專利名稱：：一種新的酚酸類化合物、制備方法及其藥物組合物和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的酚酸類化合物、制備方法及其含有該化合物的藥物組合物和在制備治療肝臟疾病、心腦血管疾病、癡呆疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：丹參(RadixSalviaeMiltiorrhizae)為唇型禾斗植物丹參(RadixSalviaeMiltiorrhizaeBunge)的干燥根及根莖，丹參的化學(xué)成分主要分為以丹參酚酸B為主的酚酸類水溶性成分，以及以丹參酮IIA為主的酯溶性成分。李向軍報道了丹參水溶性成分提取工藝研究中國中醫(yī)藥信息雜志2005，12(12)49-50，葉勇研究了不同大孔樹脂分離丹參酚酸B時珍國醫(yī)國藥2006,6(17)973-974，中國專利CN1247855提供了一種采用熱水提取，用大孔樹脂分離精制丹參多酚酸鹽的方法。本發(fā)明人對丹參進行了深入的研究，經(jīng)過了大量的實驗研究，提供了一種新的化合物，同時提供了該新化合物的制備方法、含有該化合物的藥物組合物以及該化合物和組合物在制備治療肝臟疾病、心腦血管疾病、癡呆疾病的藥物中的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了式I所式化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式I其化學(xué)名稱為(2E)-2-(6-[(E)-2-羧基乙烯基-2，3-二羥基苯基H3-(3,4-二羥基苯基)丙烯酸，通用名為雙咖酚酸。本發(fā)明提供了該化合物的制備方法。本發(fā)明提供了含有該化合物的藥物組合物。本發(fā)明提供了該化合物和藥物組合物在制備治療或預(yù)防肝臟疾病、心腦血管疾病、癡呆疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的化合物的制備方法為(1)制備丹參多酚酸；(2)堿性條件下降解丹參多酚酸取丹參多酚酸，加入堿和極性溶劑，回流降解；(3)純化取降解液，減壓回收乙醇，過濾，用大孔吸附樹脂，收集洗脫液，濃縮近干，有黃色沉淀析出，過濾，干燥濾餅，即得。其中丹參多酚酸可以采用文獻報道的方法制備；堿選自常用的金屬氫氧化物或堿式鹽，可以是氫氧化鈉、氫氧化鉀或碳酸鈉，優(yōu)選為氫氧化鈉；極性溶劑可以是水、甲醇溶液、乙醇溶液或丙酮溶液，優(yōu)選為50%乙醇溶液。本發(fā)明所述化合物的制備方法為(1)取丹參生藥粉碎，30倍量水滲漉提取，過濾，用大孔吸附樹脂進行吸附(提取液與樹脂的體積比3:1)，用純化水洗脫3—5柱體積，再用30%的乙醇溶液洗脫5個柱體積，收集洗脫液，調(diào)節(jié)pH值為2-5，濃縮乙醇，凍干，得丹參多酚酸；(2)取丹參多酚酸，按重量比2:l加入氫氧化鈉，加入50倍量50%乙醇溶液，回流降解；(3)取降解液，減壓回收乙醇，過濾，濾液上AB-8大孔樹脂層析柱，水洗5體積，15%乙醇洗脫4體積，收集該部分洗脫液，濃縮近干，放冷，有黃色沉淀析出，干燥即得。本發(fā)明提供的藥物組合物，均采用藥學(xué)常規(guī)方法制備而成；可以通過注射、口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥等途徑給藥，可以以注射劑、片劑、丸劑、顆粒劑、膠囊、糖漿等形式存在，優(yōu)選為凍干粉針和膠囊。本發(fā)明提供了化合物和藥物組合物在制備治療或預(yù)防急慢性肝損傷及肝纖維化、缺血性腦中風(fēng)、腦缺血/再灌注損傷、冠心病、心絞痛、老年性癡呆、血管性癡呆的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的化合物和藥物組合物在用于上述疾病時，其注射給藥劑量范圍是25mg2000mg;優(yōu)選251000mg，口服給藥劑量范圍是50mg4000mg;優(yōu)選502000mg。圖1化合物IR圖譜；圖2化合物NOESY圖譜DMSO;圖3化合物HNMR圖譜DMSO;圖4化合物C麗R圖譜DMSO;圖5化合物cosy圖譜DMSO;圖6化合物HSQC圖譜DMS0;圖7化合物HMBC圖譜DMS0;具體實施例方式制備例1雙咖酚酸的制備取丹參生藥粉lkg，30倍量水滲漉提取，過濾，用大孔吸附樹脂進行吸附(提取液與樹脂的體積比3:1)，用純化水洗脫5個柱體積，再用30%的乙醇溶液洗脫5個柱體積，收集洗脫液，調(diào)節(jié)pH值為2，濃縮，凍干，得丹參多酚酸；將丹參多酚酸，按重量比2:l加入氫氧化鈉，加入50倍量50%乙醇溶液，回流降解；取降解液，減壓回收乙醇，過濾，濾液上AB-8大孔樹脂層析柱，水洗5個柱體積，15%乙醇洗脫4個柱體積，收集該部分洗脫液，濃縮近干，放冷，有黃色沉淀析出，干燥得30g該化合物。結(jié)構(gòu)鑒定本品為淡黃色無規(guī)則結(jié)晶性粉末，(:18^408，熔點為255-258'0，IR見圖1，ESI圖譜分子離子峰357(M-H)—,由化合物H剛R圖譜、CNMR圖譜、cosy圖譜、HSQC圖譜、物HMBC圖譜歸屬見表1，N0ESY譜中7位與7'位氫無相關(guān)峰，說明雙鍵為反式。