，如A^爿damczj^:爭乂/Szoorg.MedC/zew.9(7999)"7-220。然而，在該化學(xué)過程以及在本發(fā)明中舉例說明的化學(xué)過程之間有顯著差異。例如在A/.^J"mcz^:爭乂的方法中，固相染料與各種親核試劑反應(yīng)，親核試劑隨后從固相中釋放染料共軛物。因此，這一化學(xué)過程基本上局限于在固相上的單個(gè)置換反應(yīng)，并且不服從于組合合成。本發(fā)明的化學(xué)過程允許在固相上多重合成轉(zhuǎn)變，用于將吖啶酯連接于固相上的化學(xué)過程允許合成先前得不到的AE-共軛物庫。鑒于化學(xué)發(fā)光的吖啶f翁化合物的有趣的性能，在現(xiàn)有技術(shù)中需要用于制備吖啶鋪化合物衍生物和共軛物的改進(jìn)合成方法。因此本發(fā)明的目的是提供吖啶鎩化合物衍生物和共軛物的固相合成方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供吖啶鋪官能化的固相載體作為吖啶f翁化合物衍生物和共輒物的固相合成的試劑。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供吖啶鎩官能化的固相載體作為免疫測定用化學(xué)發(fā)光的試劑。發(fā)明概述根據(jù)前述目標(biāo)和其它目標(biāo)，本發(fā)明提供吖啶鋪官能化的固相載體，其包括固相載體，該固相載體具有固定在其上的化學(xué)發(fā)光的吖啶鎩化合物?；瘜W(xué)發(fā)光的吖啶鋪化合物包括以共價(jià)鍵連接于吖啶鋪核的氮原子和固相載體上的連接劑基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，吖啶鎩官能化的固相載體具有通式I的結(jié)構(gòu)其中，L是在吖啶鋪核的氮和所述固相載體之間的磺酸酯或羧酸酯連接劑基團(tuán)；R4表示在一個(gè)或多個(gè)碳原子l-4上的取代基，R2表示在一個(gè)或多個(gè)碳原子5-8上的取代基；R!和R2獨(dú)立地在各情況下選自氫、取代或未被取代的烷基，鏈烯基，炔基，芳基，烷基芳基，或芳基-烷基，和它們的結(jié)合物，任選地含有選自氧、氮、磷、硫、卣素和它們的結(jié)合物中的一個(gè)或多個(gè)雜原子；X是O,S,或NRa;其中Ra是-S02-R，，R'選自，取代或未一皮取代的、支化或直鏈的烷基，鏈烯基，炔基，芳基，烷基-芳基，或芳基-烷基，和它們的結(jié)合物，任選地含有選自氧，氮，磷，硫，卣素和它們的結(jié)合物中的一個(gè)或多個(gè)雜原子；和當(dāng)X是O或S時(shí)，Y是以下通式的取代基其中R3，R4,R5，R6,R7,R8和R9中的至少一個(gè)獨(dú)立地是基團(tuán)-Q-Ru),其中Ru)是包含一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)活性官能團(tuán)的基團(tuán)；其中Q表示鍵或選自支化或直鏈的烷基，鏈烯基，炔基，取代或未被取代的芳基，烷基-芳基，和芳基-烷基中的官能團(tuán)，任選地含有選自氧，氮，磷，硫，鹵素，和它們的結(jié)合物中的一個(gè)或多個(gè)雜原子；和其中不屬于基團(tuán)-Q-Rio的R3,R4,R5,R6,R7,Rs和R9中的任何一個(gè)是獨(dú)立地選自以上對于Ri和R2所定義的取代基之中的取代基，氫，羥基，鹵素，烷基，鏈烯基，炔基，芳基，烷基-芳基，或芳基-烷基，-ORb,-SRb,氰基，羧基，-(C=0)-ORb，-NRbRe,或-(C二0)-NRbR0,其中Rb和Re獨(dú)立地選自以上對于和R2定義的取代基；和當(dāng)X是NRa時(shí)，Y是以上定義的基團(tuán)-Q-R^;A—是選自CH3S04—、FSCV、CF3S(V、C4F9SOT、CH3C6H4S(V、鹵素、CF3COO—、CH3COCT和N03—中的抗衡離子；和SP表示選自聚苯乙烯王氏樹脂，順磁性顆粒，膠乳顆粒，和微量滴定板中的固相載體。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于吖啶f翁化合物衍生物或共軛物的固相合成的方法，該方法包括以下步驟(a)提供吖啶f翁官能化的固相載體，其包括固相載體，在該固相載體上固定有化學(xué)發(fā)光的吖啶f翁化合物；其中取代的吖啶鋪化合物包括以共價(jià)鍵連接于吖啶fl核的氮原子和固相載體上的連接劑基團(tuán)；(b)對吖啶f翁化合物進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)合成轉(zhuǎn)變以提供吖啶f翁化合物的衍生物或共軛物；和(c)將吖啶鎩化合物的衍生物或共軛物從固相載體上分裂。本發(fā)明的方法的一些實(shí)施方案中，吖啶f翁官能化的固相載體將具有以上所示的通式I的結(jié)構(gòu)。在閱讀本發(fā)明的以下詳細(xì)說明(包括舉例性的實(shí)施方案，實(shí)施例和附圖)之后本發(fā)明的這些和其它方面將變得十分清楚。附圖簡述圖l是舉例說明了在本發(fā)明中將NSP-DMAE連接于固相樹脂上的化學(xué)過程的附圖。圖2是舉例說明在本發(fā)明中各種NSP-DMAE-蝶酸酯共軛物的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的那些點(diǎn)的附圖。圖3是舉例說明本發(fā)明的各種NSP-DMAE-間隔劑-蝶酸酯(pteroate)共軛物的合成用的合成反應(yīng)順序的附圖。圖4是舉例說明合成本發(fā)明的各種非自然NSP-DMAE-TEG-葉酸酯共軛物的合成反應(yīng)順序的附圖。圖5是舉例說明DMAE衍生物的固相合成的合成策略的附圖。圖6是舉例說明NCM-DMAE-ED的脫羧的附圖。圖7是舉例說明DMAE-ED-6-CMO-雌二醇共軛物的固相合成的合成反應(yīng)順序的附圖。圖8是舉例說明DMAE-ED-l,3-二曱基黃噪呤共軛物的固相合成的合成反應(yīng)順序的附圖。圖9是舉例說明DMAE-ED-蝶酸酯共輒物的固相合成的合成反應(yīng)順序的附圖。發(fā)明的詳細(xì)說明在這里使用的全部術(shù)語具有它們在現(xiàn)有技術(shù)中通常的意義，除非另有明確說明。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)吖啶鋪核能夠可逆地鍵接于固相載體以得到可用于吖啶鎩化合物(包括吖啶鋪化合物衍生物和共扼物)的固相合成中的吖啶鎩官能化的固相載體。術(shù)語"吖啶鎩化合物，，旨在包括包含以下所示的"吖啶銻核，，的任何分子在以上吖啶鋪核中所示的環(huán)編號系統(tǒng)在整個(gè)本公開中使用。術(shù)語"吖啶鎩化合物衍生物"旨在包括在吖啶錄核的任何位置上有取代基的化合物。術(shù)語"吖啶鎩化合物共軛物"指連接到另一個(gè)分子如生物學(xué)活性分子上的任何吖啶鋪化合物，該活性分子包括但不限于甾類，維生素類，激素，治療藥物，肽，核酸，等等。在最寬的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供吖啶f翁官能化的固相載體，包括在其上固定有吖啶f翁化合物(優(yōu)選化學(xué)發(fā)光的吖啶鎩化合物)的固相載體?；瘜W(xué)發(fā)光的吖啶鎩化合物包括以共價(jià)鍵連接于吖啶錄核的氮原子(位置IO)和固相載體的連接劑基團(tuán)。對于連接劑的性質(zhì)基本上沒有限制。典型地，該連接劑是在所給定的一組條件下如酸或堿水解、親核置換等等允許吖啶鋪化合物從固相載體上分裂的結(jié)構(gòu)部分。該連接劑將包括能夠與固相載體上的基團(tuán)鍵接的官能團(tuán)。優(yōu)選該連接劑是無痕跡的連接劑。在這里使用的術(shù)語"無痕跡的"連接劑是指屬于吖啶f翁化合物結(jié)構(gòu)的固有部分的連接劑，它能夠連接于固相載體上并在從固相分裂之后保持它的原結(jié)構(gòu)。用于可逆的無痕跡的連接于固相載體上的在連接劑上的合適官能團(tuán)包括親核試劑和親電子試劑，例如羥基，巰基，羧基，磺酸酯，等等。優(yōu)選的無痕跡的連接劑包括羧基(-C02H)或磺酰基(-S03H)。這些官能團(tuán)能夠與在固相載體的表面上的親核基團(tuán)如羥基反應(yīng)形成共價(jià)鍵。在與固相載體上的羥基進(jìn)行反應(yīng)的特定情況下，分別形成羧酸酯和磺酸酯，它們能夠在酸或堿水解條件下分裂。優(yōu)選的連接劑結(jié)構(gòu)部分由結(jié)構(gòu)-(CH2)n-C02H和-(CH2)n-S03H或它的鹽定義，其中n是在1和IO之間的整數(shù)，和更優(yōu)選n是l到4。應(yīng)該理解的是，在整個(gè)本公開中，連接劑結(jié)構(gòu)的左手側(cè)表示鍵接于吖啶f翁核的環(huán)中氮上的末端，而右手側(cè)表示鍵接于或能夠鏈接于固相載體上的末端。可以考慮的是在一些實(shí)施方案中，連接劑的烷基鏈可以是支化鏈或直鏈，任選地包括一個(gè)或多個(gè)不飽和鍵，并且任選地包括一個(gè)或多個(gè)雜原子。在一個(gè)有益的實(shí)施方案中，吖啶f翁官能化的固相載體具有通式I的結(jié)構(gòu)在通式I的優(yōu)選實(shí)施方案中，L是在吖啶鎩核的氮和固相載體之間的磺酸酯或羧酸酯連接劑基團(tuán)。