專利名稱：多肽、疫苗及其用途的制作方法
專利說明多肽、疫苗及其用途 本發(fā)明涉及預(yù)防性或治療性治療，從而阻止血管形成，例如阻止腫瘤生長、視網(wǎng)膜疾病、動脈硬化癥、子宮內(nèi)膜異位癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥性病況。
預(yù)防性或治療性治療的一種形式是免疫接種。疫苗是源于造成疾病的病源或其成分的制品，其被給藥以刺激免疫應(yīng)答，這將保護(hù)人免于因該病源造成的疾病。治療性(治療)疫苗是在疾病發(fā)生后給予的，目的是要減輕或延緩疾病進(jìn)程。預(yù)防性(預(yù)防)疫苗要防止一開始疾病的發(fā)生。例如，用在疫苗中的試劑可以是完全滅活的(失活)、活的減毒的(減弱的)病原生物或人造物。
疫苗通過刺激宿主免疫系統(tǒng)而特異產(chǎn)生抗主要靶位的抗體和/或免疫細(xì)胞(細(xì)胞毒性T細(xì)胞)來介導(dǎo)它們的效應(yīng)。這些靶位被稱為“抗原”。刺激針對靶抗原的免疫應(yīng)答能導(dǎo)致通過免疫介導(dǎo)來破壞并消除存在于經(jīng)免疫的宿主體內(nèi)的病源。一旦被刺激，則免疫系統(tǒng)還會保持對以后由該靶向的病源造成的感染或疾病發(fā)生的監(jiān)視。因此，疫苗是控制現(xiàn)存疾病并抑制其將來惡化或復(fù)發(fā)的有效的途徑。
有各種方法來針對靶抗原來免疫接種。這些中的一些包括注射完整的蛋白質(zhì)；對應(yīng)于蛋白質(zhì)片段的合成肽；和/或編碼蛋白質(zhì)的DNA/RNA序列。遞送DNA和RNA的遞送載體包括表達(dá)表達(dá)抗原以及其它免疫刺激劑，如細(xì)胞因子或生長因子的基因、裸DNA/RNA或重組質(zhì)粒的改變了的病毒。
除了免疫接種，預(yù)防性或治療性治療可通過用治療性抗體治療宿主來實現(xiàn)，所述抗體產(chǎn)生在宿主外并特異針對感興趣的抗原。
產(chǎn)生、分離和使用針對所需抗原或表位的抗體的方法對相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。例如，利用現(xiàn)有已知的標(biāo)準(zhǔn)方法可在合適的宿主動物(如，例如，小鼠、兔、或山羊)中產(chǎn)生抗體并將其用作粗抗血清或進(jìn)行純化，例如通過親和純化進(jìn)行。所需特異性的抗體可另外利用公知的分子生物學(xué)方法產(chǎn)生，包括從重組抗體的分子文庫中篩選，或?qū)⒒パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植或改組到合適的框架區(qū)上。人抗體可選自重組文庫和/或利用公知的分子生物學(xué)技術(shù)通過將非人抗體的CDR移植到人框架區(qū)上而產(chǎn)生。該抗體可用于治療性治療，例如含治療性抗體的藥物可被導(dǎo)入受試者中以調(diào)節(jié)受試者的免疫應(yīng)答。例如，特異針對受試者抗原的治療性抗體將刺激針對該抗原的免疫應(yīng)答，由此誘導(dǎo)和/或促進(jìn)免疫應(yīng)答并幫助痊愈。
血管發(fā)生(vasculogenesis)就是干細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞接著形成血管。血管生成(angiogenesis)是從先已存在的血管形成血管。諸如血管形成、新血管化和血管化的術(shù)語涵蓋了血管發(fā)生和血管生成。
血管生成(血管形成的一個例子)是通過從預(yù)先存在的血管萌發(fā)過程來形成新的毛細(xì)管血管，其在發(fā)育期間以及在大量生理和病理情況中發(fā)生(Folkman，1995，Nature Medicine，127-31)。通過血管生成的過程形成新血管涉及一系列復(fù)雜的事件，包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、相互作用和粘附以形成索狀組織和管，并最終成熟。生理上，血管生成是組織生長、傷口愈合、和女性生殖功能之必需，并且是如視網(wǎng)膜疾病、動脈硬化癥、子宮內(nèi)膜異位癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥性病況的病理過程的組成部分?？墒牵S多對血管生成的長期興趣來自于以下觀念，即要使實體腫瘤生長超過關(guān)鍵大小，它們必須從周圍基質(zhì)補(bǔ)充內(nèi)皮細(xì)胞以形成它們自己的內(nèi)生微循環(huán)。為了促進(jìn)新血管化，腫瘤釋放各種因子刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。這些因子包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)胎盤生長因子、和胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(源于血小板的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；Relf等，1997，Cancer Research，57963-9)。因此，已有許多工作致力于找到干擾這些信號傳遞途徑并由此阻斷腫瘤血管生成的分子。
與傳統(tǒng)溶瘤細(xì)胞療法相比，靶向血管生成具有幾個潛在優(yōu)勢。這些中最突出的是所有實體腫瘤都是血管生成依賴性的；靶內(nèi)皮細(xì)胞容易為治療所接近；而且它們是遺傳穩(wěn)定的并較不傾向于產(chǎn)生對治療的耐受性。靶向癌細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)的顯著優(yōu)勢之一是遺傳可變性和迅速的細(xì)胞生長和分裂造成的大的選擇壓力，其經(jīng)常使這些藥物失效，這歸因于耐受性機(jī)制和其他途徑的產(chǎn)生和利用。
血管生成的抑制也對糖尿病性視網(wǎng)膜病變和黃斑變性展現(xiàn)出早期的前景，所述疾病都由眼血管過度生長造成。在這些病癥中，血管干擾眼中正常的結(jié)構(gòu)，或使光線不能到達(dá)眼后部。新血管本身就是原發(fā)病理情況，而且阻止血管生長可防止失明。
大量天然產(chǎn)生的血管生成抑制劑被鑒定出來了，如血管生成抑制素(angiostatin)(血纖維蛋白溶酶原的38kDa蛋白水解片段)、抗血管生成的抗凝血酶III、內(nèi)皮抑制素(膠原蛋白XVIII片段)、干擾素α/β/γ、促乳激素16kDa片段和凝血栓蛋白-1(TSP-1)，其在體外和體內(nèi)模型中顯示出各種程度的效果。這些抑制劑靶向內(nèi)皮細(xì)胞并抑制血管生成。例如，觀察到的血管生成抑制素的抑制不依賴于刺激內(nèi)皮細(xì)胞的是何血管生成因子(Eriksson等，2003 FEBS Letts.53619-24)。這與諸如結(jié)合VEGF或抑制VEGF-受體激酶活性的低分子量化合物的抗體的試劑相反。大多數(shù)腫瘤表達(dá)各種血管生成因子，這顯示靶向單一血管生成途徑不足以抑制腫瘤擴(kuò)展。因而，直接靶向于內(nèi)皮細(xì)胞的療法具有繞開由數(shù)種源于腫瘤的因子控制的血管生成問題的能力。可是，在另一方面，該療法必須應(yīng)對能特異靶向涉及在新血管化的過程中的血管內(nèi)皮細(xì)胞、而同時不靶向成熟血管的問題。