表1化合物碳氫譜峰歸屬<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>制備例2制備雙咖酚酸凍干粉針取雙咖酚酸100g，用NaOH溶液調(diào)pH值至7，制成1000瓶，按凍干工藝凍干即得。制備例3制備雙咖酚酸膠囊取雙咖酚酸100g，加輔料適量，制成1000粒，即得。試驗例l:雙咖酚酸對四氯化碳引起小鼠急性肝損傷的影響1.1材料雙咖酚酸按制備例l制備四氯化碳(分析純，煙臺三和化學(xué)試劑公司，批號050122);聯(lián)苯雙酯(滴丸，北京協(xié)和制藥廠，規(guī)格1.5mg，批號050512);ALT/GPT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號060281);ASP/GOT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號06020D全自動生化分析儀(意大利)清潔級昆明種小鼠，體重18g22g，雌雄各半，山東綠葉制藥股份有限公司實驗動物中心提供，合格證號SYXK(魯)20030020。1.2方法小鼠130只，隨機分為13組，即正常對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯灌胃10mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射2.5mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射5mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射25mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射100mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射200mg/kg組、雙咖酚酸灌胃5mg/kg組、雙咖酚酸灌胃10mg/kg組、雙咖酚酸灌胃50mg/kg組、雙咖酚酸灌胃200mg/kg組、雙咖酚酸灌胃400mg/kg組，各靜脈給藥組連續(xù)給藥3天，各灌胃給藥組連續(xù)給藥7天，末次給藥前16小時除對照組外各組用0.2%的四氯化碳油溶液腹腔注射，注射體積0.25m1/只，隨即禁食16小時，末次給藥1小時后眼眶采血，離心(4000rpm,10min)，收集血清，用藥盒檢測ALT/GPT、ASP/GOT活性。數(shù)據(jù)以數(shù)據(jù)用^±s表示，以組間t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。1.3結(jié)果結(jié)果如表2所示，雙咖酚酸靜脈注射5mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射25mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射IOOmg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射200mg/kg組、雙咖酚酸灌胃10mg/kg組、雙咖酚酸灌胃50mg/kg組、雙咖酚酸灌胃200mg/kg組、雙咖酚酸灌胃400mg/kg組明顯降低GPT、GOT水平(與模型對照組比較，p〈0.05或0.01)。雙咖酚酸灌胃200mg/kg組降低GPT、GOT水平與雙咖酚酸灌胃400mg/kg組比較，無顯著性差異；雙咖酚酸靜脈注射100mg/kg組降低GPT、GOT水平與雙咖酚酸靜脈注射200mg/kg組比較，無顯著性差異。表2雙咖酚酸對CCU肝損傷小鼠的G0T、GPT的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與模型組比較*代0.05，"代0.01,試驗例2雙咖酚酸對大鼠慢性肝損傷的影響2.1藥品與試劑雙咖酚酸按制備例l制備聯(lián)苯雙酯(滴丸，北京協(xié)和制藥廠，規(guī)格1.5mg，批號050512);ALT/GPT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號060281);ASP/GOT試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號060201);乙醇(分析純，煙臺三和化學(xué)試劑公司，批號050325)。實驗動物普通級Wistar大鼠，雄性，體重150-200g，SD大鼠，山東綠葉天然藥物研究開發(fā)公司實驗動物中心提供，合格號SYXK(魯)20030020。