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具有cea抗性的藥物組合物的制作方法

文檔序號(hào):3558706閱讀:205來(lái)源:國(guó)知局

專利名稱::具有cea抗性的藥物組合物的制作方法具有CEA抗性的藥物組合物
背景技術(shù)
:自從Gold和Freedman首次描述在人結(jié)腸癌組織提取物中的與腫瘤相關(guān)的癌胚抗原(Gold和Freedman;J.Exp.Med.122(1965);467-481),已過(guò)去三十多年。同時(shí),已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與CEA基因家族有關(guān)的28個(gè)其它基因/假基因。為了簡(jiǎn)化對(duì)CEA基因家族成員的命名,近來(lái)已經(jīng)將該家族更名為"CEA相關(guān)的細(xì)胞黏附分子"(CEACAM)并且對(duì)其成員命名進(jìn)行了統(tǒng)一(Beauchemin,Exp.CellRes.252(1999),243-249)。例如,根據(jù)這一命名,人CEA(CD66e)被稱為CEACAM5。人CEA基因家族集簇在染色體19ql3.2(Olsen等人.Genomics23(1994);659-668)。其29個(gè)基因和假基因被分為三個(gè)亞群,即,含有7個(gè)表達(dá)基因的CEA亞群、含有11個(gè)表達(dá)基因的妊娠特異性糖蛋白(PSG)亞群和僅含有假基因的第三個(gè)亞群(Hammarstr6m,Sem.CancerBiol.9(1999),67-81;Beauchemin,Exp.CellRes.252(1999),243-249)。對(duì)CEA和其它家族成員的氨基酸序列分析表明,其屬于免疫球蛋白(Ig)超家族(Williams和Barclay,Annul.Rev.Immunol.6(1988),381-405)。CEA亞群的全部成員黏附于細(xì)胞表面的膜上膽汁糖蛋白(CEACAM1;BGP1;TM畫CEA;CD66a)、CEA基因家族成員1(CEACAM3;CGM1;CD66d)和CEA基因家族成員7(CEACAM4;CGM7)具有疏7JC跨膜結(jié)構(gòu)域,而癌胚抗原(癌胚抗原相關(guān)的細(xì)胞黏附分子5;CEACAM5;CEA;CD66e)、非特異性交叉反應(yīng)抗原(CEACAM6;NCA;NCA-50/90;CD66c)、CEA基因家族成員2(CEACAM7;CGM2)和CEA基因家族成員6(CEACAM8;CGM6;CD66b)通過(guò)糖基砩脂酰肌醇(GPI)脂質(zhì)部分與質(zhì)膜相連。CEA蛋白質(zhì)是高度糖基化的,由Ig結(jié)構(gòu)域的數(shù)目決定,具有高達(dá)約300kDa的分子量。關(guān)于CEA蛋白質(zhì)的生物活性,在對(duì)腫瘤細(xì)胞系的體外研究表明幾個(gè)CEA亞家族(包括膽汁糖蛋白、CEA和非特異性交叉反應(yīng)抗原)當(dāng)在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)時(shí),能夠起到親同種抗原的和異型細(xì)胞黏著分子的作用(Oikawa等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.186(1992),881-887;Zhou等人,CancerRes.53(1993),3817-3822)。最近,已經(jīng)討論了CEA和非特異性交叉反應(yīng)抗原在保護(hù)結(jié)腸免受微生物攻擊的先天免疫防御中的可能的作用(HammarstHim和Baranov,TrendsMicrobiol.9(2001),第119-125頁(yè))。特別提出了這些蛋白質(zhì)結(jié)合和引誘微生物阻止其到達(dá)和入侵微絨毛的上皮細(xì)胞。推測(cè)CEA是癌胚抗原,其在胚胎期表達(dá),在健康成人中缺乏且在癌中重新表達(dá)。然而,CEA也在正常成人組織中表達(dá),例如,膽汁糖蛋白、CEA、非特異性交叉反應(yīng)抗原和CEA基因家族成員2在正常人結(jié)腸,特別是在面對(duì)腸腔的成熟柱狀上皮細(xì)胞中表達(dá)且在隱窩口腔(cryptmouth)的高度分化細(xì)胞中表達(dá)((Frangsmyr等人,CancerRes.55(1995),2963-2967;Frangsmyr等人,TumorBiol.20(1999),277-292))。具體而言,這些蛋白質(zhì)位于內(nèi)襯自由腔表面的成熟結(jié)腸細(xì)胞的刷狀緣多糖包衣。膽汁糖蛋白、CEA和非特異性交叉反應(yīng)抗原也在多種上皮起源的腫瘤中表達(dá)(Hammarstr6m,Sem.CancerBiol.9(1999),67-81;Shively和BeattyCRCCrit.Rev.Oncol.Hematol.2(1985),355-399)。在70年代末和80年代初,CEA已經(jīng)成為結(jié)腸直腸腫瘤和其它上皮腫瘤的放射免疫定位的優(yōu)選靶標(biāo)抗原。這是由于CEA在95%的胃腸道癌和胰腺癌,以及在多數(shù)小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌中過(guò)表達(dá)。其也在乳腺癌和頭和頸的鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)(Primus等人,Cancer42(1978),1540-1545)。實(shí)際上,CEA是最廣泛使用的臨床腫瘤標(biāo)記之一。由于它的穩(wěn)定性、在正常成人組織中相當(dāng)有限的表達(dá)及其在上皮來(lái)源的腫瘤中的高表達(dá),而被用作結(jié)腸直腸癌和某些其它癌的血清腫瘤標(biāo)志。在健康個(gè)體中CEA主要在結(jié)腸中產(chǎn)生。其在那里從成熟結(jié)腸細(xì)胞的頂表面釋放進(jìn)入腸腔,并且隨糞便消失。因此從健康個(gè)體的血液中通常僅見(jiàn)到非常低水平的CEA。例如,在健康個(gè)體的血液中CEA水平少于2g/1。相反,在患有結(jié)腸癌和其它癌癥的患者血清中CEA水平增加,范圍高達(dá)超過(guò)2000g/1(Thomson等人,PNAS64(1969),161-167)。特別是,進(jìn)^f亍性的、惡性或晚期的上皮腫瘤通常伴隨著高血清濃度的可溶CEA(Fletcher;Ann.Intern.Med.104(1986),66-73)。已知來(lái)自質(zhì)膜的成份(包括CEA)是作為質(zhì)膜衍生的小嚢泡持續(xù)從表面剝脫(Taylor和Black,J.Natl.CancerInst.74(1985),859-866;Sack等人,JClinInvest.82(1988),586-93),其通過(guò)淋巴引流和血管在血液中終結(jié)。隨著腫瘤體積增加,將有更多的CEA積聚在血液中。作為腫瘤標(biāo)志的血清CEA檢測(cè)主要用于結(jié)腸癌的術(shù)后監(jiān)督中。分別在81"/。的患者中(Minton等人,Cancer55(1985),1284腸1290)和89。/o的患者中(Wanebo等人,Surg.Gynecol.Obstet.169(1989),479-487),增加的CEA水平是疾病復(fù)發(fā)的第一指標(biāo)。血清CEA水平也可以用作預(yù)后指標(biāo)(Mulcahy和Benson,Curr.Oncol.Rep.1(1999),168-172)。由于其在多種上皮癌中過(guò)表達(dá),CEA不僅用作腫瘤標(biāo)志,也用作抗腫瘤治療的靶標(biāo)。例如,胃腸癌在人上皮腫瘤中占很大比例,2001年在美國(guó)估計(jì)有新發(fā)生的21700例胃癌和135400例結(jié)直腸癌(Greenlee;CACancerJClin51(2001),15-36)。結(jié)直腸癌是第三常見(jiàn)的惡性腫瘤并且是在男性和女性中由癌癥致死的第三大原因(Ries;Cancer88(2000),2398_2424)。為了找到針對(duì)這些肺瘤的新的療法,已經(jīng)開發(fā)抗-CEA單克隆抗體作為對(duì)CEA陽(yáng)性癌癥的可能的治療方法(Murakami等人,Immunol.Invest.25(1996),23-35)。由Behr等人進(jìn)行的研究中提供了方法的一個(gè)實(shí)例,其中具有低腫瘤負(fù)荷(對(duì)應(yīng)于低血清CEA水平)的患者得到成功的治療。在這一方法中,已經(jīng)在II期實(shí)驗(yàn)中分析了1311-標(biāo)記的labetuzumab變體(labetuzumab是抗-CEA單克隆抗體MN-14的人源化形式;Behr等人,Cancer,94:lni^l,(2002),1559-64),其中入選的30個(gè)CRC患者具有對(duì)5-氟尿嘧啶和亞葉酸的小體積轉(zhuǎn)移疾病抗性或是處于肝轉(zhuǎn)移后的輔助治療中。給予1311-標(biāo)記的labetuzumab的單獨(dú)注射。在19個(gè)可評(píng)估的患者中,3個(gè)具有部分的緩解,且8個(gè)顯示持續(xù)高達(dá)15個(gè)月的輕微應(yīng)答。在輔助治療中,9個(gè)患者中有7個(gè)長(zhǎng)達(dá)3年未再患病,而在相同期間對(duì)照組中的復(fù)發(fā)率是67%?;颊叩难錍EA水平范圍從3.9-45ng/ml(Behr等人,Cancer,94:1373-1381,2002)。在其特征為患者具有低的CEA血清水平(<5ng/ml)的另一研究中,用1311-標(biāo)記的labetuzumab進(jìn)行CEA放射免疫療法(如上所述)已經(jīng)顯示提高在肝中直結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的搶救切除術(shù)之后的存活。23個(gè)患者接受劑量為40-60mCi/m2的131I-labetuzumab。分別而言,對(duì)治療組五年的存活率為51,3%而對(duì)照組為7.4%(Liersch等人,JCO,2005,ASCOProc,Vol23,No16S:3627)。然而,使用高血清CEA濃度處理的治療方法通常產(chǎn)生低的或沒(méi)有抗-腫瘤應(yīng)答。例如,在臨床評(píng)估人源化的抗CEA單克隆抗體的臨床研究中,用1311標(biāo)記MN-14版本的CDR-移植片(hMN-14;Sharkey,CancerRes.55(23Suppl)(1995)5935-5945)。具有CEA產(chǎn)生增加的腫瘤的19個(gè)患者接受了"'I標(biāo)記的hMN-14。hMN-14的生物分布、腫瘤耙標(biāo)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)行為與觀察到的鼠MN-14相似。然而,在血漿中具有升高的CEA^200ng/ml)的患者在注射后1小時(shí)有超過(guò)30%的標(biāo)記抗體絡(luò)合。在部分的這些患者中,增加的并發(fā)癥導(dǎo)致抗體代謝提高,其比具有更低血漿CEA的患者能夠更快的從血液清除(Sharkey,上述引文)。在由Yu等人進(jìn)行的另一I期試驗(yàn)中,已經(jīng)使用針對(duì)CEA的以1311標(biāo)記的高親合的鼠單克隆抗體(mAb),COL-1(Muraro,CancerRes.45(1985),5769-80)在患有胃腸道惡性腫瘤的患者中進(jìn)行研究。具體而言,已經(jīng)分析了血清CEA和腫瘤體積在藥代動(dòng)力學(xué)上的影響。為此,患有晚期胃腸道惡性腫瘤的18個(gè)患者接受了用1311標(biāo)記的20mg的COL-1,劑量從IOraCi/m2至75mCi/m2。血清CEA水平范圍從6至2739叫/1111^(平均值+/-SD,500+/-639)。有關(guān)腫瘤的全部器官的82%和全部病灶的58%是陽(yáng)性。然而,已經(jīng)再次觀察到提高的血清CEA(>500ng/mL)和腫瘤體積與血清放射活性清除直接有關(guān)。作者得出結(jié)論是具有高度提高的循環(huán)CEA水平和/或增加的腫瘤體積的患者能夠從循環(huán)中更快清除1311標(biāo)記的COL-l(Yu等人,J.Cli.Oncol.14(1996),1798-1809)。Hajjar等人已經(jīng)使用碘-131-標(biāo)記的人源化MN-14抗CEA單克隆抗體在具有轉(zhuǎn)移胃腸道和結(jié)直腸癌的患者中獲得了相似的結(jié)果。在I期試驗(yàn)中,21個(gè)患者或在事先的外線束放射之后或在標(biāo)準(zhǔn)化療之后已經(jīng)用抗體治療。其中的7個(gè)患者具有人抗人抗體(HAHA),但是沒(méi)有副作用。沒(méi)有觀察到抗腫瘤應(yīng)答。已經(jīng)再次發(fā)現(xiàn)提高的血漿CEA水平增加抗體從血液和整個(gè)身體的清除(Hajjar等人,ClinColorectalCancer,2(2002),31-42),其可以至少部分的提供在這一研究中觀察到的缺乏抗肺瘤應(yīng)答的解釋。治療抗體從血液和身體迅速清除的現(xiàn)象可以通過(guò)增加的免疫復(fù)合體的形成來(lái)解釋,所述免疫復(fù)合體必須被從身體迅速除去以避免器官損害。在加入這些研究的胂瘤患者中觀察不到治療效果,最可能是由于單克隆抗體的迅速清除。為了避免由免疫復(fù)合體形成和治療單克隆抗體的迅速清除(其最可能由免疫細(xì)胞Fc受體識(shí)別的抗體Fc部分介導(dǎo))引起的問(wèn)題,已經(jīng)生產(chǎn)抗體衍生物(例如scFc構(gòu)建體)或沒(méi)有Fc部分的片段(例如Fab和Fab2片段)并且進(jìn)行臨床分析。這些研究大多針對(duì)腫瘤造影和檢測(cè)/定位(見(jiàn),例如Chester等人,CancerChemotherPharmacol,46(2000)Suppl:S8-12;Mayer等人,ClinCancerRes,6:(2000)1711-1719;Begent等人,NatMed,2(1996):979-984)。僅少數(shù)研究調(diào)查了這類抗體衍生物/片段在臨床上的治療效果。例如,在Francis等人的臨床方法中(Francis,Br.J.Cancer87(6)(2002),600-607),已經(jīng)研究了scFv-羧肽酶構(gòu)建體的抗腫瘤活性。在這一I期試驗(yàn)中,已經(jīng)將抗體定向的酶藥物前體治療(ADEPT)應(yīng)用于具有晚期結(jié)直腸癌或其它產(chǎn)生CEA的腫瘤的患者中。為此目的,使用了A5CP(其由針對(duì)CEA(A5B7)產(chǎn)生的鼠單克隆抗體的F(ab)2片段連接于細(xì)菌酶羧肽酶(CPG^作為抗體-酶耙向劑)和ZDr76P(雙碘代苯酚芥子藥物前體)。結(jié)果是,在該研究中沒(méi)有看到臨床或放射的應(yīng)答。預(yù)處理的血清CEA水平范圍高達(dá)1000ng/ml。在治療的腫瘤患者的血清中,這些高CEA濃度可能是在這一研究中觀察到缺少抗腫瘤應(yīng)答的至少部分原因??紤]到以上提出的問(wèn)題,提供對(duì)于發(fā)展的惡性或晚期上皮腫瘤的有效治療的手段和方法是受到高度期待的。因此,本發(fā)明一方面涉及藥物組合物,所述藥物組合物包括雙特異性的單鏈抗體,其具有(a)特異性結(jié)合人CD3的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域,和(b)特異性結(jié)合人CEA的笫二結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含至少氨基酸序列"D&XzXsXJYFDY"(SEQIDN0.65),其中"X,、"X2,,、"乂3"或"乂4"代表任意氨基酸殘基,并且氨基酸殘基"D"對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置95且氨基酸殘基"FYFDY,,分別對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置100、100a、100b、101和102。在一個(gè)實(shí)施方案中,"X,代表"R"(精氨酸)、"F"(苯丙氨酸)、"M,,(甲硫氨酸)、"E,,(谷氨酸)或"T,,(蘇氨酸);"X2,,代表"G,,(甘氨酸)、"Y,,(酪氨酸)、"A,,(丙氨酸)、"D,,(天冬氨酸)或"S"(絲氨酸);"X3"代表"L"(亮氨酸)、"F"(苯丙氨酸)、"M"(曱硫氨酸)、"E"(谷氨酸)或"T"(蘇氨酸);和"X4"代表"R"(精氨酸)、"Y"(酪氨酸)、"A,,(丙氨酸)、"D"(天冬氨酸)或"S,,(絲氨酸)。在本發(fā)明的藥物組合物的實(shí)施方案中,對(duì)本文定義的雙特異性單鏈抗體的人CEA特異的所述第二個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含至少氨基酸序列"DRGLRFYFDY"(SEQIDNO.66),其對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置95—102。本發(fā)明提供的手段和方法特別適于治療在其血漿中具有高可溶的CEA濃度的上皮肺瘤患者。在具有進(jìn)行性肺瘤、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、晚期腫瘤的上皮腫瘤患者的血清/血漿中和具有高腫瘤負(fù)荷/負(fù)擔(dān)的患者中發(fā)現(xiàn)這類高濃度可溶CEA。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有CEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雙特異性單鏈抗體包含氨基酸序列"DRGLRFYFDY"(SEQIDNO.66),不僅結(jié)合CEA-陽(yáng)性靶標(biāo)細(xì)胞,而且結(jié)合可溶CEA,見(jiàn)本發(fā)明的實(shí)施例3和圖2;和EPBl491031。指明的氨基酸序列"DRGLRFYFDY"對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置95—102(SEQIDNO.66)(Harwood,BrJCancer.54(1986),75-82)。令人驚奇的,盡管結(jié)合可溶CEA,所述雙特異性單鏈抗體甚至在高濃度的可溶CEA(已經(jīng)檢測(cè)到高達(dá)1嗎/ml可溶CEA)存在下殺死帶有CEA的腫瘤細(xì)胞。換言之,所迷雙特異性構(gòu)建體在其針對(duì)CEA-陽(yáng)性肺瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性上不受到可溶CEA的抑制。如在以下實(shí)施例5和8所示(與圖5、6、8、10、19、20、22和27組合),包含氨基酸序列"DRGLRFYFDY"的具有CEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雙特異性單鏈抗體甚至在高濃度的可溶CEA存在下介導(dǎo)對(duì)CEA-陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。例如,圖10顯示,在增加量的可溶CEA抗原的存在下,CEA-反應(yīng)的雙特異性單鏈構(gòu)建體重新定向KatoIII細(xì)胞(CEA-陽(yáng)性的人胃癌細(xì)胞系)的細(xì)胞毒性測(cè)定。使用刺激的人CD8陽(yáng)性細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)作為效應(yīng)細(xì)胞。CEAIVHVLxSEQIDNO.77VHVL-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性是對(duì)可溶CEA有抗性的。相反,CEAIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL-介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性是由增加量的可溶CEA抑制的。CEAI是衍生自鼠mAbA5B7的可變區(qū),而CEAIIVHVL是衍生自mAbT84.66。重要的是,已經(jīng)發(fā)現(xiàn),當(dāng)用于抗-CEAx抗-CD3雙特異性單鏈抗體的人CEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即,特異結(jié)合人CEA的人結(jié)合結(jié)構(gòu)域)時(shí),氨基酸序列"DRGLRFYFDY,,足以介導(dǎo)對(duì)可溶CEA的抗性,見(jiàn)例如,圖19、20、22和27。在下文中,本文所定義的雙特異性單鏈抗體因此被稱為對(duì)可溶CEA抗原有抗性。術(shù)語(yǔ)"對(duì)可溶CEA抗原有抗性"、"對(duì)可溶CEA有抗性,,或本文使用的相關(guān)術(shù)語(yǔ)指這一事實(shí),即由所述雙特異性單鏈抗體介導(dǎo)的針對(duì)CEA-陽(yáng)性靶標(biāo)或腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性不受到可溶CEA的濃度增加的影響。具體而言,細(xì)胞毒活性甚至不受到高濃度的可溶CEA(已經(jīng)檢測(cè)高達(dá)lng/ml)的抑制。如上所述,在健康個(gè)體血液中CEA水平低于2ng/ml。在腫瘤患者的血清/血漿中高的可溶CEA濃度是進(jìn)行性、復(fù)發(fā)的、轉(zhuǎn)移的或晚期腫瘤和具有高胂瘤負(fù)荷的患者的特征。因此,本發(fā)明提供的手段和方法特別適用于治療在其血漿中具有這類高可溶CEA濃度的上皮腫瘤患者。如本文所使用的"高可溶CEA濃度"指可溶的血清/血漿-CEA濃度高于IO、20、50、70、80、90或100ng/ml。這一血清/血漿-CEA濃度尤其可通過(guò)ELISA確定。優(yōu)選的,所述可溶血清/血漿-CEA濃度高于100ng/ml,例如通過(guò)ELISA測(cè)定。產(chǎn)生所述對(duì)可溶CEA抗原具有抗性的雙特異性單鏈抗體并非平凡任務(wù),如從以下實(shí)施例所示。例如,不能產(chǎn)生衍生自單克隆抗體(niAb),即mAbPR1A3(Durbin,ProcNatlAcadSciUSA.91(1994),4313國(guó)7)的、已知結(jié)合膜結(jié)合的CEA而不結(jié)合可溶CEA的具有CEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雙特異性單鏈抗體當(dāng)以雙特異性單鏈抗體形式使用時(shí),不能實(shí)現(xiàn)抗CD3x抗-CEA雙特異性單鏈構(gòu)建體的表達(dá)/分泌。當(dāng)使用人源化形式的PR1A3(Durbin,上文所迷)來(lái)產(chǎn)生時(shí),從宿主細(xì)胞表達(dá)和分泌雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體。然而,沒(méi)有獲得抗-CEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與膜結(jié)合的CEA的結(jié)合。當(dāng)從詳細(xì)描迷的單克隆抗體T84.66(Neumaier,M.等人,CancerRes50(1990),2128-34)或MFE-23(Boehm,M.K.BiochemJ2(2000)產(chǎn)生雙特異性單鏈抗體時(shí),這些雙特異性抗體是對(duì)可溶CEA抗原高度敏感的,即在存在可溶CEA抗原時(shí),它們針對(duì)CEA陽(yáng)性靶標(biāo)或腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性被阻斷。由于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述構(gòu)建體結(jié)合可溶CEA,推測(cè)可溶CEA抗原阻止抗體結(jié)合膜結(jié)合的CEA,由此阻斷抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性。例如,圖7顯示,在可溶人CEA存在下,CEA反應(yīng)性雙特異性單鏈構(gòu)建體重新定向用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞毒活性測(cè)定。刺激的人CD8陽(yáng)性毒性T細(xì)胞(CTL)用作效應(yīng)細(xì)胞。CEAIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL的細(xì)胞毒活性明顯受到可溶CEA量增加的抑制。CEAIIVHVL衍生自mAbT84.66;SEQIDNO.77是抗CD3VH-VL結(jié)構(gòu)域。僅雙特異性單鏈抗體可以發(fā)現(xiàn)對(duì)可溶CEA抗原的抗性,其CEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的氨基酸序列"DRGLRFYFDY"(Harwood,BrJCancer.54(1986),75-82)。對(duì)于MFE-23-和T84.66-衍生的雙特異性單鏈構(gòu)建體,A5B7-衍生的雙特異性單鏈抗體結(jié)合可溶CEA。從MFE-23-和T84.66-衍生的雙特異性單鏈構(gòu)建體獲得的結(jié)果可見(jiàn),不能期望可溶CEA不影響A5B7-衍生的單鏈雙特異性抗體構(gòu)建體的細(xì)胞毒活性。如上所述,針對(duì)人的帶有CEA的上皮腫瘤的許多治療方法受到在癌癥患者血漿中存在的高水平可溶CEA抗原的嚴(yán)重妨礙.例如,在許多臨床研究中已經(jīng)觀察到在血漿中高CEA濃度存在下,免疫-復(fù)合物形成和治療性抗-CEA單克隆抗體的清除的增加。此外,可溶CEA抗原阻礙針對(duì)CEA-陽(yáng)性肺瘤細(xì)胞的治療,從而阻止腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和破壞,所述CEA抗原通常以高濃度存在于患有進(jìn)行性腫瘤、復(fù)發(fā)的癌癥、轉(zhuǎn)移腫瘤、高腫瘤負(fù)荷/負(fù)擔(dān)或晚期腫瘤的癌癥患者的血清中。因此,到達(dá)腫瘤的治療的實(shí)際量被減少,導(dǎo)致減少的、低的抗肺瘤活性或甚至沒(méi)有抗腫瘤活性。這一局限目前為止限制例如,基于抗體的方法用于具有不可能阻止治療法-腫瘤細(xì)胞相互作用的非常低量的可溶CEA抗原的那些患者。在本發(fā)明中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可能產(chǎn)生對(duì)人CD3和人CEA具有特異性的雙特異性單鏈抗體療法,其中針對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性對(duì)甚至高濃度的可溶CEA抗原(已測(cè)試高達(dá)l|ag/ml可溶CEA)有抗性??紤]到本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體結(jié)合可溶CEA抗原這一事實(shí),這一發(fā)現(xiàn)是完全未預(yù)料的(見(jiàn)本發(fā)明的實(shí)施例3和圖2;也見(jiàn)EPB1491031)。然而,如本文定義的雙特異性單鏈抗體在其針對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性上對(duì)甚至高水平的可溶CEA存在完全的抗性。因此,本發(fā)明提供的手段和方法特別適于治療在其血漿中具有高度可溶CEA濃度(如在進(jìn)行性腫瘤、癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、具有高腫瘤負(fù)荷/負(fù)擔(dān)或晚期腫瘤的患者中所觀察)的腫瘤患者。根椐本發(fā)明,術(shù)語(yǔ)"藥物組合物"涉及施用于人患者的組合物。優(yōu)選的,該藥物組合物包含載體、穩(wěn)定劑和/或賦形劑的合適制劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,藥物組合物包括胃腸外、經(jīng)皮、管腔內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腱鞘內(nèi)和/或鼻內(nèi)施用或通過(guò)直接注射進(jìn)入組織。具體可期待將所迷組合物經(jīng)由灌注或注射施用于患者??梢酝ㄟ^(guò)不同方法,例如通過(guò)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、局部或真皮內(nèi)施用影響合適組合物的施用。本發(fā)明的組合物還可以包括的藥物可接受的載體。合適的藥物載體的實(shí)例是本領(lǐng)域眾所周知的,并且包括磷酸緩沖鹽溶液、水、多種類型的濕潤(rùn)劑、消毒溶液、脂質(zhì)體等??梢酝ㄟ^(guò)眾所周知的常規(guī)方法配制包含這類載體的組合物??梢砸院线m的劑量將這些組合物施用于受試者,該劑量可以通過(guò)例如劑量升級(jí)研究來(lái)確定(通過(guò)將本文所述呈現(xiàn)對(duì)可溶血清CEA抗原抗性的雙特異性單鏈抗體以增加劑量施用)。如以上提出的,對(duì)可溶血清CEA抗原具有抗性的本文所述雙特異性單鏈抗體最好用于治療具有高CEA血清濃度的癌癥患者,例如進(jìn)行性肺瘤、復(fù)發(fā)癌癥、轉(zhuǎn)移性腫瘤、高腫瘤負(fù)荷/負(fù)擔(dān)、或晚期腫瘤。這些組合物也抗原與其它蛋白質(zhì)的和非蛋白質(zhì)的藥物組合施用,例如以共治療的方式。這些藥物可以與包含本文定義的雙特異性單鏈抗體的組合物同時(shí)施用,或單獨(dú)的在所述雙特異性抗體的施用之前或之后以確定時(shí)間間隔和劑量施用??梢酝ㄟ^(guò)主治醫(yī)生和臨床因素確定給藥方案。如在治療領(lǐng)域眾所周知的,對(duì)于任何患者的劑量依賴于多種因素,包括患者的體積、體表面積、年齡、要施用的特定化合物、性別、時(shí)間和施用的途徑、總體健康和被同時(shí)施用的其它藥物。對(duì)于胃腸道外給藥的準(zhǔn)備包括無(wú)菌的含水或非水溶液和懸浮液。