優(yōu)選地，L表示-(CH2)n-(C=0)-0-或-(CH2)n-S(=0)2-0-，其中n是在1和IO之間的整數(shù)，和更優(yōu)選n是1,2，3到4。在通式I中，R!表示在碳原子1-4中一個(gè)或多個(gè)上的取代基，R2表示在碳原子5-8中一個(gè)或多個(gè)上的取代基。Ri和R2在各情況下獨(dú)立地選自氬，取代或未被取代的烷基，鏈烯基，炔基，芳基，烷基-芳基，或芳基-烷基，和它們的結(jié)合物，任選地含有一個(gè)或多個(gè)選自氧，氮，磷，硫，卣素，和它們的結(jié)合物中的雜原子。在通式I中，X表示O,S,或NR"其中Ra是-S02-R,，R'選自，取代或未被取代的，支化或直鏈的烷基，鏈烯基，炔基，芳基，烷基-芳基，或芳基-烷基，和它們的結(jié)合物，任選地含有一個(gè)或多個(gè)選自氧，氮，磷，硫，卣素，和它們的結(jié)合物中的雜原子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，X是氧。對于其中X是O或S的情況，Y是以下通式的取代基其中R3，R4，R5,R6，R7,R8和R9中的至少一個(gè)獨(dú)立地是基團(tuán)-Q-R丄0,其中R!o是包括一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)活性官能團(tuán)的基團(tuán)；其中Q表示鍵或選自支化或直鏈的烷基，鏈烯基，炔基，取代或未被取代的芳基，烷基-芳基，和芳基-烷基中的官能團(tuán)，任選地含有一個(gè)或多個(gè)選自氧，氮，磷，硫，卣素，和它們的結(jié)合物中的雜原子；且其中不屬于基團(tuán)-Q-Rio的R3,R4,R5,R6,R7,R8和R9中的任何一個(gè)是獨(dú)立地選自以上對于R4和R2定義的取代基，羥基，卣素，烷基，鏈烯基，炔基，芳基，烷基-芳基，或芳基-烷基，-ORb,-SRb,氰基，羧基，-(C=0)-ORb,-NRbRc,或-(C=O)-NRbRe之中的取代基，其中Rb和Re獨(dú)立地選自以上對于和R2所定義的取代基。對于其中X是NRa的通式I，Y是以上定義的基團(tuán)-Q-R^。取代基Ri。包括反應(yīng)活性官能團(tuán)，后者提供化學(xué)構(gòu)建吖啶鎩化合物以形成吖啶鋪化合物衍生物或共軛物的部位。在一個(gè)實(shí)施方案中，R10包括一個(gè)或多個(gè)親核基團(tuán)，親電基團(tuán)，和它們的結(jié)合物。合適的親核基團(tuán)非限制性地包括選自氨基，鞋基，巰基，鈉或鋰有機(jī)金屬結(jié)構(gòu)部分，或與強(qiáng)吸電子基團(tuán)鄰近的活性亞曱基中的親核試劑；此類吸電子基團(tuán)包括-N02,-CN，S02OR*，-N(R、+,-S(R*)2+,和COOR*,其中R;選自，取代或未被取代的，支化或直鏈的烷基，鏈烯基，炔基，芳基，烷基-芳基，或芳基-烷基，和它們的結(jié)合物，任選地含有一個(gè)或多個(gè)選自氧，氮，磷，硫，鹵素，和它們的結(jié)合物中的雜原子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Rw包括一個(gè)或多個(gè)親電基團(tuán)。根據(jù)這一實(shí)施方案的優(yōu)選Rio取代基選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>如SO。CI^_N=C=S,其中乂*是面素；11*是選自取代或未被取代的，支化或直鏈的烷基,鏈烯基，炔基，芳基，烷基-芳基，或芳基-烷基，和它們的結(jié)合物中的官能團(tuán)，任選地含有一個(gè)或多個(gè)選自氧，氮，磷，硫，卣素，和它們的結(jié)合物中的雜原子。Q的屬性沒有特別限制。當(dāng)存在時(shí)，Q將典型地，雖然不一定，包括羰基結(jié)構(gòu)部分，Q通過它連接于取代基Y。Q可包括的作為連接到Y(jié)上的連結(jié)點(diǎn)的舉例性官能化單元包括以下所示的那些乂X/1\NHNH1~^NH人NH丄oNH、NH乂JyNHlNH2+在一個(gè)有益的實(shí)施方案中，Q表示基團(tuán)-(C二0)-NH-Ru-NH-R『，其中Rn和Ru獨(dú)立地選自烷基，鏈烯基，炔基，芳基，芳基-烷基，和烷基-芳基，任選地含有一個(gè)或多個(gè)選自氧，氮，磷，硫，卣素，和它們的結(jié)合物中的雜原子。Ru可以是，例如，聚氧化乙烯。根據(jù)這一實(shí)施方案的一個(gè)舉例性的Q基團(tuán)是-NH-(CH2CH20)n-CH2CH2NH-C(0)(CH2)m-,其中11=0-20和111=1-4。在一個(gè)有益的實(shí)施方案中，-NH-Ru-NH-是以下結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>其中X!和X2獨(dú)立i也選自以下基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>式中是1或2。A—表示抗衡離子?？购怆x子的屬性不是太重要。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗4軒離子A-選自CH3S04-、FSCV、CF3SCV、C4F9S〇4-、CH3C6H4SCV、卣素、CF3COCT、CH3COCT、NCV和它們的結(jié)合物。SP表示固相載體。對于固相載體的性質(zhì)基本上沒有限制，但是有以下要求它以允"i午與連接劑形成4建的方式，和優(yōu)選以可逆方式，和更優(yōu)選以無痕跡的方式被官能化。優(yōu)選的固相載體具有可用于與優(yōu)選的連接劑形成羧酸酯或磺酸酯的羥基官能團(tuán)。優(yōu)選的固相載體包括，沒有限制，聚苯乙烯王氏樹脂，順磁性顆粒，膠乳顆粒(包括磁性膠乳顆粒)，和微量滴定板。需要理解的是，在這里的結(jié)構(gòu)中使用的縮寫SP周圍的圓僅僅為了舉例說明而已，不應(yīng)該將固相載體限于球形結(jié)構(gòu)。固相載體可以是任何結(jié)構(gòu)，它們沒有限制地包括珠粒，無定形結(jié)構(gòu)，平整表面，等等。在本發(fā)明的一個(gè)目前優(yōu)選的實(shí)施方案中，吖啶f翁官能化的固相載體具有下面的結(jié)構(gòu)其中A-、R7和SP如以上所定義。在其中R7是全氟苯氧基羰基的特別有意義的情況下，吖啶f翁官能化的固相載體具有以下結(jié)構(gòu)其中A—和SP如以上所定義。另一種目前優(yōu)選的吖啶鋪官能化的固相載體具有以下結(jié)構(gòu):其中A-、R7和SP如以上所定義。以下所示的全氟苯氧基羰基也是目前優(yōu)選的實(shí)施方案其中SP和A—如以上所定義。用于本發(fā)明的其它合適吖啶鎩化合物已描述在美國專利No6,355,803,6,664,043，6,673,569和6,783,948中，它們的公開內(nèi)容^皮引入本文供參考。本發(fā)明的合成方法適用于各種各樣的吖啶鎩化合物。在本發(fā)明的合成方法的優(yōu)選實(shí)踐中，提供NSP-DMAE和DMAE衍生物的固相合成。通過延伸，這一方法也適用于其它類型的吖啶鋪化合物如吖啶鋪石黃酰胺。本發(fā)明的方法可用于小分子被分析物的吖啶鋪化合物共軛物的快速構(gòu)建，然后可對于最佳的分析特性進(jìn)行篩選。本發(fā)明的方法也允許發(fā)射不同波長的光的化學(xué)發(fā)光的吖啶鋪化合物用于由組合化學(xué)過程產(chǎn)生的化合物的復(fù)合物庫或混合物的去褶合(de-convolution)。本發(fā)明的方法需要使用位于吖啶f翁氮上的官能團(tuán)使吖啶鎩化合物連接于固相上；和使用位于吖啶鋪環(huán)上的苯酚或磺酰胺離去基團(tuán)上或另外其它位置上的第二種官能團(tuán)進(jìn)行合成構(gòu)建設(shè)計(jì)，從而形成新的吖啶鋪化合物衍生物，隨后進(jìn)行吖啶鋪化合物衍生物從樹脂上的分裂。更具體地說，優(yōu)選的方法需要在吖啶鎩氮上含有官能團(tuán)的吖啶鎩酯連接于固相上；使用位于吖啶f翁環(huán)中的苯酚離去基團(tuán)上或其它位置上的第二官能團(tuán)進(jìn)行合成構(gòu)建設(shè)計(jì)以形成新的吖啶酯衍生物，隨后進(jìn)行從樹脂上的吖啶酯衍生物的分裂。可用于連接于固相上的在吖啶鋪氮上的官能團(tuán)是N-磺基烷基，優(yōu)選N-磺丙基(NSP)或N-磺基丁基(NSB)和N-羧曱基基團(tuán)(NCM)。能夠用于合成構(gòu)建設(shè)計(jì)的在苯酚或吖啶鎩環(huán)上的官能團(tuán)有許多，它們的例子能夠在有機(jī)化學(xué)的任何標(biāo)準(zhǔn)教科書中見到，如Smith等人，爿JwwceJ(9rgawz.cCTzew^/^jA'7e〃c/7o;w，A/ec/za"&ms5Vrwc^wre(5thEditionWiley-Interscience)。合成構(gòu)建設(shè)計(jì)是指官能團(tuán)通過反應(yīng)轉(zhuǎn)化成其它官能團(tuán)或分子。