被稱為血管生成抑制素結(jié)合蛋白(angiomotin)的80kDa分子(“p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白”)由于其結(jié)合血管生成抑制劑——血管生成抑制素的能力而被鑒定出來(Troyanovsky等，2001，J.Cell.Biol.1521247-1254；WO 99/66038)。p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白屬于新的蛋白質(zhì)家族，其有兩個額外的成員——血管生成抑制素結(jié)合蛋白樣蛋白1(Amot1)和2(Amot2)。這些蛋白質(zhì)的特征在于保守的卷曲-卷曲結(jié)構(gòu)域和C末端PDZ結(jié)合基序(Nishimura等，2002，J.Biol.Chem.2775583-5587；Bratt等，2002，Gene，29869-77)。p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白區(qū)別于其相關(guān)蛋白質(zhì)，在于它含細(xì)胞外血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。P80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白主要在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)并介導(dǎo)血管生成抑制素對體外內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管形成的抑制效應(yīng)(Troyanovsky等，2001，J.Cell.Biol.1521247-1254)。在小鼠主動脈內(nèi)皮(MAE)細(xì)胞中表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白能增加對化學(xué)趨化因子的遷移性應(yīng)答(Troyanovsky等，2001，J.Cell.Biol.1521247-1254)。在遷移中起的作用被小鼠p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白敲除實驗的發(fā)現(xiàn)所強(qiáng)化，其中約有70％的敲除小鼠在胚胎期第7-8天死亡，這歸因于前內(nèi)臟內(nèi)胚層的遷移缺陷(Shimono和Behringer，2003，Current Biology，13613-7)。
在原代細(xì)胞以及細(xì)胞系中實時PCR分析p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的表達(dá)模式表明，血管生成抑制素結(jié)合蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞中優(yōu)勢表達(dá)。p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的體內(nèi)圖譜揭示了在如人胎盤的血管生成組織以及腫瘤組織中有表達(dá)。這些數(shù)據(jù)提示，血管生成抑制素結(jié)合蛋白在血管生成期間在內(nèi)皮細(xì)胞中被上調(diào)。WO 99/66038討論了p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白及其用途，例如用作藥物篩選靶位。
130kDa的p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的新剪接同工型(被稱為“p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白”)最近被鑒定出來了。該較大的同工型包含延伸的N末端結(jié)構(gòu)域并在血管生成中起作用，其不同于，但與p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白相關(guān)。
本發(fā)明提供了對應(yīng)于完整p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子或其片段的疫苗的用途，用于產(chǎn)生阻止血管形成(血管生成)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供了用p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子的免疫接種和利用疫苗防止在腫瘤生長以及由新血管生成產(chǎn)生或惡化的其他疾病中起關(guān)鍵作用的血管形成的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療性抗體、和其片段，其特異針對p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白，用作藥物以阻止血管形成(血管生成)和/或防止在腫瘤生長以及由新血管生成產(chǎn)生或惡化的其他疾病中起關(guān)鍵作用的血管形成。
本發(fā)明的第一個方面提供了用于調(diào)節(jié)血管生成和/或腫瘤形成的分離或重組的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽。
各種用于分離多肽的方法對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。例如，多肽可通過應(yīng)用親和純化而分離自表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞。制備重組多肽的方法也是公知的，并包括在細(xì)菌、酵母、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)。例如，分離多肽和表達(dá)重組多肽的方法在Sambrook等，2001，MolecularCloningA Laboratory Manual(第3版)中有討論。
對于“多肽”，我們包括互相用肽鍵連接的約10或更多個氨基酸的鏈(或其衍生物)。本發(fā)明的多肽可通過添加一個或多個化學(xué)基團(tuán)(例如，磷酸基和法呢基)來修飾。本發(fā)明還包括糖基化或未糖基化的多肽。在酵母或哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的多肽與天然分子在分子量和糖基化模式上可以是相似的或有輕微差異，這取決于表達(dá)系統(tǒng)。例如，在諸如大腸桿菌的細(xì)菌中表達(dá)編碼多肽的DNA通常提供了非糖基化的分子。真核蛋白質(zhì)的N-糖基化位點(diǎn)的特征在于氨基酸三聯(lián)體Asn-A.sub.1-Z(其中A.sub.1是除了脯氨酸之外的任意氨基酸，而Z是絲氨酸或蘇氨酸)。具有失活的N-糖基化位點(diǎn)的多肽變體可通過所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)來制備，如寡核苷酸合成和連接或位點(diǎn)特異性突變技術(shù)，這包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，N-連接的糖基化位點(diǎn)可加于本發(fā)明的多肽上。