非水溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二烯、植物油和可注射的有機(jī)酯,例如油酸乙酯。含水載體包括水、含水溶液,或懸浮液,包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸道外載體包括氯化鈉溶液、任氏葡萄糖(Ringer,sdextrose)、右旋糖和氯化鈉、或乳酸林格(IactatedRinger's)。靜脈內(nèi)注射的載體包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(例如基于任氏葡萄糖的那些)等等。還可以提出的防腐劑和其它添加劑,例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等等。此外,本發(fā)明的組合物可以包括蛋白質(zhì)載體,例如,血清白蛋白或免疫球蛋白,優(yōu)選人來(lái)源的。可以想象,除了本文所定義的雙特異性單鏈抗體之外,由該組合物的使用目的決定,共治療還包括更多的生物活性物質(zhì)。這類物質(zhì)可以是作用于胃腸系統(tǒng)的藥物、作為抗腫瘤物質(zhì)起作用的藥物、化療藥物、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑、防止高尿酸血癥的藥物、抑制免疫反應(yīng)的藥物(例如,皮質(zhì)類固醇)、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的藥物、作用于循環(huán)系統(tǒng)的藥物和/或例如本領(lǐng)域公知的細(xì)胞因子類物質(zhì)。優(yōu)選的,本文定義的雙特異性單鏈抗體是以緩沖液、穩(wěn)定劑和表面活性劑配制。該緩沖液可以是磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或醋酸鹽緩沖液。穩(wěn)定劑可以是氨基酸和/或糖。表面活性劑可以是去污劑、PEG等。更優(yōu)選的,本文定義的雙特異性單鏈抗體是以檸檬酸鹽、賴氨酸、海藻糖和吐溫80配制。作為本發(fā)明藥物組合物的稀釋劑,優(yōu)選等滲鹽水和吐溫80。如本文所使用的,"雙特異性單鏈抗體"指包含兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單個(gè)多肽鏈。如本文所用的每個(gè)"結(jié)合結(jié)構(gòu)域"包含來(lái)自抗體重鏈(VH區(qū))的一個(gè)可變區(qū),其中第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的VH區(qū)特異性結(jié)合所述第一分子,即人CD3分子,并且第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的VH區(qū)特異性結(jié)合人CEA,如以下具體詳述。兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域任選的通過(guò)短的間隔多肽彼此連接,該間隔多肽通常包含5個(gè)氨基酸次序。各個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以另外包含來(lái)自抗體輕鏈("VL區(qū)")的一個(gè)可變區(qū),在每個(gè)第一和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域之內(nèi)的VH區(qū)和VL區(qū)彼此經(jīng)由,例如在EPB1623679中公開和要求的類型實(shí)例的多肽接頭而連接,但是無(wú)論如何應(yīng)該足夠長(zhǎng)以允許第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的VH區(qū)和VL區(qū)以及第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的VH區(qū)和VL區(qū)與笫三者相互匹配,從而共同能夠特異性結(jié)合各自的第一和第二分子。第一或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的V區(qū)的排列可以是VH-VL或VL-VH。優(yōu)選的,特異性結(jié)合人CD3的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的排列是VH-VL,如在以下實(shí)施例所示。預(yù)期的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域可能位于第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的N末端或C末端。因此,本文定義的雙特異性單鏈抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的排列可能是VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3、VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3、VHCD3-VLCD3-VHCEA-VLCEA或VHCD3-VLCD3-VLCEA-VHCEA。優(yōu)選的,所述CD3特異性的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的C末端。更優(yōu)選的,這里定義的雙特異性單鏈抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是以VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3或VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3順序排列。甚至更優(yōu)選的,該排列是VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3。最優(yōu)選雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體A240VL-B9VHxSEQIDNO.77VHVL如在SEQIDNO.34中所定義??稍O(shè)想本文定義的雙特異性單鏈抗體的所述第一和/或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是非人來(lái)源的(即,衍生自非人序列)。例如,所迷第一和/或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以衍生自鼠單克隆抗體。然而,當(dāng)將其施用于人患者時(shí),衍生自鼠抗體的雙特異性單鏈抗體可能被識(shí)別為異物。因此雙特異性單鏈抗體的所述第一和/或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選為人源(即,衍生自人序列)。可以例如通過(guò)基于謹(jǐn)菌體展示的技術(shù)來(lái)鑒定特異性結(jié)合CEA或CD3的這類人結(jié)合結(jié)構(gòu)域。也可設(shè)想第一(或第二)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的VH區(qū)是人VH區(qū),而相應(yīng)的笫一(或第二)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的VL區(qū)可能是非人源。這類結(jié)合結(jié)構(gòu)域也可以被稱為嵌合的雙特異性單鏈抗體?;蛩鼋Y(jié)合結(jié)構(gòu)域之一是非人源的,而另一個(gè)是人源的,產(chǎn)生嵌合的雙特異性單鏈抗體。當(dāng)施用于人患者時(shí),還可以修飾所述第一和/或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域以減少本文所述雙特異性單鏈抗體的免疫原性。例如,至少一條雙特異性單鏈抗體的所述笫一或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是人源化、CDR-移植、嵌合和/或脫免疫的,如以下具體詳述。也可以設(shè)想,連接在第一和/或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域之內(nèi)的VH和VL區(qū)的多狀接頭是脫免疫的。優(yōu)逸的,連接在脫免疫的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CD3特異性)之內(nèi)的VH和VL區(qū)的多肽接頭是脫免疫的多肽接頭,具有序列"GEGTSTGS(G2S)2GGAD"(SEQIDNO.141)。還可以設(shè)想,本文定義雙特異性單鏈抗體的所迷結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或兩個(gè)帶有可以用于例如蛋白質(zhì)表達(dá)、純化、檢測(cè)或富集的所謂的"標(biāo)簽",例如,F(xiàn)lag-標(biāo)簽、c-myc-標(biāo)簽、GST-標(biāo)簽或His-標(biāo)簽.例如,對(duì)于Flag-標(biāo)簽,目前最廣泛^f吏用的親水乂\肽是DYKDDDDK(Chubet和Brizzard,Biotechniques20(1996):136-141),盡管最近研究表明由Ml單克隆抗體可以以幾乎相同的親和力識(shí)別更短的肽DYKD(KnappikA,PluckthunA;Biotechniques17(1994):754-761)。Flag-標(biāo)簽、c-myc-標(biāo)簽、GST-標(biāo)簽、His-標(biāo)簽等可以位于雙特異性單鏈抗體的N末端或C末端,例如,標(biāo)簽-VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3或VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3—標(biāo)簽。在技術(shù)中詳迷了這類用于表達(dá)、檢測(cè)或純化目的的標(biāo)簽的來(lái)源和特征,見(jiàn),例如Lichty,ProteinExprPurif.41(2005),98-105。如本文所用,術(shù)語(yǔ)"單鏈Fv"或"scFv"指包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗體片段,其中這些結(jié)構(gòu)域在單個(gè)多肽鏈中存在??勺兘Y(jié)構(gòu)域可以以順序VH-VL或VL-VH排列。通常,F(xiàn)v多肽還包含在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭,其使scFv能夠形成抗原結(jié)合所期望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFV的綜述,見(jiàn)Pluckthun在單克隆抗體的藥理學(xué),第113巻,Rosenburg和Moore編輯Springer-Verlag,NewYork,笫269-315頁(yè)(1994)。在特異性的實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及從本文所述的雙特異性單鏈抗體衍生的抗-CEA.scFv。根據(jù)本發(fā)明,在用于具有Ig-衍生的抗原-相互作用時(shí),術(shù)語(yǔ)"結(jié)合結(jié)構(gòu)域"或"可變區(qū)"包含多肽的片段和衍生物,其至少包括衍生自抗體、抗體片段或其衍生物的一個(gè)CDR。由本發(fā)明可以設(shè)想,特異性結(jié)合本文所定義的雙特異性單鏈抗體的人CEA的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括至少一個(gè)CDR,優(yōu)選CDR-H3,更優(yōu)選鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的部分,具有氨基酸序列"FYFDY"(SEQIDNO.112),分別對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置100、100a、100b、101和102;甚至更優(yōu)選具有氨基餅列"DXAXAFYFDY"(SEQIDNO.65),其中'%,,、"X2"、"X3"或"X4"代表任意氨基酸殘基,并且氨基酸殘基"D"對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置95,且氨基酸殘基"FYFDY"分別對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置100、100a、100b、101和102??稍O(shè)想,"Xi"、"X2"、"X3"或"X4"分別對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置96("X,")、97("X2")、98("乂3")和99("X4"),代表氨基酸殘基"R,,(精氨酸)、"G"(甘氨酸)、"L"(亮氨酸)、"Y"(酪氨酸)、"A,,(丙氨酸)、"D,,(天冬氨酸)、"S,,(絲氨酸)、"W"(色氨酸)、"F,,(苯丙氨酸)或"T"(蘇氨酸)。這里,本發(fā)明的范圍內(nèi)排除"Xr,、"X2"、"X3"和"X4"代表相同的氨基酸,例如"X,、"X2"、"X3"和"X4,,都是"F"(苯丙氨酸)。優(yōu)選的,"X,"代表"R"(精氨酸)、"F,,(苯丙氨酸)、"M"(甲硫氨酸)、"E"(谷氨酸)、或"T"(蘇氨酸);"X2,,代表"G"(甘氨酸)、"Y"(酪氨酸)、"A"(丙氨酸)、"D"(天冬氨酸)、或"S,,(絲氨酸);"X3,,代表"L,,(亮氨酸)、"F"(苯丙氨酸)、"M,,(甲硫氨酸)、"E,,(谷氨酸)、或"T"(蘇氨酸);和"X4,,代表"R"(精氨酸)、"Y,,(酪氨酸)、"A"(丙氨酸)、"D,,(天冬氨酸)、或"S"(絲氨酸)?;蜃顑?yōu)選本文定義的雙特異性單鏈抗體的特異性結(jié)合人CEA的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含完整的A5B7的CDR-H3,具有氨基酸序列"DRGLRFYFDY"(SEQIDNO.66)對(duì)應(yīng)于A5B7的CDR-H3的Kabat位置95-102。如在下列實(shí)施例中所示,關(guān)于本文定義的雙特異性單鏈抗體(包舍在與CEA相互作用的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域中所述單克隆抗體A5B7-衍生的CDR-H3"DRGLRFYFDY"(SEQIDNO.66)氨基酸序歹')對(duì)肺瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性是對(duì)可溶CEA耐藥的,因此使能夠治療在其血漿中具有高血清CEA濃度的胂瘤患者。CDR的確定是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的,見(jiàn)例如h"D:〃www.bioinf.or2.uk/abs/#cdrid??梢岳绮鹏迵?jù)本4頁(yè)域4支術(shù)所述Kabat編號(hào)方案執(zhí)行抗體中的氨基酸序列編號(hào),見(jiàn)例如,Kabat,E.A.,T,T.Wu,H.M.Perry,K.S.Gottesman和CFoeller.1991.SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版編輯.Bethesda,Md.:NationalCenterforBiotechnologyInformation,NationalLibraryofMedicine。最優(yōu)選并且如在所附實(shí)施例中記錄的,在本發(fā)明的藥物組合物中使用的"雙特異性單鏈抗體,,是具有脫免疫的抗-CD3結(jié)合結(jié)構(gòu)域(WO2005/040220)和人抗-CEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雙特異性單鏈Fv(scFv),至少包含氨基酸序列"DRGLRFYFDY"對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置95-102(SEQIDNO.66)。雙特異性單鏈分子是本領(lǐng)域公知的,并且描述于,例如WO99/54440或Mack,PNAS,(1995),92,7021-7025。根據(jù)本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)"單鏈,,意指所述雙特異性單鏈構(gòu)建體的第一和第二結(jié)構(gòu)域是共價(jià)連接的,優(yōu)選以能夠由單個(gè)核酸分子編碼的共線性氨基酸序列的形式。如本文所用,"人,,指智人(好o附o仰/;i'e朋)物種。"人"分子,例如人CEA或人CD3(CD3s),因此是在智人中天然表達(dá)的分子的變體。本文使用的術(shù)語(yǔ)"上皮腫瘤"指CEA陽(yáng)性的上皮來(lái)源的腫瘤(CancerMedicine;第6版;Kufe,DonaldW.;Pollock,RaphaelE.;Weichselbaum,RalphR.;Bast,RobertC"Jr.;Gansler,TedS.;Holland,JamesF.;FreiIII,Emil編豐專.Hamilton(Canada):BCDeckerInc.2003;http:〃www.dkfz.de;http:〃www.krebsinformationsdienst.de/Krebsarten/index.htinl)。要治療的上皮腫瘤可以是胃腸道腺癌、乳腺癌或肺腺癌。所述胃腸道腺癌優(yōu)選是結(jié)直腸、胰腺、食道或胃腺的腺癌。如本文提出的,本發(fā)明的藥物組合物尤其適于治療具有進(jìn)行性腫瘤、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)癌癥、晚期上皮腫瘤、高上皮腫瘤負(fù)荷/腫瘤負(fù)擔(dān)的患者、或具有CEA血清濃度高于100ng/ml(例如,通過(guò)ELISA測(cè)定)的腫瘤患者,其特征為在胂瘤患者的血漿中高水平的可溶CEA抗原。在原發(fā)腫瘤的手術(shù)移除之后使用所述藥物組合物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如,從產(chǎn)生CEA的上皮腫瘤衍生的彌散的殘余肺瘤細(xì)胞也脫落CEA進(jìn)入其微環(huán)境。因此,在這些胂瘤細(xì)胞的周圍可溶CEA的水平也很高。因此,本發(fā)明的藥物組合物的細(xì)胞毒活性對(duì)可溶CEA的抗性對(duì)于治療微小殘留疾病也是有利的。設(shè)想可以在一個(gè)期間內(nèi)施用所述藥物組合物,在該期間內(nèi)血清CEA水平降低(由于移除了CEA來(lái)源,即原發(fā)腫瘤),以殺死殘余的腫瘤細(xì)胞。該藥物組合物也可用于原發(fā)腫瘤的移除之后,在此情況下由于繼發(fā)性肺瘤的形成或遷移,血清CEA水平增加??梢岳缤ㄟ^(guò)CEAELISA測(cè)定(見(jiàn)例如IBLCEAEIA,IBLHamburg,德國(guó))確定CEA血清濃度。如上所述,在許多基于抗體的治療方法中,所述血清CEA抑制抗體與腫瘤細(xì)胞上膜結(jié)合的CEA的結(jié)合,并且阻斷抗體的活性,由此阻礙抗腫瘤治療的成功。如本文所用,術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"或相關(guān)的表達(dá),例如"特異的結(jié)合"或"與/對(duì)..特異性反應(yīng)活性"等指本文定義的雙特異性單鏈抗體的第一和/或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域分辨各自第一和/或第二分子至某程度的能力,從而在來(lái)自作為可能的結(jié)合配偶體的多種不同分子的庫(kù)中,僅所述各自的第一和/或第二分子被結(jié)合,或被顯著的結(jié)合。可以例如在Biacore儀器上,通過(guò)ELISA、FACS分析等常規(guī)的執(zhí)行這類結(jié)合的測(cè)量。更明確的,本文定義的雙特異性單鏈抗體的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合于人CD3,優(yōu)選人CD3s。本文定義的雙特異性單鏈抗體的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合于上皮腫瘤抗原,即人CEA(癌胚抗原、癌胚抗原相關(guān)的細(xì)胞黏附分子5、CEACAM5、CD66e),如下所述。術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"意指根據(jù)本發(fā)明雙特異性的單鏈抗體分子能夠特異性的與本文定義的各個(gè)人靶標(biāo)分子的至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)或甚至更多氨基酸相互作用,和/或結(jié)合本文定義的各個(gè)人靶標(biāo)分子的至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)或甚至更多氨基酸。所述術(shù)語(yǔ)涉及該抗體分子的特異性,即其能夠辨別本文所定義的人靶標(biāo)分子的特異性區(qū)域的能力??乖嗷プ饔梦稽c(diǎn)與其特異性抗原的特異性相互作用可能導(dǎo)致信號(hào)的起始,例如由于誘導(dǎo)抗原構(gòu)象的改變、抗原的寡聚化等等。此外,所述結(jié)合可以通過(guò)"鑰匙-鎖-原則,,示例。因此,在抗原相互作用位點(diǎn)的氨基,列中的特異性基序與抗原彼此結(jié)合,其為它們的初級(jí)、二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)以及所述結(jié)構(gòu)的二級(jí)修飾的結(jié)果??乖嗷プ饔梦稽c(diǎn)與其特異性抗原的特異性相互作用可能還導(dǎo)致所述位點(diǎn)與抗原的結(jié)合。抗體的"特異性結(jié)合"主要由兩個(gè)參數(shù)來(lái)表征定性參數(shù)(結(jié)合表位、或抗體結(jié)合位置)和定量參數(shù)(結(jié)合親和力,或其結(jié)合處有多強(qiáng))。最好可以通過(guò)例如已知的FACS方法、肽點(diǎn)表位作圖(peptide-spotepitopemapping)、質(zhì)譜法或肽ELISA測(cè)定由抗體結(jié)合的該表位。最好通過(guò)例如公知的Biacore和/或ELISA方法測(cè)定抗體與特定表位結(jié)合的強(qiáng)度。這類技術(shù)的組合允許將信噪比率作為結(jié)合特異性的代表性測(cè)量計(jì)算。在這樣的信噪比率中,信號(hào)代表抗體結(jié)合至目的表位的強(qiáng)度,而噪音代表抗體與其它與目的表位不同的無(wú)關(guān)表位結(jié)合的強(qiáng)度。優(yōu)選的,對(duì)于目的表位的信噪比率高于對(duì)與目的表位不同的其它表位約50倍可以認(rèn)為表明評(píng)估的抗體以特異性方式結(jié)合至目的表位,即是"特異性結(jié)合"。根據(jù)本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"或"特異性相互作用"意指該雙特異性單鏈構(gòu)建體不與或基本不與相似結(jié)構(gòu)的多肽交叉反應(yīng)??梢詼y(cè)試待研究的一組雙特異性單鏈構(gòu)建體的交叉反應(yīng)性,例如通過(guò)評(píng)估在常規(guī)條件下(見(jiàn),例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988andUsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1999)所述組的雙特異性單鏈構(gòu)建體與目的多肽以及許多大致上(結(jié)構(gòu)和/或功能)近似相關(guān)的多肽的結(jié)合進(jìn)行。例如,在本發(fā)明范圍內(nèi),本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合人CEA(癌胚抗原;CEACAM5;CEA;CD66e)即同時(shí)結(jié)合可溶CEA抗原和結(jié)合膜結(jié)合的CEA,而結(jié)合至其它CEA家族成員,例如膽汁糖蛋白(CEACAM1;BGP1;TM-CEA;CD66a)的雙特異性抗體被排除在所述范圍之外??乖嗷プ饔梦稽c(diǎn)與特異性抗原的特異性相互作用的實(shí)例包括配體對(duì)其受體的特異性。所述定義特別包括配體的相互作用,一旦當(dāng)其結(jié)合至特異性受體時(shí)誘導(dǎo)信號(hào)。相應(yīng)配體的實(shí)例包括細(xì)胞因子,其相互作用/結(jié)合至它們的特異性細(xì)胞因子受體。所述定義還特別包括抗原相互作用位點(diǎn)與抗原(例如,選擇素家族、整合蛋白和生長(zhǎng)因子,例如EGF家族的抗原)的結(jié)合。所述相互作用的另一實(shí)例,其也特別包含在所述定義之內(nèi),是抗原決定簇(表位)與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的相互作用。術(shù)語(yǔ)"結(jié)合/相互作用"也可以是關(guān)于構(gòu)象表位、結(jié)構(gòu)表位或由人靶標(biāo)分子或其部分的兩個(gè)區(qū)組成的非連續(xù)表位。在本發(fā)明的情況下,構(gòu)象表位被定義為以基本序列分離的兩個(gè)或多個(gè)不連續(xù)的氨基^列,當(dāng)多肽折疊為天然蛋白質(zhì)時(shí),它們一起在分子表面出現(xiàn)(Sela,(1969)Science166,1365和Laver,(19卯)Cell61,553-6)。術(shù)語(yǔ)"不連續(xù)的表位,,意指在本發(fā)明中非線性的表位,其由來(lái)自多肽鏈遠(yuǎn)距離部分的殘基組合。當(dāng)多肽鏈折疊成為三維結(jié)構(gòu)以構(gòu)成構(gòu)象/結(jié)構(gòu)表位時(shí),這些殘基一起出現(xiàn)在分子表面。本文使用的"CD3"指作為多分子T細(xì)胞受體復(fù)合物的部分在T細(xì)胞表達(dá)的抗原,并且其由至少5個(gè)不同的鏈組成,CD3-Y、-&、-s、-;和-il。CD3在T細(xì)胞上的聚簇(例如,通過(guò)固定抗-CD3抗體)導(dǎo)致的T細(xì)胞激活與T細(xì)胞受體的銜接相似,而與其克隆類型特異性無(wú)關(guān)。實(shí)際上,大多數(shù)抗-CD3抗體識(shí)別CD3s鏈。人CD3s的氨基酸序列在基因庫(kù)登錄號(hào)NM—000733中描述,并且包含SEQIDNO.111。"CEA"指癌胚抗原(癌胚抗原相關(guān)的細(xì)胞黏附分子5;CEACAM5;CEA;CD66e),該抗原在大量上皮來(lái)源的腫瘤中表達(dá)(Hammarstr8m,Sem.CancerBiol.9(1999),67-81;Shively和BeattyCRCCrit.Rev.Oncol.Hematol.2(1985),355-399)。人CEA的氨基酸序列在基因庫(kù)登錄號(hào)NM—004363中描述并且包含SEQIDNO.76。在本發(fā)明中已經(jīng)令人驚奇的發(fā)現(xiàn)可能產(chǎn)生對(duì)人CD3和人CEA具有特異性的基于抗體的治療,其中針對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性對(duì)甚至高濃度的可溶CEA抗原是有抗性的??紤]到本發(fā)明的雙特異性單鏈抗體結(jié)合可溶CEA抗原這一事實(shí),這一發(fā)現(xiàn)是完全未預(yù)料的。然而,如本文定義的雙特異性單鏈抗體在其針對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性上對(duì)甚至高水平的可溶CEA存在完全有抗性。例如,當(dāng)已經(jīng)產(chǎn)生來(lái)自單克隆抗體T84.66或MFE-23的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體時(shí),這些抗體對(duì)可溶CEA抗體高度敏感,即,當(dāng)存在可溶CEA抗原時(shí),其細(xì)胞毒活性凈支阻斷。所述構(gòu)建體的細(xì)胞毒活性受到可溶CEA的抑制不能通過(guò)增加抗體的量來(lái)克服。還發(fā)現(xiàn)這些構(gòu)建體能夠結(jié)合可溶CEA??紤]于此,推斷出可溶CEA抗原阻止抗體行使其細(xì)胞毒活性。相反,如本文定義的雙特異性單鏈抗體在其針對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性方面對(duì)甚至高水平的可溶CEA的存在具有完全的抗性。而且,由于其高細(xì)胞毒活性,本文定義的所述雙特異性構(gòu)建體在甚至低濃度呈現(xiàn)其生物活性。因此,如本文定義的包含雙特異性單鏈抗體的低量的藥物組合物足以在上皮腫瘤患者中獲得治療效果,所述患者表征為在其血清/血漿中的高可溶CEA濃度。在上皮腫瘤患者血清/血漿中的高可溶CEA濃度是進(jìn)行性、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或晚期腫瘤和具有高腫瘤負(fù)荷患者的特征。甚至更驚奇的是,已經(jīng)發(fā)現(xiàn),當(dāng)用在抗-CEAx抗-CD3雙特異性單鏈抗體的人CEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即特異性結(jié)合人CEA的人結(jié)合結(jié)構(gòu)域)時(shí),對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置95-102的氨基酸序列"DRGLRFYFDY"(SEQIDNO.66)足以介導(dǎo)對(duì)可溶CEA抗體的抗性。