可使用的固相或樹脂典型地，雖然不一定地，由交聯(lián)的聚苯乙烯制成并在它們的表面上含有各種官能團(tuán)以便具有不同官能團(tuán)的分子的連接。許多的此類固相或樹脂可從商品供應(yīng)商如AdvancedChemtechInc商購。通常用于固相合成中并且在本發(fā)明的實(shí)施中優(yōu)選的一種類型的固相或樹脂是現(xiàn)有4支術(shù)中7>知的并且已7>開在例如S.S.WangJ.Am.Chem.Soc.Vol95,第13128頁，(1973)中的王氏樹脂，它的公開內(nèi)容被引入這里供參考。聚苯乙烯王氏樹脂([4-(羥甲基)苯氧基曱基]聚苯乙烯)可從很多的供應(yīng)商(包括例如Aldrich)商購。聚苯乙烯王氏樹脂由聚苯乙烯組成并在樹脂的表面上含有節(jié)醇官能團(tuán)以便用于含有羧酸或磺酸的分子的連接。盡管聚苯乙烯王氏樹脂(PS-Wang)是這一類型的優(yōu)選樹脂，應(yīng)該理解的是其它王氏樹脂也能夠使用。其它固相包括順磁性顆粒和膠乳顆粒，其中包括磁性膠乳顆粒。在固相合成中使用這些顆粒的優(yōu)點(diǎn)是利用磁力分離使試劑與顆粒容易分離。在本申請中又一個(gè)有用的固相是微量滴定板，它廣泛地用于固相合成。在一個(gè)有益的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在聚苯乙烯王氏樹脂上NSP-DMAE和DMAE衍生物的固相合成方法。有利地，本發(fā)明的用于NSP-DMAE衍生物的連接和分裂的方法不需要吖啶酯用附加官能團(tuán)的改性以使之連接于固相。通過使用石黃酸酯結(jié)構(gòu)部分(該結(jié)構(gòu)部分為NSP-DMAE結(jié)構(gòu)的固有部分)作為連接和/人王氏樹脂上分裂的手l爻，實(shí)現(xiàn)了此類化合物和它們的衍生物的固相合成的"無痕跡連接基"途徑，如在圖1中所示。圖1顯示了通過在NSP-DMAE衍生物中的磺酸酯結(jié)構(gòu)部分轉(zhuǎn)化成磺酰氯，隨后偶聯(lián)于王氏樹脂上，來使NSP-DMAE衍生物連接于王氏樹脂(參見表1)。在NSP-DMAE甲酉旨，NSP-DMAE-PFP(PFP:五氟苯基)酯和NSP-DMAE-NHS(NHS:N-羥基琥珀酰亞胺)酯中的石黃酸酯轉(zhuǎn)化成磺酰氯的過程是通過在純凈亞硫酰氯中加熱這些化合物來實(shí)現(xiàn)，如在圖l中所示。通過讓磺酰氯與在樹脂上的醇基團(tuán)在溶劑如二氯甲烷或四氫呋喃中反應(yīng)形成千基磺酸酯酯鍵，來進(jìn)行NSP-DMAE衍生物的共價(jià)連接。這些化學(xué)轉(zhuǎn)變是在合成有機(jī)化學(xué)中的標(biāo)準(zhǔn)4支術(shù)并且是本領(lǐng)域中專業(yè)人員所熟知的。沖對脂固定的NSP-DMAE的分裂也通過用酸處理來容易地實(shí)現(xiàn)。因此，用三氟乙酸在二氯甲烷中處理樹脂(用固定的NSP-DMAE衍生物)，水解該磺酸酯和將吖啶酯釋放到溶液中。含有吖啶酯的溶液然后通過簡單的過濾步驟與樹脂分離。吖啶酯固定和分裂的程度能夠通過UV-可見分光光度分析來測定。吖啶鋪環(huán)顯示出在酸溶液如水和乙腈的1:1混合物(各含0.05%三氟乙酸)中的在370nm處的強(qiáng)吸收帶。通過使用這一規(guī)程，可以觀察到各種NSP-DMAE衍生物能夠有效地與聚苯乙烯王氏樹脂偶聯(lián)并從聚苯乙烯王氏樹脂上分裂(表1)。表1__NSP-DMAE衍生物連接于PS-王氏樹脂和從該樹脂分裂_亞石克酰氯，固定+分裂效分裂的NSP-DMAE衍R反應(yīng)溫度，率，％生物的HPLC純度，。/。_時(shí)間(小時(shí))_-OMe80。C，1-24898PFP50-60oC，33599陽O-琥珀酰亞胺基50-60oC,43690從表1,由HPLC(高壓液相色譜法)測定的分裂的NSP-DMAE衍生物的純度是很高的，因此表明在苯酚(甲酯，五氟苯基酯和NHS酉旨)上的官能團(tuán)沒有受到在NSP-DMAE衍生物轉(zhuǎn)化成》黃酰氯，其連接于樹脂上和其隨后從樹脂上分裂的過程中所涉及到的反應(yīng)順序之影響。而且觀察到，在NSP-DMAE衍生物固定在樹脂上之后，樹脂能夠一皮濾出且含有殘留吖啶酯(未附著于樹脂上)的溶劑能夠循環(huán)利用。從以上可以清楚地看出，在吖啶鋪環(huán)的其它位置上用磺酸酯官能團(tuán)官能化的吖啶ll化合物也能夠通過使用本發(fā)明的方法以共價(jià)鍵方式偶聯(lián)于王式樹脂以及從王式樹脂上分裂。例如，吖啶氮能夠用市場上買得到的1,4-丁烷磺內(nèi)酯來烷基化，按照Natrajan等人在美國專利No.6,355,803中所述，它的公開內(nèi)容被引入這里供參考。然后，該N-磺基丁基能夠按照這里所述方法進(jìn)行處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該固定和分裂方法也能夠用于葉酸類似物的吖啶f翁共軛物的構(gòu)建。維生素葉酸是谷氨酸和蝶酸的共軛物并且通常由免疫測定法測定。葉酸是小的被分析物且在自動化的免疫分析器中，例^口在SiemensMedicalSolutionsDiagnostic的ACS:180⑧和AdviaCentaur中，葉酸分析法使用葉酸的吖啶鋪共軛物以及固定到順磁性顆粒(PMP)上的葉酸酯結(jié)合蛋白(FBP)作為兩種主要的分析試劑。在葉酸中，兩種羧酸(稱為oc和y型)中的一種通常用于共軛物的制備。為了讓葉酸酯共輒物有效結(jié)合于葉酸酯結(jié)合蛋白上，該a-羧酸應(yīng)該是游離的，Y-羧酸應(yīng)該是^f尤選的連才妻^f立置，^口在Wang等人_S/oco/^wga^C/ze附.1996,Vol7，第56-62頁中所述，它的公開內(nèi)容被引入這里供參考。葉酸的結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)有與這些共扼物結(jié)合于FBP上有關(guān)的NSP-DMAE-葉酸酯共軛物的兩個(gè)結(jié)構(gòu)方面，并在圖2中示出。通常地，在小的被分析物的化學(xué)發(fā)光的或發(fā)熒光的共軛物的制備過程中，"間隔基"被引入在被分析物和化學(xué)發(fā)光的或發(fā)熒光的分子之間。該間隔基或連接基可發(fā)揮許多功能，并且對于給定的被分析物，它的結(jié)構(gòu)可能需要優(yōu)化。間隔基的一個(gè)功能是最大程度減少化學(xué)發(fā)光的或熒光的標(biāo)記物對于共軛物結(jié)合于它的結(jié)合分子上的位阻干撓。通常使用的結(jié)合分子是在免疫測定中的抗體或結(jié)合蛋白和在核酸分析中的核酸。該間隔基也會影響共軛物的溶解度，并且從聚(亞乙基)二醇和精胺衍生的具有改進(jìn)的水溶解度的親水性間隔基已經(jīng)由Natrajan等人在美國專利No.6,664,043中描述，它的公開內(nèi)容被引入這里供參考。發(fā)現(xiàn)這些親水性間隔基賦予有益的性能如增強(qiáng)的特異性結(jié)合，和對于被分析物葉酸酯、茶堿和托普霉素降低的在吖啶酯-被分析物共軛物上的非特異性結(jié)合。通過篩選幾種間隔基，該間隔基長度對于NSP-DMAE-蝶酸酯共軛物的最大結(jié)合而優(yōu)化。即使這些共軛物不含有在葉酸酯中發(fā)現(xiàn)的谷氨酸結(jié)構(gòu)部分，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該蝶酸酯結(jié)構(gòu)部分本身也結(jié)合于FBP,雖然不如Y-連接的葉酸酯共軛物結(jié)合的好。篩選的間隔基包括乙二胺(ED)，和從二甘醇(DEG),三甘醇(TEG),示如下。十酸的結(jié)構(gòu)罕叫H2N|^Op^H211=1-5間隔基四甘醇(TEEG),五甘醇(PEEG)和六甘醇(HEG)衍生的其它二氨基分子。NSP-DMAE-蝶酸酯共軛物的固相合成可以按照在圖3中所說明的那樣來進(jìn)行。聚苯乙烯王氏樹脂固定的NSP-DMAE-PFP酯首先與以上二氨基化合物反應(yīng)。在這些反應(yīng)中，該P(yáng)FP酯被在間隔基中的這些胺當(dāng)中的一個(gè)之間的酰胺鍵所替代，讓另一端(胺)保持游離以便用于后續(xù)的與N氣三氟乙?；岬姆磻?yīng)。這一偶聯(lián)反應(yīng)通過常常在肽合成中使用的商購偶聯(lián)劑HATU來媒介。在該第二反應(yīng)中，在樹脂固定的NSP-DMAE-間隔基和蝶酸酯結(jié)構(gòu)部分之間形成酰胺鍵。然后利用三氟乙酸從樹脂上分裂各種NSP-DMAE-間隔基-N氣三氟乙?；?蝶酸酯共軛物，并通過過濾與樹脂分離。共軛物全部由HPLC提純。在共軛物中三氟乙?；某ネㄟ^4吏用有才幾堿。底啶來完成。在如上所述的反應(yīng)中，沒有觀察到NSP-DMAE從樹脂上的非有意的分裂。這對于吖啶鋪化合物衍生物的固相合成是有利的。通常地，千基磺酸酯對于水解是相當(dāng)敏感的，但是對于連接于王氏樹脂上的NSP-DMAE所觀察到的增強(qiáng)穩(wěn)定性可歸因于固相。用固定于王氏樹脂上的其它節(jié)基磺酸酯所獲得的類似觀察結(jié)果已經(jīng)由Hari和MillerOrg.Lett.1999,Voll,第2109-2111頁報(bào)道，它的公開內(nèi)容因此被引入這里供參考。