對于“p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白”，我們包括任意天然產(chǎn)生的130kDa全長血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽(例如，由本發(fā)明人在實施例中描述的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽)或其任意變體，其保留與天然產(chǎn)生的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽或其片段的抗原交叉反應(yīng)性。
優(yōu)選地，多肽是分離或重組的哺乳動物p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白；更優(yōu)選地，是分離或重組的人p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白。
更優(yōu)選地，多肽包含 (i)序列SEQ ID NO1；或 (ii)與SEQ ID NO1具有至少80％和/或至少90％和/或至少95％和/或至少98％同一性并提供功能性多肽的序列；或 (iii)SEQ ID NO1或(ii)的序列的功能性片段。
而且其中多肽不是p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白或p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的片段。
術(shù)語“血管生成抑制素結(jié)合蛋白”對于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的，并包括多肽，其具有卷曲-卷曲和C末端PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域；被認(rèn)為是細(xì)胞表面相關(guān)蛋白；而且被認(rèn)為結(jié)合血管生成抑制素并介導(dǎo)血管生成抑制素對內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管的形成的抑制效應(yīng)。天然產(chǎn)生的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽的例子由以下給出Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-1254；WO 99/66038；Levchenko等，2003，J.Cell Sci.1163803-3810；Bratt等，2002，Gene，29869-77；GenBank登錄號NP_573572(人)。
可是，與p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和其片段相同的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其片段不被認(rèn)為是本發(fā)明的多肽。
對于“功能性多肽”和/或“SEQ ID NO1的功能性片段”，我們包括SEQID NO1的任意片段，其顯示出SEQ ID NO1的一些或全部細(xì)胞功能。優(yōu)選地，SEQ ID NO1的功能性片段是p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的N末端區(qū)，其不與p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白具有相似性，而且更優(yōu)選地是包含或由SEQ ID NO1氨基酸殘基第1至409位組成的片段。如實施例所示，p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的N-末端能誘導(dǎo)應(yīng)力纖維并改變細(xì)胞形狀，這都是全長p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白所涉及的促進(jìn)血管生成的功能。
本發(fā)明的第二個方面提供了抗體或其片段，其能結(jié)合本發(fā)明的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽。
抗體包含兩個通過二硫鍵連在一起的相同的Mr50,000-70,000(被稱為“重鏈”)的多肽，其每一個連于一對相同的Mr25,000(被稱為“輕鏈”)的多肽之一。在不同抗體分子重鏈的各N末端之間和在不同抗體分子各輕鏈之間有著相當(dāng)大的序列可變性，因而這些區(qū)域被稱為“可變結(jié)構(gòu)域”。相反，在不同抗體分子重鏈的各C末端之間和在不同抗體分子各輕鏈之間有著相當(dāng)大的序列相似性，因而這些區(qū)域被稱為“恒定結(jié)構(gòu)域”。
一對重和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的高變區(qū)形成了抗原結(jié)合位點(diǎn)。高變區(qū)也被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，決定了抗體所針對配體的特異性。重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變結(jié)構(gòu)域通常包含3個CDR，其每一個的側(cè)翼是較少變化的被稱為框架區(qū)(FR)的序列。
抗體的可變重(VH)和可變輕(VL)結(jié)構(gòu)域與抗原識別有關(guān)，通過早期蛋白酶消化實驗就認(rèn)識到該事實。嚙齒動物抗體的“人源化”發(fā)現(xiàn)了進(jìn)一步證實的依據(jù)。嚙齒動物來源的可變結(jié)構(gòu)域可與人源的恒定結(jié)構(gòu)域融合，由此產(chǎn)生的抗體保留了嚙齒動物親本抗體的抗原特異性(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，6851-6855)。
通過涉及抗體片段的細(xì)菌表達(dá)的實驗，其所有片段都包含一個或多個可變結(jié)構(gòu)域，可知抗原特異性由可變結(jié)構(gòu)域賦予，而且不依賴于恒定結(jié)構(gòu)域。這些分子包括Fab樣分子(Better等，1988，Science，2401041)；Fv分子(Skerra等，1988，Science，240，1038)；單鏈Fv(ScFv)分子，其中VH和VL配對結(jié)構(gòu)域通過柔性寡肽相連(Bird等，1988，Science 242423；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855879)；和單結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)，其包含分離的V結(jié)構(gòu)域(Ward等，1989 Nature 341，544)。涉及合成保留其特異結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段的技術(shù)的概括性綜述可在Winter等，1991，Nature，349，293-299中找到。