由于他們是人源的,所述構(gòu)建體當(dāng)施用于人腫瘤患者時(shí)是低的或無(wú)免疫原性的。總之,包含本文定義的雙特異性單鏈抗體的藥物組合物特別適用于治療在其血漿中具有高度可溶CEA濃度的上皮腫瘤患者,如在例如進(jìn)行性腫瘤、癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、具有高腫瘤負(fù)荷/負(fù)擔(dān)或晚期腫瘤的患者中觀察到的。在本發(fā)明的藥物組合物的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中,本文定義的雙特異性單鏈抗體的CD3特異性的所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的C末端。在本發(fā)明的范圍內(nèi)及其全部實(shí)施方案中,在單個(gè)多肽鏈的第一和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的安排順序上,即在本文定義的雙特異性單鏈抗體的內(nèi)部,是有關(guān)系的。設(shè)想本文定義的雙特異性單鏈抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的排列可以是VHcEA"VLcEA-VHcD3-VL(CD3、VLcEA-VHcEA-VHcD3誦VLcD3、VHCD3-VLCD3-VHCEA-VLCEA或VHCD3-VLCD3-VLCEA-VHCEA。如在以下實(shí)施例中所示,當(dāng)?shù)谝唤Y(jié)合結(jié)構(gòu)域(特異性結(jié)合于CD3)位于第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的C末端時(shí),即比第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域更接近于雙特異性單鏈抗體的C末端時(shí),特別能夠?qū)崿F(xiàn)以上所述的優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)選特異性結(jié)合于人CD3的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域是以VH-VL方向排列。例如,本文定義的雙特異性單鏈抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以以VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3或VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3的順序排列。如本文使用的,"在N末端,,或"在C末端"及其語(yǔ)法變體涉及在主要氨基酸序列之內(nèi)的有關(guān)位置而非放置在雙特異性單鏈抗體的絕對(duì)的N-或C-末端。因此,作為非限定性實(shí)例,"位于第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的C末端,,的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域僅表示第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域是位于雙特異性單鏈抗體內(nèi)第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的羧基側(cè),并且不排除額外序列(例如以上提出的標(biāo)簽,或另一蛋白質(zhì)的或非蛋白質(zhì)的化合物,例如放射性同位素)位于雙特異性單鏈抗體的最終C末端的可能。優(yōu)選的,本文定義的雙特異性單鏈抗體的所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域以VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3或VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3順序排列。甚至更優(yōu)選該排列為VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3。最優(yōu)選的是如在SEQIDNO.34定義的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體A240VL-B9VHxSEQIDNO.77VHVL。優(yōu)選特異性結(jié)合至本文定義的雙特異性單鏈抗體的人CEA的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)CDR,優(yōu)選CDR-H3,更優(yōu)選鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的部分,具有氨基酸序列"FYFDY"(SEQIDNO.112),分別對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置100、100a、100b、101和102;甚至更優(yōu)選具有氨基,列"DX!X2X3X4FYFDY"(SEQIDNO.65),其中"Xr、"X2"、"X3"或"X4"代表任意氨基酸殘基,并且氨基酸殘基"D"對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置95,且氨基酸殘基"FYFDY"分別對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置100、100a、100b、101和102。這里,'%,,、"X2"、"乂3,,和"乂4,,分別對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置96("X,,,)、97("X2")、98("X3")和99("X4")??稍O(shè)想,"X,、"X2"、"X3,,或"X4"代表氨基酸殘基"R"(精氨酸)、"G,,(甘氨酸)、"L"(亮氨酸)、"Y,,(酪氨酸)、"A"(丙氨酸)、"D"(天冬氨酸)、"S"(絲氨酸)、"W"(色氨酸)、"F"(苯丙氨酸)或"T"(蘇氨酸)。這里,本發(fā)明的權(quán)利要求范圍不包括"X,","X2","X3"和"X4"代表相同的氨基酸,例如"Xr,、"X2,,、"X3"和"X4"都是"F"(苯丙氨酸)。優(yōu)選的,代表"R,,(精氨酸)、"F"(苯丙氨酸)、"M"(甲硫氨酸)、"E"(谷氨酸)或"T"(蘇氨酸);"X2,,代表"G"(甘氨酸)、"Y"(酪氨酸)、"A"(丙氨酸)、"D,,(天冬氨酸)或"S"(絲氨酸);"X3"代表"L"(亮氨酸)、"F"(苯丙氨酸)、"M"(甲硫氨酸)、"E,,(谷氨酸)或"T"(蘇氨酸);和"X4,,代表"R,,(精氨酸)、"Y,,(酪氨酸)、"A,,(丙氨酸)、"D"(天冬氨酸)或"S"(絲氨酸)。甚至更優(yōu)選對(duì)人CEA特異的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域至少包含單克隆抗體A5B7的CDR-H3的氨基酸序列"RFYFDY,,(SEQIDNO.113)、"LRFYFDY,,(SEQIDNO.114)、"GLRFYFDY,,(SEQIDNO.115)或"RGLRFYFDY,,(SEQIDNO.116)。最優(yōu)選的是A5B7的完整CDR-H3,具有氨基酸序列"DRGLRFYFDY"(SEQIDN0.66)分別對(duì)應(yīng)于Kabat位置95("D",天冬氨酸)、96("R";精氨酸)、97("G";甘氨酸)、98("L";亮氨酸)、99("R,,;精氨酸)、100("F";苯丙氨酸)、100a("Y";酪氨酸)、100b("F";苯丙氨酸)、101("D";天冬氨酸)和102("Y";酪氨酸)。根據(jù)Kabat系統(tǒng)的編號(hào)可以執(zhí)行例如在Kabat,E.A"T.T.Wu,H.M.Perry,K.S.Gottesman和C.Foeller.1991.SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版編輯.Bethesda,Md.:NationalCenterforBiotechnologyInformation,NationalLibraryofMedicine。如在下列實(shí)施例中所示,本文定義的雙特異性單鏈抗體針對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(包括在與CEA相互作用的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的所述mAbA5B7-衍生的CDR-H3"DRGLRFYFDY"(SEQIDNO.66)氨基酸序列)是對(duì)可溶CEA抗原有抗性的,由此允許治療在其血漿中有高血清CEA濃度的腫瘤患者??善谕嘈揎椷@一A5B7-衍生的"DRGLRFYFDY"CDR-H3氨基酸序列,例如為了提高對(duì)CEA靶標(biāo)抗原(在上皮腫瘤細(xì)胞上)的親和力和/或?yàn)榱藘?yōu)化本文定義的雙特異性單鏈抗體的"細(xì)^L的特異性"。為此目的,在氨基酸序列"DXiXzXAaFYFDY"(SEQIDNO.65)中,可以測(cè)定在位置"X,"、"X2"、"X3"和/或"X4"(分別對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置96("X1")、97("X2")、98("X3")和99("X4"))的多個(gè)氨基酸殘基以鑒定具有改良的親和力和/或細(xì)微特異性的修飾的CDR-H3。例如,"X,"、"X2,,、"X3"或"X4"可以代表氨基酸殘基"R"(精氨酸)、"G"(甘氨酸)、"L,,(亮氨酸)、"Y,,(酪氨酸)、"A,,(丙氨酸)、"D,,(天冬氨酸)、"S,,(絲氨酸)、"W"(色氨酸)、"F,,(苯丙氨酸)或"T"(蘇氨酸)。這里,與CDR-H3"DRGLRFYFDY"(SEQIDNO.66)氨基酸序列中在Kabat位置96-99的原始"RGLR,,氦基酸序列相比,可以交換以"X,,位置表示的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或全部四個(gè)。然而,本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍不包括"xr,、"X2"、"X3,,和"X4"代表相同的氨基酸,例如"X,"、"X2"、"X3"和"X4"都是"F"(苯丙氨酸)。可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)獲得A5B7-衍生的"DRGLRFYFDY"CDR-H3氨基酸序列的上述修飾,例如使用隨機(jī)化引物的PCR,其允許產(chǎn)生在CEA-結(jié)合的結(jié)構(gòu)域中具有這樣的修飾的CDR-H3區(qū)的雙特異性單鏈抗體??梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域所迷技術(shù),例如通過(guò)ELISA、Biacore或FACS分析測(cè)定這些修飾的雙特異性單鏈抗體的親和力或細(xì)樣l特異性??梢栽谠黾恿康目扇蹸EA的存在下,在細(xì)胞毒測(cè)定中測(cè)試具有這樣的修飾的CDR-H3的雙特異性單鏈抗體對(duì)可溶CEA抗原的抗性,如在下列實(shí)施例中所述。更優(yōu)選的,本文定義的對(duì)人CEA特異性的雙特異性單鏈抗體的所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO.65或66和/或CDR-H1(具有M酸序列"SYWMH"(SEQIDNO.68))和/或CDR-H2(具有氨基酸序列"FIRNKANGGTTEYAASVKG"(SEQIDNO.67)或"FILNKANGGTTEYAASVKG,,(SEQIDNO.145))。因此,對(duì)人CEA特異性的本文定義的雙特異性單鏈抗體的所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含以上定義的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)CDR-H區(qū)?;蛘?,對(duì)人CEA特異性的本文定義的雙特異性單鏈抗體的所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO.65或66和/或CDR-H1(具有氨基酸序列"TYAMH"(SEQIDNO.70))和/或CDR-H2(具有氨基酸序列"LISNDGSNKYYADSVKG,,(SEQIDNO.69))。因此,可選擇的,對(duì)人CEA特異性的本文定義的雙特異性單鏈抗體的所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含如上定義的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)CDR-H區(qū)。甚至更優(yōu)選的,對(duì)人CEA特異性的本文定義的雙特異性單鏈抗體的所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域除了以上描述的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)CDR-H區(qū)之外包含CDR-Ll(具有氨基酸序列"TLRRGINVGAYSIY,,(SEQIDNO.73))和/或CDR-L2(具有氨基酸序列"YKSDSDKQQGS,,(SEQIDNO.72))和/或CDR-L3(具有氨基,列"MIWHSGASAV"(SEQIDNO.71))。對(duì)人CEA特異性的本文定義的雙特異性單鏈抗體的所迷第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域VH區(qū)的氨基酸序列優(yōu)選是SEQIDNO.60,包含對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR國(guó)H3的Kabat位置95—102的"DRGLRFYFDY"(SEQIDNO.66)、和具有氨基,列"SYWMH"(SEQIDNO.68)的CDR-H1、和具有氨基酸序列"FIRNKANGGTTEYAASVKG"(SEQIDNO.67)的CDR-H2。本文定義的雙特異性單鏈抗體的對(duì)人CEA特異性的所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域VH區(qū)的氨基酸序列優(yōu)選是SEQIDNO.146,包含對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置95-102的"DRGLRFYFDY"(SEQIDNO.66)、和具有氨基斷列"SYWMH"(SEQIDNO.68)的CDR-H1、和具有氨基酸序列"FILNKANGGTTEYAASVKG"(SEQIDNO.145)的CDR-H2。對(duì)人CEA特異性的本文定義的雙特異性單鏈抗體的所述笫二結(jié)合結(jié)構(gòu)域VH區(qū)的氨基酸序列優(yōu)選SEQIDNO.58或SEQIDNO.62,包含對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置95-102的"DRGLRFYFDY"(SEQIDNO.66)、和具有氨基紗列"TYAMH,,(SEQIDNO.70)的CDR-H1、和具有氨基酸序列"LISNDGSNKYYADSVKG,,(SEQIDNO.69)的CDR-H2。對(duì)人CEA特異性的本文定義的雙特異性單鏈抗體的所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域VL區(qū)的氨基酸序列優(yōu)選SEQIDNO.64,包含具有氨基酸序列"TLRRGINVGAYSIY,,(SEQIDNO.73)的CDR-L1、和具有氨基紗列"YKSDSDKQQGS"(SEQIDNO.72)的CDR-L2、和具有氨基酸序列"MIWHSGASAV,,(SEQIDNO.71)的CDR-L3。如上所述,特異性結(jié)合CEA的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)的次序或排列可以是VH-VL或VL-VH。兩種排列都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。對(duì)于包含SEQII)NO.60的VH和SEQIDNO.64的VL的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域,在SEQIDNO.52中顯示VH-VL排列,而在SEQIDNO.122中描述VL-VH的排列。對(duì)于包含SEQIDNO.146的VH和SEQIDNO.64的VL的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域,在SEQIDNO.147中顯示VH-VL排列。對(duì)于包含SEQIDNO.58的VH和SEQIDNO.64的VL的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域,在SEQIDNO50顯示VH-VL排列,而在SEQIDNO.120中顯示VL-VH排列。對(duì)于包含SEQIDNO.62的VH和SEQIDNO.64的VL的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域,在SEQIDNO54顯示VH-VL排列,而在SEQIDNO.124中顯示VL-VH排列。對(duì)于包含SEQIDNO.56的VH和SEQIDNO.64的VL的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域,在SEQIDNO48顯示VH-VL排列,而在SEQIDNO.118中顯示VL-VH排列。甚至更優(yōu)選的,本文定義的雙特異性單鏈抗體對(duì)人CEA特異性的笫二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的V區(qū)是選自以下組成的組(a)由在SEQIDNO.60中所示氨基酸序列組成的VH區(qū)和在SEQIDNO.64中所示氨基酸序列組成的VL區(qū);(b)由在SEQIDNO.146中所示氨基酸序列組成的VH區(qū)和在SEQIDNO.64中所示氨基酸序列組成的VL區(qū);(c)由在SEQIDNO.58中所示氨基酸序列組成的VH區(qū)和在SEQIDNO.64中所示氨基酸序列組成的VL區(qū);(d)由在SEQIDNO.62中所示氨基酸序列組成的VH區(qū)和在SEQIDN0.64中所示氨基酸序列組成的VL區(qū);和(e)由在SEQIDNO.56中所示#^酸序列組成的VH區(qū)和在SEQIDNO.64中所示氨基酸序列組成的VL區(qū)。最優(yōu)選的,所述雙特異性單鏈抗體包含的氨基酸序列選自以下組成的組(a)如在SEQIDNO.6、8、16、18、24、26、32、34、40、42、126、130、134或143的任意中描述氨基酸序列;(b)由在SEQIDNO.5、7、15、17、23、25、31、33、39、41、125、129、133或142所示核酸序列編碼的氨基酸序列;(c)由核酸序列編碼的氨基酸序列,所述核酸序列在嚴(yán)格條件下與(b)的互補(bǔ)核酸序列雜交;(d)由核酸序列編碼的氨基酸序列,所述核酸序列是作為(b)的核苷酸序列遺傳密碼的簡(jiǎn)并結(jié)果;和(e)氨基酸序列,其與(a)或(b)的^J^酸序列具有至少S50/。的同一性,更優(yōu)選至少90%的同一性,最優(yōu)選至少95%的同一性。在本發(fā)明的藥物組合物的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中,治療的所述上皮腫瘤是胃腸道腺瘤、乳腺瘤或肺腺瘤。所述胃腸道腺瘤優(yōu)選是結(jié)直腸、胰腺、食管或胃的腺瘤。更優(yōu)選的,本發(fā)明的所述藥物組合物是用于治療進(jìn)行性腫瘤、晚期腫瘤、具有高腫瘤負(fù)荷/負(fù)擔(dān)的腫瘤患者、遷移腫瘤或具有CEA血清濃度高于100ng/ml的腫瘤患者。所述CEA血清濃度可以通過(guò)ELISA來(lái)確定。在本發(fā)明的藥物組合物的更多優(yōu)選的實(shí)施方案中,本文定義的雙特異性單鏈抗體的所述第一或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)是嵌合的、人源化的、CDR-移植的、和/或脫免疫的或人的。本文所用的術(shù)語(yǔ)"嵌合"已經(jīng)定義如上。術(shù)語(yǔ)"人"結(jié)合結(jié)構(gòu)域,例如本文使用的特異性結(jié)合于人CEA的人結(jié)合結(jié)構(gòu)域應(yīng)該理解為意指本文定義的雙特異性單鏈抗體包含在人種系抗體鐠或抗體傳中含有的氨基^列,至少具有氨基酸序列"FYFDY",對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的或如上定義的A5B7-衍生的CDR-H3的Kabat位置100、100a、100b、101和102(SEQIDNO.11"。如果由它的(它們的)最接近的人種系序列通過(guò)預(yù)期內(nèi)的由于體細(xì)胞高度突變特征衍生的序列組成,本文定義的雙特異性單鏈抗體也可以認(rèn)為是人的。此外,許多非人哺乳動(dòng)物,例如,嚙齒類(例如小鼠和大鼠)的抗體包含VHCDR氨基酸序列,其可以期望也在表達(dá)的人抗體鐠中存在。任何這樣的人或非人源的序列(其可以預(yù)期在表達(dá)的人鐠存在)出于本發(fā)明的目的也被認(rèn)為是"人的"。如本文所用,術(shù)語(yǔ)"人源化的"、"人源化,,或"類人的"可交換的使用,用來(lái)指雙特異性單鏈抗體,在其至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包含至少一個(gè)來(lái)自非人抗體或其片段的互補(bǔ)性決定區(qū)("CDR")。在例如WO91/09968和US6,407,213中描述了人源化的方法。作為非限定的實(shí)例,該術(shù)語(yǔ)包括這樣的情況,其中至少一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)包含來(lái)自另一非人動(dòng)物(例如,嚙齒類)的單個(gè)的CDR區(qū)(例如VH的第三CDR區(qū)),以及這樣的情況,其中一個(gè)或兩個(gè)可變區(qū)包含它們各自的第一、第二和第三CDR,該CDR來(lái)自所述非人動(dòng)物。在該事件中,雙特異性單鏈抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的全部CDR已經(jīng)由其相應(yīng)的來(lái)自例如,嚙齒類的等價(jià)物代替,一個(gè)代表性的說(shuō)法為"CDR-移植",且這一術(shù)語(yǔ)應(yīng)該理解為包括在術(shù)語(yǔ)"人源化"或本文使用的與其語(yǔ)法相關(guān)的變體中。術(shù)語(yǔ)"人源化"或其語(yǔ)法相關(guān)的變體也包括這樣的情況,其中,除了在第一和/或笫二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的VH和/或VL內(nèi)一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的替代,在CDR之間構(gòu)架("FR")區(qū)內(nèi)至少一個(gè)單個(gè)的氨基酸殘基的更多突變(例如,置換)已經(jīng)起作用從而使在那個(gè)/那些位置的氨基酸(對(duì)應(yīng)于在來(lái)自替代的CDR區(qū)動(dòng)物的那個(gè)/那些位置的氨基酸)得到衍生。如本領(lǐng)域^^知的,通常在CDR-移植后在構(gòu)架區(qū)產(chǎn)生這樣的單個(gè)突變,從而儲(chǔ)存該非人抗體用作其靶標(biāo)分子的CDR-供體的原始結(jié)合親和力。除了如上所述在構(gòu)架中的氨基酸替代,術(shù)語(yǔ)"人源化"還可以包括將來(lái)自非人動(dòng)物的CDR區(qū)氨基酸替代為來(lái)自人抗體的相應(yīng)CDR區(qū)的氨基酸。如本文所用,術(shù)語(yǔ)"脫免疫的"或"脫免疫"指相對(duì)于原始野生型構(gòu)建體對(duì)第一和/或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的修飾,通過(guò)該修飾使所述野生型構(gòu)建體在人中無(wú)免疫原性或較少免疫原性。脫免疫方法顯示在,例如WO00/34317、WO98/52976、WO02/079415或WO92/10755。術(shù)i吾"脫免疫,,也涉及構(gòu)建體,其顯示減少的產(chǎn)生T細(xì)胞表位的傾向。根據(jù)本發(fā)明,術(shù)語(yǔ)"減少的產(chǎn)生T細(xì)胞表位的傾向,,涉及除去導(dǎo)致特異性T細(xì)胞激活的T細(xì)胞表位。此外,"減少的產(chǎn)生T細(xì)胞表位的傾向"意指對(duì)有助于形成T細(xì)胞表位的氨基酸的替代,即,對(duì)于T細(xì)胞表位的形成是必須的氨基酸的替代。換言之,"減少的產(chǎn)生T細(xì)胞表位的傾向"涉及減少的免疫原性或減少的誘導(dǎo)抗原依賴的T細(xì)胞增殖的能力。術(shù)語(yǔ)"T細(xì)胞表位"涉及短肽序列,其可以在細(xì)胞內(nèi)的肽、多肽或蛋白質(zhì)的降解過(guò)程中被釋,放,并且隨即由主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的分子呈遞以誘發(fā)T細(xì)胞的激活;尤其見(jiàn)WO02/066514。對(duì)于由MHC類型II呈遞的肽,這樣的T細(xì)胞激活可以通過(guò)直接刺激T細(xì)胞以產(chǎn)生所述抗體來(lái)產(chǎn)生抗體應(yīng)答。可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)來(lái)測(cè)量"減少的產(chǎn)生T細(xì)胞表位的傾向"和/或"脫免疫"。優(yōu)選的,可以在體外通過(guò)T細(xì)胞增殖測(cè)定來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)的脫免疫。在這一測(cè)定中,篩選來(lái)自捐獻(xiàn)人的PBMC應(yīng)答野生型或脫免疫的肽的增殖,其代表全世界80%的HLA-DR等位基因。僅在裝載具有野生型肽的抗原呈遞細(xì)胞時(shí)檢測(cè)理想的細(xì)胞增殖。或者,可以通過(guò)代表全部單體型的表達(dá)HLA-DR的四聚體來(lái)檢測(cè)脫免疫??梢詸z測(cè)這些四聚體的肽結(jié)合或裝載肽替代物用于增殖測(cè)定中的抗原呈遞細(xì)胞。為了檢測(cè)脫免疫的肽是否在HLA-DR單體型上存在,可以測(cè)量在PBMC上例如熒光標(biāo)記的肽的結(jié)合。此外,可以通過(guò)確定當(dāng)施用于患者之后是否已經(jīng)形成針對(duì)脫免疫分子的抗體來(lái)證明脫免疫。優(yōu)選的,抗體衍生的分子在構(gòu)架區(qū)是脫免疫的,并且多數(shù)CDR區(qū)未被修飾以產(chǎn)生減少的誘導(dǎo)T細(xì)胞表位的傾向,從而不影響CDR區(qū)的結(jié)合親和力。甚至除去一個(gè)T細(xì)胞表位導(dǎo)致減少的免疫原性。總之,上迷方法幫助減少本文定義的治療性雙特異性單鏈抗體當(dāng)被施用于上皮腫瘤患者時(shí)的免疫原性。例如,在SEQIDN0.77中顯示的特異性結(jié)合于CD3的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域是脫免疫的,也見(jiàn)WO2005/040220。優(yōu)選的,在這一CD3結(jié)合結(jié)構(gòu)域中V區(qū)的排列是VH-VL。在另一方面,本發(fā)明涉及雙特異性單鏈抗體,其包含的氨基酸序列選自下列組成的組(a)如在任意的SEQIDNO.6、8、16、18、24、26、32、34、40、42、126、130、134或143所述的氨基酸序列;(b)由在SEQIDNO.5、7、15、17、23、25、31、33、39、41、125、129、133或142中所示核酸序列編碼的氨基酸序列;(c)由核酸序列編碼的M酸序列,所述核酸序列在嚴(yán)格條件下與(b)的互補(bǔ)核酸序列雜交;(d)由核酸序列編碼的氨基酸序列,所述核酸序列是作為(b)的核苷酸序列遺傳密碼的簡(jiǎn)并結(jié)果;和(e)氨基酸序列,其與(a)或(b)的氨基酸序列具有至少85。/。的同一性,更優(yōu)選至少90%的同一性,最優(yōu)選至少95%的同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及包含以上定義的雙特異性單鏈抗體的組合物。優(yōu)選的,將如上定義的所述雙特異性單鏈抗體作為藥物組合物用于治療上皮肺瘤或人的上皮腫瘤。所述上皮腫瘤是CEAP日性的。針對(duì)這些藥物組合物的CEA陽(yáng)性上皮腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性對(duì)腫瘤患者的血漿中甚至高濃度的可溶CEA抗原具有抗性。此外,如以下詳述,如上定義的所述雙特異性單鏈抗體或其衍生的抗-CEAscFv可以用作診斷組合物,用于檢測(cè)上皮腫瘤或人的上皮腫瘤。本文使用的術(shù)語(yǔ)"在嚴(yán)格條件下雜交"指核酸序列,其能夠在嚴(yán)格條件下與在SEQIDNO,5、7、15、17、23、25、31、33、39、41、125、129、133或142中描述的序列或其互補(bǔ)序列雜交,并且其編碼對(duì)CEA陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性的雙特異性單鏈抗體。"嚴(yán)格雜交條件"指在42匸在溶液中過(guò)夜孵育,所述溶液包含50%甲酰胺、5xSSC(750mMNaCl、75mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20pg/ml變性、剪切的鮭精DNA,接著在約65匸在0.1xSSC中洗膜。