為了研究在NSP-DMAE-蝶酸酯共軛物中的各種間隔基對于共軛物在FBP上的結(jié)合之影響，這些共軛物在SiemensMedicalSolutionsDiagnostics的葉酸酯分析中進(jìn)行篩選。具有各種間隔基的NSP-DMAE-蝶酸酯共扼物和具有不同連接位置的NSP-DMAE-葉酸酯共輒物在葉酸酯結(jié)合分一斤(SiemensMedicalSolutionsDiagnostics的ACS:180FolateAssay)中進(jìn)行試驗(yàn)，以比較它們在葉酸酯結(jié)合蛋白上的結(jié)合。對于這一分析，上述共扼物各自在含有0.0060M-舞酸二氬鈉，0.024M4,酸一氬鉀，0.015M疊氮化鈉，0.15M氯化鈉，1.0g/L牛血清白蛋白的溶液(在pH7.4)中被稀釋至10毫微摩爾/L的濃度。ACS:180⑧葉酸酯分析(儀)是由SiemensMedicalSolutionsDiagnostics制造的供在SiemensMedicalSolutionsDiagnostics的ACS:180(AutomatedChemiluminescentImmunoassaySystem(自動化的化學(xué)發(fā)光免疫測定系統(tǒng)))上使用的一系列商購免疫測定設(shè)備中的一種。在這一分析中，葉酸酯和蝶酸酯的吖啶錄化合物共軛物結(jié)合于葉酸酯結(jié)合蛋白上，后者被固定在磁性可分離的順磁性顆粒(PMP)上。因?yàn)檫灌や伝衔锸腔瘜W(xué)發(fā)光的并且發(fā)射由ACS:180測量的光，和因?yàn)槿~酸酯和蝶酸酯化合物結(jié)合于葉酸酯結(jié)合蛋白，所以在結(jié)合于PMP上的葉酸酯結(jié)合蛋白上的NSP-DMAE-蝶酸酯或-葉酸酯共軛物的量與由ACS:180⑧測量的化學(xué)發(fā)光的量之間存在正的相互關(guān)系。ACS:180⑧自動地進(jìn)行葉酸酯分析的以下步驟。首先，將0.100mL的NSP-DMAE-蝶酸酯或-葉酸酯共軛物的各10毫微摩爾/L溶液與0.480mL的在PMP上的葉酸酯結(jié)合蛋白在37。C混合2.5分鐘。通過從含有未結(jié)合的NSP-DMAE-蝶酸酯共軛物或-葉酸酯共扼物的流體中磁性分離PMP和然后用水洗滌PMP,ACS:180⑧完成ACS:180⑧葉酸酯分析。從PMP上的吖吱鎩化合物發(fā)出的化學(xué)熒光通過各0.30mL的ACS:180⑧試劑1和試劑2的順序添加，用后續(xù)的光發(fā)射來引發(fā)。試劑1是O.lM硝酸和0.5%過氧化氬。試劑2是0.25M氬氧化鈉和0.05%氯化十六烷基三甲基餒。ACS:180⑧測量對應(yīng)于作為相對的發(fā)光單元(RLU)進(jìn)行試驗(yàn)的各NSP-DMAE-蝶酸酯或-葉酸酯共軛物的化學(xué)熒光。所測量的化學(xué)熒光的量與結(jié)合于PMP上的NSP-DMAE-蝶酸酯或-葉酸酯共軛物的量相關(guān)；因此，化學(xué)熒光的量與用于葉酸酯結(jié)合蛋白的NSP-DMAE-蝶酸酯或隱葉酸酯共軛物的親合性有關(guān)，因?yàn)楦髟?驗(yàn)的NSPDMAE-蝶酸酯或-葉酸酯共軛物的量是相同的，這意味著NSP-DMAE-蝶酸酯或-葉酸酯共軛物對于葉酸酯結(jié)合蛋白的親合性越大，則所測量的RLU的數(shù)目越大。與在0.100mL的10毫微摩爾的NSP-DMAE-蝶酸酯或-葉酸酯共輒物中的總化學(xué)熒光相比所測量的化學(xué)熒光百分?jǐn)?shù)的歸一化得到了NSP-DMAE-蝶酸酯或-葉酸酯共軛物與各種間隔基或用于葉酸酯結(jié)合蛋白的連接位置之間的已制成表的相對親合性(Bo/T)。對于NSP-DMAE-蝶酸酯或-葉酸酯共軛物所測量的結(jié)合的化學(xué)萸光的百分?jǐn)?shù)越高，該共軛物對于葉酸酯結(jié)合蛋白的親合性越大。對于蝶酸的這些各種NSP-DMAE共軛物，即NSP-DMAE-ED-蝶酸酯，NSP-DMAE-DEG-蝶酸酉旨，NSP-DMAE-TEG匿蝶酸酉旨NSP-DMAE隱TEEG-蝶酸酉旨,NSP-DMAE-PEEG-蝶酸西旨NSP-DMAE-HEG-蝶酸酯，結(jié)果以表格形式列于表2中。表2.NSP畫DMAE畫蝶i酸酯與FBP的結(jié)合化合物Bo/T,%NSP-DMAE-ED-蝶酸酯0.82NSP-DMAE-DEG-蝶酸酯0.92NSP-DMAE-TEG-蝶酸酯1.26NSP-DMAE-TEEG-蝶酸酯1.13NSP-DMAE-PEEG-蝶酸酯1.15NSP-DMAE-HEG-蝶酸酯1.10從表2中看出，共軛物的結(jié)合隨著間隔基長度的增加而提高，直至達(dá)到最佳長度為止，它對應(yīng)于TEG間隔基。在含有TEEG、PEEG和HEG間隔基的共軛物中間隔基長度進(jìn)一步增大不會更進(jìn)一步改進(jìn)結(jié)合作用。因此，實(shí)現(xiàn)最佳結(jié)合的間隔基長度能夠由這一簡單研究，即通過NSP-DMAE-蝶酸酯共軛物與不同長度的間隔基在固相上的快速組裝并對于在SiemensMedicalSolutionsDiagnostics的葉酸酯分片斤中的結(jié)合作用篩選它們，來快速地測定。隨著間隔基的長度的優(yōu)化，本發(fā)明的合成方法用于考察在NSP-DMAE與TEG間隔基的"非自然"葉酸酯共軛物中各種氨基酸取代的作用。該葉酸酯共軛物^t認(rèn)為是非自然的，因?yàn)橥ǔＴ谌~酸酯中發(fā)現(xiàn)的氨基酸谷氨酸已經(jīng)被這些共軛物中的其它氨基酸例如氨基酸丙氨酸(Ala)，精氨酸(Arg)，谷氨酸(Gln),組氨酸(His),異亮氨酸(Isoleu),亮氨酸(Leu),蛋氨酸(Met),正亮氨酸(Norleu),苯基丙氨酸(Phe),脯氨酸(Pro)，絲氨酸(Ser)，酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)替代。這些共軛物的固相合成是按照在圖4中所說明的方式進(jìn)行。在圖4中描述的全部化學(xué)反應(yīng)和試劑是在合成有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中的專業(yè)人員所熟知的。固相合成是用0.9g的聚苯乙烯王氏樹脂開始的，其中通過從吖啶酯的磺酸根結(jié)構(gòu)部分到在樹脂上的,醇之間的磺酸酯鍵連接將NSP-DMAE-PFP酯連接于樹脂。PFP酯與二氨基-TEG的反應(yīng)替代了PFP酯并獲得樹脂固定的NSP-DMAE-TEG。小部分的樹脂用三氟乙酸在二氯甲烷中處理，以使吖啶酯從樹脂上分裂。通過HPLC的后續(xù)分析表明，產(chǎn)物NSP-DMAE-TEG具有94%的純度，因此表明該NSP-DMAE化合物在王氏樹脂上的純凈形成。由早已討論的UV-可見分光光度測定法對吖啶酯產(chǎn)率的分析也表明85%的總產(chǎn)率。因此，這些結(jié)果表明，樹脂固定的NSP-DMAE-PFP酯與二氨基-TEG的反應(yīng)進(jìn)行至完全，在反應(yīng)過程中非常少的吖啶酯從樹脂上分裂。然后通過使用偶聯(lián)劑HATU(它通常用于肽合成)或通過與FMOC-氨基酸-PFP酯的直接反應(yīng)，樹脂固定的NSP-DMAE-TEG(25mg樹脂/每次反應(yīng))偶聯(lián)于各種FMOC保護(hù)的(FMOC二藥基曱基)氨基酸。該FMOC保護(hù)基團(tuán)通常用于肽合成中，F(xiàn)MOC保護(hù)的氨基酸是現(xiàn)有技術(shù)中公知。在這些偶聯(lián)反應(yīng)之后，樹脂固定的NSP-DMAE-TEG-FMOC-氨基酸在各情況下用1%。底咬處理，使FMOC基團(tuán)從氨基酸上分裂。為了確定這一處理是否也由吖啶酯從樹脂上的任何不希望有的分裂所引起，對于氨基酸苯基丙氨酸，在哌啶處理之后小部分的樹脂用三氟乙酸處理以使NSP-DMAE衍生物從樹脂上分裂。吖咬酯,人這一處理的量化表明100%的產(chǎn)率。因此，哌咬處理沒有影響從NSP-DMAE到樹脂的磺酸酯鍵連接。合成的最終階段是通過使用肽偶聯(lián)劑HATU將N氣三氟乙?；崤悸?lián)到樹脂固定的NSP-DMAE-TEG-氨基酸上來完成。然后通過使用三氟乙酸從樹脂上分裂各種NSP-DMAE-TEG-氨基酸-N氣三氟乙?；?蝶酸酯共軛物和通過HPLC進(jìn)行提純。吖啶酯總產(chǎn)率對于氨基酸苯基丙氨酸和脯氨酸進(jìn)行測量，并測得是81%和72%。在全部共輒物中使三氟乙?；至训淖罱K反應(yīng)通過使用哌啶水溶液來進(jìn)行。各種非自然的NSP-DMAE-葉酸酯共輒物的結(jié)構(gòu)顯示如下。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>NSP-DMAE-TEG-Phe隱蝶酸酉旨<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>NSP-DMAK-l'EG-Isoleu-蟲菜酸酯接著，對各種非自然的葉酸酯共軛物在葉酸酯結(jié)合蛋白(FBP)上的結(jié)合按照早已對于NSP-DMAE-蝶酸酯共軛物所描述的SiemensMedicalSolutionsDiagnostics的葉酸酯分析來評價(jià)。結(jié)果列于表3中。也包括在表3中的是兩種葉酸酯共軛物與自然的氨基酸谷氨酸的結(jié)合值。