對于“ScFv分子”，我們指分子，其中VH和VL配對結(jié)構(gòu)域通過柔性寡肽相連。
利用抗體片段而不是完整抗體有若干優(yōu)勢。較小尺寸的片段可導(dǎo)致增強(qiáng)藥理學(xué)性質(zhì)，如更好地穿透實體組織。去除了完整抗體的效應(yīng)器功能，如補(bǔ)體結(jié)合。Fab、Fv、ScFv和dAb抗體片段都可在Escherichia coli(大腸桿菌)中表達(dá)和分泌，因此容易產(chǎn)生大量所述片段。
完整抗體、和F(ab′)2片段是“二價”的。對于“二價”，我們指所述抗體和F(ab′)2片段具有兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)。相反，F(xiàn)ab、Fv、ScFv和dAb片段是單價的，僅具有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)。
產(chǎn)生、分離和使用針對所需抗原或表位的抗體的方法對相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。例如，利用現(xiàn)有已知的標(biāo)準(zhǔn)方法可在合適的宿主動物(如，例如，小鼠、兔、或山羊)中產(chǎn)生抗體并將其用作粗抗血清或進(jìn)行純化，例如通過親和純化進(jìn)行。所需特異性的抗體可另外利用公知的分子生物學(xué)方法產(chǎn)生，包括從重組抗體的分子文庫中篩選，或?qū)⒒パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植或改組到合適的框架區(qū)上。人抗體可選自重組文庫和/或利用公知的分子生物學(xué)技術(shù)通過將非人抗體的CDR移植到人框架區(qū)上而產(chǎn)生。
優(yōu)選地，抗體或片段能結(jié)合由SEQ ID NO1殘基1至殘基409所限定的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽區(qū)，但不能結(jié)合p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽。SEQ ID NO1的殘基1-409對應(yīng)于p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的N末端，其與p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的多肽序列不具有同一性。
優(yōu)選地，抗體或片段能結(jié)合由SEQ ID NO1殘基410至殘基1084所限定的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽區(qū)，但不能結(jié)合p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽。SEQ ID NO1的殘基410-1084對應(yīng)于p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的C末端，其與p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的多肽序列具有相似性。
優(yōu)選地，抗體或片段能結(jié)合由SEQ ID NO1殘基817至殘基1013所限定的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽區(qū)，但不能結(jié)合p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽。SEQ ID NO1的殘基871-1013對應(yīng)于p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其與p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽序列具有相似性。
優(yōu)選地，抗體是人抗體。
能結(jié)合p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和其片段的抗體可被認(rèn)為是本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明的第三個方面提供了本發(fā)明的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)用于產(chǎn)生能結(jié)合本發(fā)明的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽的抗體的用途。
產(chǎn)生、分離和使用針對所需抗原或表位(例如，本發(fā)明的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽)的抗體的方法對相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的并包括在上述的那些方法中。
本發(fā)明的第四個方面提供了本發(fā)明的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)和/或本發(fā)明的抗體或片段，其用于藥物中。
對于“多核苷酸”，我們包括單鏈和/或雙鏈DNA (脫氧核糖核酸)和/或RNA(核糖核酸)分子和其衍生物。對于“編碼多核苷酸”，我們包括多核苷酸，其序列可被翻譯形成所需多肽。對于“反義多核苷酸”，我們包括多核苷酸，其與編碼多核苷酸的編碼鏈互補(bǔ)。
本發(fā)明人證實了p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白在調(diào)節(jié)血管發(fā)生/血管生成中起作用。這些多肽尤其涉及通過調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、細(xì)胞大小和管形成而促進(jìn)血管發(fā)生/血管生成。本發(fā)明的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)和/或本發(fā)明的抗體或片段因此可用于藥物中。
有一些醫(yī)學(xué)病況的特征在于缺失對控制血管發(fā)生和/或血管生成的分子過程的調(diào)節(jié)控制。例如，血管發(fā)生/血管生成相關(guān)疾病包括癌(尤其是實體腫瘤)、血管瘤、眼新血管形成、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、黃斑變性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性病況(如牛皮癬、慢性腸炎、哮喘)和子宮內(nèi)膜異位癥。
本發(fā)明人以前在PCT/EP2004/014573中顯示血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子(尤其是p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白)可有效用于治療性和/或預(yù)防性治療血管發(fā)生和/或血管生成，其內(nèi)容納入本文參考。