2.2實驗方法大鼠130只，隨機分為13組，即正常對照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組灌胃10mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射2.5mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射5mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射25mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射50mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射100mg/kg組、雙咖酚酸灌胃5mg/kg組、雙咖酚酸灌胃10rag/kg組、雙咖酚酸灌胃50rag/kg組、雙咖酚酸灌胃100mg/kg組、雙咖酚酸灌胃200mg/kg組，每組10只。除正常組外，各組首次給予sc四氯化碳原液5ml/kg體重，以后每周2次sc25W四氯化碳溶液(橄欖油釋釋)2ml/kg體重，連續(xù)20周。除正常對照組外，其余按上述方法制備慢性肝損傷模型，于實驗第8周時，開始給藥，連續(xù)給藥12周，給藥結(jié)束后用20%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉，解剖，腹主動脈采血，留取肝組織，部分用10%中性福爾馬林溶液固定，24—48h內(nèi)制石蠟塊。肝組織病理學(xué)檢査采用HE染色，對慢性肝損傷大鼠病理組織學(xué)改變進行評分，肝細胞漿疏松化分為0-3級，肝細胞脂肪變分為0-3級，肝細胞壞死分為0-3級，肝間質(zhì)纖維增生分為0-3級，對大鼠病理組織學(xué)改變分數(shù)進行秩和檢驗。血樣離心(4000rpm，10min),收集血清，用藥盒檢測ALT/GPT、ASP/G0T活性。數(shù)據(jù)以數(shù)據(jù)用^土s表示，以組間t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。2.3實驗結(jié)果如表3所示，雙咖酚酸靜脈注射5mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射25mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射50mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射100mg/kg組、雙咖酚酸灌胃10mg/kg組、雙咖酚酸灌胃50mg/kg組、雙咖酚酸灌胃100mg/kg組、雙咖酚酸灌胃200mg/kg組明顯降低G0T、GPT水平及肝指數(shù)(與模型對照組比較，p〈0.05或0.01)。雙咖酚酸灌胃100mg/kg組降低G0T、GPT水平及肝指數(shù)與雙咖酚酸灌胃200rag/kg組比較，無顯著性差異；雙咖酚酸靜脈注射50mg/kg組降低G0T、GPT水平及肝指數(shù)與雙咖酚酸靜脈注射100mg/kg組比較，無顯著性差異。肝組織病理變化結(jié)果顯示,CC14慢性肝損組大鼠，正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，有廣泛的脂肪變性，肝細胞壞死及不同程度的間質(zhì)纖維增生，而經(jīng)雙咖酚酸治療的大鼠,損傷性病理變化明顯減輕。如表4所示，雙咖酚酸靜脈注射5mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射25mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射50mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射IOOmg/kg組、雙咖酚酸灌胃10mg/kg組、雙咖酚酸灌胃50mg/kg組、雙咖酚酸灌胃100mg/kg組、雙咖酚酸灌胃200mg/kg組明顯降低肝細胞漿疏松化、肝細胞脂肪變、肝細胞壞死及肝間質(zhì)纖維增生(與模型對照組比較，P〈0.05或O.Ol)。雙咖酚酸灌胃100mg/kg組降低肝細胞漿疏松化、肝細胞脂肪變、肝細胞壞死及肝間質(zhì)纖維增生與雙咖酚酸灌胃200mg/kg組比較，無顯著性差異；雙咖酚酸靜脈注射50mg/kg組肝細胞漿疏松化、肝細胞脂肪變、肝細胞壞死及肝間質(zhì)纖維增生與雙咖酚酸靜脈注射ioorag/kg組比較，無顯著性差異。表3雙咖酚酸對慢性肝損傷的大鼠GOT、GPT水平及肝指數(shù)影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與模型組比較'代0.05,"代0.01表4雙咖酚酸對慢性肝損傷的大鼠病理組織學(xué)改變的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與模型組比較*代0.05，"代0.01試驗例3雙咖酚酸對肝纖維化的影響3.1藥品與試劑雙咖酚酸:按制備例l制備；文迪雅(馬來酸羅格列酮片，GlaxoSmithKline公司，批號051023)HA(透明質(zhì)酸)、LN(層粘連蛋白)及PcIII(III型膠原)試劑盒購買于上海海研醫(yī)學(xué)中心。羥脯氨酸檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。