專利名稱：絨白乳菇素的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物提取，尤其是涉及一種利用絨白乳菇菌絲體發(fā) 酵液中的抑菌活性成分一一絨白乳菇素防治林木病害。
技術(shù)背景目前，絨白乳菇Uw"r/M ^//ere"s ( Fr. ) Fr.)是隸屬擔(dān)子菌 亞門 (Basidiomycotina )、 層菌綱 (Hymenomycetes )、 傘菌目 (Agaricales )、紅蔬科(Russulaceae )、乳蒜屬(hc"r/zw)的真菌， 具微毒且具有一定的藥用價值，對小白鼠肉瘤S-180及艾氏癌的抑制率 均為60%。目前尚未有利用絨白乳菇菌絲體發(fā)酵液中的抑菌活性成分一一 絨白乳菇素防治林木病害的報道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種絨白乳菇素的分離純化方法。 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案是分離純化工藝絨 白乳菇子實體鑒別一一菌種分離、純化一一菌株鑒定一一菌絲體液體培 養(yǎng)一一絨白乳菇素萃取一一絨白乳菇素分離一一絨白乳菇素純化。a、 絨白乳菇子實體鑒別子實體群生，菌蓋直徑6—10cm,初期白 色，扁半球形，中央下陷呈漏斗狀，老后米黃色，表面干燥密被細(xì)絨毛, 邊緣內(nèi)卷至伸展，菌肉白色，厚，乳汁少，白色，不變色，味苦，菌褶 直生至稍下延，不等長，菌柄短粗，圓柱形，長3—5cm，直徑1. 5 — 2. 5cm, 內(nèi)實，白色，有絨毛，b、 菌種分離、純化采用組織分離法，無菌條件下，挑取菌柄與菌 蓋之間的組織接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，待組織塊上長出 菌絲，將菌絲轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，馬鈴薯葡萄糖瓊 脂培養(yǎng)基配方，馬鈴薯150—250g,葡萄糖15 — 25g，瓊脂15—25g,水 1000ml,"菌株鑒定采用分子生物學(xué)鑒定方法，將子實體與分離得到的菌絲體分別進(jìn)行rDNAITS序列鑒定、比對，以證明分離得到的菌株來自于所 分離的子實體，d、液體發(fā)酵培養(yǎng)采用培養(yǎng)基配方為0. 05% 0. 5%(g/ mL)葡萄糖、 P/o 10。"g/mL)麩皮、0. 01% 0. 25% (g/mL)硫酸銨、0, 01% 0. 25% (g/mL) g 黃豆粉，1% 3%無機(jī)鹽及0. 008%~0. 016%(g/ mL)煙酸，e、 發(fā)酵生產(chǎn)絨白乳菇素的培養(yǎng)條件接種量5 / 15 / 、裝液量 100 300raL/5O0mL、 pH值5 7、搖床轉(zhuǎn)速100~140r/min、溫度20 28。C、 發(fā)酵時間10 20d。f、 絨白乳菇素萃取將上述培養(yǎng)液超聲破碎l~4h,過濾除菌后與正 丁醇以1: 2 5比例萃取l 5h,g、 絨白乳菇素分離釆用硅膠柱層析法分離，h、 絨白乳菇素純化采用薄層層析(TLC)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是抑制楊樹葉枯病菌a/"r朋")菌絲生長及孢子萌發(fā)。 同時對楊樹葉銹病菌(yi/e7a/z/;ww^ /ar/c/1/^/7"http://朋)和楊樹爛皮病菌 (0^o"。,a c力r"c^/^r鵬)、金黃色葡萄球菌 (iYa/^/yococciAS1 awrews0、枯草桿菌(j9ac/"ws 5^6〃//s)、大腸桿菌(■foc/zer/cA/a co//)也有顯著的抑制作用。高效、低毒、無公害。
具體實施方式
下面結(jié)合對本發(fā)明的實施例作進(jìn)一步詳細(xì)描述。 實施例1、a、 絨白乳菇子實體鑒別子實體群生，菌蓋直徑6—10cm,初期白 色，扁半球形，中央下陷呈漏斗狀，老后米黃色，表面干燥密被細(xì)絨毛， 邊緣內(nèi)卷至伸展，菌肉白色，厚。乳汁少，白色，不變色，味苦。菌褶 直生至稍下延，不等長，菌柄短粗，圓柱形，長3—5cm，直徑1. 5 — 2. 