本發(fā)明的第五個方面提供了本發(fā)明的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸和/或本發(fā)明的抗體或片段用于制備調(diào)節(jié)血管生成和/或腫瘤形成的藥物的用途。
將多肽、多核苷酸和抗體配制成藥物、藥物組合物和疫苗的方法對于相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。含本發(fā)明多肽、多核苷酸和抗體的藥物、藥物組合物和疫苗的優(yōu)選配方在實施例中有描述。
優(yōu)選地，藥物防止和/或減輕血管生成和/或腫瘤形成。
一些公知的方法可用于檢測和/或測量血管生成和/或腫瘤形成，而且將會理解這些可用于確定藥物是否能防止和/或減輕血管生成和/或腫瘤形成?？蓽y量免疫接種的功效，例如通過利用酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)分析抗體滴度；利用酶聯(lián)免疫印跡(ELISPOT)測試通過γ干擾素產(chǎn)生間接測量T細(xì)胞活化。也可定量循環(huán)的內(nèi)皮細(xì)胞水平并用作成功的免疫接種的代用標(biāo)記?？赏ㄟ^確定管形成和內(nèi)皮細(xì)胞的存在性來測量血管生成的“水平”，這如在實施例和Troyanovsky等，2001，J.Cell.Biol.1521247-1254中所述的那樣。
例如可利用測微計通過確定腫瘤大小和體積來檢測和/或測量腫瘤。腫瘤中的新血管化可通過各種已知測試來評估，包括“基質(zhì)膠-栓”測試(例如，London等，2003，Cancer Gene Ther.10823-832所述)或基于成像的測試，如皮膚-皮片窗-室模型。
本發(fā)明的第六方面提供了本發(fā)明的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)和/或本發(fā)明的抗體或片段用于制備治療患有血管生成相關(guān)疾病或病癥的受試者的藥物的用途。
本發(fā)明的第七方面提供了本發(fā)明的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)和/或本發(fā)明的抗體或片段用于制備免疫接種患有或有血管生成和/或腫瘤形成和/或血管生成相關(guān)疾病或病癥風(fēng)險的受試者的疫苗的用途。
優(yōu)選地，血管生成相關(guān)疾病或病癥是癌、實體腫瘤、血管瘤、眼新血管形成、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、黃斑變性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性病況、牛皮癬、慢性腸炎、哮喘或子宮內(nèi)膜異位癥。
有血管發(fā)生/血管生成相關(guān)疾病風(fēng)險的患者可以是有癌癥風(fēng)險(尤其是有實體腫瘤風(fēng)險)的患者，例如有形成癌而導(dǎo)致實體腫瘤的遺傳傾向的患者、或有實體腫瘤環(huán)境風(fēng)險的患者。例如，有癌癥風(fēng)險的患者可以是有癌家族史的人，其結(jié)腸中存在息肉；或已知感染了與宮頸癌相關(guān)的人乳頭瘤病毒株的和/或呈現(xiàn)有最早期宮頸癌變的pap涂片的婦女。
優(yōu)選地，要治療的受試者是人，例如患有或有血管生成相關(guān)疾病或狀況風(fēng)險(如上定義)的人。另外，接受者可以是患有或有這種狀況風(fēng)險的動物，例如馴養(yǎng)動物(如貓或狗)或有重要農(nóng)業(yè)用途的動物，例如牛、綿羊、山羊、或家禽。
藥物或治療可以是預(yù)防性治療或治療性治療。
產(chǎn)生、分離和使用針對所需抗原或表位的抗體方法對相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的并如上所述。該抗體可用在治療中一一例如，含治療性抗體的藥物可被導(dǎo)入受試者中以調(diào)節(jié)該受試者的免疫應(yīng)答。例如，特異針對受試者抗原的治療性抗體將刺激針對該抗原的免疫應(yīng)答，由此誘導(dǎo)和/或促進(jìn)免疫應(yīng)答并幫助痊愈。向需要其的患者給藥治療性抗體的方法是現(xiàn)有公知的。將會理解，本發(fā)明的抗體可用作治療性抗體以調(diào)節(jié)受試者中針對p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的免疫應(yīng)答，優(yōu)選抑制和/或減輕該受試者中的血管生成。
免疫接種可通過向受試者給藥本發(fā)明的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽或多核苷酸；或通過在受試者體外將受試者的免疫細(xì)胞暴露于本發(fā)明的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽或多核苷酸，然后將經(jīng)過暴露的免疫細(xì)胞(和/或它們的后代)輸回受試者，由此來進(jìn)行。
用本發(fā)明的多肽或多核苷酸作為免疫原進(jìn)行免疫接種的范圍不受限，涵蓋了蛋白質(zhì)、肽和基于基因的免疫接種策略。例如，疫苗可包含本發(fā)明的多肽或多核苷酸或其免疫刺激衍生物或片段。希望向受試者同時或順序給藥基于蛋白質(zhì)或肽的和基于多核苷酸/基因的疫苗成分。這可促進(jìn)更強(qiáng)、更廣或更平衡的免疫應(yīng)答。
衍生物包括但不限于(A)本發(fā)明多肽的類似物，其中天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列在一個或多個氨基酸位置上被修飾，從而增加了分子的免疫原性；(B)化學(xué)修飾一個或多個氨基酸，如用人工化學(xué)基團(tuán)取代天然產(chǎn)生在所述氨基酸上的一個或多個化學(xué)基團(tuán)，以增強(qiáng)所得的肽的免疫原性；(C)用免疫原性蛋白質(zhì)(如鑰孔血藍(lán)素-KLH)或半抗原(即小化學(xué)分子，如二硝基酚-DNP)與對應(yīng)于本發(fā)明多肽片段的肽綴合。
疫苗被認(rèn)為能打破耐受并在接受者中產(chǎn)生抗內(nèi)源p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的免疫應(yīng)答。例如，在人中有效抗血管形成的疫苗可包含有效量的人p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子和/或其編碼多核苷酸；p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子或所編碼的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽可以是全長血管生成抑制素結(jié)合蛋白或其片段，其能促進(jìn)抗出現(xiàn)于內(nèi)源p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白中并可接近的一個或多個表位的免疫應(yīng)答。
疫苗可進(jìn)一步包含(作為一種或多種抗原的)一種或多種腫瘤抗原以及其它已知一種或多種血管生成因子，例如血管生成抑制素受體。