實驗動物普通級Wistar大鼠，雄性，體重150-200g，SD大鼠，山東綠葉天然藥物研究開發(fā)公司實驗動物中心提供，合格號SYXK(魯)20030020。3.2實驗方法大鼠130只，隨機分為13組，即正常對照組、模型組、羅格列酮組灌胃8mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射2.5mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射5mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射25mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射50mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射100mg/kg組、雙咖酚酸灌胃5mg/kg組、雙咖酚酸灌胃10mg/kg組、雙咖酚酸灌胃50mg/kg組、雙咖酚酸灌胃100mg/kg組、雙咖酚酸灌胃200mg/kg組，每組10只。大鼠肝纖維化模型復(fù)制及各組處置方法參考吳孟超等復(fù)制大鼠肝纖維化模型的方法吳孟超，楊廣順.大鼠肝硬變模型復(fù)制的研究.中華實驗外科雜志，1984，1(4):145—147，除正常對照組外，各組每3d每100g體重皮下注射40呢四氯化碳油溶液0.3ml，首劑量加倍，正常對照組大鼠每3d皮下注射油溶液0.3ml/100g體重，6周后,各組開始給藥，連續(xù)給藥6周，給藥結(jié)束后用20%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉，解剖，腹主動脈采血，留取肝組織，部分用10%中性福爾馬林溶液固定，24—48h內(nèi)制石蠟塊。肝組織病理學(xué)檢查采用HE染色，纖維增生程度分為0-4級栗坤，趙玉珍，朱秋霜等.川芎嗪對老齡小鼠心、肝超氧化物歧化酶活力的影響.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，1998;21:4—5，對血清中HA(透明質(zhì)酸)、LN(層粘連蛋白)及PcIII(ni型膠原)、及肝中HYP(羥脯氨酸)進行測定，HA、LN、PcIII、HYP按檢測試劑盒測定方法測定。3.3實驗結(jié)果病理學(xué)檢查正常對照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠肝臟12周均出現(xiàn)明顯的纖維化；雙咖酚酸各組中纖維化程度均較模型組輕。光鏡觀察服常規(guī)染色和VG膠原染色肝組織切片顯示，肝纖維化模型對照組大鼠肝組織中可見肝細胞脂肪變性，壞死，炎細胞浸潤；匯管區(qū)內(nèi)膠原纖維沉積，Henny管增生；纖維結(jié)締組織增生明顯，纖維間隔增粗，并有典型假小葉形成。雙咖酚酸治療組大鼠肝組織纖維結(jié)締組織增生程度減輕，纖維間隔變細，假小葉形成不明顯。對各組纖維增生程度分值進行秩和檢驗。結(jié)果見表5，雙咖酚酸靜脈注射5mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射25mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射50mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射100mg/kg組、雙咖酚酸灌胃10mg/kg組、雙咖酚酸灌胃50mg/kg組、雙咖酚酸灌胃100mg/kg組、雙咖酚酸灌胃200mg/kg組明顯降低纖維增生程度(與模型對照組比較，p〈0.05或0.01)。電鏡觀察正常對照組大鼠肝細胞間緊密相連，細胞內(nèi)各種細胞器分布規(guī)整，結(jié)構(gòu)典型。血竇排列整齊，Disse腔內(nèi)可見肝貯脂細胞，細胞質(zhì)內(nèi)有脂滴。模型對照組大鼠肝組織中則出現(xiàn)典型的肝細胞損傷結(jié)構(gòu)，相鄰肝細胞間隙增寬，肝細胞變性壞死，核固縮，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等、分布不規(guī)則的脂滴。肝組織中存在輕重不等的纖維化病變。肝竇毛細血管化，Disse間隙內(nèi)可見較多成纖維細胞(活化的肝忙脂細胞)，且周圍有大量膠原纖維沉積。匯管區(qū)內(nèi)可出現(xiàn)大量的膠原纖維。雙咖酚酸治療組中，肝細胞損傷有不同程度的減輕，肝細胞間隙較緊密，細胞質(zhì)內(nèi)脂肪小滴減少，細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)趨向正常。肝纖維化病變不明顯，肝血竇和Disse間隙內(nèi)膠原纖維沉積及成纖維樣細胞數(shù)量減少。對各組HA、LN、PcIII、HYP進行T檢驗。結(jié)果見表6，雙咖酚酸靜脈注射5rog/kg組、雙咖酚酸靜脈注射25mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射50mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射100rag/kg組、雙咖酚酸灌胃10rag/kg組、雙咖酚酸灌胃50mg/kg組、雙咖酚酸灌胃100mg/kg組、雙咖酚酸灌胃200mg/kg組明顯降低HA、LN、PcIII、HYP水平(與模型對照組比較，p<0.05或0.01)。