使用公知的計(jì)算程序可以常規(guī)測(cè)定是否任何特定的核酸分子或多肽與本文定義的核苷酸或氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。用于確定在查詢序列(本文定義的序列)和目標(biāo)序列之間最佳總體匹配的優(yōu)選的方法,也稱為全球序列比對(duì),可以使用FASTDB計(jì)算程序基于Brutlag等人的算法來(lái)確定(Comp.App.Biosci.6:237-245(19卯))。在序列比對(duì)中,查詢和目標(biāo)序列都是DNA序列??梢酝ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)換U為T來(lái)比較RNA序列。本發(fā)明也提供包舍編碼如本文定義的雙特異性單鏈抗體的核酸序列的藥物組合物。可以使用所述核酸,例如,用于基因治療方法來(lái)治療人的上皮肺瘤,如在以下進(jìn)一步詳述。本發(fā)明還涉及包含載體的藥物組合物,該載體包含如上定義的核,列。優(yōu)選的,所迷栽體還包含調(diào)節(jié)序列,其有效連接在如上定義的所迷核酸序列。更優(yōu)選的,所述載體是表達(dá)載體。此外,本發(fā)明的載體還可以是基因轉(zhuǎn)移或基因靶向的載體?;谕ㄟ^(guò)離體或體內(nèi)技術(shù)將基因或核酸導(dǎo)入細(xì)胞的基因治療是基因轉(zhuǎn)移的最重要的應(yīng)用之一。用于體外研究或體內(nèi)基因治療的合適的載體、方法或基因傳遞系統(tǒng)描述于文獻(xiàn)中,并且是對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的,見(jiàn),例如,Giordano,NatureMedicine2(1996),534-539;Schaper,Circ.Res.79(1996),911-919;Anderson,Science256(1992),808-813,Isner,Lancet348(1996),370-374;Muhlhauser,Circ.Res.77(1995),1077-1086;Onodua,Blood91(1998),30-36;Verzeletti,Hum.GeneTher.9(1998),2243-2251;Verma,Nature389(1997),239-242;Anderson,Nature392(Supp.1998),25-30;Wang,GeneTherapy4(1997),393-400;Wang,NatureMedicine2(1996),714-716;WO94/29469;WO97/00957;US5,580,859;US5,589,466;US4,394,448或Schaper,CurrentOpinioninBiotechnology7(1996),635-640,和其中引用的參考??梢栽O(shè)計(jì)本文定義的核酸分子和載體用于經(jīng)由脂質(zhì)體、病毒載體(例如,腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒)、電穿孔或其它傳遞系統(tǒng)導(dǎo)入細(xì)胞,此夕卜,可以使用桿狀病毒系統(tǒng)作為本文定義的核酸分子的真核表達(dá)系統(tǒng)。優(yōu)選的,導(dǎo)入和基因治療方法應(yīng)該導(dǎo)致本文定義的功能性雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體的表達(dá),藉此所述表達(dá)的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體在治療、改善和/或防止人的上皮肺瘤中是特別有用的。在另一方面,本發(fā)明涉及包含了用以上定義的載體或核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主的藥物組合物。本發(fā)明的另一方面涉及以上定義的藥物組合物,還包含能夠提供免疫效應(yīng)細(xì)胞的激活信號(hào)的蛋白質(zhì)化合物。優(yōu)選的,該藥物組合物還包含載體、穩(wěn)定劑和/或賦形劑的合適的制劑。在另一方面,本發(fā)明涉及產(chǎn)生以上定義的藥物組合物的方法,所述方法包括在允許表達(dá)以上定義的雙特異性單鏈抗體的條件下培養(yǎng)宿主,和從培養(yǎng)物回收產(chǎn)生的雙特異性單鏈抗體。本發(fā)明的另一方面涉及如上定義的或通過(guò)如上定義的方法產(chǎn)生的雙特異性單鏈抗體、如上定義的核酸分子、如上定義的載體或如上定義的宿主在制備用于防止、治療或改善人的上皮腫瘤的藥物組合物中的用途。本發(fā)明的另一方面涉及用于防止、治療或改善人的上皮腫瘤的方法,所述方法包括施用有效量的本發(fā)明的或根據(jù)以上提出的方法產(chǎn)生的藥物組合物的步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員,特別是主治醫(yī)師可以評(píng)估對(duì)需要施用本發(fā)明的雙特異性分子/雙特異性單鏈抗體的患者的成功的治療。因此,可以由本領(lǐng)域所述技術(shù)人員評(píng)估施用方案和劑量以及施用時(shí)間被評(píng)估的相應(yīng)的"改善"和/或"治療"在下文被定義。如本文所使用,在上皮腫瘤背景下本發(fā)明的藥物組合物的"有效量"或"治療有效量"指足以毀壞、修正、控制和移除原發(fā)、局部或轉(zhuǎn)移的腫瘤組織的治療物質(zhì)的量。治療有效量可以指足以延緩或最小化上皮腫瘤的擴(kuò)散的治療物質(zhì)的量。治療有效量還可以指在治療或控制上皮腫瘤中提供治療益處的治療物質(zhì)或藥劑的量。此外,關(guān)于本發(fā)明的治療物質(zhì)或藥劑的治療有效量意指治療物質(zhì)或藥劑(單獨(dú)或與其它治療組合)的量在治療或控制上皮腫瘤中提供治療益處。與本文定義的雙特異性單鏈抗體的量結(jié)合使用,該術(shù)語(yǔ)可以包括提高整體治療,減少或避免不需要的效果,或提高與另一治療物質(zhì)的協(xié)同效果(如本文定義)的量。優(yōu)選的,治療物質(zhì)的治療有效量提高整體治療,減少或避免不需要的效果,或提高與另一治療物質(zhì)在治療上皮肺瘤中的協(xié)同治療效果。例如,本文定義的雙特異性單鏈抗體如果作為單一療法施用于患者,可能導(dǎo)致20%的上皮肺瘤的直徑皺縮。相反,第二種治療,例如以下定義的抗癌物質(zhì)可能導(dǎo)致10%的腫瘤皺縮。然而,如果將本文定義的雙特異性單鏈抗體和所述第二種治療物質(zhì)以共治療的形式組合施用,可以觀察到50%的胖瘤皺縮。這類效果可以理解為本文使用的協(xié)同效果。參考本文,術(shù)語(yǔ)"治療法"指能夠用于預(yù)防、治療或改善上皮腫瘤的任何施用方案、方法和/或物質(zhì)。以下對(duì)術(shù)語(yǔ)"預(yù)防、治療或改善上皮腫瘤"進(jìn)行詳述。術(shù)語(yǔ)"治療法"可以指用于治療、預(yù)防或改善上皮腫瘤或其一種或更多癥狀的生物治療法、支持治療法、化療法、放射治療法和/或其它治療法。如本文所用,術(shù)語(yǔ)"治療"在向患者施用治療物質(zhì)的情況下指減少或改善上皮腫瘤的發(fā)展、嚴(yán)重性和/或持續(xù)時(shí)間。所述上皮腫瘤可能與例如,CEA的過(guò)表達(dá)或活性的異常表達(dá)有關(guān),和/或通過(guò)施用一種或多種療法(包括施用一種或多種藥劑或治療物質(zhì))導(dǎo)致其一種或多種癥狀的改善。最優(yōu)選的施用模式是在給定的時(shí)間/時(shí)間間隔靜脈內(nèi)施用。而本文所定義的雙特異性單鏈抗體可以單獨(dú)的施用,優(yōu)選在藥物可接受的載體中施用。合適的藥物載體的實(shí)例是本領(lǐng)域眾所周知的,并且包括磷酸鹽緩沖的鹽溶液、水、脂質(zhì)體、多種類型的濕潤(rùn)劑、無(wú)菌溶液等??梢酝ㄟ^(guò)眾所周知的常規(guī)方法配制包含這類載體的組合物。可以以合適的劑量將這些藥物組合物施用于受試者??梢酝ㄟ^(guò)主治醫(yī)師和臨床因素確定劑量方案。如在藥物技術(shù)中眾所周知的,用于任何一名患者的劑量依賴于許多因素,包括患者體積、體表面積、年齡、施用的特定化合物、性別、施用的時(shí)間和途徑、一般健康和同時(shí)施用的其它藥物。用于腸胃外施用的制劑包括無(wú)菌含水或非水的溶液、和懸浮液。非水溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二烯和可注射的有機(jī)酯,例如油酸乙酯。含水載體包括水、含水溶液,或懸浮液,包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸道外載體包括氯化鈉溶液、任氏葡萄糖(Ringer'sdextrose)、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格或固定的油。靜脈內(nèi)注射的載體包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(例如基于任氏葡萄糖的那些)等等。還可以存在的防腐劑和其它添加劑是,例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等等。此外,本發(fā)明的組合物可以包括蛋白質(zhì)栽體,例如,血清白蛋白或免疫球蛋白,優(yōu)選人源的??梢韵胂?,除了本文所定義的雙特異性單鏈抗體之外,由該組合物的使用目的決定,共治療還包括更多的生物活性物質(zhì)。這類物質(zhì)可以是作用于胃腸系統(tǒng)的物質(zhì)、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑、防止高尿酸血癥的物質(zhì)、抑制免疫反應(yīng)的物質(zhì)(例如,皮質(zhì)類固醇FK506)、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的藥物、作用于循環(huán)系統(tǒng)的藥物和/或例如本領(lǐng)域公知的T細(xì)胞共刺激分子或細(xì)胞因子類物質(zhì)。優(yōu)選的,本文定義的雙特異性單鏈抗體是以緩沖液、穩(wěn)定劑和表面活性劑配制。該緩沖液可以是磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽或醋酸鹽緩沖液。穩(wěn)定劑可以是氨基酸和/或糖。表面活性劑可以是去污劑、PEG等。更優(yōu)選的,本文定義的雙特異性單鏈抗體是以檸檬酸鹽、賴氨酸、海藻糖和吐溫80配制。作為所述藥物組合物的稀釋劑,優(yōu)選等滲鹽水和吐溫80。本文使用的術(shù)語(yǔ)"改善"指疾病,即上皮腫瘤嚴(yán)重度的改良或緩和。例如,這類改善可以是獲得穩(wěn)定的疾病,或甚至更優(yōu)選上皮腫瘤的皺縮,即由于施用本發(fā)明的藥物組合物而產(chǎn)生的最小的、部分的答應(yīng)或完全的應(yīng)答。"穩(wěn)定的疾病"指疾病狀態(tài),其中通過(guò)臨床和/或組織診斷方法能夠觀察到或檢測(cè)到?jīng)]有腫瘤發(fā)展/生長(zhǎng)或沒(méi)有顯著的腫瘤發(fā)展/生長(zhǎng)。例如,腫瘤的皺縮超過(guò)指數(shù)損傷橫斷面總和的50%皺縮可以認(rèn)為是"部分的應(yīng)答"。"完全的應(yīng)答"指其中在治療后再檢測(cè)不到任何損傷的狀態(tài)。在穩(wěn)定的疾病和部分應(yīng)答之間具有腫瘤皺縮的應(yīng)答可以認(rèn)為是最小應(yīng)答。例如,指數(shù)損傷的橫斷面的總和的20%、25%或30。/。的皺縮可以稱為最小應(yīng)答。本文使用的術(shù)語(yǔ)"改善,,也包括上皮腫瘤數(shù)目的減少。其還指示,腫瘤發(fā)展的預(yù)防/減慢。此外,如本文所使用的,與未治療的肺瘤患者相比,治療的腫瘤患者的整體存活的改善可以被認(rèn)為"改善"。這就實(shí)際情況而言應(yīng)用于與未治療的腫瘤患者相比,治療的胂瘤患者的疾病無(wú)惡化的生存或無(wú)復(fù)發(fā)的存活的改善。此外,術(shù)語(yǔ)"改善,,也可以指上皮腫瘤的癥狀強(qiáng)度的減少,導(dǎo)致例如,治療的腫瘤患者的生活質(zhì)量的改善。本文使用的術(shù)語(yǔ)"上皮腫瘤的預(yù)防,,應(yīng)該被理解如下在從人患者手術(shù)移除原發(fā)上皮腫瘤之后和/或在原發(fā)上皮肺瘤的化療或放射治療之后,可能是這樣的情況,并非全部腫瘤細(xì)胞能夠從身體中清除。然而,這些剩余的腫瘤細(xì)胞可能在患者中產(chǎn)生復(fù)發(fā)的癌癥,即,原位復(fù)發(fā)和/或遷移。遷移是癌癥常見(jiàn)的并發(fā)癥,然而對(duì)通過(guò)該途徑癌細(xì)胞從原始腫瘤擴(kuò)散形成遠(yuǎn)距離的細(xì)胞群理解仍很少。遷移的癌癥無(wú)一例外的不可治愈,導(dǎo)致需要新的治療方式。可以使用本發(fā)明的藥物組合物用于殺死這些擴(kuò)散的腫瘤細(xì)胞以防止形成次生腫瘤(源于在初次治療之后從身體中剩余的腫瘤細(xì)胞)。以這一方式,該藥物組合物幫助防止在腫瘤患者中原位復(fù)發(fā)和/或遷移的形成??梢酝ㄟ^(guò)建立各自疾病單元的標(biāo)準(zhǔn)方法監(jiān)測(cè)抗腫瘤治療的成功,例如通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助斷層攝影術(shù)、X-射線、核磁共振斷層攝影術(shù)(例如,基于應(yīng)答評(píng)估的國(guó)家癌癥協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[Cheson(1999),J.Clin.Oncol.;l7(4》1244)、正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)掃描、內(nèi)窺鏡檢查、熒光激活細(xì)胞分選法、骨髓、胸膜或腹膜液抽吸術(shù)、組織/組織學(xué)和多種上皮腫瘤特異性的臨床化學(xué)參數(shù)(例如,血清中的可溶CEA濃度),并且可以使用其它建立的標(biāo)準(zhǔn)方法。此外,可以使用確定T細(xì)胞激活的測(cè)定;見(jiàn),例如WO99/054440。也可以使用與未治療的腫瘤患者相比,對(duì)確定的治療的腫瘤患者的整體存活、疾病無(wú)惡化的生存或無(wú)復(fù)發(fā)存活的統(tǒng)計(jì)。優(yōu)選的,所述上皮腫瘤是胃腸道腺瘤、乳腺瘤或肺腺瘤。所述胃腸道腺瘤更優(yōu)選是結(jié)直腸、胰腺、食道或胃的腺瘤。甚至更優(yōu)選的,本發(fā)明的所述藥物組合物是用于治療進(jìn)行性腫瘤、晚期腫瘤、具有高腫瘤負(fù)荷/負(fù)擔(dān)的腫瘤患者、遷移腫瘤或具有CEA血清濃度高于100ng/ml(通過(guò)ELISA確定)的腫瘤患者。在本發(fā)明的用途或方法的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中,以上定義的所迷藥物組合物適于與另外的藥物,即,作為共治療的部分,組合施用。在某些實(shí)施方案中,本文定義的雙特異性單鏈抗體或藥物組合物以與一種或多種其它治療組合的形式施用,在某些實(shí)施方案中,將本文定義的雙特異性單鏈抗體或藥物組合物與一種或多種其它治療同時(shí)施用于患者。優(yōu)選的,這類治療對(duì)于治療上皮腫瘤是有用的。術(shù)語(yǔ)"同時(shí)"不限于將藥物組合物或藥劑準(zhǔn)確在相同時(shí)間施用,而是意味著本文定義的雙特異性單鏈抗體或藥物組合物和其它物質(zhì)是順序的和在時(shí)間間隔內(nèi)施用于患者,從而本文定義的雙特異性單鏈抗體或藥物組合物可以與其它物質(zhì)一起作用來(lái)提供與如果另外施用它們相比增加的益處。例如,可以同時(shí)或在不同時(shí)間點(diǎn)以任意順序施用各個(gè)藥劑;然而,如果不在相同時(shí)間施用,應(yīng)該在足夠接近的時(shí)間施用它們以提供期望的治療效果。可以以合適的形式和通過(guò)任何合適的途徑分別施用各個(gè)治療物質(zhì),在其它實(shí)施方案中,在手術(shù)之前、同時(shí)或之后施用本文定義的雙特異性單鏈抗體或藥物組合物。優(yōu)選手術(shù)完全除去局部的上皮腫瘤或減少大的上皮腫瘤的體積。手術(shù)也可以作為預(yù)防措施或減少疼痛而完成。本文提供的藥物的施用劑量和頻率包括在以上術(shù)語(yǔ)"治療有效"中。由施用的特異性的治療或預(yù)防物質(zhì)、上皮腫瘤的嚴(yán)重性和類型、施用的途徑以及年齡、體重、應(yīng)答和患者的既往病史決定,通常還根據(jù)對(duì)每個(gè)患者特異性的因素而改變劑量和頻率??梢杂杉夹g(shù)人員提供考慮這樣的因素和通過(guò)例如在文獻(xiàn)中報(bào)道的和在醫(yī)師案頭參考(第59版編輯,2005)中推薦的來(lái)選擇合適的方案。在一些實(shí)施方案中,通過(guò)本文定義的雙特異性單鏈抗體或藥物組合物的施用的治療法是與一個(gè)或多個(gè)治療法的施用組合,所述治療法例如化療、放射療法、激素療法、和/或生物療法/免疫療法。治療物質(zhì)包括,但不限于蛋白質(zhì)分子(包括,但不限于肽、多肽、蛋白質(zhì),包括翻譯后修飾的蛋白質(zhì)、抗體等);或小分子(小于1000道爾頓)、無(wú)機(jī)或有機(jī)化合物;或核酸分子,包括雙鏈或單鏈DNA、或雙鏈或單鏈RNA、以及三鏈螺旋核酸分子。治療物質(zhì)可以來(lái)自任何已知的生物(包括但不限于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌、和原生生物或病毒)或來(lái)自合成的分子庫(kù)。在特定的實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法和用途包括本文定義的雙特異性單鏈抗體或藥物組合物與一個(gè)或多個(gè)治療物質(zhì)組合施用,所述治療物質(zhì)是激酶抑制劑,例如,本領(lǐng)域所述吉非替尼(易瑞沙)、埃羅替尼(塔西法)、抗EGFR抗體(例如,西妥昔單抗、艾比特思)或抗Her2/neu抗體(例如,曲妥珠單抗、赫賽汀);見(jiàn),例如,Hardie和Hanks(1995)TheProteinKinaseFactsBook,I和II,AcademicPress,SanDiego,California,在另一特殊的實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法和用途包括本文定義的雙特異性單鏈抗體或藥物組合物與一個(gè)或多個(gè)治療物質(zhì)組合施用,所述治療物質(zhì)是血管生成抑制劑,例如,本領(lǐng)域所述的抗VEGF抗體(例如,貝伐珠單抗;阿伐他汀)、小分子化合物(例如,Vatalanib或索拉非尼)或環(huán)氧化酶抑制劑。在另一特殊的實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法和用途包括本文定義的雙特異性單鏈抗體或藥物組合物與一個(gè)或多個(gè)治療物質(zhì)組合施用,所迷治療物質(zhì)是抗癌物質(zhì),例如本領(lǐng)域所迷的5-氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸、卡培他濱、奧沙利鉑、伊立替康、吉西他濱、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、順鉑、卡鉑、紫杉烷類(例如,多西他賽、紫杉醇)。優(yōu)選的,使用本文定義的雙特異性單鏈抗體或藥物組合物與更多的治療物質(zhì)組合對(duì)上皮腫瘤患者的共治療法產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。如本文使用的,術(shù)語(yǔ)"協(xié)同效應(yīng)"指治療法的組合(例如,本文定義的雙特異性單鏈抗體和如上所述的更多治療物質(zhì)的組合),其比任何兩個(gè)或多個(gè)單獨(dú)的治療法的附加效果更有效(例如,一個(gè)或多個(gè)治療物質(zhì))。例如,如果作為單獨(dú)治療法向患者施用,本文定義的雙特異性單鏈抗體可能導(dǎo)致上皮腫瘤直徑20%的皺縮。相對(duì)而言,第二種治療法,例如,以下定義的抗癌物質(zhì),可能導(dǎo)致IO%的腫瘤皺縮。然而,如果本文定義的雙特異性單鏈抗體和所述笫二種治療以共治療的形式組合施用,可能觀察到50%的腫瘤皺縮。治療法組合的協(xié)同效果(例如,本文定義的雙特異性單鏈抗體和如上所述的更多治療物質(zhì)的組合)使能夠低劑量的使用一種或多種治療法(例如,一種或多種治療物質(zhì))和/或低頻率的施用所述治療法于具有疾病(例如上皮腫瘤)的患者。利用低劑量的治療的能力(例如,治療物質(zhì))和/或更低頻率的施用所述治療法減少與向受試者施用所述治療法的毒性而不減少所述治療法在預(yù)防或治療疾病,例如上皮腫瘤中的效果。此外,協(xié)同效果可以在預(yù)防、控制、治療和/或改善上皮肺瘤中(其可能與CEA的異常表達(dá)(例如,過(guò)表達(dá))或活性有關(guān))產(chǎn)生改良的治療效率(例如,治療物質(zhì))。最后,治療法(例如,治療物質(zhì))組合的協(xié)同效果可以避免或減少與使用任何單獨(dú)治療法相伴的不利或不需要的副作用。在所述共治療法中,活性物質(zhì)可以任選的包含在與本文定義的雙特異性單鏈抗體相同的藥物組合物中,或可以包含在分開的藥物組合物中。在后者的情況,所述分開的藥物組合物適用于在施用包含本文定義的雙特異性單鏈抗體的所述藥物組合物之前、同時(shí)或之后。另外的藥物或藥物組合物可以是非蛋白質(zhì)的化合物或蛋白質(zhì)的化合物。在該情況下,另外的藥物是蛋白質(zhì)化合物,最好該蛋白質(zhì)化合物能夠?yàn)槊庖咝?yīng)細(xì)胞提供激活信號(hào)。優(yōu)選的,可以同時(shí)或不同時(shí)施用所述蛋白質(zhì)化合物或非蛋白質(zhì)化合物與上文定義的雙特異性單鏈抗體、上文定義的核酸分子、如上定義的載體或如上定義的宿主。優(yōu)選的,治療的所述受試者是人。在另外的實(shí)施方案中,本文定義的雙特異性單鏈抗體或抗CEAscFv可以與診斷或可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)。這類診斷和檢測(cè)可以通過(guò)將抗體或scFv偶聯(lián)在可檢測(cè)的物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn),所述可檢測(cè)物質(zhì)例如,多種酶,例如,辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、|3-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶;輔基,例如鏈霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素;熒光材料,例如,傘形酮、熒光素、熒光素異硫氰酸鹽、羅丹明、二氯三嗪氨基熒光素(dichlorotriazinylaininefluorescein)、丹磺酰氯或藻紅蛋白;發(fā)光材料,例如,魯米諾;生物發(fā)光材料,例如,螢光素酶、螢光素和水母熒光素;放射活性物質(zhì)和同位素,例如,鈷(57Co)、銦(115In,113In,112In,lllln)、碟(13U,1251,1231,1211)或釔(90Y),使用多種正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)發(fā)射正電子物質(zhì),和非放射活性的順磁的金屬離子。用于對(duì)抗體偶聯(lián)部分的:R術(shù)是眾所周知的。可以通過(guò)本領(lǐng)域/^知的任何技術(shù)將部分偶聯(lián)于抗體,所述技術(shù)包括,但不限于,乙醛/希夫連接、硫氫基連接、酸依賴的連接、順-烏頭基(cis-aconityl)連接、腙連接、酶促可降解連接;通常見(jiàn)Garnett,2002,Adv.DrugDeliv.Rev.53:171-216.InMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeld等人(編輯),笫243-56頁(yè)(AlanR.Liss,Inc.1985)。用于融合或偶聯(lián)抗體于多肽部分的方法是本領(lǐng)域公知的,見(jiàn),例如,Ashkenazi等人,1991,PNAS88:10535-10539??贵w融合于部分不需要是直接的,而可能通過(guò)接頭序列發(fā)生。這類接頭分子是本領(lǐng)域普遍公知的,并且描述在Denardo等人,1998,ClinCancerRes.4:2483-90;Peterson等人,1999,Bioconjug.Chem.10:553。在另一方面,本發(fā)明涉及試劑盒,其包含上文所定義的雙特異性單鏈抗體、上文定義的核酸分子、上文定義的載體或上文定義的宿主。本發(fā)明的說(shuō)明書和實(shí)施例中公開和包括了這些和其它的實(shí)施方案。免疫的重組技術(shù)和方法描述在,例如,在Sambrook等人MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress,第三版,2001;Lefkovits;ImmunologyMethodsManual;TheComprehensiveSourcebookofTechniques;AcademicPress,1997;Golemis;Protein-ProteinInteractions:AMolecularCloningManual;ColdSpringLaboratoryPress,2002。關(guān)于根據(jù)本發(fā)明使用的任何一種抗體、方法、用途和化合物的更多的文獻(xiàn)可以使用例如電子裝置從公共圖書館和數(shù)據(jù)庫(kù)獲得??梢岳美纾稍诨ヂ?lián)網(wǎng)獲得的公共數(shù)據(jù)庫(kù)"Medline",例如在http:〃www.ncbi.nlm.nih.qov/PubMed/medline.html。更多的數(shù)據(jù)庫(kù)和地址是例如http:〃www.ncbi.iiim.iiih.qov/、http:〃www.infobioaen.fr/_、http:〃www.fmi.ch/bioloqv/researchtools.html、http:〃www.tiqr.orO/是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的,并且也可以使用例如http:〃www.lvcos.com獲得。對(duì)于有關(guān)腫瘤的主題,見(jiàn)例嗦口http:〃www.iiih.govorhttp:〃www.dkfz.de。圖1:多種人CEA-反應(yīng)雙特異性單鏈構(gòu)建體分別對(duì)用人CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞和CD3陽(yáng)性的HPB-ALL細(xì)胞的FACS結(jié)合分析。使用單克隆抗體Col-l作為結(jié)合CEA的陽(yáng)性對(duì)照。使用如在WO99/054440所述的CD19xCD3雙特異性單鏈構(gòu)建體作為結(jié)合人CD3的對(duì)照。在這一陽(yáng)性對(duì)照中,粗線代表與10ng/ml純化的CD19xCD3雙特異性單鏈抗體孵育的細(xì)胞,其接著與抗-His抗體和檢測(cè)抗體孵育。細(xì)線代表陰性對(duì)照與抗-His抗體和檢測(cè)抗體醉育的細(xì)胞。人(膜結(jié)合的)CEA和人CD3的結(jié)合活性是可以用CEAIVHVLxSEQIDNO.77VHVL、CEAIVLVHxSEQIDNO,77VHVL、CEAIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL、CEAIIIVLVHxSEQIDNO.77VHVL和CIJAIIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL檢測(cè)的。在對(duì)應(yīng)于本發(fā)明所述的雙特異性單鏈抗體的各自的柱狀圖中,細(xì)線代表陰性對(duì)照,亮粗線代表與培養(yǎng)上清孵育的細(xì)胞,而黑色粗(最亮)線代表與10嗎/ml純化的雙特異性單鏈抗體孵育的細(xì)胞。圖2:雙特異性單鏈抗體抗-CEA/抗-CD3抗體CEAIVHVLxSEQIDNO.77VHVL、CEAIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL和CEAIIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL和抗-CEA抗體Col-l與可溶CEA的結(jié)合信號(hào),通過(guò)直接ELISA檢測(cè)。CEAIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(抗-CEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,衍生自mAbA5B7)、CEAIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(抗-CEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,衍生自mAbT84.66)和CEAIIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(抗-CEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,衍生自mAbMFE-23)雙特異性單鏈抗體和小鼠單克隆抗體Col-l特異性結(jié)合于固定的可溶人CEA。在缺乏可溶CEA抗原時(shí)(PBS對(duì)照),沒(méi)有觀察到結(jié)合信號(hào)。圖3:在缺乏可溶CEA情況下,所示CEA-反應(yīng)性的雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)T細(xì)胞裂解用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞。為了證明重新指導(dǎo)的裂解的特異性,無(wú)-CEA反應(yīng)性的雙特異性單鏈構(gòu)建體被包括作為陰性對(duì)照。