例如，編碼Her2/neu腫瘤抗原(原癌基因片段)的穿膜細(xì)胞外(TMEC)部分的質(zhì)?？膳c編碼人血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子的質(zhì)粒協(xié)同作用從而減輕腫瘤發(fā)展。TMEC部分源自大鼠p185(TMEC)的穿膜和細(xì)胞外(TMEC)部分，其為人Her2/neu癌基因的同源物。這例示了基于血管生成抑制素結(jié)合蛋白的疫苗如何作為“佐劑”與腫瘤抗原協(xié)同，在該例子中腫瘤抗原源于Her2/neu，但可能源于在人腫瘤中表達(dá)的任何腫瘤抗原，包括但不限于如下實例源于癌/睪丸腫瘤抗原(如抗原的MAGE、BAGE、GAGE、NY-ESO-1家族)的那些；分化抗原(如MART-1/MelanA、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1和-2)；廣泛表達(dá)的抗原(ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、hTERT、iCE、MUC1和2、PRAME、P15、RUI和2、SART-1和3、WT1)；和其它更獨(dú)特或相同的抗原(如AFP、b-聯(lián)蛋白、級聯(lián)蛋白-8、CDK-4、ELF2、G250、HSP70、HST-2、KIA A0205、MUM-1、2和3、RAGE)；病毒抗原(如HPV-E7、EBV抗原)；或衍生自融合蛋白的那些(如來自bcr-abl、Del-cain、LDL/FUT、TEL/AML1的那些)。腫瘤抗原可以以完整重組蛋白、質(zhì)粒、一種或多種肽、或其片段或部分(如I類或II類表位)來給藥。
疫苗可進(jìn)一步包含一種或多種抗腫瘤抗原或抗原因子的抗體。因此，本發(fā)明還包括與抗腫瘤抗原的抗體聯(lián)用的血管生成抑制素結(jié)合蛋白疫苗，包括但不限于針對Her2/neu抗原(如Herceptin/Traztusumab)、淋巴瘤上的CD20抗原、結(jié)腸直腸癌上的EpCAM抗原的抗體。
疫苗要能產(chǎn)生抗p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子的免疫應(yīng)答。得到的免疫應(yīng)答能抑制腫瘤與其它疾病狀態(tài)產(chǎn)生和/或維持所需的新毛細(xì)管的形成。進(jìn)一步(或另外)，盡管p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白至今還未在腫瘤細(xì)胞中被檢測到，但少量血管生成抑制素結(jié)合蛋白可由某些惡性腫瘤表達(dá)，因此可用作腫瘤特異性抗原。而不受理論所限，本發(fā)明涵蓋了利用疫苗(即如本文所述)的免疫接種，其中與p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白有反應(yīng)性的特異T細(xì)胞和/或抗體識別和摧毀表達(dá)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的腫瘤細(xì)胞。利用血管生成抑制素結(jié)合蛋白作為腫瘤特異性抗原的所有免疫接種模式和方法使用如抗血管生成效果的免疫接種所示的相同方法。
對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員公知的是，給藥疫苗(即通過受試者免疫系統(tǒng)作用的試劑)的分子和模式的選擇不同于直接治療劑的分子和模式的選擇。例如，作為疫苗給藥的血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子或編碼血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子的多核苷酸與非疫苗血管生成抑制素結(jié)合蛋白治療實體間的差異包括以下中一種或多種。
非疫苗治療實體必須保持血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子的功能(例如結(jié)合血管生成抑制素的能力；或與細(xì)胞成分相互作用的能力)。在另一方面，疫苗分子不必是功能性血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子，但可以是(盡管不必是)最小的功能性衍生物(包括片段)或類似物，其能產(chǎn)生與天然血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子在免疫上交叉反應(yīng)的免疫應(yīng)答。
通常疫苗劑量比非疫苗治療劑量低一或兩個數(shù)量級，例如以“每kg體重”為基礎(chǔ)測得的。
疫苗可包括(或帶有)“佐劑”，如細(xì)胞因子、BCG和/或明礬，其能增強(qiáng)免疫應(yīng)答。對于非疫苗療法，沒有這些伴隨物。例如在本案例中，在針對“自我”蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫時——即在針對人中的人蛋白質(zhì)免疫時，佐劑尤其重要。
尤其考慮到血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子作用的機(jī)理(延遲血管生成)，非疫苗治療實體將必須幾乎每天給藥，而相反涉及增強(qiáng)劑的疫苗給藥在兩或三周中只一次。例如，以幾周間隔的一次或兩次給藥對于基因疫苗或多肽/肽疫苗來說是必要的。
非疫苗載體應(yīng)當(dāng)能以高水平表達(dá)功能性分子(如本發(fā)明的多肽)；這在實踐中非常難以實現(xiàn)。DNA疫苗能以低得多的水平表達(dá)免疫性抗原。許多合適的載體和啟動子系統(tǒng)是已知的，例如基于CMV啟動子的系統(tǒng)。免疫性抗原可以是血管生成抑制素結(jié)合蛋白的最小的非功能性肽或結(jié)構(gòu)域，其能并足以產(chǎn)生抗天然血管生成抑制素結(jié)合蛋白的免疫應(yīng)答(抗體和/或T細(xì)胞)。功能性血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子不需被使用。
本發(fā)明的藥物組合物、藥物或疫苗可局部性、局部、全身或腸內(nèi)給藥以產(chǎn)生長期的免疫。產(chǎn)生的免疫應(yīng)答阻止新血管形成，而且防止新血管化對腫瘤形成或其它血管發(fā)生/血管生成相關(guān)疾病發(fā)揮預(yù)防或治療效果。
本發(fā)明使用的多肽片段可包含至少一個結(jié)構(gòu)域，即能、或預(yù)計能以與其在全長多肽中折疊的相似方式獨(dú)立折疊的部分。利用計算機(jī)分析鑒定這樣的結(jié)構(gòu)域的方法(例如，將對疏水性和/或形成α螺旋的可能性的分析加以合并)是公知的。獨(dú)立折疊的能力對于產(chǎn)生抗體應(yīng)答而言是重要的，但對于誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答而言不被認(rèn)為是重要的，因為多肽被降解了并呈遞為肽片段。
可用一種或多種代表p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的一種或多種表位的肽或肽模擬化合物。例如，可用短肽，例如多至約15、12、10或9個氨基酸(或編碼該短肽的多核苷酸)。對于表位，如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，其包括模擬表位。