共軛物NSP-DMAE-TEG-a-葉酸酯具有游離y-羧酸，而共軛物NSP-DMAE-TEG-y-葉酸酯具有游離a-羧酸。這兩種共扼物通過使用由Natrajan等人在美國專利No.6,664,043中描述的程序來合成，它的公開內(nèi)容被引入這里供參考。表3.非自然和自然NSP-DMAE-TEG-葉酸酯共軛物在FBP上的結(jié)合共軛物Bo/T,%HPLC純度，％NSP-DMAE-TEG-Arg-蝶酸酯0.8585NSP-DMAE-TEG-His-蝶酸酯1.1090NSP-DMAE-TEG-Gln-蝶酸酯0.9590NSP-DMAE-TEG-Ser-蝶酸酯0.9790NSP-DMAE-TEG-Ala-蝶酸酯0.8490NSP-DMAE-TEG-Pro-蝶酸酯0.7691NSP-DMAE-TEG-Met-蝶酸酯1.0588NSP-DMAE-TEG-Val-蝶酸酯0.9494NSP-DMAE-TEG-Tyr-蝶酸酯11996NSP-DMAE-TEG-Isoleu-蝶酸酯0.8598NSP-DMAE-TEG-Leu-蝶酸酯0.8899NSP-DMAE-TEG-Norleu-蝶酸酯0.9892NSP-DMAE-TEG-Phe-蝶酸酯1.0693NSP-DMAE-TEG-a-葉酸酯1.3197NSP-DMAE-TEG-y-葉酸酯2.3196從上表可知，全部的非自然葉酸酯共軛物的結(jié)合值都低于兩種自然葉酸酯共輒物的值，這正如所預(yù)期的。與文獻(xiàn)中的4艮道一致，通過Y-羧酸連接的共軛物即NSP-DMAE-TEG-Y-葉酸酯具有最高的結(jié)合值，它幾乎是oc-連接的異構(gòu)體NSP-DMAE-TEG-a-葉酸酯的值(1.31)的兩倍(2.31)。因此，該a-羧酸似乎是結(jié)合的重要貢獻(xiàn)者。對表3的檢查揭示了與非自然葉酸酯共軛物在FBP上的結(jié)合有關(guān)的一些有意義的細(xì)節(jié)。對于氨基酸脯氨酸觀察到最低的結(jié)合值。不希望受任何理論的束縛，可以相信這可能是因?yàn)樵谶@一共軛物中，吖啶酯相對于蝶酸酯結(jié)構(gòu)部分的取向?qū)τ诠曹椢镌贔BP上的結(jié)合作用導(dǎo)致一定程度的位阻干撓。在脯氨酸中，蝶酸酯和吖啶酯分別連接到的氨基和羧酸官能團(tuán)彼此以大約90°取向。這一取向很可能增強(qiáng)由于吖啶酯導(dǎo)致的蝶酸酯結(jié)構(gòu)部分結(jié)合在FBP上的位阻干撓。在含有堿性氨基酸精氨酸的共軛物中，該結(jié)合再次是低的。用含有游離a-羧酸的NSP-DMAE-TEG-Y-葉酸酯所觀察到的與增強(qiáng)結(jié)合相關(guān)所得到的這一結(jié)果提示了在堿性精氨酸結(jié)構(gòu)部分和在FBP的結(jié)合部位上的堿性官能團(tuán)之間有不適宜的靜電相互作用。在表3中的結(jié)果也表明，從帶芳族官能團(tuán)的氨基酸衍生的非自然葉酸酯共軛物結(jié)合好于帶脂肪族官能團(tuán)的那些氨基酸。例如，非自然葉酸酯共輒物與氨基酸His、Tyr和Phe的結(jié)合分別是1.1,1.19和1.06。這些氨基酸含有芳族官能團(tuán)。相反，非自然的葉酸酯與氨基酸Ala、Isoleu和Leu的共軛物分別具有0.84，0.85和0.88的較低結(jié)合值。這些氨基酸含有脂肪族烷基官能團(tuán)，它們似乎對結(jié)合沒有貢獻(xiàn)。一些優(yōu)選實(shí)施方案的以上描述說明了本發(fā)明的簡單性和實(shí)用性。通過由固相合成快速地組裝NSP-DMAE的許多非自然葉酸酯共輒物并為進(jìn)行結(jié)合而對它們進(jìn)行篩選，能夠在相對較短的時(shí)間內(nèi)推斷它們結(jié)合在FBP上的力學(xué)和結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。對于本領(lǐng)域中技術(shù)人員來說顯而易見的是，以上所述的方法能夠用于具有N-磺丙基或N-磺基丁基的任何吖啶鋪化合物，該基團(tuán)能夠用于以共價(jià)鍵連接于固相如王氏樹脂上。合成構(gòu)建設(shè)計(jì)所需要的第二種官能團(tuán)能夠位于苯酚上，如在本發(fā)明中所述，或位于在吖啶鋪環(huán)中的其它位置上。另外，具有不同結(jié)構(gòu)特征的各種吖啶鎩化合物衍生物能夠通過本發(fā)明的吖啶鋪化合物固定的固相來合成。吖啶鋪化合物在固相如王氏樹脂上的連接也能夠通過使用N-羧曱基(NCM)基團(tuán)而不是N-磺丙基或N-磺基丁基基團(tuán)來進(jìn)行。在這種情況下，在吖啶鋪化合物上的N-羧甲基和在王氏樹脂上的千醇的反應(yīng)得到羧酸酯鍵。在羧酸類和醇類之間形成酯鍵的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的并且構(gòu)成了在合成有機(jī)化學(xué)中的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。一旦該吖啶鎩化合物已經(jīng)固定在王氏樹脂上，則在吖啶錄化合物上的第二種官能團(tuán)能夠用于以與對于固相固定的NSP-DMAE書f生物所i兌明的方式相類似的方式所進(jìn)4亍的進(jìn)一步合成構(gòu)建設(shè)計(jì)中。羧酸酯鍵從王氏樹脂上的分裂也能夠以與以上對于石黃酸酯所述的方式相同的方式來進(jìn)行，即，用酸如三氟乙酸處理。由這一程序從樹脂上釋放的吖啶鋪化合物將含有N-羧曱基。將這一吖啶鋪化合物轉(zhuǎn)化成含有N-曱基的DMAE衍生物，需要將N-羧曱基轉(zhuǎn)化成N-甲基的方法并且該方法由本發(fā)明的方法來提供。本發(fā)明的DMAE書f生物的固相合成的一個(gè)合成策略在圖5中說明。在這一途徑中，具有NCM基團(tuán)和在苯酚上含有官能團(tuán)R的DMAE衍生物連接于聚苯乙烯王氏樹脂上形成羧酸酯鍵。該官能團(tuán)R然后用于合成構(gòu)建設(shè)計(jì)中得到基團(tuán)R'。R'沒有限制地能夠是雌二醇，茶堿或蝶酸酯衍生物和用類推的方法是任何小分子。雌二醇和茶堿是通常在免疫測定中測量的小分子一皮分析物。該DMAE衍生物然后從樹脂上分裂并且在最終的步驟中，通過NCM結(jié)構(gòu)部分的脫羧將NCM基團(tuán)轉(zhuǎn)化成具有N-甲基的DMAE衍生物。NCM-DMAE衍生物的脫羧在以前是未知的。為了說明在圖5中所說明的合成策略的可4亍性，在圖6中i兌明的NCM-DMAE-ED的脫羧被考察。NCM-DMAE衍生物通過使用標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)化學(xué)技術(shù)來合成，合成細(xì)節(jié)描述在實(shí)施例4中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在沒有溶劑的情況下加熱化合物所引起的NCM-DMAE-ED的脫羧伴隨著整個(gè)N-烷基的不希望有的損失得到吖啶-ED。然而，通過在純凈乙酸中加熱NCM-DMAE衍生物，NCM-DMAE衍生物能夠以N-烷基的最小損失來有效地脫羧基。其它反應(yīng)條件是不太成功的，雖然認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些包括將NCM-DMAE-ED在固態(tài)下本身加熱或與鹽類如氯化錳、氯化銨一起加熱或用酸如30%HBr/AcOH和三氟乙酸處理。4吏用本發(fā)明的合成方法，DMAE的三種共輒物即DMAE-ED-6-CMO-雌二醇，DMAE-ED-茶堿和DMAE-ED-蝶酸酯的固相合成分別示于圖7-9中并在這里所提供的實(shí)施例中詳細(xì)說明。簡單地說，該合成要求含有FMOC保護(hù)基團(tuán)的NCM-DMAE-ED連接到聚苯乙烯王氏樹脂上；FMOC基團(tuán)的分裂；與雌二醇、茶堿或蝶酸酯結(jié)構(gòu)部分的反應(yīng)；DMAE共軛物/人樹脂上的分裂，然后通過在純凈乙酸中加熱該共扼物進(jìn)行脫羧。該雌二醇，茶堿和蝶酸酯化合物可從商業(yè)供應(yīng)商獲得或能夠根據(jù)眾所周知的文獻(xiàn)方法容易地制備。廣義而言，根據(jù)本發(fā)明的吖啶镩化合物和它們的衍生物或共軛物的固相合成的方法包括以下步驟(a)吖啶鋪化合物通過使用N-磺基烷基連接于固相上，(b)將在吖啶鎩環(huán)上的第二官能團(tuán)或離去基團(tuán)用于合成，構(gòu)建設(shè)計(jì)得到新的吖啶鋪化合物衍生物或共軛物，(c)將吖啶鎩化合物衍生物或共軛物從固相上分裂。本發(fā)明的方法也能夠用于吖啶鋪化合物和它們的共軛物的合成，該方法包括以下步驟(a)吖啶錄化合物通過使用N-羧甲基連接于固相上，(b)將在吖啶鎩環(huán)上的第二官能團(tuán)或離去基團(tuán)用于合成構(gòu)建設(shè)計(jì)，得到新的吖啶鋪化合物衍生物或共軛物，(c)將吖啶鎩化合物衍生物或共軛物從固相上分裂，(d)通過在乙酸中加熱吖啶鎩化合物衍生物或共軛物來使之脫羧基。實(shí)施例1NSP-DMAE固定到聚苯乙烯王氏樹脂上a)2，,6，-二甲基-4，-五氟苯基氧基羰基苯基-10-^[-磺丙基-吖啶錢-9-羧酸酉旨(NSP-DMAE-PFP酯)的合成2，,6，-二曱基-4，-羧基苯基-10-N-磺丙基-吖啶鋝-9-羧酸酯(0.105g,0.25mmol)和五氟苯盼(0.132g,0.72mmol)在無水DMF(10mL)中的溶液用二異丙基碳二亞胺(0.115mL，3當(dāng)量)處理。