雙咖酚酸灌胃100mg/kg組降低HA、LN、PcIII、HYP水平與雙咖酚酸灌胃200mg/kg組比較，無顯著性差異；雙咖酚酸靜脈注射50mg/kg組降低HA、LN、PcIII、HYP水平與雙咖酚酸靜脈注射100mg/kg組比較，無顯著性差異。表5雙咖酚酸對大鼠肝纖維化病理形態(tài)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>與模型組比較，AP<0.05;AAP<0.01。表6雙咖酚酸對肝纖維化大鼠肝組織HYP含量及血清HA、LN及PCm含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>與模型組比較，AP<0.05;"P<0.01。試驗例4雙咖酚酸對大鼠心肌缺血損傷的影響4.1材料雙咖酚酸，按制備例1方法制備。氯化硝基四氮唑藍(N-BT)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥材供應(yīng)站提供。實驗動物普通級SD大鼠，雄性，體重280g—350g，雌雄各半，山東綠葉制藥股份有限公司實驗動物中心提供，合格證號SYXK(魯)20030020。4.2方法與結(jié)果動物隨機分為模型對照組(生理鹽水)、硝苯地平組6mg/kg、雙咖酚酸靜脈注射2.5mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射組(7.5mg/kg)、雙咖酚酸靜脈注射20mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射50mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射100mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射200mg/kg組、雙咖酚酸灌胃20mg/kg組、雙咖酚酸灌胃50mg/kg組、雙咖酚酸灌胃200mg/kg組、雙咖酚酸灌胃400mg/kg組。每組10只。禁食12小時后，ip.烏拉坦(1.2g/kg)麻醉，測肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖。剪去左胸前皮毛，碘酒及酒精消毒，沿胸骨左緣lcm處，剪開胸壁肌肉及二條肋骨，迅速打開胸腔，暴露心臟，在動脈圓錐與左心耳之間結(jié)扎左冠狀動脈，立即將心臟放回，排擠出胸腔空氣，用止血鉗閉合胸腔，造成大鼠急性心肌缺血模型。硝苯地平組在麻醉前灌胃給藥，灌胃給藥組連續(xù)給藥3天，于第2天給藥后禁食16小時后，第3天給藥30分鐘后手術(shù)，其余各組術(shù)后隨既靜脈注射相應(yīng)藥物。記錄給藥前及給藥后1.5h、3h心電圖，測量心電圖J點的升高值，6h后取出心臟，以冷生理鹽水洗凈后，-20"冰箱冷凍過夜。次日，將冷凍的心臟由結(jié)扎處至心尖部等厚切成5片，浸入新鮮配制的0,25。/。N-BT磷酸緩沖液(pH7.4)中。37'C水浴振搖1015min。用濾紙吸干切片表面的染色液，分離染色部分和未染色部分，稱重，記算梗死面積。梗死面積(％)=梗死部分重量/(非梗死部分重量+梗死部分重量^100%。數(shù)據(jù)用l士s表示，以組間f檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果如表7所示，心肌缺血6小時后，模型組大鼠心肌出現(xiàn)明顯的灶狀缺血區(qū)，達到26%左右。雙咖酚酸靜脈注射7.5mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射20mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射50mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射100mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射200mg/kg組、雙咖酚酸灌胃20mg/kg組、雙咖酚酸灌胃50mg/kg組、雙咖酚酸灌胃200mg/kg組、雙咖酚酸灌胃400mg/kg組降低肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖J點的升高、減少缺血面積(與模型組比較，p〈0.01);雙咖酚酸靜脈注射IOOmg/kg組與雙咖酚酸靜脈注射200mg/kg組比較，對肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖J點的升高及缺血面積無明顯差異(P>0.05);雙咖酚酸灌胃200mg/kg組與雙咖酚酸灌胃400mg/kg組比較，對肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖J點的升高及缺血面積無明顯差異(p〉0.Q5)。