能夠顯示對(duì)于多種結(jié)構(gòu)域排列的抗人CEA-轉(zhuǎn)染的靶標(biāo)細(xì)胞(CHO-CEA+細(xì)胞)的細(xì)胞毒活性,所述多種結(jié)構(gòu)域排列,即,對(duì)于SEQIDNO.77VHVLxCEAIVHVL和SEQIDNO.77VHVLxCEAIVLVH(兩個(gè)構(gòu)建體都具有N-末端的抗-CD3結(jié)合結(jié)構(gòu)域),以及CEAIVLVHxSEQIDNO.77VHVL和CEAIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(C-末端的抗-CD3結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。使用未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(缺少人CEA)作為陰性對(duì)照。圖4:在缺乏可溶CEA情況下,所示CEA-反應(yīng)性的雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)T細(xì)胞裂解用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。為了證明重指導(dǎo)的裂解的特異性,未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞被包括作為陰性對(duì)照。使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞,CEAI-HL(CEAIVHVLxSEQIDNO,77VHVL)、CEAIII畫LH(CEAIIIVLVHxSEQIDNO.77VHVL)、CEAIII-HL(CEAIIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL)和CEAIIHL(CEAIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL)顯示針對(duì)人CEA-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。使用未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(缺少人CEA)作為CEAI-LH(CEAIVLVHxSEQIDNO.77VHVL)、CEAIII國(guó)HL(CEAIIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL)和CEAIIHL(CEAIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL)的陰性對(duì)照。CEAI表示從鼠mAbA5B7衍生的可變區(qū),CEAII是從鼠T84.66衍生的可變區(qū)和CEAIII指來(lái)自鼠mAbMFE-23的可變區(qū)。圖5:在可溶人CEA存在下,所示的CEA-反應(yīng)性的雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)T細(xì)胞裂解用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞。由CEAIVLVHxSEQIDNO.77VHVL和CEAIVHVLxSEQIDNO.77VHVL介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性不^皮增加的可溶人CEA的量(高達(dá)1照/ml)抑制。CEAI是來(lái)自鼠mAbA5B7的可變區(qū)。圖6:在可溶人CEA存在下,所示的CEA-反應(yīng)性的雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)T細(xì)胞裂解用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞由SEQIDNO.77VHVLxCEAIVHVL和SEQIDNO.77VHVLxCEAIVLVH介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性不被增加的可溶人CEA的量(高達(dá)1^ig/ml)抑制。CEAI是來(lái)自鼠mAbA5B7的可變區(qū)。圖7:在可溶人CEA存在下,所示CEA-反應(yīng)性的雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)T細(xì)胞裂解用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞。CEAIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL的細(xì)胞毒活性不被增加量的可溶人CEA抑制。CEAIIVHVL是來(lái)自鼠mAbT84.66的可變區(qū)。圖8:在可溶人CEA存在下,所示CEA-反應(yīng)性的雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)T細(xì)胞裂解用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞,使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞。CEAIVHVLxSEQIDNO.77VHVL-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性對(duì)由可溶CEA抗原引起的抑制具有抗性,而CEAIIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL-介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性受到甚至低量的可溶CEA的抑制。CEAIIIVHVL是來(lái)自mAbMFE-23,而CEAI是衍生自鼠mAbA5B7的可變區(qū)。圖9:在增加量的可溶CEA抗原存在下,所示CEA-反應(yīng)性的雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)T細(xì)胞裂解KatoIII細(xì)胞。使用天然人PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞。CEAIIVHVLxSEQIDNO.77-介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性對(duì)可溶CEA沒(méi)有抗性。CEAIIVHVL衍生自mAbT84.66。圖10:在增加量的可溶CEA抗原存在下,所示CEA-反應(yīng)性的雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)T細(xì)胞裂解KatoIII細(xì)胞。使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞。CEAIVHVLxSEQIDNO.77VHVL-介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性對(duì)可溶CEA有抗性。相反,CEAIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL-介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性受到增加量的可溶CEA的抑制。CEAIIVHVL是衍生自mAbT84.66,而CEAI是衍生自鼠mAbA5B7的可變區(qū)。圖11:在增加量的可溶CEA抗原存在下,所示CEA-反應(yīng)性的雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)T細(xì)胞裂解用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞。CEAIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL-介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性受到增加量的可溶CEA的抑制。CEAIIVHVL衍生自mAbT84.66。圖12:胞質(zhì)制備物的流式細(xì)胞檢測(cè)分析,該制備物含有來(lái)自所選克隆的Flag-標(biāo)記的scFv蛋白質(zhì)片段。將可溶scFv蛋白質(zhì)片段的胞質(zhì)制備物加入100000至200000個(gè)CEA-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中。使用單克隆抗-Flag抗體,繼之以PE-標(biāo)記的多克隆抗-小鼠抗體檢測(cè)。通過(guò)與單獨(dú)和PBS孵育的細(xì)胞相比較熒光強(qiáng)度的增加來(lái)測(cè)量ScFv結(jié)合的細(xì)胞。熒光強(qiáng)度分布在X-軸,事件數(shù)分布在Y-軸。陰性對(duì)照(PBS和檢測(cè)試劑)作為實(shí)心曲線顯示,各個(gè)ScFv顯示為灰色線。向右移位表示陽(yáng)性結(jié)合至細(xì)胞。全部的ScFv,即,A121、A-183、A-240、A-313、A誦290、A-315、A4-35、A4-52和MP2-A5結(jié)合于CHO細(xì)胞上的膜結(jié)合的CEA。各個(gè)scFv包含如在實(shí)施例6中所述的鼠A5B7VH區(qū)和人VL區(qū)。圖13:胞質(zhì)制備物的流式細(xì)胞檢測(cè)分析,該制備物含有來(lái)自所選克隆的Flag-標(biāo)記的scFv蛋白質(zhì)片段。將可溶scFv蛋白質(zhì)片段的胞質(zhì)制備物加入100000至200000個(gè)CEA-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中。使用單克隆抗-Flag抗體,繼之以PE-標(biāo)記的多克隆抗-小鼠抗體進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)與單獨(dú)和PBS孵育的細(xì)胞相比較熒光強(qiáng)度的增加來(lái)測(cè)量ScFv結(jié)合的細(xì)胞。熒光強(qiáng)度分布在X-軸,事件數(shù)分布在Y-軸。陰性對(duì)照(PBS和檢測(cè)試劑)作為實(shí)心曲線顯示,各個(gè)ScFv顯示為灰色線。向右移位表示陽(yáng)性結(jié)合至細(xì)胞。向右移位表示陽(yáng)性結(jié)合至細(xì)胞'全部的人ScFv構(gòu)建體MP510_3-A5.3、MP510—3-B9.1和MP510_3-D8.1結(jié)合于CHO細(xì)胞上的膜結(jié)合的CEA。這些scFv各自包含如在實(shí)施例7中所述的人VH區(qū)和人VL區(qū)A240。240V入.3是包含鼠A5B7VH區(qū)和人VLA-240區(qū)的scFv。這一構(gòu)建體還顯示CEA-結(jié)合活性。圖14:多種人CEA-反應(yīng)性雙特異性單鏈構(gòu)建體分別對(duì)KatoIII細(xì)胞和HPB-A11細(xì)胞的FACS結(jié)合分析。粗線代表與轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清孵育的細(xì)胞,其與抗-His抗體和檢測(cè)抗體孵育。細(xì)的矩形圖線表現(xiàn)陰性對(duì)照與抗-His抗體和檢測(cè)抗體孵育的細(xì)胞。人雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體A5VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL、B9VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL和D8VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL結(jié)合于Kato細(xì)胞上的人CEA和HPB-AU細(xì)胞上的人CD3。具有衍生自mAbA5B7的CEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的VH區(qū)的CEAIVH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL顯示相同的結(jié)合活性。圖15:在缺乏可溶CEA的情況下,所示CEA-反應(yīng)性雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)定。使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞??梢詸z測(cè)A5VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL、B9VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL、D8VHA240VLxSEQIDNO.77VHVL和CEAIVH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL的細(xì)胞毒活性。CEAIVH是衍生自mAbA5B7的VH區(qū)。圖16:在缺乏可溶CEA的情況下,所示CEA-反應(yīng)性雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)定。使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞。該圖證明A240VL-A5VHxSEQIDNO.77VHVL、A240VL畫B9VHxSEQIDNO.77VHVL、A240VL-D8VHxSEQIDNO.77VHVL和A240VL-CEAIVHxSEQIDNO.77VHVL的細(xì)胞毒活性。圖17:在缺乏可溶CEA的情況下,所示CEA-反應(yīng)性雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)定。使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞。顯示SEQIDNO.77VHVLxA5VH-A240VL、SEQIDNO.77VHVLxB9VH-A240VL、SEQIDNO.77VHVLxD8VH-A240VL、SEQIDNO.77VHVLxCEAIVH-A240VL和SEQIDNO.77VHVLxCEAIVLVH對(duì)CEA+靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。圖18:在缺乏可溶CEA的情況下,所示CEA-反應(yīng)性雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)定。使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞.顯示SEQIDNO.77VHVLxA240VL-A5VH、SEQIDNO.77VHVLxA240VL畫B9VH、SEQIDNO.77VHVLxA240VL-D8VH、以及SEQIDNO.77VHVLxA240VLCEAIVH和SEQIDNO.77VHVLxCEAIVLVH的細(xì)J包毒活性。圖19:在增加量的可溶CEA抗原存在下,所示CEA-反應(yīng)性雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)定。使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞。該圖證明人雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體對(duì)可溶CEA抗原的細(xì)胞毒活性的抗性,如A5VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL和B9VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL所示例。圖20:在增加量的可溶CEA抗原存在下,所示CEA-反應(yīng)性雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)定。使用刺激的人CD8P日性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞。人雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體D8VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL和CEAIVH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL也顯示對(duì)可溶CEA抗原的抗性。圖21:在缺乏可溶CEA的情況下,所示CEA-反應(yīng)性雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)T細(xì)胞裂解用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。為了證明該重新指導(dǎo)的裂解的特異性,使用未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞作為陰性對(duì)照。使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞。A240VI^B9VHxSEQIDNO.77VHVL、SEQIDNO.77VHVLxA240VbB9VH、SEQIDNO.77VHVLxB9VH-A240VL、B9VH—A240VLxSEQIDNO.77VHVL和SEQ毒活性。圖22:在增加量的可溶CEA抗原存在下,所示CEA-反應(yīng)性雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)T細(xì)胞裂解CHO-CEA+細(xì)胞。使用刺激的人CD8+T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。A240VL"B9VHxSEQIDNO/77VHVL-介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性對(duì)可溶CEA具有抗性。圖23:雙特異性單鏈構(gòu)建體A240VL~B9VHxSEQIDNO.77VHVL的高分辨陽(yáng)離子交換色譜,藍(lán)線(上面的曲線)顯示該蛋白質(zhì)的全部電荷同工型。檢測(cè)到一個(gè)單獨(dú)的峰顯示該構(gòu)建體的高同質(zhì)性。圖24:蛋白質(zhì)穩(wěn)定性測(cè)定,基于在人血漿中孵育24小時(shí)后的細(xì)胞毒性評(píng)估。在缺乏可溶CEA的情況下,CEA-反應(yīng)性的雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞。該圖證明雙特異性單鏈構(gòu)建體A240VL~B9VHxSEQIDNO.77VHVL在人血漿中的血漿穩(wěn)定性。該構(gòu)建體的細(xì)胞毒活性在生理?xiàng)l件下不受到血漿蛋白質(zhì)的影響。圖25:雙特異性單鏈構(gòu)建體SEQIDNO.77VHVLxE12VH-A240VL的高分辨陽(yáng)離子交換色譜,藍(lán)線(上面的曲線)顯示該蛋白質(zhì)的全部電荷同工型。該圖證明該雙特異性單鏈構(gòu)建體SEQIDNO.77VHVLxE12VH-A240VL的同質(zhì)性。圖26:蛋白質(zhì)穩(wěn)定性測(cè)定,基于在人血漿中孵育24小時(shí)后的細(xì)胞毒性評(píng)估。在缺乏可溶CEA的情況下,CEA-反應(yīng)性的雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)用CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞。使用刺激的人CD8陽(yáng)性CTL作為效應(yīng)細(xì)胞。該圖證明雙特異性單鏈構(gòu)建體SEQIDNO.77VHVLxE12VH-A240VL在人血漿中的血漿穩(wěn)定性。該構(gòu)建體的細(xì)胞毒活性在生理?xiàng)l件下不受到血漿蛋白質(zhì)的影響。圖27:在增加量的可溶CEA抗原存在下,所示CEA-反應(yīng)性雙特異性單鏈構(gòu)建體重新指導(dǎo)T細(xì)胞裂解CHO-CEA+細(xì)胞。使用刺激的人CD8+T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞。雙特異性單鏈構(gòu)建體SEQIDNO.77VHVLxE12VH-A240VL-介導(dǎo)細(xì)胞毒活性,其對(duì)可溶CEA具有抗性。實(shí)施例以下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例l:使用人CEA(癌胚抗原有關(guān)的黏附分子5;CEACAM5)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)l包的產(chǎn)生使用CEA-陽(yáng)性KatoIII細(xì)胞(人胃癌細(xì)胞系;ATCCHTB-103)以獲得總RNA,根據(jù)試劑盒操作手冊(cè)(奇強(qiáng)公司(Qiagen),RNeasy迷你試劑盒)分離總RNA。通過(guò)隨機(jī)引物的反轉(zhuǎn)錄將獲得的RNA進(jìn)行cDNA合成。為了克隆CEA抗原的全長(zhǎng)序列,使用下列寡核苷酸5,CEACAM5EcoRIGAATTCGCCACCATGGAGTCTCCCTCGGCCCC(SEQIDNO.74)和3,CEACAM5SalIGTCGACCTATATCAGAGCAACCCC(SEQIDNO.75)。使用PCR(第一個(gè)循環(huán)在93。C變性5分鐘,在58t:退火l分鐘,在72。C延伸1分鐘;在93"C變性1分鐘,在58^C退火1分鐘,在72t:延伸1分鐘,進(jìn)行30個(gè)循環(huán);在72X:終末延伸5分鐘)擴(kuò)增編碼序列。接著用EcoRI和Sail消化PCR產(chǎn)物,連接到正確消化的表達(dá)載體pEF-DHFR,并且轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌。對(duì)分離的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序并且與已建立的CEACAM5的核苷酸序列(NM—004363在生物技術(shù)信息國(guó)家中心,http:〃www.ncbi.nlm,nih.gov/)進(jìn)行比較。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作手冊(cè)進(jìn)行上述方法(Sambrook,MolecularCloning;ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NewYork1989;2001)。將帶有發(fā)汪的核苷酸序列的克隆轉(zhuǎn)染進(jìn)入DHFR缺陷型CHO細(xì)胞用于該構(gòu)建體的真核表達(dá)。如在Kaufmann(KaufmannR.J"MethodsEnzymol.185(1990),537-566)所述執(zhí)行在DHFR缺陷型CHO細(xì)胞中的真核蛋白質(zhì)表達(dá)。通過(guò)增加MTX的濃度至終濃度高達(dá)20nMMTX來(lái)誘導(dǎo)構(gòu)建體的基因擴(kuò)增。然后使用FACS測(cè)定,測(cè)試轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的CEA抗原的表達(dá)。為此,將2.5、105個(gè)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與5jig/ml的鼠單克隆抗體COL-l(編號(hào)MS畫613-P1ABX,Neomakers;Fremont,CA,USA)孵育。使用R畫藻紅蛋白-綴合的親和純化的F(ab,)2片段、山羊抗-小鼠IgG、Fc-Y片段特異性抗體,在含有2%FCS(獲得自Dianova,Hamburg,德國(guó))的50jilPBS中以1:100稀釋以檢測(cè)抗體的結(jié)合。在FACS-Calibur(BectonDickinson,Heidelberg)通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析細(xì)胞。按照在當(dāng)代免疫學(xué)操作(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中所述執(zhí)行FACS染色和熒光強(qiáng)度的測(cè)量。結(jié)果是,轉(zhuǎn)染子證明人CEA抗原的清楚的陽(yáng)性染色。實(shí)施例2:CEAxCD3雙特異性單鏈抗體的產(chǎn)生一般而言,設(shè)計(jì)雙特異性單鏈抗體分子如表l所示,其各自包含具有對(duì)人CEA抗原結(jié)合特異性的結(jié)構(gòu)域以及具有對(duì)人CD3抗原的結(jié)合特異性的脫免疫的結(jié)構(gòu)域,如在SEQIDNO.77所述。在這一CD3結(jié)合結(jié)構(gòu)域中V區(qū)的排列通常是VH-VL。在如本文定義的雙特異性單鏈抗體中使用的這一脫免疫的抗-CD3結(jié)合結(jié)構(gòu)域先前已經(jīng)在例如WO2005/040220中#_描<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>文)所述的重組技術(shù)產(chǎn)生所述雙特異性單鏈構(gòu)建體。因此例如在wo99/054440中提供詳細(xì)的指導(dǎo)。抗-CD3結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于對(duì)人CD3抗原具有結(jié)合特異性的脫免疫的結(jié)構(gòu)域。在本文所述雙特異性單鏈構(gòu)建體中脫免疫的抗-CD3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的V區(qū)的排列總是VH-VL。所述VH-VL結(jié)構(gòu)域的對(duì)應(yīng)氨基酸序列描述于SEQIDNO.77。對(duì)人癌胚抗原特異性的CEAI、CEAII和CEAIII含有可變的輕鏈(VL)和可變的重鏈(VH)區(qū),分別衍生自mAbA5B7(Chester,K.A.等人,IntJCancer57(1994),67-72)、T84.66(Neimiaier,M.等人,CancerRes50(1990),2128-34)和MFE-23(Boehm,M.K.BiochemJ2(2000),519-28)。A5、B9、D8和E12是對(duì)人CEA特異性的人VH區(qū),而A240是具有相同特異性的人VL區(qū)。人A5、B9、D8、E12和A240V區(qū)的產(chǎn)生詳細(xì)描述于實(shí)施例6和7。本文描述的全部雙特異性單鏈抗體的相應(yīng)的核苷酸和氨基酸序列顯示在序列表中。以下更具體描述CEAIVLVHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.6)構(gòu)建體的產(chǎn)生??梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知范圍中的方法進(jìn)行必須的修飾來(lái)產(chǎn)生以上提到的其它構(gòu)建體。為了產(chǎn)生包舍上述CEAI特異性和脫免疫的抗-CD3(SEQIDNO.77)特異性的雙特異性單鏈抗體分子,首先必須通過(guò)PCR#^飾#據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作手冊(cè)通過(guò)基因合成獲得的CEAI的可變區(qū)以獲得相應(yīng)的單鏈Fv抗體片段。為此,使用兩步法的融合PCR擴(kuò)增編碼可變區(qū)的序列。設(shè)計(jì)合適的引物組來(lái)執(zhí)行基于PCR的克隆步驟,最后產(chǎn)生連接兩個(gè)以VL-接頭-VH的順序具有15個(gè)氨基酸的接頭([Gly4Ser3)的可變結(jié)構(gòu)域的單鏈抗體。簡(jiǎn)言之,使用下列引物組合<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>以下給出寡核苷酸引物的核苷,歹'J:5'CEAILH:5,AGGTGTACACTCCGACATTGAGCTCACCCAG3,(SEQIDNO.137)3CEAIVL接頭5"GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCTTTGATCTCGAGCTTGG3,(SEQIDNO.138)5'CEAIVH接頭5"GGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTCAGGTCCAACTGCAGGAG3,(SEQIDNO.139)3'CEAILH:5,AATCCGGAGGAGACGGTGACCG3,(SEQIDNO.140)為了產(chǎn)生單鏈抗體,如上PCR步驟1和2所述用各個(gè)引物組合進(jìn)行兩個(gè)PCR。在這一PCR期間,重疊的互補(bǔ)序列被引入PCR-產(chǎn)物(來(lái)自各自的接頭引物為莖(stemming)),在后繼的融合PCR中組合以形成15個(gè)氨基酸接頭的編碼序列。接著將擴(kuò)增的VH和VL結(jié)構(gòu)域加入這一融合PCR中,其中需要僅外引物和全部?jī)蓚€(gè)PCR-產(chǎn)物。產(chǎn)生的scFv抗體在5,末端側(cè)翼具有限制性酶BsrGI的識(shí)別位點(diǎn)并且在3'末端具有限制性酶BspEI的識(shí)別位點(diǎn)。加入BsrGI位點(diǎn)以允許在W02005/040220中所述的鼠免疫球蛋白前導(dǎo)肽的編碼序列按讀碼框融合。產(chǎn)生BspEI位點(diǎn)以允許CD3特異性單鏈抗體的編碼序列按讀碼框融合,以產(chǎn)生雙特異性單鏈抗體。