反應(yīng)在室溫下在氮?dú)夥罩袛嚢?。?-3小時(shí)的攪拌后，通過使用從Phenomenex公司獲得的分析C!8色譜柱，4.6mmx30cm和10—70%MeCN/H2〇含有0.05%三氟乙酸的30分鐘梯度(lmL/mm的流速)和在260nm下的UV沖企測進(jìn)4亍HPLC分析；表明完全轉(zhuǎn)化成在24分鐘時(shí)洗脫出的產(chǎn)物。反應(yīng)混合物被蒸干和殘留物被懸浮于甲苯中并蒸干。將干殘留物溶于曱醇中，產(chǎn)物通過使用20%曱醇/氯仿作為洗脫溶劑由在硅石上的制備性TLC提純。產(chǎn)率=0.121g(86%)。b)NSP-DMAE-PFP酯固定到聚苯乙烯王氏樹脂上將NSP-DMAE-PFP酯(CU2g,0.21mmol)懸浮于純凈的亞硫酰氯(1.5mL)中，該懸浮液在50°C的油浴中加熱2.5小時(shí)。反應(yīng)然后在減壓下濃縮和將殘留物懸浮于無水甲苯(5mL)中并蒸干。該酰氯然后被溶于無水THF(10mL)中并與二異丙基乙胺(0.2mL)—起被添加到聚苯乙烯王氏樹脂(1.8-2.0mmolOH/g,Aldrich,lg)中。反應(yīng)在室溫下溫和地?cái)嚢?6小時(shí)。反應(yīng)用5mL甲醇稀釋，在讓樹脂沉降之后，用巴斯德吸管除去溶劑。樹脂以這樣的方式用曱醇漂洗若干次。合并的洗滌液蒸干，獲得未反應(yīng)的NSP-DMAE-PFP酯，它能夠循環(huán)使用。在最終的曱醇洗滌之后樹脂在真空下干燥。通過將10mg的樹脂與0.5mL的1:1二氯甲烷和三氟乙酸一起攪拌一小時(shí)來測定吖啶酯荷載。反應(yīng)然后用甲醇(l-2mL)稀釋和過濾，分出樹脂。濾液被蒸干。從樹脂分裂的吖咬酯溶于lmL的l:l，H20/MeCN(各含有0.05%三氟乙酸)中。按照在節(jié)段(a)中描述的這一溶液的HPLC分析表明99%純度的純凈NSP-DMAE-PFP酯。在BeckmanModel7500分光光度計(jì)上進(jìn)行UV-可見光光鐠計(jì)量分析。吖啶鎩環(huán)顯示在370nm(sM=10000)處的強(qiáng)吸收。根據(jù)這一分析，在聚苯乙烯樹脂上的吖啶酯負(fù)載測得是38mg/1g王氏樹脂。實(shí)施例2在王氏樹脂上NSP-DMAE-蝶酸酯共軛物的合成a)乙二胺(ED),二氨基二甘醇(DEG)，二氨基三甘醇(TEG),二氨基四甘醇(TEEG),二氨基五甘醇(PEEG)和二氨基六甘醇(HEG)偶聯(lián)到樹脂固定的NSP-DMAE-PFP酉旨將王氏樹脂固定的NSP-DMAE-PFP酯(20mg初于脂，2mg吖啶酉旨)懸浮于二氯曱烷(l-2mL)中并用乙二胺(ED),二氨基二甘醇(DEG),二氨基三甘醇(TEG)，二氨基四甘醇(TEEG),二氨基五甘醇(PEEG)和二氨基六甘醇(HEG)(50-100mM)處理。從TEEG、PEEG和HEG衍生的二氨基化合物從商購二醇合成，按照在美國專利No.6,664,043中所述。反應(yīng)在室溫下攪拌3.5小時(shí)和然后用甲醇(4mL)稀釋。來自各反應(yīng)的樹脂進(jìn)行沉降，除去溶劑。樹脂然后用甲醇(5mL)漂洗三次，然后真空干燥。從各反應(yīng)得到的干燥樹脂(2mg)用0.1mL的1:1二氯曱烷和三氟乙酸處理。在1小時(shí)后，除去溶劑并將干燥樹脂懸浮于0.2mL的1:11:1，H20/MeCN(各含有0.05%三氟乙酸)中和進(jìn)行過濾。如實(shí)施例1節(jié)段(a)中所述對來自各反應(yīng)的濾液進(jìn)行HPLC分析。全部反應(yīng)表明完全轉(zhuǎn)化成分別在10.0mm,10.2min，11.4min,12mm,12.5mm和12.9min時(shí)洗脫出的產(chǎn)物NSP-DMAE匿ED,NSP誦DMAE-DEG,NSP-DMAE-TEG,NSP-DMAE隱TEEG,NSP-DMAE-PEEG和NSP-DMAE-HEG。b)樹脂固定的NSP-DMAE-間隔基在N"-三氟乙?；嵘系呐颊趯，三氟乙?；?25mg,61.3微摩爾)在無水DMF(1.2mL)中的溶液用二異丙基乙胺(13jLiL,1.2當(dāng)量)和HATU(28mg,1.2當(dāng)量)處理。反應(yīng)在室溫下攪拌30分鐘，然后將0.2mL的這一溶液單獨(dú)添加到來自節(jié)段(a)的六種樹脂中。樹脂在室溫下溫和地?cái)嚢?。?6小時(shí)后，反應(yīng)用DMF(2mL)和曱醇(4mL)稀釋。在樹脂沉降之后，在各情況下除去溶劑，樹脂用甲醇(5mL)漂洗三次。它們?nèi)缓笤谡婵障赂稍?。通過將樹脂與0.5mL的1:1二氯甲烷和三氟乙酸在室溫下一起攪拌一小時(shí)，共軛物從樹脂上分裂。溶劑然后從各反應(yīng)中除去，在各情況下將樹脂懸浮于DMF(2mL)中并進(jìn)行過濾。在實(shí)施例1,節(jié)段(a)中描述的HPLC分析顯示了分別在15.2mm,15.2mm,15.3min，15.5mm,15.7mm和15.9min時(shí)洗脫出的共扼物NSP-DMAE-ED-N10-三氟乙酰基蝶酸酯，NSP-DMAE-DEG-N"-三氟乙?；狨?，NSP-DMAE-TEG-N氣三氟乙?；狨?，NSP-DMAE-TEEG-N10-三氟乙?；狨?，NSP-DMAE-PEEG-N"-三氟乙?；狨ズ蚇SP-DMAE-HEG-N川-三氟乙酰基i萊酸酯。這些共扼物全部通過4吏用C1820x300mm柱由制備性HPLC提純。在各情況下含有共軛物的HPLC級分在-80。C下冷凍，然后凍干到干燥。然后將凍干的這些共軛物溶于DMF(每次0.5mL)中和用0.25mL的0.5M哌啶水溶液在4°C下處理。反應(yīng)升至室溫，然后攪拌l小時(shí)。在實(shí)施例1的節(jié)段(a)中描述的HPLC分析表明在各情況下三氟乙?；耐耆透蓛舻某?，得到分別在13.6mm,12.9min,13.5min,13.8mm,14mm和14.3mm時(shí)洗脫出的共扼物NSP-DMAE-ED-蝶酸酯，NSP-DMAE-DEG-蝶酸酯，NSP-DMAE-TEG-蝶酸酯，NSP-DMAE-TEEG-蝶酸酯，NSP-DMAE-PEEG-蝶酸酯和NSP-DMAE-HEG-蝶酸酯。反應(yīng)全部在-80。C下冷凍，然后凍干到干燥。該共扼物也由MALDI-TOF質(zhì)語分析法表征，如以下在表4中所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>實(shí)施例3在王氏樹脂上非自然NSP-DMAE-葉酸酯共軛物的合成a)樹脂固定的NSP-DMAE-TEG的合成將王氏樹脂固定的NSP-DMAE-PFP酉旨(0.9g樹脂，0.38mg吖咬酯/10mg樹脂)懸浮于無水二氯曱烷(10mL)中，然后用二氨基-TEG(75juL，50mM)處理。樹脂在室溫下溫和地?cái)嚢?小時(shí)。樹脂然后用乙酸乙酯稀釋，然后讓樹脂沉降。除去溶劑，樹脂用曱醇(5xlOmL)漂洗若干次，然后真空干燥。少量(10mg)的樹脂與0.5mL的1:1二氯甲烷和三氟乙酸在室溫下攪拌1小時(shí)。反應(yīng)然后用曱醇(lmL)稀釋，然后過濾。該濾液蒸干，將吖咬酯殘留物溶于1mL1:1H20/MeCN(各含有0.05°/。三氟乙酸)中。按實(shí)施例1節(jié)段(a)中描述的對這一溶液進(jìn)行的HPLC分析顯示在11.4分鐘(94%純度)洗脫出的產(chǎn)物NSP-DMAE-TEG,UV-可見光分光光度分析表明85%的吖咬酯產(chǎn)率。b)樹脂固定的NSP-DMAE-TEG在FMOC保護(hù)的氨基酸上的偶聯(lián)程序A:對于FMOC-亮氨酸-PFP酯偶聯(lián)到樹脂固定的NSP-DMAE-TEG上所描述的下列程序?qū)⒂糜谌可藤廎MOC-氨基酸-PFP酯(Pro,Phe，Isoleu,Leu,Met，Tyr,Ala,His和Norleu)的偶聯(lián)。來自節(jié)段(a)的王氏樹脂-NSP-DMAE-TEG(25mg,1mg吖啶酉旨)用FMOC-亮氨酸-PFP酯(25mM,6.5mg)和二異丙基乙胺(2|uL)的DMF(0.5mL)溶液處理。反應(yīng)在室溫下溫和地?cái)嚢?。?小時(shí)后，反應(yīng)用DMF(2mL)稀釋，然后在樹脂沉降之后，除去溶劑。樹脂用DMF(2mL)漂洗兩次，然后用甲醇(3x3mL)漂洗，然后真空干燥。程序B:對于FMOC-纈氨酸偶聯(lián)到樹脂固定的NSP-DMAE-TEG所描述的下列程序用于全部商購FMOC-氨基酸(Val,Ser，Gln和Arg)的偶聯(lián)。FMOC纈氨酸(4.3mg,12.5微摩爾，25mM)在無水DMF(0.4mL)中的溶液用二異丙基乙胺(2.2PL,12.5微摩爾)和HATU(5.7mg,12.5微摩爾)處理。在5分鐘后，將這一溶液添加到在DMF(0.1mL)中的樹脂固定的NSP-DMAE-TEG(25mg,1mg吖咬酯)中。反應(yīng)在室溫下攪拌16小時(shí)。反應(yīng)然后用DMF(2-3mL)稀釋，然后在樹脂沉降之后，除去溶劑。樹脂用DMF(2x3mL)漂洗，然后用甲醇(3x3mL)漂洗，然后真空干燥。