表7雙咖酚酸對大鼠心肌缺血損傷的影響(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>與模型對照組比較，*P<0.05，**P〈0.01。試驗例5雙咖酚酸提取物對大鼠局部腦缺血損傷的影響5.l材料雙咖酚酸，按制備例1方法制備。紅四氮唑美國Sigma公司產(chǎn)品，臨用前用生理鹽水配成4%溶液。實驗動物普通級SD大鼠，雄性，體重280g—350g，雌雄各半，山東綠葉制藥股份有限公司實驗動物中心提供，合格證號SYXK(魯)20030020。5.2方法與結(jié)果隨機分成正常組、模型對照組、雙咖酚酸靜脈注射2.5mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射組(7.5mg/kg)、雙咖酚酸靜脈注射20mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射50m^kg組、雙咖酚酸靜脈注射100mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射200mg/kg組、雙咖酚酸灌胃20mg/kg組、雙咖酚酸灌胃50mg/kg組、雙咖酚酸灌胃200mg/kg組、雙咖酚酸灌胃400mg/kg組。每組10只。禁食12小時后，水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉，分離右側(cè)頸總動脈，夾閉頸內(nèi)、頸總動脈，頸外動脈近心端及遠心端結(jié)扎，中間剪斷。將頸外動脈游離端拉至與頸內(nèi)動脈成一條直線，將栓線(選用直徑0.24mm尼龍線，長度5.0cm)由頸外動脈插入至顱內(nèi)，遇輕微阻力時停止，插入深度約為2cm。結(jié)扎頸外動脈開口，并打開頸總動脈動脈夾，消毒縫合傷口，造成右側(cè)大腦中動脈缺血模型；假手術(shù)組僅進行右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈的分離(以上實驗均在23。C25。C進行)。灌胃給藥組連續(xù)給藥3天，于第2天給藥后禁食16小時后，第3天給藥30分鐘后手術(shù)，其余各組術(shù)后靜脈注射相應(yīng)藥物。24小時后按文獻劉小光，徐理納，一種能評價溶栓和抗溶栓的大鼠腦中動脈模型，藥學(xué)學(xué)報，1995，30:662所述方法及標準觀察并記錄大鼠的行為障礙(A)提鼠尾觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對稱伸向地面，計為0分，如手術(shù)對側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈曲計為1分，肘屈曲計為2分，肩內(nèi)旋計為3分，既有腕屈曲和/或肘屈曲，又有肩內(nèi)旋者，計為4分。(B)將動物置于平地面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動，檢査阻力。如雙側(cè)阻力對等且有力，計為O分，如向手術(shù)對側(cè)推動時阻力下降者，根據(jù)下降程度不同分為輕、中、重三度，分別計為l，2和3分。(C)將動物雙前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察雙前肢的肌張力。雙前肢肌張力對等且有力者計為0分。同樣根據(jù)手術(shù)對側(cè)肌張力下降程度不同計為1，2和3分。(D)動物有不停地向一側(cè)轉(zhuǎn)圈者，計為1分。根據(jù)標準評分，滿分為11分，分數(shù)越高，表示動物行為障礙越嚴重。行為評分后處死大鼠，取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冠狀切成5片，腦片用紅四氮唑(TTC)染色，正常組織經(jīng)染色后呈紅色，梗塞組織呈白色，染色后照相，用中國航空航天大學(xué)病理圖像分析軟件求梗塞面積比。數(shù)據(jù)用I士s表示，以組間Z檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果如表8所示，缺血24小時后，模型組大鼠表現(xiàn)出明顯的行為障礙，大鼠腦組織也出現(xiàn)明顯的灶狀缺血區(qū)，達到全腦24%左右。雙咖酚酸靜脈注射組(7.5mg/kg)、雙咖酚酸靜脈注射20mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射50mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射100mg/kg組、雙咖酚酸靜脈注射200mg/kg組、雙咖酚酸灌胃20mg/kg組、雙咖酚酸灌胃50mg/kg組、雙咖酚酸灌胃200mg/kg組3、雙咖酚酸灌胃400mg/kg組4顯著改善大鼠行為障礙、減少缺血面積(與模型組比較，p<0.05或p<0.01)，雙咖酚酸靜脈注射100mg/kg組與雙咖酚酸靜脈注射200mg/kg組比較，對改善大鼠行為障礙、減少缺血面積無明顯差異(p〉0.05);雙咖酚酸灌胃200mg/kg組與雙咖酚酸灌胃400mg/kg組比較，對改善大鼠行為障礙、減少缺血面積無明顯差異(p〉0.05)。