為了實(shí)現(xiàn)單鏈Fv抗體的融合和允許真核表達(dá),經(jīng)由BsrGI和BspEI將CEA特異性單鏈Fv抗體的編碼序列克隆進(jìn)入含有如在WO2005/040220所述的脫免疫抗-CD3單鏈Fv抗體的pEFDHFR表達(dá)載體(pEFDHFR描述于Mack等人Proc.Natl,Acad.Sci.USA92(1995)7021-7025);在本發(fā)明中稱為SEQIDN0.77。分離該構(gòu)建體的單克隆并且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作使用與表達(dá)載體的側(cè)翼區(qū)互補(bǔ)的引物測(cè)序(Sambrock,MolecularCloning;ALaboratoryManual,笫2版編輯,ColdSpringHarbourlaboratoryPress,ColdSpringHarbour,NewYork(1989))。選擇帶有發(fā)逸的核苷酸序列的構(gòu)建體的克隆用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。2.CEAxCD3特異性單鏈抗體的表達(dá)和純化在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)雙特異性單鏈抗體。如Kaufmann(上述引文)中所迷在DHFR缺陷型CHO細(xì)胞中進(jìn)行真核蛋白質(zhì)表達(dá)。通過(guò)增加MTX的濃度至終濃度高達(dá)20nMMTX來(lái)誘導(dǎo)構(gòu)建體的基因擴(kuò)增。在靜止培養(yǎng)兩代之后使細(xì)胞在具有CHO改良的DMEM培養(yǎng)基(HiQ⑧,HiClone)的滾瓶中生長(zhǎng)7天,之后收獲。通過(guò)離心移去細(xì)胞,并且在-20'C保藏含有表達(dá)的蛋白質(zhì)的上清液。使用AktaFPLC系統(tǒng)(法瑪西亞公司(Pharmacia))和Unicorn⑧軟件用于色謙法。全部化學(xué)藥品為研究級(jí),并且購(gòu)自希格瑪公司(Sigma)(Deisenhofen)或默克公司(Merck)(Darmstadt)。根據(jù)廠商提供的操作說(shuō)明書使用Fractogd柱(默克公司)進(jìn)行固定化的金屬親和色鐠("IMAC"),該柱載有ZnCl2。用緩沖液A2(20mM砩酸鈉緩沖液pH7.5,0.4MNaCl)平衡該柱,并且將細(xì)胞培養(yǎng)物上清液以3ml/分鐘的流速加到柱(IOml)上。用緩沖液A2洗該柱以移去未結(jié)合的樣品。根據(jù)以下使用2步梯度緩沖液B2(20mM磷酸鈉緩沖液pH7.5、0.4MNaCl、0.5M咪唑)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)步驟l:以6柱體積的20。/。緩沖液B2,;步驟2:以6柱體積的100%緩沖液B2將從步驟2洗脫的蛋白質(zhì)片段集合用于進(jìn)一步純化。在用PBS(吉博公司(Gibco))平衡的SephadexS200HiPr印柱上進(jìn)行凝膠過(guò)濾色譜。將洗脫的蛋白質(zhì)樣品(流速1ml/分鐘)加入標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE并且用蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。純化之前校準(zhǔn)該柱用于分子量確定(分子量標(biāo)記物試劑盒,希格瑪公司MWGF-200)。使用蛋白質(zhì)測(cè)定染料(MicroBCA,皮而森公司(Pierce))和IgG(拜爾瑞德公司(Biorad))作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)來(lái)確定蛋白質(zhì)濃度。在IMAC和凝膠過(guò)濾的兩步純化過(guò)程中分離CEAxCD3雙特異性單鏈抗體。如通過(guò)凝膠過(guò)濾在PBS中所確定的,主要產(chǎn)物在天然條件下具有約52kDa的分子量。該分子量與雙特異性單鏈抗體相對(duì)應(yīng)。根據(jù)此方法純化全部構(gòu)建體。將純化的雙特異性單鏈抗體于還原條件下用預(yù)凝4-12%雙丙烯酰胺Tris凝膠(英杰公司(Invitrogen))進(jìn)行的SDSPAGE中分析。根據(jù)廠商提供的操作手冊(cè)進(jìn)行樣品制備和應(yīng)用。使用多標(biāo)記物蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(英杰公司)確定分子量。用膠體考馬斯(英杰公司操作手冊(cè))染色凝膠。通過(guò)SDS-PAGE確定分離的蛋白質(zhì)純度>95%。根據(jù)廠商提供的操作手冊(cè),使用OptitranBA-S83膜和英杰公司印跡模塊進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。使用針對(duì)His標(biāo)簽(五個(gè)His,奇強(qiáng)公司(Qiagen))的抗體,和堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的山羊-抗-小鼠的Ig(希格瑪公司),并且用BCIP/NBT(希格瑪公司)作為底物??梢酝ㄟ^(guò)蛋白質(zhì)印跡特異性的檢測(cè)雙特異性單鏈抗體。在52kD對(duì)應(yīng)于純化的雙特異性單鏈抗體分子的位置檢測(cè)到單個(gè)的條帶。3.CEAxCD3雙特異性單鏈抗體的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)合分析為了檢測(cè)構(gòu)建體關(guān)于對(duì)膜結(jié)合的人CEA和人CD3的結(jié)合能力的功能,進(jìn)行FACS分析。為此目的,使用人CEA-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞和CD3陽(yáng)性的人T細(xì)月包白血病細(xì)月包系HPB-A11(DSMZ,Braunschweig,ACC483)。200000個(gè)CEA陽(yáng)性的CHO細(xì)胞或200000個(gè)HPB-AH細(xì)胞與50pl的CHO細(xì)胞培養(yǎng)物的純細(xì)胞上清液在冰上孵育30分鐘,所述CHO細(xì)胞培養(yǎng)物各所述)。細(xì)胞在PBS中洗兩次并且用未標(biāo)記的鼠五His抗體(在具有2%FCS的50filPBS中以l:20稀釋;奇強(qiáng)公司)檢測(cè)構(gòu)建體的結(jié)合,所述抗體經(jīng)由構(gòu)建體的C-末端組氨酸標(biāo)簽特異性結(jié)合于結(jié)合細(xì)胞的構(gòu)建體。接著清洗以除去未結(jié)合的鼠五His抗體。用FcY-特異性抗體(Dianova)檢測(cè)結(jié)合的抗-His抗體,所述Fcy-特異性抗體與藻紅蛋白綴合,在具有2。/。FCS的50PBS中以1:100稀釋。使用單克隆抗體Col-l(見(jiàn)實(shí)施例3)作為結(jié)合人CEA的陽(yáng)性對(duì)照。4吏用如在WO99/054440所述CD19xCD3鼠特異性單鏈構(gòu)建體作為結(jié)合人CD3的對(duì)照。使用新鮮的培養(yǎng)液作為代替培養(yǎng)物上清的陰性對(duì)照。通過(guò)流式細(xì)J包計(jì)數(shù)(FACS-Calibur;BeetonDickinson,Heidelberg)分析細(xì)胞。如在現(xiàn)代免疫學(xué)操作(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach和Strober,Wiley-Interscience,2002)中所述進(jìn)行FACS染色和測(cè)量熒光強(qiáng)度。如在圖1所示,雙特異性單鏈抗體的幾個(gè)結(jié)構(gòu)域的排列,即,CEAIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.8)、CEAIVLVHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.6)、CEAIIVHVLxSEQIDNO-77VHVL(SEQIDNO.10)、CEAIIIVLVHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.12)和CEAIIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.14),結(jié)合于人膜結(jié)合的CEA和人CD3。使用培養(yǎng)液和1和2檢測(cè)抗體作為陰性對(duì)照。實(shí)施例3:CEAxCD3雙特異性抗體與可溶人CEA的結(jié)合為了確定對(duì)可溶人CEA的特異性,在ELISA中測(cè)試多種CEAxCD3雙特異性單鏈抗體。為此,首先生物素化可溶人CEA抗原。在含有5%DMSO(希格瑪公司)的PBS中完成生物素化,其中有15倍摩爾的過(guò)量的EZ-連接硫代NHS-LC-LC-生物素(皮而森公司),在室溫于樣品混合器(丹奈爾公司(Dynal》內(nèi)l小時(shí)。為了分離游離的生物素和生物素化的CEA抗原,才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作將該測(cè)定對(duì)PBS過(guò)度透析。在ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)中確定生物素標(biāo)記的CEA的保留的生物活性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行直接的ELISA以確定CEAxCD3雙特異性單鏈抗體對(duì)可溶人CEA的特異性。簡(jiǎn)言之,通過(guò)在4'C孵育約16小時(shí)將50pi/孔PBS或可溶生物素化的人CEA(Abeam;5fig/ml在1xPBS中)固定于96孔鏈霉抗生物素包被的ELISA平板(南斯公司(Nunc))上。每孔用200pi水清洗之后,加入200fil封閉溶液(PBS/3。/。BSA)。在室溫封閉1小時(shí)之后,移去封閉溶液。全部后續(xù)的清洗(200pl/孔的lxPBS/0.05%(v/v)吐溫20)和孵育步驟在室溫進(jìn)行。清洗一次之后,將CEAIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.8;抗-CEA部分衍生自mAbA5B7)、CEAIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.10;抗-CEA部分衍生自mAbT84.66)和CEAIIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.14;抗畫CEA部分衍生自mAbMFE-23)雙特異性單鏈抗體和小鼠單克隆抗體CEA/CD66Ab-3(Col-1;Dunn)以不同濃度(0.5jig/ml和5jig/ml在1xPBS;50^1/孔)孵育1小時(shí)。加入lxpBS(50ji!/孔)作為非特異性結(jié)合的對(duì)照。洗涂3次之后加入50pI/孔五-HisIgG(奇強(qiáng)公司;2ng/ml在1xPBS中)用于檢測(cè)His-標(biāo)記的雙特異性單鏈抗體。接著,洗孔三次,并且與50^1的辣根過(guò)氧化物酶-標(biāo)記的山羊抗-小鼠FcY-特異性抗體(杰克遜免疫研究(JacksonImmuneResearch);1:1000在1xPBS中)孵育1小時(shí)。洗三次后通過(guò)加入ABTS底物溶液(羅氏)使ELISA顯影并且在405nm的波長(zhǎng)測(cè)量光吸收。圖2顯示在ELISA檢測(cè)的不同雙特異性單鏈抗體的光吸收。CEAIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.8;抗-CEA部分衍生自mAbA5B7)、CEAIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.10;抗-CEA部分衍生自mAbT84.66)和CEAIIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.14;抗-CEA部分衍生自mAbMFE-23)雙特異性單鏈抗體和小鼠單克隆抗體Col-l特異性結(jié)合于可溶人CEA。在缺乏CEA抗原(PBS對(duì)照)時(shí)沒(méi)有觀察到結(jié)合信號(hào)??傊?,衍生自mAbA5B7、T84.66和MFE-23的抗-CEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域同時(shí)結(jié)合可溶和膜結(jié)合的CEA。實(shí)施例4:CEAxCD3雙特異性單鏈抗體的生物活性通過(guò)體外鉻釋放細(xì)胞毒性測(cè)定分析產(chǎn)生的CEAxCD3雙特異性單鏈抗體的生物活性,分別使用人胃癌細(xì)胞系KatoIII或人CEA-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)刺激的CD8+T細(xì)胞的產(chǎn)生執(zhí)行如下培養(yǎng)皿(直徑145ram,greinerbio-one)用抗-CD3抗體(OKT3Janssen-CilagGmbH,Orthoclonelmg/ml;終濃度ljig/ml)和抗國(guó)CD28抗體(BD,lmg/ml;終濃度1將/ml)在37X:預(yù)包被1小時(shí)。孵育之后,通過(guò)用PBS—次清洗除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作通過(guò)聚糖體梯度離心從外周血(30-50ml)分離新鮮的PBMC。將3-5x107的PBMC加入預(yù)包祐_的培養(yǎng)皿的150ml的RPMI1640/10。/。FCS/IL曙220U/ml(Proleukin,Chiron)中,并且刺激2天。在第3天收集細(xì)胞,用RPMI1640洗1次和轉(zhuǎn)移至大的T-燒瓶。加入IL-2至終濃度為20U/ml并且再次孵育1天。按照操作的指示在CD8陰性分離試劑盒(丹奈爾生物技術(shù)(DynalBiotech))的幫助下分離CD8+CTL。在聚糖體梯度離心之后直接使用天然的PBMC而沒(méi)有刺激步驟。用PBS洗靶標(biāo)細(xì)胞兩次并且用11.1MBq"Cr在含有50。/。FCS的100piRPMI的終體積中37。C標(biāo)記45分鐘。接著,用5mlRPMI洗標(biāo)記的耙標(biāo)細(xì)胞3次,和然后用于細(xì)胞毒性測(cè)定。該測(cè)定在96孔圓底平板中總體積250fil的補(bǔ)料RPMI(如上)中進(jìn)行,具有E:T比率為10:1對(duì)應(yīng)于每孔5000個(gè)革巴標(biāo)細(xì)胞和50000個(gè)效應(yīng)細(xì)胞。為了評(píng)估構(gòu)建體,在測(cè)定體積中使用起始濃度為l照/ml的雙特異性單鏈分子并且對(duì)其12次三倍稀釋。測(cè)定時(shí)間為18小時(shí),且按照在上清液中釋放的鉻的相對(duì)數(shù)值測(cè)量細(xì)胞毒性,該數(shù)值與最大裂解(加入Triton-X)和自發(fā)裂解(沒(méi)有效應(yīng)細(xì)胞)的差異有關(guān)。全部測(cè)量以一式三份進(jìn)行。用向?qū)?y計(jì)數(shù)器(PerkinElmerLifeSciencesGmbH,K(iln,德國(guó))對(duì)上清液中鉻的活性進(jìn)行測(cè)量。執(zhí)行視窗的Prism4(4.02版本,GraphPad軟件公司,SanDiego,California,USA)來(lái)測(cè)量在上清液中的鉻活性。如通過(guò)軟件確定的S形的劑量應(yīng)答曲線通常具有W值X).卯。使用通過(guò)分析程序計(jì)算的ECso值用于生物活性的比較。圖3顯示多種結(jié)構(gòu)域排列,即,SEQIDNO.77VHVLxCEAIVHVL(SEQIDNO.4)和SEQIDNO.77VHVLxCEAIVLVH(SEQIDNO.2)(兩個(gè)構(gòu)建體都具有N末端的抗-CD3部分)、以及CEAIVLVHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.6)和CEAIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.8)(抗-CD3C-末端)的抗人CEA-轉(zhuǎn)染的靶標(biāo)細(xì)胞(CHO-CEA+細(xì)胞)的細(xì)胞毒活性。使用未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞(缺少人CEA)作為陰性對(duì)照。在圖4中,CEAIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.8)、CEAIIIVLVHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.12)、CEAIIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.14)和CEAIIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.10)呈現(xiàn)對(duì)人CEA-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。使用未轉(zhuǎn)染的CHO(缺少人CEA)作為陰性對(duì)照。如前所述,CEAI指從鼠mAbA5B7衍生的可變區(qū),CEAII是從鼠mAbT84.66衍生的可變區(qū)和CEAIII指從鼠mAbMFE-23衍生的可變區(qū)??傊?,全部測(cè)試的構(gòu)建體在缺乏可溶人CEA時(shí)顯示對(duì)表達(dá)(人)CEA的KatoIII和轉(zhuǎn)染人CEA的CHO細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。實(shí)施例5:在可溶CEA抗原存在下CEAxCD3雙特異性單鏈抗體的特異性生物活性。除了在多種濃度的可溶人CEA抗原的存在下測(cè)試CEAxCD3雙特異性單鏈抗體的生物活性之外,按照在實(shí)施例4中所述執(zhí)行竟?fàn)帨y(cè)定。使用的溶解的人CEA抗原(AbCAMLtd.CambridgeUK)是從單個(gè)患者肝臟的轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌分離。實(shí)驗(yàn)上,通過(guò)在加入細(xì)胞前將給定量的雙特異性單鏈抗體與增加量的可溶人CEA抗原(或者O|Ltg/ml;0.1pg/ml;1ng/ml,或者0jig/ml;0.004ng/ml;0.02jug/ml;O.lpg/ml;0.5|ug/ml;1jug/ml)在37'C預(yù)孵育30分鐘來(lái)進(jìn)行竟?fàn)帨y(cè)定。如在實(shí)施例4中所述執(zhí)行測(cè)定的其余部分。這些竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖5-11。具有衍生自mAbT84.66的抗-CEA部分的雙特異性單鏈抗體CEAHVHVLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.10;見(jiàn)圖7和9-11),和具有衍生自mAbMFE-23的抗-CEA區(qū)的CEAIIIVLVHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.12;見(jiàn)圖8)對(duì)人CEA-陽(yáng)性的靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性受到增加量的可'溶人CEA抗原徹底的抑制。如上所述,所述構(gòu)建體同時(shí)結(jié)合于膜結(jié)合的和可溶人CEA抗原,見(jiàn)例如實(shí)施例2和3以及圖l和2。因此,最可能的,可溶人CEA阻止所述雙特異性單鏈抗體的抗-CEA部分結(jié)合于耙標(biāo)細(xì)胞上,例如CHO-CEA+或KatoIII腫瘤細(xì)胞的膜結(jié)合的人CEA,由此抑制通過(guò)所述抗體構(gòu)建體介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性。相反,已經(jīng)驚奇的發(fā)現(xiàn)具有衍生自mAbA5B7的抗-CEA部分的雙特異性單鏈抗體對(duì)可溶人CEA具有耐受性例如,由CEAIVLVHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO,6;見(jiàn)圖5)、CEAIVHVLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.8;見(jiàn)圖5、8和10)、SEQIDNO.77VHVLxCEAIVHVL(SEQIDNO.4;見(jiàn)圖6)和SEQIDNO.77VHVLxCEAIVLVH(SEQIDNO.2;見(jiàn)圖6)介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性不被增加量,甚至不被高濃度(l嗎/ml)的可溶人CEA抑制。考慮到所述雙特異性單鏈抗體的抗-CEA部分結(jié)合可溶人CEA(圖2),這是意料之外的。而且,已經(jīng)預(yù)期增加量的可溶人CEA抑制對(duì)CEA陽(yáng)性的耙標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性,因?yàn)門84.66-和MFE-23-衍生的構(gòu)建體是這種情況;見(jiàn)上。因此,本發(fā)明提供了在甚至高水平的可溶CEA抗原存在下具有細(xì)胞毒抗肺瘤活性的藥物組合物。因此,這些藥物組合物是特別適用于治療在其血漿中具有高的可溶CEA抗原濃度的腫瘤患者,例如具有發(fā)展的上皮腫瘤、遷移的上皮腫瘤、高的腫瘤負(fù)荷/負(fù)擔(dān)、晚期上皮腫瘤的患者或具有CEA血清濃度高于100ng/ml(如通過(guò)ELISA確定)的腫瘤患者。實(shí)施例6:人VL區(qū)的選擇當(dāng)向癌患者施用時(shí),為了提供具有減少的免疫原性的藥物組合物,已經(jīng)產(chǎn)生了對(duì)可溶CEA抗原具有抗性的人雙特異性單鏈抗體。在第一個(gè)步驟中,已經(jīng)分離了對(duì)可溶CEA具有抗性的人VL區(qū)。因此,這一實(shí)驗(yàn)的目的是選擇人VL區(qū),其能夠與母本的單克隆抗體(mAb)A5B7的鼠VH匹配。1.可溶人CEA抗原的生物素化為了噬菌體文庫(kù)選擇,將可溶的CEA抗原生物素化。在含有5%DMSO(希格瑪公司)的PBS中完成生物素化,其中有1S倍摩爾的過(guò)量的EZ-連接硫代NHS-LC-LC-生物素(皮而森公司),在室溫于樣品混合器(丹奈爾公司)內(nèi)l小時(shí)。為了分離游離的生物素和生物素化的CEA抗原,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作將該測(cè)定對(duì)PBS過(guò)度透析。在ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)中確定生物素標(biāo)記的CEA的保留的生物活性。2.從人B-細(xì)胞分離RNA從五個(gè)健康人供體采集100mL血。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)聚糖體-梯度分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。按照操作指南使用RNeasyMidi試劑盒(奇強(qiáng)公司)分離總RNA。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook,ColdSpringHarborLaboratoryPress1989,2001)合成cDNA。3.可變輕鏈區(qū)(VL-區(qū))的PCR-擴(kuò)增進(jìn)行RT-PCR來(lái)分離輕鏈V-區(qū)DNA,使用V-k-(5,-huVKl-SacI-2001(5-GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCC-3,)(SEQIDNO.78)、5,-huVK2/4-SacI-2001(5,-GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGATGACyCAGTCTCC-3,)(SEQIDNO.79)、5-huVK3-SacI國(guó)2001(5,-GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGwTGACrCAGTCTCC-3,)(SEQIDNO.80)、5,huVK5-SacI-2001(5隱GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCACACTCACGCAGTCTCC-3,)(SEQIDNO.81)、5,-huVK6-SacI-2001(5,陽(yáng)GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGCTGACTCAGTCTCC國(guó)3,)(SEQIDNO.82)、3-hu-Vk-Jl國(guó)Spel-BsiWI(5,-GACGACACTAGTTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCC-3,)(SEQIDNO.83)、3,-huVkJ2/4-SpeI-BsiWI(5,-GACGACACTAGTTGCAGCCACCGTACGTTTGATCTCCAsCTTGGTCC-3)(SEQIDNO.84)、3-hu-Vk畫J3-Spel畫BsiWI(5,-GACGACACTAGTTGCAGCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCC-3,)(SEQIDNO.85)、3畫hu畫Vk-J5-Spel-BsiWI(5'-GACGACACTAGTTGCAGCCACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCC-3,)(SEQIDNO.86))和V入(5-huVLla-SacI-2001(GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGTTGACGCAGCCGCCCTC)(SEQIDNO.87)、5-huVLlb-SacI-2001(GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGCTGACTCAGCCACCCTC)(SEQIDNO.88)、5-huVL2SacI-2001(GAGCCGCAGGAGCCCGAGCTCGCCCTGACTCAGCCTSCCTCCGT)(SEQIDNO.89)、5huVL4-SacI國(guó)2001(ACCTGCGAGCTCGTGCTGACTCARYCMYCCTCTGC)(SEQIDNO.90)、5'-huVL5-SacI-2001(ACCTGCGAGCTCGTGCTGACTCAGCCRSCTTCC)(SEQIDNO.91)、5huVL6-SacI誦2001(ACCTGCGAGCTCATGCTGACTCAGCCCCACTC)(SEQIDNO.92)、5-huVL3/9-SacI-2001(GAGCCGCACGAG5-huVL7/8-SacI-2001(GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGGTGACYCAGGAGCCMTC)(SEQIDNO.94)、3'-hu-Vlam-BlnI-SpeI-2001(CGTGGGACTAGTCTTGGGCTGACCTAGGACGGT)(SEQIDNO.95)、3'國(guó)hu-Vlam2-Blnl-Spel-2002:CGTGGGACTAGTCTTGGGCTGACCGAGGACGGT)(SEQIDNO.96)引物組。將來(lái)自人B-細(xì)胞的RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA(如上所述)并且用在PCR反應(yīng)中作為模板。每個(gè)PCR反應(yīng),將一個(gè)5,-引物與一個(gè)3,-引物組合。通過(guò)多個(gè)5,-和3,-引物的可能的組合確定不同PCR反應(yīng)的數(shù)目。使用下列PCR-程序進(jìn)行擴(kuò)增在94。C變性15秒;其次,引物在52匸退火50秒和在72。C延伸90秒,執(zhí)行超過(guò)40個(gè)循環(huán);接著在72'C最后延伸IO分鐘。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作手冊(cè)分離輕鏈DNAV-片段。4.文庫(kù)構(gòu)建-人VL庫(kù)的克隆通常基于標(biāo)準(zhǔn)操作構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù),例如在"PhageDisplay:ALaboratoryManual";Barbas,Burton,Scott和Silverman編輯;ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001所公開的。對(duì)于輕鏈V-片段,選擇用于PCR擴(kuò)增的引物,產(chǎn)生5,-SacI和3,-SpeI識(shí)別位點(diǎn)。建立四個(gè)連接反應(yīng),每個(gè)由400ng的輕鏈片段(SacI-SpeI消化;2xk和2xA)和1400ng的噬菌粒(SacI-SpeI消化,大片段;這一載體描述在Dr.RalfLutterbttse的學(xué)術(shù)演講中)組成。接著通過(guò)電穿孔(2.5kV,0.2cm槽樣品池,25mF,200歐姆,拜爾瑞德基因-脈沖儀)將四個(gè)產(chǎn)生的抗體V-輕鏈庫(kù)各自轉(zhuǎn)化進(jìn)入300jiL的電感受態(tài)大腸桿菌XLlBlue,產(chǎn)生文庫(kù)大小為Kl:2xl08k2:6xl07XI:9xl07k2:6xl07的獨(dú)立的克隆。對(duì)于每個(gè)連接,來(lái)自不同PCR擴(kuò)增的K(輕鏈)DNA-片段衡量(weight)如下各個(gè)5,-引物限定特異性的組。