5cm, 內(nèi)實，白色，有絨毛，b、 菌種分離、純化釆用組織分離法，無菌條件下，挑取菌柄與菌 蓋之間的組織接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，待組織塊上長出 菌絲，將菌絲轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，馬鈴薯葡萄糖瓊 脂，馬鈴薯200g，葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000ml，C、菌株鑒定采用分子生物學(xué)鑒定方法，將子實體與分離得到的菌 絲體分別進(jìn)行rDNA ITS序列鑒定、比對，以證明分離得到的菌株來自于所分離的子實體，d液體發(fā)酵培養(yǎng)釆用培養(yǎng)基配方為2g葡萄糖、50g麩皮、1.25g 硫酸銨、1.25g黃豆粉，20mL無機(jī)鹽溶液、120mg煙酸，e、 發(fā)酵生產(chǎn)絨白乳菇素的培養(yǎng)條件接種量12.5%、裝液量 300mL/500mL、 pH6、搖床轉(zhuǎn)速120r/min、溫度26。C、發(fā)酵天數(shù)12d。f、 絨白乳菇素萃取將培養(yǎng)液超聲破碎2h，過濾除菌后與正丁醇以1: 3比例萃取3h,g、 絨白乳菇素分離采用硅膠柱層析法分離，h、 絨白乳菇素純化釆用薄層層析(TLC)。實施例2、a、 絨白乳菇子實體鑒別子實體群生，菌蓋直徑6—10cm，初期白 色，扁半球形，中央下陷呈漏斗狀，老后米黃色，表面干燥密被細(xì)絨毛， 邊緣內(nèi)巻至伸展，菌肉白色，厚，乳汁少，白色，不變色，味苦，菌褶 直生至稍下延，不等長，菌柄短粗，圓柱形，長3—5cm,直徑1. 5—2. 5cm， 內(nèi)實，白色，有絨毛，b、 菌種分離、純化采用組織分離法，無菌條件下，挑取菌柄與菌 蓋之間的組織接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，待組織塊上長出 菌絲，將菌絲轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上。馬鈴薯葡萄糖瓊 脂，馬鈴薯180g、葡萄糖20g、瓊脂18g、水1000ml，C、菌株鑒定釆用分子生物學(xué)鑒定方法，將子實體與分離得到的菌 絲體分別進(jìn)行rDNA ITS序列鑒定、比對，以證明分離得封的菌株來自于所分離的子實體，d、 液體發(fā)酵培養(yǎng)采用培養(yǎng)基配方為1.5g葡萄糖、55g麩皮、1.20g 硫酸銨、1. 35g黃豆粉，18mL無機(jī)鹽溶液、118mg煙酸，e、 發(fā)酵生產(chǎn)絨白乳菇素的培養(yǎng)條件接種量10y。、裝液量250mL/500mL、 pH6、搖床轉(zhuǎn)速125r/min、溫度23。C、發(fā)酵天數(shù)15d，f、 絨白乳蒜素萃取將培養(yǎng)液超聲破碎3h,過濾除菌后與正丁醇以 1: 4比例萃取2h，.g、絨白乳菇素分離采用硅膠柱層析法分離， h、絨白乳菇素純化采用薄層層析(TLC)。 實施例3、a、 絨白乳菇子實體鑒別子實體群生，菌蓋直徑6—10cm，初期白色， 扁半球形，中央下陷呈漏斗狀，老后米黃色，表面干燥密被細(xì)絨毛，邊緣內(nèi)卷至伸展，菌肉白色，厚，乳汁少，白色，不變色，味苦，菌褶直生至 稍下延，不等長，菌柄短粗，圓柱形，長3—5cm，直徑1.5 — 2. 5cm,內(nèi)實，白色，有絨毛，b、 菌種分離、純化采用組織分離法，無菌條件下，挑取菌柄與菌 蓋之間的組織接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，待組織塊上長出菌 絲，將菌絲轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，馬鈴薯葡萄糖瓊脂，馬鈴薯210g，葡萄糖17g，瓊脂17g,水1000ml，c、 菌株鑒定采用分子生物學(xué)鑒定方法，將子實體與分離得到的菌 絲體分別進(jìn)行rDNA ITS序列鑒定、比對，以證明分離得到的菌株來自于所分離的子實體，d、 液體發(fā)酵培養(yǎng)采用培養(yǎng)基配方為2. lg葡萄糖、48g麩皮、L23g 硫酸銨、1.20g黃豆粉、22mL無機(jī)鹽溶液、125mg煙酸，e、 發(fā)酵生產(chǎn)絨白乳菇素的培養(yǎng)條件:接種量15y。、裝液量240mL/500mL、 pH7、搖床轉(zhuǎn)速110r/min、溫度28。C、發(fā)酵天數(shù)20d,f、 絨白乳菇素萃取將培養(yǎng)液超聲破碎l.化，過濾除菌后與正丁醇 以1: 2比例萃取5h，g、 絨白乳菇素分離釆用硅膠柱層析法分離，h、 絨白乳菇素純化'采用薄層層析(TLC)。