表8雙咖酚酸對大鼠腦缺血損傷的影響(n-lO)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>與模型對照組比較，*P〈0.05，**P〈0.01，*林P<0.001。試驗例6雙咖酚酸對側(cè)腦室注射P淀粉肽所致癡呆大鼠記憶獲得性障礙的影響6.1材料雙咖酚酸，按制備例1方法制備。P淀粉樣肽2535片段，Sigma公司。哈伯因(石杉堿甲，HuperzineA),河南竹林眾生制藥股份有限公司豫中制藥廠產(chǎn)品，批號為0508036。Y型水迷宮裝置，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所產(chǎn)品。動物普通級Wistar大鼠，雌雄各半，體重250g—280g，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心實驗動物中心提供，合格證號SYXK(魯)200300206.2方法與結(jié)果大鼠隨機分為正常對照組，模型對照組，哈伯因O.Olmg/kg組，雙咖酚酸靜脈注射2.5mg/kg組，雙咖酚酸靜脈注射15mg/kg組，雙咖酚酸靜脈注射50mg/kg組，雙咖酚酸靜脈注射100mg/kg組，雙咖酚酸靜脈注射200mg/kg組，雙咖酚酸灌胃劑量5mg/kg組，雙咖酚酸灌胃劑量20mg/kg組，雙咖酚酸灌胃劑量50rag/kg組，雙咖酚酸灌胃劑量200mg/kg組，雙咖酚酸灌胃劑量400mg/kg組，每組10只。各組動物分別按文獻陳勤,夏宗勤，胡雅兒.1知母皂苷元對擬癡呆大鼠e-淀粉樣肽沉積及膽堿能系統(tǒng)功能的影響.中國藥理學(xué)通報,2002,184):390-3.所述方法，行腦定位右側(cè)單側(cè)腦室注射e淀粉樣肽4ng/只，正常對照組注射等量生理鹽水。造模結(jié)束后，灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)30天后按文獻徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué).北京人民衛(wèi)生出版社，1991，662所述方法進行訓(xùn)練。訓(xùn)練前，先將大鼠放在梯子附近使其自行爬上2次，之后分3階段進行訓(xùn)練。第l階段用擋板在A處攔住，使大鼠從A處開始訓(xùn)練；第2階段用擋板攔住B處，由此開始訓(xùn)練；第3階段由起點C處開始訓(xùn)練。每一階段學(xué)習(xí)訓(xùn)練2次，休息5min后再進行下一階段訓(xùn)練。全部訓(xùn)練完畢后使大鼠休息5min，再將其放于爬梯附近使其自行爬上2次，然后直接將其放于C處，記錄大鼠游完全程到達爬梯的時間和進入盲端的次數(shù)錯誤次數(shù)，5min不能游出者按5min計，以此作為學(xué)習(xí)成績。24h后重復(fù)測試，作為記憶成績。結(jié)果如表9顯示，模型組大鼠的學(xué)習(xí)成績、記憶成績與假手術(shù)組相比，錯誤次數(shù)明顯增多、游泳時間明顯延長；雙咖酚酸劑量組、哈博因組與模型組比，錯誤次數(shù)、游泳時間明顯減少。表9雙咖酚酸對血管性癡呆大鼠水迷宮試驗的影響(^土s,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>:PO.OOlvs假手術(shù)組；厶P<0.05，AAPO.01vs模型對照組試驗例7雙咖酚酸對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響7.1材料雙咖酚酸，按制備例1方法制備。尼莫地平片由正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號000605，每片20mg。硝普鈉由北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號005071。大鼠跳臺裝置，北京醫(yī)科大學(xué)儀器廠生產(chǎn)。普通級Wistar大鼠雌雄各半，體重250g280g，山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心實驗動物中心提供，合格證號SYXK魯200300207.2方法與結(jié)果大鼠隨機分為假手術(shù)組，模型組，尼莫地平組10mg/kg組，雙咖酚酸靜脈注射2.5mg/kg組，雙咖酚酸靜脈注射15mg/kg組，雙咖酚酸靜脈注射50mg/kg組，雙咖酚酸靜脈注射100mg/kg組，雙咖酚酸靜脈注射200mg/kg組，雙咖酚酸灌胃5mg/kg組，雙咖酚酸灌胃劑量20mg/kg組，雙咖酚酸灌胃劑量50mg/kg組，雙咖酚酸灌胃劑量200mg/kg組，雙咖酚酸灌胃劑量400mg/kg組，每組10只。灌胃給藥，每天l次，3天后按文獻周小青，劉旺華，李花，等.丹龍醒腦片對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦組織興奮性氨基酸影響的實驗研究.