在這些組內(nèi),3,-引物限定亞組。K亞組衡量為1:2:1:1,對(duì)應(yīng)引物3,-hu-Vk-Jl-SpeI-BsiWI:3,-hu-Vk-J2/4-Spel畫BsiWI:3,-hu誦Vk-J3-Spel-BsiWI:3'-hu-Vk-J5-Spel-BsiWI。根據(jù)它們的種系分布對(duì)該組衡量為1:1:1:0.2:0.2,對(duì)應(yīng)引物5'-huVKl-Sac-2001:5,-huVK3國(guó)Sac-2001:5'畫huVK2/4-Sac-2001:5'-huVK5-Sac曙2001:5,畫huVK6-Sac畫2001。對(duì)于各個(gè)連接,來(lái)自不同PCR擴(kuò)增的M輕鏈)DNA-片段被衡量如下各個(gè)5,-引物限定特異性的組。在這些組內(nèi),3,-引物限定亞組。該X亞組被衡量為3:1,對(duì)應(yīng)于引物3'-hu-Vlam-Blnl-Spel-2001:3-hu畫Vlam2-Blnl-Spel-2002。根據(jù)它們的種系分布對(duì)該組衡量為1:1:2:2:2:3,對(duì)應(yīng)引物5-huVLla-SacI-20015'-huVLlb-SacI畫2001:5-huVL2-Sac1-2001:5-huVL4-SacI-2001+5'-huVL5畫SacI畫2001:5huVL6-SacI-2001+5'-huVL7/8-SacI-2001:5'-huVL3/9國(guó)SacI國(guó)2001。電穿孔之后,將各個(gè)反應(yīng)在SOC肉湯(Fluka)中孵育用于表型表達(dá)。兩個(gè)K培養(yǎng)物以及兩個(gè)A培養(yǎng)物被組合。然后,產(chǎn)生的K培養(yǎng)物和產(chǎn)生的入培養(yǎng)物各自被置于含有50ng/mL羧千西林和2%w/v葡萄糖的500mL的SB選擇培養(yǎng)基中孵育過(guò)夜。第二天,通過(guò)離心收獲細(xì)胞,并且使用可商購(gòu)的質(zhì)粒制備試劑盒(奇強(qiáng)公司)進(jìn)行質(zhì)粒制備。5.抗體文庫(kù)-人VL-母本VH的構(gòu)建執(zhí)行PCR來(lái)擴(kuò)增來(lái)自含有所述母本VH的載體的mAbA5B7的母本VH。為了擴(kuò)增,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法執(zhí)行PCR操作如下,使用5,-引物5-AVH畫XhoI(5-GTCACACTCGAGTCAGGAGGAGGCTTGGTAC-3)(SEQIDNO.97)和3,畫引物3,-AVH-BstEI1(5,-GTCACAGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3,(SEQIDNO.98)。在從分析的瓊脂糖凝膠純化約350bp擴(kuò)增產(chǎn)物之后,用限制酶BstEII和Xhol切DNA片段。相應(yīng)的消化噢菌粒pComb3H5BHis(該載體描迷在Dr.RalfLutterbiise的學(xué)術(shù)演講中)并且將大的片段與上述片段連接。轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌XLlblue之后,在100mLSB培養(yǎng)基(含有50將/mL羧節(jié)西林)中培養(yǎng)單個(gè)克隆,并且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作制備質(zhì)粒。通過(guò)測(cè)序插入片段確定成功的克隆(Sequiserve,Munich)。用限制酶Sacl和Spel切該載體pComb3H5BHis/mAbA5B7的母本VH。分離大的載體片段。用限制酶Sacl和Spel切割含有Vk-和VX文庫(kù)的質(zhì)粒-DNA。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作分離小的Vk-和各自的V入片段(各自約350bp)。將1200ng的載體與200ng的載體片段Vk和V入片段的混合物各自連接。通過(guò)電穿孔(2,5kV,0.2cm槽樣品池,25mF,200歐姆)將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入300jiL的電感受態(tài)大腸桿菌XLlBlue,產(chǎn)生大小為1.2xl()s個(gè)獨(dú)立克隆的總scFv文庫(kù)。表型表達(dá)和緩慢適應(yīng)羧千西林之后,將抗體文庫(kù)轉(zhuǎn)移進(jìn)入SB-羧千西林(50照/mL)選擇培養(yǎng)基。接著用感染劑量為1x1012個(gè)顆粒的輔助噬菌體VCSM13感染抗體文庫(kù),導(dǎo)致絲狀M13噬菌體的產(chǎn)生和分泌,其中各個(gè)喧菌體顆粒含有單鏈的pComb3H5BHis-DNA,編碼半-人scFv誦片段并且作為與噬菌體外殼蛋白質(zhì)III的翻譯融合物展示相應(yīng)的scFv-蛋白質(zhì)。6.人VL的噬菌體展示選擇通過(guò)PEG8000/NaCl沉淀和離心從培養(yǎng)物上清液收獲帶有scFv-所有組成成份的噬菌體顆粒。接著,將約為1x10"至1x1012的scFv噬菌體顆粒重懸在0.5mL的TBS/1%BSA中并且與生物素化的可溶CEA孵育,其在ELISA平板(南斯公司)的鏈霉親和素包被的孔中被固定化1小時(shí)。在鏈霉親和素包被的孔中將10jig抗原/mlPBS溶液(50pl)于4"C孵育過(guò)夜,用水洗一次,接著用200jil的在TBS中的3%BSA在37'C封閉1小時(shí),在孵育后除去封閉液。使用TBS/0.05。/o吐溫通過(guò)清洗步驟除去非特異性結(jié)合于靶標(biāo)抗原的scFv謹(jǐn)菌體。在下一輪中重復(fù)這一清洗步驟高達(dá)10次。清洗之后,通過(guò)使用HCl-甘氨酸,pH2.2洗脫結(jié)合的實(shí)體。用2MTris,pH12中和之后,使用洗脫物感染新鮮的未感染的大腸桿菌XLlBlue培養(yǎng)物。為了洗脫剩余的高結(jié)合實(shí)體,向孔中加入50nL的新鮮大腸桿菌XL1Blue培養(yǎng)物(OD60020.5)并且孵育15分鐘。然后混合兩種培養(yǎng)基,并且對(duì)用編碼人scFv-片段的噬菌??截惓晒D(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞再次篩選羧節(jié)西林抗性,和接著用VCMS13輔助噬菌體感染開始第二輪抗體展示和體外選擇。從大腸桿菌培養(yǎng)物分離與4輪淘選對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒DNA。為了產(chǎn)生可溶的scFv-蛋白質(zhì),從質(zhì)粒切割VH-VL-DNA片段(XhoI-SpeI),并且經(jīng)由在質(zhì)粒pComb3H5BFlag/His中的相同限制位點(diǎn)克隆,其中該表達(dá)構(gòu)建體(例如scFv)在scFv和His6-標(biāo)簽之間包括Flag-標(biāo)簽(TGDYKDDDDK)(SEQIDNO.99),并且刪除另外的噬菌體蛋白質(zhì)。連才妾之后,將質(zhì)粒DNA的各個(gè)集合(不同輪的淘選)轉(zhuǎn)化進(jìn)入100熱休克的感受態(tài)大腸桿菌TG1并且在羧千西林LB-瓊脂上鋪板。挑出單個(gè)的菌落并且接種于96孔平板(格瑞納公司(Greiner))中的120pL的LB羧芐西林(50照/mL)1%葡萄糖中。用半透膜(格瑞納公司)封孔并且將平板在37。C于震搖孵育器(總平板)中孵育過(guò)夜。然后將IO^L的總平板培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移進(jìn)入第二個(gè)96孔平板(工作平板),每孔含有卯nLLB羧芐西林(50照/mL)0.1。/。葡萄糖。在37X:震搖孵育器中孵育4小時(shí)之后,通過(guò)向每個(gè)孔加入20jiLLB羧千西林6mMIPTG誘導(dǎo)scFv產(chǎn)生。在30t!震搖過(guò)夜的另一孵育步驟之后,細(xì)胞在室溫與40uL裂解緩沖液(400mM硼酸、3加mMNaCl、4mMEDTApH8、2.5mg/mL溶菌酶)孵育裂解1小時(shí)。通過(guò)在1900xg(Hettich)離心12分鐘分離剩余的細(xì)胞和細(xì)胞碎片。然后測(cè)試含有scFv分子的上清液在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)合測(cè)定中的結(jié)合。使用用人CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞作為CEA-陽(yáng)性的細(xì)胞系。通過(guò)用含有人scFv或有關(guān)對(duì)照的胞質(zhì)制備物原始孵育100000和200000之間的細(xì)胞來(lái)執(zhí)行細(xì)胞結(jié)合測(cè)定。孵育之后,在PBS/1。/。FCS(胎牛血清)中清洗細(xì)胞和進(jìn)一步與5-10照/ml的抗-FLAGM2抗體(希格瑪公司)孵育。再次清洗細(xì)胞之后,將其與多克隆、PE-標(biāo)記的抗-小鼠抗體(迪艾諾瓦公司(Dianova))孵育,并且隨后通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。測(cè)試約600個(gè)克隆在CEA-陽(yáng)性CHO細(xì)胞上的結(jié)合信號(hào)。獲得27個(gè)陽(yáng)性克隆。分別測(cè)序scFvDNA之后,獲得總共9個(gè)不同的序列。圖12描述了通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析測(cè)量的九個(gè)不同的半-人scFv(即,鼠A5B7VH-人VL)構(gòu)建體對(duì)不同細(xì)胞系的結(jié)合。該圖含有多個(gè)圖表,每個(gè)測(cè)試的構(gòu)建體一個(gè)。在任何給出的圖表中,黑色的分布顯示在缺乏任何構(gòu)建體但是具有全部用于檢測(cè)scFvs的合適的檢測(cè)物質(zhì)時(shí)僅與PBS單獨(dú)賻育的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。以這一方式,觀察到的任何熒光變化可以被明確的歸因于scFv構(gòu)建體而非檢測(cè)物質(zhì)或緩沖液。熒光的變化(其為構(gòu)建體結(jié)合至各個(gè)細(xì)胞系的指示)是通過(guò)在各自圖表的灰色線描述的。通常更高程度的遠(yuǎn)離,即更遠(yuǎn)于(黑色)對(duì)照的變化表示更強(qiáng)的結(jié)合,而更低程度的遠(yuǎn)離,即更接近于(黑色)對(duì)照的變化表示更弱的結(jié)合。從圖12可見(jiàn),與各自的對(duì)照相比,構(gòu)建體A-121、A-183、A-240、A-313、A-290、A-315、A4-35、A4-52、MP2-A5顯示在熒光強(qiáng)度的清楚的可辨別的變化,表示scFv與在CHO靶標(biāo)細(xì)胞上的膜結(jié)合的CEA的結(jié)合。在以下,已經(jīng)選擇了人VL區(qū)的scFvA-240(SEQIDNO.48)并且用于分離人VH區(qū)。所述人VL區(qū)描述在SEQIDNO.63(核苷^列)和64(氨基酸序列)。實(shí)施例7:抗體文庫(kù)的構(gòu)建和對(duì)可溶CEA抗原具有抗性的人VH區(qū)的噬菌體展示篩選下列實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是選擇對(duì)可溶CEA抗原具有抗性的人VH區(qū)的組,其與scFvA-240的人VL區(qū)匹配,篩選如實(shí)施例6中所述。所述人VL區(qū)描述在SEQIDNO.63(核苷酸序列)和64(氨基酸序列)。1.從外周血單核細(xì)胞(PBMC)分離RNA從五個(gè)健康人供體采集100mL血。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)聚糖體-梯度分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。按照操作者指南使用RNeasyMidi試劑盒(奇強(qiáng)公司)分離總RNA。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook,ColdSpringHarborLaboratoryPress1989,2001)合成cDNA。2.可變重鏈區(qū)(VH-區(qū))的PCR-擴(kuò)增構(gòu)建VH文庫(kù)并且命名為文庫(kù)134-VH。這一VH-文庫(kù)由FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的人所有組成成份組成,其來(lái)自上述PBMC庫(kù)的PCR擴(kuò)增的VH區(qū),然后通過(guò)人FR4種系序列有效連接于母本抗體的VHCDR3。為了分離人模板VH區(qū),使用5,-VH-特異性引物組(5-huVHl,3,5-XhoI國(guó)2001(5,-AGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG-3,)(SEQIDNO.100)、5,-huVH4-XhoI-2001(5,-CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG-3,)(SEQIDNO.101)、5,-huVH4B-XhoI-2001(5,-CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGG隱3,)(SEQIDNO.102))和兩個(gè)3,-VH-特異性引物(3,-hu-VH-BstEII-2001(5,-CTGAGGAGACGGTGACC國(guó)3,)(SEQIDNO.103)、3,-hu-VH-J3-BstEII-2001(5,-CTGAAGAGACGGTGACC-3,)(SEQIDNO.104)的組執(zhí)行RT-PCR。每個(gè)PCR反應(yīng),使用一個(gè)3,-引物與一個(gè)5,-引物組合,通過(guò)5,-和3,-引物的可能的組合數(shù)來(lái)確定不同的PCR反應(yīng)數(shù)目。使用五個(gè)供體的PBMCcDNA作為VH基因的來(lái)源。使用下列PCR程序用于擴(kuò)增在94'C變性15秒;引物在52'C退火50秒和在72'C延伸60秒,執(zhí)行超過(guò)40個(gè)循環(huán);接著在72t:最后延伸IO分鐘。沖艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法分離大小大于為350bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。為了分離Lib134-VH-區(qū),以兩步法進(jìn)行RT-PCR。首先,使用與上述相同的5,-VH-特異性引物組(5,國(guó)huVHl,3,5-XhoI陽(yáng)2001、5'-huVH4-XhoI畫2001、5,-huVH4B-XhoI-2001;SEQIDNO.100畫102)和3,-特異性引物組G,-A134-VH1A(5,-GTAGTCAAAGTAGAACCGTAGCCCCCTATCTCTYGCACAGTAATACACGGC-3,)(SEQIDNO.105)、3,-A134-VHlB(5,-GTAGTCAAAGTAGAACCGTAGCCCCCTATCTCTYGCACAGTAATACAYRGC-3,)(SEQIDNO.106)、3-A134-VH3A(5,-GTAGTCAAAGTAGAACCGTAGCCCCCTATCTCTTGYACAGTAATACACRGC3,)(SEQIDNO.107),其中表示的"T"也可以由"A"、"C,,或"G,,代替、3,-A134-VH3Bf5,-GTAGTCAAAGTAGAACCGTAGCCCCCTATCTCTTGCACAGTAATACAARGC-3,)(SEQIDNO.108),其中表示的"T"也可以由"A"、"C"或"G"代替、3,-A134國(guó)VH4(5,-GTAGTCAAAGTAGAACCGTAGCCCCCTATCTCTSGCACAGTAATACACRGC-3,)(SEQIDNO.109))從分離的模板VH片段PCR-擴(kuò)增人重鏈VH-區(qū)段(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3),對(duì)于人VH亞家族1、3和4在FR3的非常末端區(qū)域匹配。使用下列引物組合a)5,-huVHl,3,5-XhoI-2001x3,-A134-VHlAb)5,畫huVHl,3,5陽(yáng)XhoI國(guó)2001x3,-A134畫VHlBc)5,-huVHl,3,5XhoI-2001x3,-A134-VH3Ad)5,-hiiVHl,3,5-XhoI-2001x3,-A134-VH3Be)5,-huVH4-XhoI-2001x3,-A134-VH4f)5,-huVH4B-XhoI-2001x3,曙A134-VH4每個(gè)PCR反應(yīng),將一個(gè)5,-引物與3,-引物組合;通過(guò)5,-和3,-引物的可能的組合數(shù)確定不同PCR反應(yīng)的數(shù)目。使用下列PCR-程序用于擴(kuò)增在94C變性15秒;引物在52匸退火50秒和在72'C延伸90秒,執(zhí)行超過(guò)40個(gè)循環(huán);接著在72。C最后延伸10分鐘。通過(guò)這一PCR步驟和各自的3,-引物序列,延伸人VH區(qū)段的母本VHCDR3部分,而后其依次為第二步PCR3,-引物的引發(fā)位點(diǎn)。然后在笫二PCR反應(yīng)中使用VH-(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)DNA-片段作為模板,再次使用各個(gè)5,VH-特異性引物和通用的3,引物,該3,引物與擴(kuò)增的DNA-片段(3'A134-JH6-BstEI1,5,-CGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAGTCAAAGTAGAACCGTAGCC3,)(SEQIDNO.IIO)的通用的3,-末端匹配。使用下列PCR-程序用于擴(kuò)增在94C變性15秒;在52'C引物退火50秒和在72。C延伸60秒,執(zhí)行超過(guò)40個(gè)循環(huán);接著在72。C最后延伸10分鐘。根椐標(biāo)準(zhǔn)操作分離DNAV-片段。3.文庫(kù)構(gòu)建-人VH庫(kù)的克隆在上述方法的第二輪,選擇在先前第一輪選擇(見(jiàn)實(shí)施例6)中鑒定的scFvA-240的人VL,并且然后與人VH片段的文庫(kù)組合,目的是產(chǎn)生人scFv。通?;跇?biāo)準(zhǔn)操作構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù),例如在"PhageDisplay:ALaboratoryManual";Barbas,Burton,Scott和Silverman編輯;ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001中公開的。來(lái)自不同PCR擴(kuò)增的重鏈DNA-片段對(duì)于各個(gè)連接被衡量如下a:b:c:d:e:f-3:l:3:l:l:l,其中a-f具有下列含義a)5,-huVHl,3,5-XhoI-2001x3,-A134-VHlAb)5,-huVHl,3,5-XhoI-2001x3,A134誦VH1Bc)5,huVHl,3,5-XhoI-2001x3,畫A134-VH3Ad)5,-hiiVHl,3,5XhoI-2001x3,-A134國(guó)VH3Be)5,-huVH4-XhoI-2001x3,畫A134誦VH4f)5,-huVH4B-XhoI-2001x3,-A134國(guó)VH4建立一個(gè)連接反應(yīng),由400ng的人Lib134-VH片段庫(kù)(XhoI-BstEII消化)和1200ng的質(zhì)粒pComb3H5BHis/A-240VL(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作,經(jīng)由限制酶切位點(diǎn)Sacl和Spel將編碼scFvA-240的VL區(qū)的DNA克隆進(jìn)入pComb3H5BHis)組成。然后通過(guò)電穿孔(2.5kV,0.2cm槽樣品池,25mF,200歐姆,拜爾瑞德基因-脈沖儀)將產(chǎn)生的抗體人VH庫(kù)轉(zhuǎn)化進(jìn)入300nL的電感受態(tài)的大腸桿菌,產(chǎn)生總共大小為0.8><108個(gè)獨(dú)立克隆的文庫(kù)。電穿孔后,在SOC肉湯(Fluka)中孵育測(cè)定用于表型表達(dá)。然后將培養(yǎng)物各自在含有50ng/mL的羧芐西林和2%v/v葡萄糖的500mL的SB選擇培養(yǎng)基中孵育過(guò)夜。第二天,通過(guò)離心收獲培養(yǎng)物的細(xì)胞,并且使用可商業(yè)獲得的質(zhì)粒制備試劑盒(奇強(qiáng)公司)進(jìn)行質(zhì)粒制備以保存DNA文庫(kù)。然后將編碼各自scFv庫(kù)的1.5將的該質(zhì)粒庫(kù)電穿孔進(jìn)入大腸桿菌XLlblue(2.5kV,0.2cm槽樣品池,25mF,200歐姆,拜爾瑞德基因-脈沖儀),產(chǎn)生總共大小為2.4乂109個(gè)獨(dú)立克隆的文庫(kù)。表型表達(dá)和緩慢適應(yīng)羧節(jié)西林之后,將抗體文庫(kù)轉(zhuǎn)移進(jìn)入SB-羧千西林(50ng/mL)選擇培養(yǎng)基。然后用感染劑量為lxl()U的輔助噬菌體VCSM13顆粒感染抗體文庫(kù),導(dǎo)致絲狀M13噬菌體的產(chǎn)生和分泌,其中每個(gè)噬菌體顆粒含有單鏈的pComb3H5BHis-DNA,編碼人scFv-片段和展示相應(yīng)的scFv-蛋白質(zhì)作為與噬菌體蛋白質(zhì)III的翻譯融合。4.人VH的噬菌體展示選擇通過(guò)PEG別00/NaCl沉淀和離心從培養(yǎng)物上清液收獲帶有人scFv-所有組成成份的噬菌體顆粒。接著,將約為1xio"至1xio12的scFv謹(jǐn)菌體顆粒重懸在0.5mL的TBS/1%BSA中并且與生物素化的可溶CEA孵育,其在ELISA平板(南斯公司)的鏈霉親和素包被的孔中被固定化1小時(shí)。在鏈霉親和素包被的孔中將10將抗原/mlPBS溶液(50jil)于4'C孵育過(guò)夜,用水洗一次,接著用200jil的在TBS中的3%BSA在37X:封閉1小時(shí),在孵育后除去封閉液。使用TBS/0.05。/。吐溫通過(guò)清洗步驟除去非特異性結(jié)合于靶標(biāo)抗原的scFv噬菌體。在下一輪中重復(fù)這一清洗步驟高達(dá)10次。清洗之后,使用HCl-甘氨酸,pH2.2洗脫結(jié)合的實(shí)體。用2MTris,pH12中和之后,使用洗脫物感染新鮮的未感染的大腸桿菌XL1Blue培養(yǎng)物。為了洗脫剩余的高結(jié)合實(shí)體,向孔中加入50jaL的新鮮大腸桿菌XL1Blue培養(yǎng)物(OD60020.5)并且孵育15分鐘。然后混合兩種培養(yǎng)基,并且對(duì)用編碼人scFv-片段的噬菌??截惓晒D(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞再次篩選羧芐西林抗性,和接著用VCMS13輔助噬菌體感染以開始第二輪抗體展示和體外選擇。從大腸桿菌培養(yǎng)物分離對(duì)應(yīng)于4輪淘選的質(zhì)粒DNA。為了產(chǎn)生可溶的scFv-蛋白質(zhì),從質(zhì)粒切割VH-VL-DNA片段(XhoI-SpeI),并且經(jīng)由在質(zhì)粒pComb3H5BFlag/His中的相同限制酶切位點(diǎn)克隆,其中該表達(dá)構(gòu)建體(例如scFv)在scFv和His6-標(biāo)簽之間包括Flag-標(biāo)簽(TGDYKDDDDK)(SEQIDN0.99),并且刪除另外的噬菌體蛋白質(zhì)。連接之后,將質(zhì)粒DNA的各個(gè)集合(不同輪的淘選)轉(zhuǎn)化進(jìn)入IOOpL熱休克的感受態(tài)大腸桿菌TG1并且在羧芐西林[B-瓊脂上鋪板。挑出單個(gè)的菌落并且接種于96孔平板(格瑞納公司)中的120pL的LB羧芐西林(50jag/mL)1%葡萄糖中。用半透膜(格瑞納公司)封孔并且將平板在37'C于震搖孵育器(總平板)中孵育過(guò)夜。然后將IO的總平板培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移進(jìn)入第二個(gè)96孔平板(工作平板),每孔含有卯LB羧千西林(50將/mL)0.1%葡萄糖。在37'C震搖孵育器中孵育4小時(shí)之后,通過(guò)向每個(gè)孔加入20fiLLB羧千西林6mMIPTG誘導(dǎo)scFv產(chǎn)生。在30匸震搖過(guò)夜的另一孵育步驟之后,細(xì)胞在室溫與40jiL裂解緩沖液(400mM硼酸,320mMNaCl,4mMEDTApH8,2.5mg/mL溶菌酶)孵育裂解1小時(shí)。通過(guò)在1900xg(Hettich)離心12分鐘分離剩余的細(xì)胞和細(xì)胞碎片。然后測(cè)試舍有scFv分子的上清液在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)合測(cè)定中的結(jié)合。使用用人CEA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞作為CEA-陽(yáng)性的細(xì)胞系。通過(guò)用含有人scFv或有關(guān)對(duì)照的胞質(zhì)制備物原始孵育100000和200000之間的細(xì)胞來(lái)執(zhí)行細(xì)胞結(jié)合測(cè)定。孵育之后,在PBS/1%FCS(胎牛血清)中清洗細(xì)胞和進(jìn)一步與5-10pg/ml的抗-FLAGM2抗體孵育。再次清洗細(xì)胞之后,將其與多克隆、PE-標(biāo)記的抗-小鼠抗體(迪艾諾瓦公司)孵育,并且隨后通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。測(cè)試46個(gè)克隆在CEA-陽(yáng)性CHO細(xì)胞上的結(jié)合信號(hào)。其全部顯示陽(yáng)性信號(hào)。對(duì)各個(gè)scFvDNA測(cè)序之后,獲得總共9個(gè)不同的序列,其中8個(gè)顯示高度的同源性。已經(jīng)選擇人構(gòu)建體MP510—3-A5.3(MP510國(guó)A5;SEQIDNO.50)、MP510—3-B9.1(MP511-B9;SEQIDNO.52)、MP510—3-D8.1(MP511-D8;SEQIDNO.54)用于進(jìn)一步表征。相應(yīng)的氨基賄列被顯示在序列表中。在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中使用CEA-陽(yáng)性和CEA-陰性的細(xì)胞系進(jìn)一步分析所述人構(gòu)建體MP510-A5、MP511-B9、MP511-D8以及半人構(gòu)建體A-240V入,3(鼠VHA5B7/人VLA240;SEQIDNO.48)的胞質(zhì)提取物。從圖13可見(jiàn),與各自的半-人對(duì)照A-240V入.3(鼠VHA5B7/人VLA240;SEQIDNO.48)相比,人構(gòu)建體MP510國(guó)A5(SEQIDNO.50)、MP511-B9(SEQIDNO.52)、MP511-D8(SEQIDNO.54)顯示在熒光強(qiáng)度上清楚可辨別的改變。因此,人scFv構(gòu)建體比半人構(gòu)建體A-240V入,3顯示對(duì)膜結(jié)合的人CEA更強(qiáng)的結(jié)合活性。此外,所有的人構(gòu)建體顯示對(duì)CEA-陽(yáng)性的人KATOIII細(xì)胞(人胃癌細(xì)胞系)顯著的結(jié)合,而其沒(méi)有顯示對(duì)CEA-陰性的、未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞以及對(duì)CEA-陰性的人NALM6細(xì)胞(人B細(xì)胞系)的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例8:人CEAxCD3雙特異性單鏈抗體的產(chǎn)生和細(xì)胞毒活性1.排列在下一步,已經(jīng)產(chǎn)生人雙特異性單鏈抗體分子的多種結(jié)構(gòu)域排列。這些分子包含人抗-CEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(其產(chǎn)生已經(jīng)在以上實(shí)施例7中描述)并且如在表1中提出的設(shè)計(jì)脫免疫的結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其對(duì)在SEQIDNO.77VHVL顯示的人CD3抗原具有特異性;也見(jiàn)以上實(shí)施例2。具有這里描述的人抗-CEA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的全部雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體(明顯的)結(jié)合可溶人CEA抗原,由于在對(duì)固定在ELISA平板的可溶CEA抗原的四輪噬菌體展示篩選之后其已經(jīng)被分離。具體的,已經(jīng)產(chǎn)生下列排列(a)人抗-CEA部分位于N-末端(i)VH-VL方向的抗-CEA:A5VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.24),A5VHA240VL#xSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.126),B9VHA240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.32),B9VH-A240VL#xSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.130),D8VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.40),D8VH-A240VL#xSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.134),和CEAIVH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.16)。