c)FMOC基團(tuán)從樹脂固定的NSP-DMAE-TEG-氨基酸上的分裂使用以下一般程序。來自(b)的樹脂在含有P/。哌啶的DMF(0.25mL)中在室溫下攪拌。在1小時(shí)后，反應(yīng)用乙酸乙酯(3mL)稀釋，然后在樹脂沉降之后，除去溶劑。樹脂用乙酸乙酯和曱醇漂洗若干次，然后真空干燥。d)樹脂固定的NSP-DMAE-TEG-氨基酸偶聯(lián)到N，三氟乙?；嵘?，隨后從樹脂上分裂對于樹脂固定的NSP-DMAE-TEG-Phe偶聯(lián)到N氣三氟乙?；嵘纤枋龅南铝幸话愠绦蛴糜谌科渌亲匀蝗~酸酯共軛物。N"-三氟乙?；?4mg,9.8微摩爾)在DMF(0.4mL)中的溶液用二異丙基乙胺(2juL,1.2當(dāng)量)和HATU(4.5mg,1.2當(dāng)量)處理。反應(yīng)在室溫下攪拌30分鐘，然后與附加二異丙基乙胺(ljuL)—起被添加到樹脂固定的NSP-DMAE-TEG-Phe中。反應(yīng)在室溫下攪拌16小時(shí)。反應(yīng)然后用DMF(2mL)稀釋，然后在樹脂沉降之后，除去溶劑。樹脂用DMF(4x2mL)漂洗，然后用甲醇(4x2mL)漂洗。它然后在真空下干燥。它然后用0.5mL的1:1二氯曱烷和三氟乙酸處理，并攪拌一小時(shí)。反應(yīng)然后用DMF(1.5mL)稀釋和進(jìn)行過濾，分出樹脂。按實(shí)施例l節(jié)段(a)中所述進(jìn)行的對濾液的HPLC分析顯示在17分鐘時(shí)洗脫出的產(chǎn)物。該產(chǎn)物通過制備性HPLC用C1820x300mm柱提純。在各情況下含有共輒物的HPLC級分在-80。C下冷凍，然后凍干到干燥。其它共軛物的HPLC停留時(shí)間是Pro(15.3min),Val(161min)，Arg(13.8min),Gln(14.1min)，Ser(14.1mm),Leu(17.2mm),Met(16.3mm),Isoleu(17min),Tyr(15.5min),Ala(15.1min),His(13.5min)和Norleu(17.2min)。e)NSP-DMAE-TEG-氨基酸-N"-三氟乙?；狨ス捕笪镏械腘10-三氟乙?；乃馐褂靡韵乱话愠绦颉碜?d)的共軛物溶于DMF(每次0.5mL)中，用0.3mL的0.5M哌咬水溶液處理。反應(yīng)在室溫下攪拌1小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到-15。C的冷凍機(jī)中。各反應(yīng)通過在實(shí)施例1節(jié)段(a)中描述的HPLC進(jìn)行分析。在HPLC分析后，反應(yīng)混合物在-80。C下冷凍，然后凍干到干燥。由MALDI-TOF質(zhì)語分析獲得的共軛物和所觀察的分子離子的HPLC停留時(shí)間也包括在內(nèi)。表5共軛物HPLCM亭留時(shí)間(min)測得的質(zhì)量NSP-DMAE-TEG-Arg-蝶酸酯12.41078.59NSP-DMAE-TEG-His-蝶酸酯12.11058.8NSP-DMAE-TEG-Gln-蝶酸酯12.81048.7NSP-DMAE-TEG-Ser-蝶酸酯12.51007.9NSP-DMAE-TEG-Ala-蝶酸酯13.5992.7NSP-DMAE-TEG-Pro-蝶酸酯14.01019.1NSP-DMAE-TEG-Met-蝶酸酯14.61052.1NSP-DMAE-TEG-Val-蝶酸酯14.61021.0NSP-DMAE-TEG-Tyr-蝶酸酯14.01084.7NSP-DMAE-TEG-Isoleu-蝶酸酯15.31034.6NSP-DMAE-TEG-Leu-蝶酸酯15.41033.9NSP-DMAE-TEG-Norleu-蝶酸酯15.41035.1NSP-DMAE-TEG-Phe-蝶酸酯15.71069.0NSP-DMAE-TEG-a-葉酸酯12.71050.1NSP-DMAE-TEG干葉酸酯12.71050.2實(shí)施例4DMAE衍生物的固相合成a)2，，6，-二甲基-4，-「芴基甲氧基羰基l-酰胺基乙基酰胺基羰基苯基-10-N-爺氧基羰基甲基-吖啶g-9-羧酸酯(NCM-DMAE-ED-FMOC〗的合成2，,6，-二甲基-4，-N-琥珀酰亞胺基氧基羰基苯基-吖啶-9-羧酸酯(50mg)在石典4戈乙酸千酯(3mL,/人溴乙酸千酯和石典化鈉合成)中的懸浮液在140°C下在氮?dú)夥罩屑訜?6小時(shí)。它然后冷卻到室溫和傾倒在己烷(30mL)中。深棕色固體析出。潷析掉己烷，殘留物用己烷漂洗幾次。然后將粗產(chǎn)物溶于MeCN(25mL)中，然后通過使用Phenomenex公司的分析ds柱，4.6mmx30cm和10—100%MeCN/1120(含0.05%三氟乙酸)的30分鐘梯度以1ml/mm的流速由HPLC進(jìn)行分析和在260nm下進(jìn)行UV檢測。產(chǎn)物被觀察在19分鐘時(shí)洗脫出來。該MeCN溶液被濃縮到小體積，由以上所述的制備性HPLC提純。含有產(chǎn)物的HPLC級分的蒸發(fā)獲得油狀固體產(chǎn)物。產(chǎn)量=55mg。這一物質(zhì)用FMOC-ED(Aldnch，52mg,0.14mmol)與二異丙基乙胺(50juL,0.29mmol)的DMF溶液(2mL)處理。反應(yīng)在室溫下攪拌。在一個(gè)小時(shí)后，HPLC分析顯示在20.6分鐘時(shí)洗脫出的產(chǎn)物，由MALDI-TOF質(zhì)譜分析得到在785處的分子離子。反應(yīng)混合物蒸干得到粘性固體。這一物質(zhì)用30Q/。HBr/AcOH處理，反應(yīng)在室溫下攪拌16小時(shí)。添加醚(25mL),沉淀的固體物由過濾收集，然后用乙醚漂洗。將^IL物質(zhì)溶于DMF(5mL)中，并由HPLC分一斤，顯示在17.4分鐘時(shí)洗脫出的產(chǎn)物。該產(chǎn)物由制備性HPLC分離出來。含有產(chǎn)物的HPLC級分被濃縮到小體積，在-80。C下冷凍，凍干到干燥。產(chǎn)量=20mg。b)NCM-DMAE-ED-FMOC在聚苯乙烯王氏樹脂上的固定和FMOC基團(tuán)的分裂將聚苯乙烯王氏樹脂(l.8-2.0mmolOH/g,0.1g)懸浮于2mL的10%DMF,90%二氯曱烷中，然后用NCM-DMAE-ED-FMOC(6.5mg，9.4微摩爾)和l-羥基苯并三唑(10m5,75微摩爾)在DMF(02mL)中的溶液處理。添加二異丙基,友二亞胺(23juL,150微摩爾)，然后添加4-二曱基氨基吡啶(1.2mg，0.1微摩爾)。反應(yīng)在室溫下攪拌16小時(shí)。反應(yīng)然后用曱醇稀釋，在樹脂沉降后，除去溶劑。樹脂然后用曱醇(5mL)漂洗幾次，然后真空干燥。用0.5mL的l:l二氯曱烷和三氟乙酸處理8.6mg的樹脂來測定吖啶酯引入的程度。反應(yīng)在室溫下攪拌一個(gè)小時(shí)，然后用甲醇(3mL)稀釋。反應(yīng)然后過濾和濾液被蒸干。將從樹脂上分裂的吖啶酯溶于1mL的1:1MeCN和水(含有0.05%三氟乙酸)中。為節(jié)段(a)中描述對這一溶液進(jìn)行的HPLC分一斤顯示了82%純度的在17.5分鐘時(shí)洗脫出的NCM-DMAE-ED-FMOC。在實(shí)施例1節(jié)段(a)中描述的UV-可見光分光光度分析表明20%的固定效率，其對應(yīng)于O.lmg吖t定酯/8.6mg樹脂。FMOC基團(tuán)然后按以下方式分裂。從以上獲得的樹脂在含有1%哌啶的DMF(2mL)中在室溫下攪拌1小時(shí)。反應(yīng)然后用乙酸乙酯(5mL)稀釋，然后在樹脂沉降之后，除去溶劑。樹脂再一次用乙酸乙酯漂洗，和用甲醇漂洗幾次。它然后在真空下干燥。少量(5.6mg)的樹脂與0.5mL的1:1二氯甲烷和三氟乙酸攪拌。反應(yīng)在室溫下攪拌一個(gè)小時(shí)，然后用曱醇(lmL)稀釋。反應(yīng)然后過濾和濾液被蒸干。將從樹脂上分裂下來的吖咬酯溶于1mL的1:1MeCN和水(含有0.05%三氟乙酸)中。如節(jié)段(a)中描述的對這一溶液進(jìn)行的HPLC分析顯示了在9.5分鐘時(shí)洗脫出的NCM-DMAE-ED和<5%的起始原料。c)樹脂固定的NCM-DMAE-ED-茶堿的固相合成對于NCM-DMAE-ED-茶堿的固相合成所描述的下列程序也用于雌二醇和蝶酸酯共軛物的合成。8-羧基丙基茶堿(Sigma，1.6mg,6微摩爾)在DMF(0.5mL)中的溶液用二異丙基乙胺(1.6juL,1.5當(dāng)量)和HATU(2.7mg，1.2當(dāng)量)處理。在室溫下15分鐘后，將這一溶液添加到10mg的來自節(jié)段(b)的樹脂中，反應(yīng)在室溫下攪拌16小時(shí)。樹脂然后用DMF(3x2mL)和甲醇(4x3mL)漂洗兩次。它然后在真空下干燥。干燥樹脂然后與0.5mL的1:1二氯甲烷和三氟乙酸一起在室溫下攪拌1小時(shí)，然后用甲醇(2mL)稀釋。反應(yīng)然后過濾和濾液被蒸干。將從樹脂上分裂下來的共軛物溶于1mL的2:1MeCN和水(含有0.05%三氟乙酸)中。由實(shí)施例1節(jié)萃殳(a)中描述的UV-可見光分光光度測定法的分析表明97。/。的吖啶酯產(chǎn)率。在節(jié)段(a)中描述的HPLC分析顯示了作為寬峰的在11.5分鐘時(shí)洗脫出的共軛物，該寬峰顯示與共軛物對應(yīng)的在721質(zhì)量單位處的分子離子(當(dāng)由MALDI-TOF質(zhì)譜分析時(shí))。