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2002，222:4-7所述血管性癡呆大鼠模型建立方法(加以改良)，將水合氯醛麻醉的大鼠腹腔注射0.05%硝普鈉(5ml/kg)，常規(guī)消毒，分離雙側(cè)頸總動脈，用無創(chuàng)動脈夾夾閉，30min后，再通30min，再夾閉30min，再通后，傷口嚴格消毒，縫合，回籠室溫27士0.5'C飼養(yǎng)并灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)30天。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過程同模型組，但不阻斷雙側(cè)頸總動脈，不注射硝普鈉。30天后按文獻周小青，劉旺華，李花，等.丹龍醒腦片對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦組織脂質(zhì)過氧化和鈣超載的影響.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2002，223:l-5所述方法進行學(xué)習(xí)訓(xùn)練。訓(xùn)練前先將動物放入箱中自由活動3min，熟悉環(huán)境，然后將動物置于圓臺上，接通銅柵電源，記錄動物3min內(nèi)錯誤次數(shù)動物跳下圓臺次數(shù)及受電擊總時間，作為學(xué)習(xí)成績。24h后直接將動物置于圓臺上，記錄其放入至第1次下臺受到電擊的時間潛伏期、3min內(nèi)錯誤次數(shù)及受電擊總時間，作為記憶成績。結(jié)果如表10顯示，模型組大鼠的學(xué)習(xí)成績、記憶成績與假手術(shù)組相比，錯誤次數(shù)及受電擊時間顯著增多，潛伏期(記憶成績)明顯縮短。表10雙咖酚酸對血管性癡呆大鼠跳臺試驗的影響(^土s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>權(quán)利要求1.一種新化合物，結(jié)構(gòu)式如下2.權(quán)利要求1所述的化合物的制備方法，A制備丹參多酚酸；B堿性條件下降解丹參多酚酸:取丹參多酚酸，加入堿和極性溶劑，回流降解；C純化取降解液，減壓回收乙醇，過濾，用大孔吸附樹脂，收集洗脫液，濃縮近干，有黃色沉淀析出，過濾，干燥濾餅，即得。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其制備方法為A取丹參生藥粉碎，30倍量水滲漉提取，過濾，用大孔吸附樹脂進行吸附，提取液與樹脂的體積比3:1，用純化水洗脫3—5個柱體積，再用30%的乙醇溶液洗脫5個柱體積，收集洗脫液，調(diào)節(jié)pH值為2-5，濃縮乙醇，凍干，得丹參多酚酸；B取丹參多酚酸，按重量比2:l加入氫氧化鈉，加入50倍量50%乙醇溶液，回流降解；C取降解液，減壓回收乙醇，過濾，濾液上AB-8大孔樹脂層析柱，水洗5體積，15%乙醇洗脫4體積，收集該部分洗脫液，濃縮近干，放冷，有黃色沉淀析出，千燥即得。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其制備方法為取丹參生藥粉lkg，30倍量水滲漉提取，過濾，大孔吸附樹脂吸附，提取液與樹脂的體積比為3:1，用純化水洗脫5個柱體積，再用30%的乙醇溶液洗脫5個柱體積，收集洗脫液，調(diào)節(jié)pH值為2，濃縮，凍干；將凍干得到的丹參多酚酸，按重量比2:l加入氫氧化鈉，再加入50倍量50%乙醇溶液，回流降解；取降解液，減壓回收乙醇，過濾，濾液上AB-8大孔樹脂層析柱，水洗5個柱體積，15%乙醇洗脫4個柱體積，收集該部分洗脫液，濃縮近干，放冷，有黃色沉淀析出，干燥即得30g該化合物。5.權(quán)利要求1所述化合物在制備治療或預(yù)防肝臟疾病、心腦血管疾病及癡呆疾病的藥物中的應(yīng)用。6.權(quán)利要求1所述化合物在制備治療或預(yù)防急、慢性肝損傷或肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。7.權(quán)利要求1所述的化合物在制備治療或預(yù)防缺血性腦中風(fēng)、腦缺血/再灌注損傷、冠心病或心絞痛的藥物中的應(yīng)用。8.權(quán)利要求1所述的化合物在制備治療或預(yù)防老年性癡呆、血管性癡呆的藥物中的應(yīng)用。9.以權(quán)利要求1化合物為活性成分的藥物組合物。10.權(quán)利要求9所述的藥物組合物在制備治療或預(yù)防肝臟疾病、心腦血管疾病及癡呆疾病的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種新的酚酸類化合物及其制備方法、用途和藥物組合物。該化合物通過降解丹參多酚酸制備而成，該化合物在肝臟疾病、心腦血管疾病和癡呆疾病方面均有較好的效果。文檔編號C07C65/00GK101376628SQ200710015108公開日2009年3月4日申請日期2007年8月30日優(yōu)先權(quán)日2007年8月30日發(fā)明者孫盛茂,徐本明,李桂生,田京偉,蔣王林,高玉白申請人:山東綠葉天然藥物研究開發(fā)有限公司