表位序列可用公知的技術(shù)來鑒定，如那些在Epotope Mapping Protocols(1996)Methods Mol Biol 66(Glenn E Morris，編，Humana Press，Totowa，New Jersey)；美國專利4,708,871；Geysen等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.813998-4002；Geysen等，1986，Mol.Immunol.23709-715中所述的。線性或構(gòu)型表位的鑒定可利用諸如X-射線晶體學(xué)或2D-核磁共振衍生的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來進(jìn)行?？乖曰蚴杷詧D(如利用OMIGA軟件產(chǎn)生的，該軟件可得自O(shè)xford Molecular Group，其基于Hopp等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.783824-3828和Kyte等，1982，J.Mol.Biol.157105-132的算法)也可用于鑒定表位。
抗體可用作疫苗中的抗原。例如，給藥針對所要靶向(如血管生成抑制素結(jié)合蛋白)的抗體的抗體，而免疫系統(tǒng)的B細(xì)胞產(chǎn)生抗該抗體的抗體，其也能識別所要的靶位。這被稱為抗獨(dú)特型疫苗，而且與被動抗體治療有區(qū)別，其中針對所要靶位的抗體被給藥。
本發(fā)明還提供了基于p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的疫苗和其他類型的靶向內(nèi)皮細(xì)胞或產(chǎn)物的抗血管生成療法的組合。因而，例如，疫苗可進(jìn)一步包含適于用作抗血管生成促進(jìn)多肽(例如VEGFR-2(例如登錄號AF063658)或Tie2(例如登錄號BC035514))的免疫原的多核苷酸或多肽(或肽模擬化合物)。這些其它血管生成促進(jìn)多肽衍生的序列(例如VEGFR-2序列)可與本發(fā)明的多肽/多核苷酸包括在相同或不同多肽(或如合適，為多核苷酸)中。治療或疫苗可進(jìn)一步包括免疫治療，其基于給藥帶有抗腫瘤效應(yīng)的細(xì)胞因子或腫瘤抗原，例如給藥pDNA疫苗、病毒載體、或在DC細(xì)胞中表達(dá)或負(fù)載在DC細(xì)胞上。
疫苗可包含其它多肽或多核苷酸，這對于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯然的。例如，一種或多種多肽或一種或多種多核苷酸可以重組生物體或其部分、或其產(chǎn)物(如細(xì)胞培養(yǎng)上清液)的形式被包含在疫苗中，優(yōu)選是微生物，優(yōu)選能表達(dá)一種或多種多肽，即能表達(dá)血管生成抑制素結(jié)合蛋白氨基酸序列，或可選地能將編碼一種或多種多肽的核酸遞送到其表達(dá)的宿主細(xì)胞中。重組微生物優(yōu)選是非毒性微生物，這對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。例如，重組微生物可以是雙歧桿菌或乳酸桿菌、或減毒的沙門氏菌或BCG或減毒的大腸桿菌。重組生物體可選的還可以是植物，例如利用WO97/40177的教導(dǎo)。
進(jìn)一步可選的是，疫苗可以由完整的真核細(xì)胞或細(xì)胞所含物質(zhì)所構(gòu)成。例如，細(xì)胞可衍生自疫苗所要針對的生物體類型。細(xì)胞可以是重組的，如衍生自能表達(dá)本發(fā)明多肽的和/或用本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的細(xì)胞。細(xì)胞可以被輻照、熱滅活或用多聚甲醛固定，并用于免疫。
細(xì)胞可以是表達(dá)本發(fā)明的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的腫瘤細(xì)胞，或人源或來源于其它物種的異種的、表達(dá)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的新移植或培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，或用p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白或該分子部分轉(zhuǎn)染并表達(dá)它的細(xì)胞。另外，細(xì)胞可以是抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如樹突細(xì)胞(DC)，其負(fù)載有本發(fā)明的多肽或用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)染。腫瘤細(xì)胞疫苗(其不必包含p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白抗原)與本發(fā)明的疫苗一起使用。對于完整的細(xì)胞疫苗，腫瘤細(xì)胞取自一個或多個患者，并在實驗室中生長。然后處理腫瘤細(xì)胞以確保1)它們不再增殖，和2)沒有能感染患者的東西。
有兩種類型的完整細(xì)胞癌癥疫苗。自體同源的完整細(xì)胞疫苗用患者自己的完整、失活的腫瘤細(xì)胞制備。異源的完整細(xì)胞疫苗用別人的完整、失活的腫瘤細(xì)胞或幾個人腫瘤細(xì)胞組合來制備。
APC疫苗包含抗原呈遞細(xì)胞，通常是樹突細(xì)胞。例如，癌癥疫苗可由用腫瘤抗原刺激或在腫瘤抗原存在的情況下生長的樹突細(xì)胞制成。用抗原刺激的樹突細(xì)胞(或APC)在它們的表面帶有腫瘤抗原，當(dāng)注射時，可有力激活T細(xì)胞。
抗原疫苗包含一種或多種包含于腫瘤中的抗原。一些抗原是所有特定類型癌癥所共有的，而一些抗原是個體特有的。一些抗原是不同類型癌癥腫瘤間共有的。
本發(fā)明的多肽可以是肽模擬化合物，例如對應(yīng)于血管生成抑制素結(jié)合蛋白表位或模擬表位。術(shù)語“肽模擬物”指化合物，其模擬作為治療劑的特定肽的構(gòu)型和所需特征，但避免了不需要的特征。
涉及肽的治療用途是有限的，這歸因于缺乏口服生物利用度以及蛋白酶水解降解。例如，通常肽迅速在體內(nèi)通過外切和內(nèi)切肽酶降解，一般會造成非常短的生物半衰期。肽用作潛在治療劑的其它的缺陷是它們?nèi)狈νㄟ^口服給藥的生物利用度。蛋白水解酶在胃腸道中降解肽可能是重要的起作用的因素。可是，問題更復(fù)雜，因為已認(rèn)識到即使不被迅速代謝失活的小的環(huán)肽也顯示出不好的口服生物利用度。這可能歸因于不良的穿過腸膜的傳輸和由肝提取將其迅速清除出血液并然后排出到腸中。這些觀察結(jié)果提示多種酰胺鍵可干擾口服生物利用度。據(jù)信，肽鏈中連接氨基酸殘基的肽鍵可在肽藥物口服給藥時被打斷。
有一些不同方法來設(shè)計和合成肽模擬物。在一種方法中，如Sherman和Spatola(1990，J.Am.Chem.Soc.112433)所公開的，一種或多種酰胺鍵以基本電子等排(isoteric)的方式被各種化學(xué)功能性基團(tuán)所替代。該階梯式的方法取得了一些成功，由此獲得了活性類似物。在一些情況下，這些類似物顯示比它們的天然產(chǎn)生的對應(yīng)物具有更長的生物半衰期。然而，該方法有局限性。成功地替換超過一個酰胺鍵是很少見的。因此，產(chǎn)生的類似物仍舊易于在分子的其它地方被酶促失活。當(dāng)替換肽鍵時，優(yōu)選新的接頭部分與肽鍵有基本相同的電荷分布和基本相同的平面性。