(ii)VL-VH方向的抗-CEA:A240VL畫A5VHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.26),A240VL-B9VHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.34),A240VL-D8VHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.42),和A240VL-CEAIVHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.18)。(b)人抗-CEA部分位于C-末端(i)VH-VL方向的抗-CEA:SEQIDNO.77VHVLxA5VH-A240VL(SEQIDNO,30),SEQIDNO.77VHVLxA5VH-A240VL#(SEQIDNO.128),SEQIDNO.77VHVLxB9VH陽(yáng)A240VL(SEQIDNO.36),SEQIDNO.77VHVLxE12VH-A240VL(SEQIDNO.143),SEQIDNO.77VHVLxB9VH-A240VU(SEQIDNO.132),SEQIDNO.77VHVLxD8VH-A240VL(SEQIDNO.44),SEQIDNO.77VHVLxD8VHA240VL#(SEQIDNO.136),和SEQIDNO.77VHVLxCEAIVH-A240VL(SEQIDNO.20)。(ii)VL-VH方向的抗-CEA:SEQIDNO.77VHVLxA240VL-A5VH(SEQIDNO.28),SEQIDNO.77VHVLxA240VL-B9VH(SEQIDNO.38),SEQIDNO.77VHVLxA240VL-D8VH(SEQIDNO.46),和SEQIDNO.77VHVLxA240VL-CEAIVH(SEQIDNO.22)。CEAIVH(SEQIDNO.56)指衍生自鼠mAbA5B7的VH區(qū),而CEAIVHVL或CEAIVLVH分別指衍生自mAbA5B7的VH-VL結(jié)構(gòu)域和VL-VH結(jié)構(gòu)域。A240對(duì)應(yīng)于人VL區(qū)(見(jiàn)SEQIDNO.64和實(shí)施例7)。相應(yīng)的,例如CEAIVH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO,16)對(duì)應(yīng)具有半-人CEA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雙特異性構(gòu)建體,其具有來(lái)自mAb7的鼠VH區(qū)和人VL區(qū)A240。為了克隆人抗體文庫(kù),將編碼原始的A240VL區(qū)的N末端的核苷酸序列轉(zhuǎn)化到限制酶切位點(diǎn)。在A5VH-A240VL#xSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.126)、SEQIDNO.77VHVLxA5VH-A240VL#(SEQIDNO.128)、B9VH-A240VL#xSEQIDNO,77VHVL(SEQIDNO.130)、SEQII)NO.77VHVLxB9VH-A240VL#(SEQIDNO.132)、D8VH-A240VL#xSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.134)和SEQIDNO.77VHVLxD8VH-A240VL#(SEQIDNO.136)中,已經(jīng)重新引入原始的N-末端。雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體SEQIDNO.77VHVLxE12VH-A240VL(SEQIDNO.143)與SEQIDNO.77VHVLxB9VH-A240VL(SEQIDNO.36)構(gòu)建體的差異在于僅一個(gè)氨基酸殘基有差異在E12VH中的CDR-H2序列讀為"FILNKANGGTTEYAASVKG"(SEQIDNO.145),而在B9VH中其讀為"FIRNKANGGTTEYAASVKG"(SEQIDNO.67)。已經(jīng)如在實(shí)施例7中提到的分離人E12VH區(qū)。2.表達(dá)、純化和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析通過(guò)以上在實(shí)施例2中描述的方法已經(jīng)進(jìn)行了對(duì)這些人CEAxCD3雙特異性單鏈抗體的表達(dá)、純化和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。3.結(jié)合活性如在圖14中所示例的,人雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體A5VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.24)、B9VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.32)、D8VHA240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.40)和CEAIVHA240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.16)結(jié)合CEA-陽(yáng)性的人KatoIII細(xì)胞和CD3-陽(yáng)性的HPB-ALL細(xì)胞。4.缺乏可溶CEA抗原時(shí)的細(xì)胞毒活性已經(jīng)證明人雙特異性單鏈抗體的下列結(jié)構(gòu)域排列對(duì)CHO-CEA+靶標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性具有抗-CEA部分位于N-末端和VH-VL方向的抗-CEA部分的構(gòu)建體,圖15顯示了A5VHA240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.24)、B9VHA240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.32)、D8VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.40)和CEAIVHA240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.16)的細(xì)月包毒活性。圖16證明A240VL畫A5VHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.26)、A240VL-B9VHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.34)、A240VL-D8VHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.42)和A240VL陽(yáng)CEAIVHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.18),VL-VH方向的抗-CEA結(jié)構(gòu)域(位于N-末端)的細(xì)胞毒活性。建體,圖17顯示了SEQIDNO.77VHVLxA5VH畫A240VL(SEQIDNO.30)、SEQIDNO.77VHVLxB9VH-A240VL(SEQIDNO.36)、SEQIDNO.77VHVLxD8VH-A240VL(SEQIDNO.44)和SEQIDNO.77VHVLxCEAIVH-A240VL(SEQIDNO.20)對(duì)CEA+乾標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。使用SEQIDNO.77VHVLxCEAILH作為陽(yáng)性對(duì)照。圖18顯示了對(duì)于SEQIDNO.77VHVLxA240VL-A5VH(SEQIDNO,28)、SEQIDNO.77VHVLxA240VL-B9VH(SEQIDNO.38)、SEQIDNO.77VHVLxA2拼L畫D8VH(SEQIDNO.46)和SEQIDNO.77VHVLxA240VL-CEAIVH(SEQIDNO.22),具有VL-VH方向的抗畫CEA結(jié)構(gòu)域(位于C-末端)的構(gòu)建體的細(xì)胞毒活性。使用SEQIDNO.77VHVLxCEAILH(SEQIDNO.2)作為陽(yáng)性對(duì)照。圖21顯示雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體針對(duì)人CEA-轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的細(xì)胞毒活性,所迷構(gòu)建體包含不同排列的人B9VH區(qū)和人A240VL區(qū)A240VLB9VHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.34)、SEQIDNO.77VHVLxA240VL-B9VH(SEQIDNO.38)、SEQIDNO.77VHVLxB9VH-A240VL(SEQIDNO.36)和B9VH—A240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.32)。5.人CEAxCD3雙特異性單鏈抗體對(duì)可溶CEA抗原的抗性如以上在實(shí)施例5中提到的,在可溶人CEA抗原的存在下對(duì)人雙特異性單鏈抗體進(jìn)行竟?fàn)帨y(cè)定。圖19和20證明細(xì)胞毒活性對(duì)可溶CEA抗原的抗性也適于人構(gòu)建體,例如示例的構(gòu)建體A5VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.24)、B9VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.32)、D8VH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.40)和CEAIVH-A240VLxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.16);對(duì)鼠衍生的雙特異性單鏈抗體的可溶CEA的抗性見(jiàn)實(shí)施例5。此外,圖22顯示在增加量的可溶CEA抗原存在下,CEA-反應(yīng)的雙特異性單鏈構(gòu)建體A240VL"B9VHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.34)重新指導(dǎo)T細(xì)胞裂解CHO-CEA+細(xì)胞。這一實(shí)^ii明A240VL~B9VHxSEQIDNO.77VHVL-介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性對(duì)可溶CEA也有抗性。最后,如能夠從圖27得出的,雙特異性單鏈構(gòu)建體SEQIDNO.77VHVLxE12VH-A240VL(SEQIDNO.143)-介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性對(duì)可溶CEA有抗性。因此,本發(fā)明提供在甚至高水平的可溶CEA抗原存在下具有細(xì)胞毒抗-腫瘤活性的藥物組合物。如以上提到的,具有上皮腫瘤的患者中高血清CEA濃度減少基于抗-CEA抗體的治療的成功。因此,本發(fā)明的藥物組合物適于治療具有進(jìn)行性上皮腫瘤(例如,在手術(shù)移去原始腫瘤之后繼發(fā)的、轉(zhuǎn)移的腫瘤)、惡性上皮腫瘤、高(上皮)腫瘤負(fù)荷和晚期上皮肺瘤的患者,其特征為在所迷患者的血清/血漿中具有高的可溶CEA抗原濃度。而且,本發(fā)明的藥物組合物還被期望以低劑量施用。此外,當(dāng)施用于患者時(shí),所迷藥物組合物不可能是免疫原性的,因?yàn)樵诒景l(fā)明的藥物組合物中雙特異性單鏈抗體的抗-CEA部分為人源的,且抗-CD3部分為脫免疫的。此外,由于雙特異性單鏈構(gòu)建體的低分子量和小尺寸,本發(fā)明的藥物組合物可期望提供高的腫瘤穿透性。而且,由于所迷分子的高的細(xì)胞毒活性,可以使用低量的雙特異性單鏈抗體用于腫瘤治療。因?yàn)轭A(yù)期向患者^(guò)f氐量施用,可以期望減少患者的副作用。最后,如以上提出的,由于以低濃度施用,對(duì)可溶CEA沒(méi)有抗性的雙特異性單鏈抗體將對(duì)腫瘤患者血漿中的甚至低濃度的可溶CEA抗原高度敏感。這一問(wèn)題也可通過(guò)本發(fā)明的藥物組合物而避免發(fā)生。實(shí)施例9:通過(guò)高分辨的陽(yáng)離子交換色i普對(duì)A240VL-B9VHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.34)的純化的單體的蛋白質(zhì)同質(zhì)性評(píng)估為了進(jìn)一步表征純化的A240VL—B9VHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.34)構(gòu)建體的同質(zhì)性,將分離的單體部分加于高分辨的陽(yáng)離子交換色譜。在MiniS柱(MiniSPE4.6/50CatX0.8ml;GE保健17-5005-01)進(jìn)行該色語(yǔ)法,用20mMMES緩沖液pH5.5平衡。在上樣于該柱之前用相同的緩沖液以1:3稀釋樣品。用含有1MNaCl:0-30%的60倍柱體積的梯度平衡緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。以3倍柱體積的1MNaCl洗脫剩余的蛋白質(zhì)。產(chǎn)生的色譜圖顯示在圖23,并且顯示具有單個(gè)主峰的同質(zhì)蛋白質(zhì)部分。實(shí)施例10:A240VL~B9VHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.34)的血漿穩(wěn)定性在不同孵育條件下繼之以如在實(shí)施例4中所述的基于細(xì)胞毒性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)51-鉻釋放來(lái)測(cè)試A240VL-B9VHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.34)構(gòu)建體的血漿穩(wěn)定性。通過(guò)收集在EDTA-包被的注射器中的血液產(chǎn)生具有五個(gè)健康供體血液的人血漿庫(kù)。通過(guò)離心移去細(xì)胞成份,并且收集上層的血漿層和隨后混合。在存在或缺乏血漿情況下將A240VL-B9VHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDN0.34)構(gòu)建體置于37。C或4。C孵育。作為對(duì)照,在細(xì)胞毒性測(cè)定之前將構(gòu)建體分別在血漿或RPMI1640培養(yǎng)基中即刻稀釋。使用CHO-CEA+作為耙標(biāo)細(xì)胞;刺激的CD8+T作為效應(yīng)細(xì)胞。效應(yīng)子靶標(biāo)(E:T)的比率為10:1。該測(cè)定持續(xù)時(shí)間為18小時(shí)。如在圖24中所示,CEA-反應(yīng)性雙特異性單鏈構(gòu)建體A240VL-B9VHxSEQIDNO.77VHVL(SEQIDNO.34)被證明是非常穩(wěn)定的;在人血漿中于37。C孵育24小時(shí)之后檢測(cè)到細(xì)胞毒活性沒(méi)有損失。實(shí)施例11:通過(guò)高分辨的陽(yáng)離子交換色鐠對(duì)SEQIDNO,77VHVLxE12VH-A240VL(SEQIDNO.143)的純化的單體的蛋白質(zhì)同質(zhì)性評(píng)估除了分析SEQIDNO.77VHVLxE12VH-A240VL(SEQIDNO.143)之外,以與實(shí)施例9類似的方法進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)生的色譜圖顯示在圖25中,并且呈現(xiàn)具有單個(gè)主峰的均質(zhì)蛋白質(zhì)部分。實(shí)施例12:SEQIDNO.77VHVLxE12VH-A240VL(SEQIDNO.143)的血漿穩(wěn)定性除了分析SEQIDNO.77VHVLxE12VH-A240VL(SEQIDNO.143)之外,以與實(shí)施例10相似的方法進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。如在圖26中所示,CEA-反應(yīng)性雙特異性單鏈構(gòu)建體SEQIDNO.77VHVLxE12VH-A240VL(SEQIDNO.143)被證明是非常穩(wěn)定的;在人血漿中于37'C孵育24小時(shí)之后沒(méi)有檢測(cè)到細(xì)胞毒活性損失。權(quán)利要求1.用于治療在人中的上皮腫瘤的藥物組合物,所述藥物組合物包含雙特異性單鏈抗體,其具有(a)特異性結(jié)合于人CD3的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域,和(b)特異性結(jié)合于人CEA的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域至少包含氨基酸序列“DX1X2X3X4FYFDY”(SEQIDNO.65),其中“X1”、“X2”、“X3”或“X4”代表任意的氨基酸殘基,且氨基酸殘基“D”對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置95,和氨基酸殘基“FYFDY”分別對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的CDR-H3的Kabat位置100、100a、100b、101和102。2.權(quán)利要求l的藥物組合物,其中-"Xr代表"R,,(精氨酸)、"F,,(苯丙氨酸)、"M,,(曱硫氨酸)、"E"(谷氨酸)或"T"(蘇氨酸);-"X2,,代表"G,,(甘氨酸)、"Y"(酪氨酸)、"A"(丙氨酸)、"D"(天冬氨酸)或"S"(絲氨酸);-"X3"代表"L,,(亮氨酸)、"F"(苯丙氨酸)、"M"(甲硫氨酸)、"E"(谷氨酸)或"T"(蘇氨酸);和-"X4"代表"R,,(精氨酸)、"Y,,(酪氨酸)、"A"(丙氨酸)、"D"(天冬氨酸)或"S"(絲氨酸)。3.權(quán)利要求1或2的藥物組合物,其中對(duì)人CEA特異性的所迷笫二結(jié)合結(jié)構(gòu)域至少包含氨基酸序列"DRGLRFYFDY"(SEQIDNO.66)對(duì)應(yīng)于鼠單克隆抗體A5B7的Kabat位置95-102。4.權(quán)利要求l-3的任一項(xiàng)的藥物組合物,其中對(duì)CD3特異性的所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于C-末端。5.權(quán)利要求1-4的任一項(xiàng)的藥物組合物,其中所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域以VHCEA-VLCEA-VHCD3-VLCD3或VLCEA-VHCEA-VHCD3-VLCD3的順序排列。6.權(quán)利要求l-5的任一項(xiàng)的藥物組合物,其中對(duì)人CEA特異性的所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含具有氨基酸序列"SYWMH,,(SEQIDNO,68)的CDR-H1和/或具有氨基酸序列"FIRNKANGGTTEYAASVKG,,(SEQIDNO.67)或"FILNKANGGTTEYAASVKG,,(SEQIDNO.145)的CDR-H2。7.權(quán)利要求l-5的任一項(xiàng)的藥物組合物,其中對(duì)人CEA特異性的所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含具有氨基酸序列"TYAMH"(SEQIDNO.70)的CDR-Hl和/或具有氨基斷列"LISNDGSNKYYADSVKG,,(SEQIDNO,69)的CDR誦H2。8.權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)的藥物組合物,其中對(duì)人CEA特異性的所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含具有氨基酸序列"TLRRGINVGAYSIY,,(SEQIDNO.73)的CDR-Ll和/或具有氨基斷列"YKSDSDKQQGS,,(SEQIDNO.72)的CDR-L2和/或具有氨基斷列"MIWHSGASAV"(SEQIDNO.71)的CDR國(guó)L3。9.權(quán)利要求6的藥物組合物,其中對(duì)人CEA特異性的笫二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的VH區(qū)的氨基酸序列是SEQIDNO.60或146。10.權(quán)利要求7的藥物組合物,其中對(duì)人CEA特異性的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的VH區(qū)的氨基酸序列是SEQIDNO.58或SEQIDNO,62。11.權(quán)利要求8的藥物組合物,其中對(duì)人CEA特異性的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的VL區(qū)的氨基酸序列是SEQIDNO.64。12.權(quán)利要求l-ll的任一項(xiàng)的藥物組合物,其中對(duì)CEA特異性的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的V區(qū)選自以下組成的組(a)在SEQIDNO.60中顯示的氨基酸序列組成的VH區(qū)和在SEQIDNO.64中顯示的氨基酸序列組成的VL區(qū);(b)在SEQIDNO.146中顯示的氨基酸序列組成的VH區(qū)和在SEQIDNO.64中顯示的氨基酸序列組成的VL區(qū);(c)在SEQIDNO.58中顯示的氨基酸序列組成的VH區(qū)和在SEQIDNO.64中顯示的氨基酸序列組成的VL區(qū);(d)在SEQIDNO.62中顯示的氨基酸序列組成的VH區(qū)和在SEQIDNO.64中顯示的氨基酸序列組成的VL區(qū);和(e)在SEQIDNO.56中顯示的氨基酸序列組成的VH區(qū)和在SEQIDNO.64中顯示的氨基酸序列組成的VL區(qū)。13.權(quán)利要求1-12的任一項(xiàng)的藥物組合物,其中所述雙特異性單鏈抗體包含的氨基酸序列選自以下組成的組(a)如在任意的SEQIDNO.6、8、16、18、24、26、32、34、40、42、126、130、134或143中描述的氨基酸序列;(b)由在如SEQIDN0.5、7、15、17、23、25、31、33、39、41、125、129、133或142所示核酸序列編碼的M酸序列;(c)由核酸序列編碼的氨基酸序列,其在嚴(yán)格條件下與(b)的互補(bǔ)核酸序列雜交;(d)由核酸序列編碼的氨基酸序列,該核酸序列是作為(b)的核苷酸序列的遺傳密碼子的簡(jiǎn)并結(jié)果;和(e)氨基酸序列,其與(a)或(b)的氨基酸序列有至少85%同一性,更優(yōu)選至少90%同一性,最優(yōu)選至少95%同一性。14.權(quán)利要求1-13的任一項(xiàng)的藥物組合物,其中所述上皮腫瘤是胃腸道腺癌、乳腺癌或肺腺癌。15.權(quán)利要求14的藥物組合物,其中所述胃腸道腺癌是結(jié)腸直腸腺癌、胰腺癌、食道腺癌或胃腺癌。16.權(quán)利要求1-15的藥物組合物,其中所述藥物組合物是用于治療進(jìn)行性肺瘤、晚期肺瘤、具有高腫瘤負(fù)荷/負(fù)擔(dān)的腫瘤患者、遷移腫瘤或具有超過(guò)100ng/ml的CEA血清濃度的腫瘤患者。17.權(quán)利要求1-16的任一項(xiàng)的藥物組合物,其中所述第一或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)是嵌合的、人源化的、CDR-移植的和/或脫免疫的或人的。18.包含核酸序列的藥物組合物,所述核酸序列編碼在權(quán)利要求1-17中的任一項(xiàng)定義的雙特異性單鏈抗體。19.包含載體的藥物組合物,所述載體包含在權(quán)利要求18中定義的核酸序列。20.權(quán)利要求19的藥物組合物,其中所述載體還包含有效連接于在權(quán)利要求18中定義的所述核酸序列的調(diào)節(jié)序列。21.權(quán)利要求19或20的藥物組合物,其中所述載體是表達(dá)載體。22.藥物組合物,其包含使用在權(quán)利要求18中定義的核酸或在權(quán)利要求19-21的任一項(xiàng)定義的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主。23.權(quán)利要求1-22的任一項(xiàng)的藥物組合物,還包含能夠?yàn)槊庖咝?yīng)細(xì)胞提供激活信號(hào)的蛋白質(zhì)化合物。24.根據(jù)權(quán)利要求1-23的任一項(xiàng)的藥物組合物的生產(chǎn)方法,所述方法包括培養(yǎng)在權(quán)利要求22中定義的宿主和從培養(yǎng)物回收產(chǎn)生的雙特異性單鏈抗體,所述培養(yǎng)在允許表達(dá)在權(quán)利要求1-17的任一項(xiàng)中定義的雙特異性單鏈抗體的條件下進(jìn)行。25.權(quán)利要求l-24的任一項(xiàng)的藥物組合物,其還包含載體、穩(wěn)定劑和/或賦形劑的合適的制劑。26.在權(quán)利要求1-17的任一項(xiàng)中定義的雙特異性單鏈抗體、在權(quán)利要求18中定義的核酸分子、在權(quán)利要求19-21的任一項(xiàng)中定義的載體或在權(quán)利要求22中定義的宿主在制備用于預(yù)防、治療或改善人的上皮腫瘤的藥物組合物中的用途。27.權(quán)利要求26的用途,其中所述上皮腫瘤是胃腸道腺癌、乳腺癌或肺腺癌。28.權(quán)利要求27的用途,其中所述胃腸道腺癌是結(jié)腸直腸腺癌、胰腺癌、食道腺癌或胃腺癌。29.權(quán)利要求1-28的任一項(xiàng)的用途,其中該藥物組合物是用于治療進(jìn)行性腫瘤、晚期肺瘤、具有高胂瘤負(fù)荷/負(fù)擔(dān)的腫瘤患者、遷移腫瘤或具有CEA血清濃度高于100ng/ml的腫瘤患者。30.權(quán)利要求1-29的任一項(xiàng)的用途,其中所述藥物組合物適于與另外的藥物組合施用。31.用于根據(jù)受試者需要來(lái)預(yù)防、治療或改善上皮腫瘤的方法,所述方法包括在充分的時(shí)期內(nèi)施用有效量的權(quán)利要求1-17的任一項(xiàng)的藥物組合物,或通過(guò)根椐權(quán)利要求24的方法產(chǎn)生的藥物組合物的步驟。32.權(quán)利要求31的方法,其中所述上皮腫瘤是胃腸道腺癌、乳腺癌或肺腺癌。33.權(quán)利要求32的方法,其中所述胃腸道腺癌是結(jié)直腸腺癌、胰腺癌、食道腺癌或胃腺癌。34.權(quán)利要求31-33的任一項(xiàng)的方法,其中藥物組合物是用于治療進(jìn)行性腫瘤、晚期腫瘤、具有高腫瘤負(fù)荷/負(fù)擔(dān)的腫瘤患者、遷移腫瘤或具有CEA血清濃度高于100ng/ml的腫瘤患者。35.權(quán)利要求31-34的任一項(xiàng)的方法,其中所述藥物組合物與另外的藥物組合施用。36.權(quán)利要求35的方法,其中所述藥物是非蛋白質(zhì)化合物或蛋白質(zhì)化合物。37.權(quán)利要求36的方法,包括施用能夠?yàn)槊庖咝?yīng)細(xì)胞提供激活信號(hào)的蛋白質(zhì)化合物。38.權(quán)利要求36或37的方法,其中所述蛋白質(zhì)化合物或非蛋白質(zhì)化合物是與在權(quán)利要求1-17中的任一項(xiàng)定義的雙特異性單鏈抗體、在權(quán)利要求18中定義的核酸分子、在權(quán)利要求19-21的任一項(xiàng)定義的栽體、或在權(quán)利要求22中定義的宿主同時(shí)或不同時(shí)施用。39.權(quán)利要求31-38的任一項(xiàng)的方法,其中所述受試者是人。40.試劑盒,其包含在權(quán)利要求1-17的任一項(xiàng)中定義的雙特異性單鏈抗體、在權(quán)利要求18中定義的核酸分子、在權(quán)利要求19_21的任一項(xiàng)定義的載體、或在權(quán)利要求22中定義的宿主。41.權(quán)利要求16的藥物組合物、權(quán)利要求29的用途或權(quán)利要求34的方法,其中所述CEA血清濃度是通過(guò)ELISA確定的。全文摘要本發(fā)明涉及用于治療在人中的上皮腫瘤的藥物組合物,所述藥物組合物包含具有特異性結(jié)合人CD3的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和特異性結(jié)合人CEA的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雙特異性單鏈抗體,其中所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含鼠單克隆抗體A5B7的至少部分的CDR-H3或完整的CDR-H3。而且,公開了所述藥物組合物的生產(chǎn)方法以及對(duì)人CD3抗原和人CEA抗原具有特異性的特異性的雙特異性單鏈抗體分子的醫(yī)療/藥物用途。文檔編號(hào)C07K16/24GK101370827SQ200680052637公開日2009年2月18日申請(qǐng)日期2006年12月21日優(yōu)先權(quán)日2005年12月21日發(fā)明者A·穆拉,D·勞,E·沙勒,M·維辛格,P·庫(kù)弗,P·邁爾,R·盧特比澤,S·曼戈?duì)柕?T·勞姆申請(qǐng)人:麥克羅梅特股份公司
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