本發(fā)明的抑菌機(jī)理為，絨白乳菇素能夠抑制菌體4種保護(hù)酶的活性， 破壞了保護(hù)酶系統(tǒng)原有的平衡狀態(tài)，導(dǎo)致氧自由基清除系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，MDA 含量升高，膜脂過氧化嚴(yán)重，絨白乳菇素能夠引起ATP酶階段性的增強(qiáng)， 這個階段也致使HK、 PK、 LDH、 SDH、 MDH活力與輔酶I含量下降，更加劇 了對ATP的水解，ATP合成受阻，使菌體內(nèi)許多需能的合成代謝與物質(zhì)運(yùn) 輸受阻，干擾了糖酵解與TCA循環(huán)的順利進(jìn)行，嚴(yán)重破壞了糖類、脂類、 蛋白質(zhì)代謝相互間的動態(tài)平衡，直接以菌體電導(dǎo)率、呼吸強(qiáng)度、蛋白質(zhì)含 量的下降及菌體與孢子形態(tài)發(fā)生非正常的變化表現(xiàn)出來，最終使菌體膜系 統(tǒng)完整性喪失，大量的內(nèi)含物被釋放到胞外，菌體變得十分粘稠，瀕臨死 亡。
權(quán)利要求
1.一種絨白乳菇素的分離純化方法，包括id="icf0001" file="A2007100716910002C1.gif" wi="76" he="45" top= "36" left = "52" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>，其特征在于分離純化工藝絨白乳菇子實體鑒別——菌種分離、純化——菌株鑒定——菌絲體液體培養(yǎng)——絨白乳菇素萃取——絨白乳菇素分離——絨白乳菇素純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的絨白乳菇素的分離純化方法，其特征在于a、 絨白乳菇子實體鑒別子實體群生，菌蓋直徑6 —10cm,初期白色, 扁半球形，中央下陷呈漏斗狀，老后米黃色，表面干燥密被細(xì)絨毛，邊緣 內(nèi)巻至伸展，菌肉白色，厚，乳汁少，白色，不變色，味苦，菌褶直生至 稍下延，不等長，菌柄短粗，圓柱形，長3—5cm，直徑1.5 — 2:5cm，內(nèi) 實，白色，有絨毛，b、 菌種分離、純化采用組織分離法，無菌條件下，挑取菌柄與菌 蓋之間的組織接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，待組織塊上長出菌 絲，將菌絲轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培 養(yǎng)基配方，馬鈴薯150—250g,葡萄糖15 — 25g，瓊脂15—25g,水1000ml,c、 菌株鑒定釆用分子生物學(xué)鑒定方法，將子實體與分離得到的菌絲體分別進(jìn)行rDNAITS序列鑒定、比對，以證明分離得到的菌株來自于所 分離的子實體，d、 液體發(fā)酵培養(yǎng)采用培養(yǎng)基配方為0. 05%~0. 5%(g/ mL)葡萄糖、 l°/ 10%(g/ mL)麩皮、0. 01% 0.25% (g/ mL)硫酸銨、0. 01%~0. 25°Mg/mL) g 黃豆粉，1%~3%無機(jī)鹽及0. 008% 0. 016%(g/ mL)煙酸，e、 發(fā)酵生產(chǎn)絨白乳菇素的培養(yǎng)條件接種量5%~15%、裝液量 100 300mL/500mL、 pH值5 7、搖床轉(zhuǎn)速100 140r/min、溫度20 28。C、 發(fā)酵時間10 20d。f、 絨白乳寐素萃取將上述培養(yǎng)液超聲破碎l~4h，過濾除菌后與正 丁醇以1: 2~5比例萃取l~5h，g、 絨白乳菇素分離采用硅膠柱層析法分離，h、 絨白乳菇素純化采用薄層層析(TLC)。
全文摘要
一種絨白乳菇素的分離純化方法。本發(fā)明涉及一種生物提取，分離純化工藝絨白乳菇子實體鑒別——菌種分離、純化——菌株鑒定——菌絲體液體培養(yǎng)——絨白乳菇素萃取——絨白乳菇素分離——絨白乳菇素純化。本發(fā)明具有抑制楊樹葉枯病菌，菌絲生長及孢子萌發(fā)。同時對楊樹葉銹病菌和楊樹爛皮病菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌也有顯著的抑制作用。高效、低毒、無公害。
文檔編號C07D213/50GK101230368SQ20071007169
公開日2008年7月30日 申請日期2007年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月26日
發(fā)明者宋瑞清, 計紅芳 申請人:東北林業(yè)大學(xué);宋瑞清;計紅芳