溶液被蒸干。將殘留物懸浮于曱苯(5mL)中并蒸干。該產(chǎn)物然后在乙酸(0.5mL)中在85°C加熱3小時(shí)，以進(jìn)行NCM基團(tuán)的脫羧。反應(yīng)然后被冷卻到室溫，由HPLC分析，它顯示了在11.9分鐘時(shí)洗脫出的產(chǎn)物DMAE-ED-茶堿。MALDI-TOS質(zhì)譜分析得到與脫羧的共軛物對應(yīng)的在677質(zhì)量單位處的分子離子。含有共輒物的乙酸溶液用曱苯(5mL)稀釋和蒸干。這里所提及的全部專利和專利出版物被？I入這里供參考。在閱讀前面的敘述之后某些改進(jìn)和改善對于本領(lǐng)域中的那些技術(shù)人員是容易實(shí)現(xiàn)的。應(yīng)當(dāng)理解的是，所有此類改進(jìn)和改善為了簡潔和可讀性而在這里刪除，但是應(yīng)當(dāng)在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.吖啶鎓官能化的固相載體，它包括上面固定有化學(xué)發(fā)光的取代吖啶鎓化合物的固相載體；該取代吖啶鎓化合物包括以共價(jià)鍵連接于吖啶鎓核的氮原子和所述固相載體上的連接基團(tuán)。2.權(quán)利要求1的吖啶鋪官能化的固相載體，具有式I的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式中L是在吖啶鎩核的氮與所述固相載體之間的磺酸酯或羧酸酯連接基團(tuán)；Ri表示在碳原子1-4中的一個(gè)或多個(gè)上的取代基，R2表示在碳原子5-8中的一個(gè)或多個(gè)上的取代基；R!和R2獨(dú)立地在各情況下選自氫、取代或未被取代的烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基-芳基或芳基-烷基和它們的結(jié)合物，任選地含有一個(gè)或多個(gè)選自氧、氮、磷、硫、卣素和它們的結(jié)合物中的雜原子；X是O、S或NR"其中Ra是-S02-R'，R'選自取代或未被取代的、支化或直鏈的烷基、鏈烯基、炔基、芳基、烷基-芳基或芳基-烷基和它們的結(jié)合物，任選地含有一個(gè)或多個(gè)選自氧、氮、磷、硫、卣素和它們的結(jié)合物中的雜原子；且當(dāng)X是O或S時(shí)，Y是下式的取代基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中Rg、R4、R5、R6、R7、Rs和R9中的至少一個(gè)獨(dú)立地是基團(tuán)-Q-Rio,其中Ru)是包括一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)活性官能團(tuán)的基團(tuán)；其中Q表示鍵或選自支化或直鏈的烷基、鏈烯基、炔基、取代或未被取代的芳基、烷基-芳基和芳基-烷基中的官能團(tuán)，該官能團(tuán)任選地含有一個(gè)或多個(gè)選自氧、氮、磷、硫、卣素和它們的結(jié)合物中的雜原子；和其中不屬于基團(tuán)-Q-R!o的R3、R4、R5、R6、R7、118和119中的任何一個(gè)是獨(dú)立地選自以上對于Ri和R2定義的取代基，羥基，卣素，烷基，鏈烯基，炔基，芳基，烷基-芳基，或芳基-烷基，-ORb,-SRb,氰基，羧基，-(C=0)-ORb,-NRbRe,或-(C=0)-NRbRC之中的取代基，其中Rb和ir獨(dú)立地選自以上對于&和R2所定義的取代基；和當(dāng)X是NRa時(shí)，Y是以上定義的基團(tuán)-Q-Rjo;A—是選自CH3S(V，F(xiàn)SO"CF3S04-，C4F9S04—，CH3C6H4S(V，鹵素，CF3COO-，CH3CO〇-，和N(V中的抗衡離子，和SP表示選自聚苯乙烯王氏樹脂，順磁性顆粒，膠乳顆粒，和微量滴定板的固相載體。3.權(quán)利要求2的吖啶錄官能化的固相載體，其中Rk)包括一個(gè)或多個(gè)親核基團(tuán)、親電基團(tuán)和它們的結(jié)合物。4.權(quán)利要求3的吖啶鎩官能化的固相載體，其中Rk)包括逸自氛基，鞋基，巰基，鈉或鋰有機(jī)金屬結(jié)構(gòu)部分或與強(qiáng)吸電子基團(tuán)鄰近的活性亞曱基中的一個(gè)或多個(gè)親核基團(tuán)；所述吸電子基團(tuán)包括-N02,-CN,-S02OR*，-N(R*)3+,-COOR*,和-S(R"g+，其中11*選自取代或未被取代的、支化或直鏈的烷基，鏈烯基，炔基，芳基，烷基-芳基，或芳基-烷基，和它們的結(jié)合物，任選地含有一個(gè)或多個(gè)選自氧、氮、磷、硫、卣素和它們的結(jié)合物中的雜原子。5.權(quán)利要求3的吖啶鋪官能化的固相載體，其中R!o表示選自以下的基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中乂*是卣素；11*是選自取代或未被取代的、支化或直鏈的烷基，鏈烯基，炔基，芳基，烷基-芳基，或芳基-烷基，和它們的結(jié)合物中的官能團(tuán)，任選地含有一個(gè)或多個(gè)選自氧、氮、磷、硫、卣素和它們的結(jié)合物中的雜原子。6.權(quán)利要求2的吖啶錄官能化的固相載體，其中L是-(012)11-8(=0)2-0-形式的磺酸酯，其中n是3或4。7.權(quán)利要求6的吖啶鎩官能化的固相載體，其具有以下結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中A-、R和SP如權(quán)利要求2中所定義。8.權(quán)利要求7的吖啶鎩官能化的固相載體，其具有以下結(jié)構(gòu):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中A-和SP如權(quán)利要求2中所定義。9.權(quán)利要求2的吖啶鋪官能化的固相載體，其中L是-CHr(C=O)-O-形式的羧酸酯。10.權(quán)利要求9的吖啶鋪官能化的固相載體，其具有以下結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中A—、R7和SP如權(quán)利要求2中所定義。11.權(quán)利要求10的吖啶fl官能化的固相載體，其具有以下結(jié)構(gòu):其中SP和A-如^l利要求2中所定義。12.權(quán)利要求2的吖啶鎩官能化的固相載體，其中Q是基團(tuán)-(C=0)-NH-Rn-NH-R12-，其中Rn和R12獨(dú)立地選自烷基，鏈烯基，炔基，芳基，芳基-烷基，和烷基-芳基，任選地含有一個(gè)或多個(gè)選自氧、氮、磷、>5克、卣素和它們的結(jié)合物中的雜原子。13.權(quán)利要求12的吖啶鎩官能化的固相載體，其中Q是基團(tuán)-NH-(CH2CH20)n-CH2CH2NH-C(0)(CH2)m-,其中n=0-20和m=l畫4。14.吖啶鋪化合物衍生物或共軛物的固相合成方法，包括以下步驟(a)提供吖啶f翁官能化的固相載體，其包括上面固定有化學(xué)發(fā)光的取代吖啶鎩化合物的固相載體；所述取代吖啶鎩化合物包括以共價(jià)鍵連接于吖啶鎩核的氮原子和所述固相載體上的連接基團(tuán)；(b)在所述吖啶镩化合物上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)合成轉(zhuǎn)化，得到所述吖啶鋪化合物的衍生物或共軛物；(c)將所述吖啶鎩化合物的所述衍生物或共軛物從所述固相載體上分裂。15.吖啶鋪化合物衍生物或共軛物的固相合成方法，包括以下步驟(a)提供權(quán)利要求2-13中任何一項(xiàng)的吖啶鋪官能化的固相載體；(b)在所述吖啶鎩化合物上進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)合成轉(zhuǎn)化，得到所述吖啶錫化合物的衍生物或共軛物；(c)將所述吖啶f翁化合物的所述衍生物或共軛物從所述固相載體上分裂。16.權(quán)利要求14的方法，其中所述連接基是N-磺基烷基。17.權(quán)利要求14的方法，其中所述連接基是N-羧曱基。18.權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包括通過在乙酸中加熱來使所述吖啶鎩化合物的所述衍生物或共軛物脫羧的步驟。19.權(quán)利要求14的方法，其中所述吖啶鎩化合物的所述衍生物或共軛物是所述吖啶鋪化合物與生物學(xué)活性分子的共軛物。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述生物學(xué)活性分子選自甾類、維生素類、激素、治療藥物、肽和核酸。全文摘要公開了吖啶官能化的固相載體和制造吖啶官能化的固相載體的方法。該吖啶官能化的固相載體包括通過以共價(jià)鍵連接于吖啶核的氮原子和固相載體上的連接基團(tuán)而連接于化學(xué)發(fā)光的取代吖啶化合物上的固相載體，如圖1所例示。文檔編號C07D219/00GK101379037SQ200780004618公開日2009年3月4日申請日期2007年2月6日優(yōu)先權(quán)日2006年2月7日發(fā)明者A·納特拉詹,D·夏普,J·科斯特洛,Q·蔣申請人:西門子醫(yī)療保健診斷公司