可用現(xiàn)有已知的方法合成逆-反肽模擬物(retro-inverso peptidomimetics)(其中肽鍵被翻轉(zhuǎn)了)，例如在Meziare等，1997，J.Immunol.1593230-3237中所述的。該方法包括制造假肽，其含涉及骨架、而不涉及側(cè)鏈定向的變化。逆-反肽，其包含替代CO-NH肽鍵的NH-CO鍵，對蛋白水解更有抗性。
在另一種方式中，各種非編碼或修飾的氨基酸(如D-氨基酸和N-甲基氨基酸)被用于修飾哺乳動物肽。另外，推測的生物活性構(gòu)型通過共價修飾(如環(huán)化)或通過摻入γ-內(nèi)酰胺或其它類型的橋接來穩(wěn)定。如參見Veber等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，752636(1978)和Thursell等，Biochem.Biophys.Res.Comm.111166(1983)。
在許多合成策略中的共同主題是將一些環(huán)化部分導(dǎo)入基于肽的框架中。環(huán)化部分限制了肽結(jié)構(gòu)的構(gòu)型空間，而且這經(jīng)常造成增加肽對特定生物受體的親和力。該策略外加的優(yōu)勢是將環(huán)化部分導(dǎo)入肽也可使得肽減少對細(xì)胞肽酶的敏感性。
合成環(huán)化穩(wěn)定的肽模擬物的一種方法是環(huán)封閉換位(RCM)。該方法包括的步驟有合成肽前體和將其與RCM催化劑接觸以產(chǎn)生構(gòu)型限制性肽。合適的肽前體可包含兩個或更多個不飽和C-C鍵。該方法可利用固相肽合成技術(shù)來進(jìn)行。在該具體實施方式
中，錨定于固相支持物上的前體與RCM催化劑接觸，然后從固相支持物上裂解下產(chǎn)物從而產(chǎn)生構(gòu)型限制性肽。
其中一種或多種氨基酸殘基在多肽合成之前或之后被化學(xué)修飾了多肽可用作抗原，只要多肽的功能，即體內(nèi)特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生基本保持不變。這些修飾包括與酸或堿成鹽，尤其是與生理上可接受的有機(jī)或無機(jī)酸或堿成鹽，形成末端羧基的酯或酰胺，和連上氨基酸保護(hù)基團(tuán)，如N-叔丁氧羰基。這些修飾可保護(hù)多肽不被體內(nèi)代謝。多肽可以被甘露糖化或以其它方式修飾以增加其抗原性，或與化合物組合增加其抗原性和/或免疫原性。
源于p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的激動性表位的用途也包括在本發(fā)明中。設(shè)計激動性表位從而通過更有效地活化MHC I類或MHC II類限制性CD8或CD4+T細(xì)胞來更高效地活化免疫系統(tǒng)。有兩種常規(guī)的方法包括在本發(fā)明中用以從T細(xì)胞表位來設(shè)計激動劑表位。一種方法進(jìn)行修飾HLA錨定殘基，造成較高的HLA I類或II類結(jié)合。該方法已成功用于源于腫瘤抗原或微生物抗原的幾種HLA I類結(jié)合肽。另外，在T細(xì)胞受體(縮寫為TCR)接觸中涉及的殘基替換也可造成增加由T細(xì)胞引發(fā)的應(yīng)答，而且這為本發(fā)明所涵蓋。
一般而言，如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，而且例如US 5,869,445所述的，氨基酸替換可以各種方式制備從而提供本發(fā)明內(nèi)變體的其它具體實施方式
。例如，首先，氨基酸替換可以是保守地制備出的；即，替換氨基酸代替具有相似性質(zhì)的氨基酸，由此，肽化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員將能預(yù)期多肽二級結(jié)構(gòu)和疏水性質(zhì)基本不變。一般而言，以下氨基酸組代表保守改變(1)ala，pro，gly，glu，asp，gln，asn，ser，thr；(2)cys，ser，tyr，thr；(3)val，ile，leu，met，ala，phe；(4)lys，arg，his；和(5)phe，tyr，trp，his。非保守改變的例子是用另一組的氨基酸替換一個組的氨基酸。
其它制備氨基酸替換物以產(chǎn)生本發(fā)明變體的方式是鑒定并替換T細(xì)胞基序中潛在結(jié)合II類MHC分子(對于CD4+T細(xì)胞應(yīng)答)或I類MHC分子(對于CD8+T細(xì)胞應(yīng)答)的氨基酸。帶有潛在結(jié)合II類MHC分子的基序的肽片段可以通過計算機(jī)分析來鑒定。例如，可用蛋白質(zhì)序列分析軟件包——T Sites，其整合了幾種設(shè)計用來區(qū)分潛在T細(xì)胞識別位點(diǎn)的計算機(jī)算法(Feller和de la Cruz，1991，Nature 349720-721)。使用兩種搜索算法(1)AMPHI算法，其在Feller和de la Cruz，1991，Nature 349720-721；Margalit等，1987，J.Immunol.1382213-2229中有描述，根據(jù)α螺旋周期性和兩親性來鑒定表位基序；(2)Rothbard和Taylor算法，其根據(jù)電荷和極性模式來鑒定表位基序(Rothbard和Taylor，988，EMBO J.793-100)。帶有這兩個基序的片段最適于結(jié)合II類MHC分子。CD8+T細(xì)胞識別結(jié)合I類MHC分子的肽。Falk等證實了結(jié)合特定MHC分子的肽共有可分辨的序列基序(Falk等，1991，Nature，351290-296)。結(jié)合于HLA-A2.1凹陷處的肽基序通過Edman降解從培養(yǎng)的細(xì)胞系的HLA-A2.1分子上剝離下的肽來確定(表2，來自Falk等，見前)。該方法將典型或平均HLA-A2.1結(jié)合肽鑒定為有9個氨基酸長、在第2(L)和9(V)位帶有優(yōu)勢性錨定殘基。通常發(fā)生的強(qiáng)結(jié)合殘基被鑒定出處于第2(M)、4(E、K)、6(V)、和8(K)位。鑒定出的基序代表許多結(jié)合肽的平均情況。
表位(例如形成表位的氨基酸序列，或被認(rèn)為包含抗血管生成表位的區(qū)域)可以單拷貝或多拷貝(例如串聯(lián)重復(fù)序列)形式出現(xiàn)。該串聯(lián)或多重復(fù)序列本身可有足夠的抗原性從而避免使用載體。以下情況對于多肽是有益的成環(huán)，N末端和C末端連接在一起，或?qū)⒁环N或多種Cys殘基加到末端以增強(qiáng)抗原性和/或使二硫鍵形成。如果表位(例如形成表位的氨基酸序列)共價連于載體上，優(yōu)選連于多肽上，則優(yōu)選進(jìn)行排列以使形成表位的氨基酸序列成環(huán)。
根據(jù)當(dāng)前的免疫學(xué)理論，載體功能應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)在任何免疫原性制劑中以刺激、或增強(qiáng)刺激免疫系統(tǒng)。以上本發(fā)明前述方面定義的一個或多個表位可以與分離的載體(如血清白蛋白、肌紅蛋白、細(xì)菌類毒素和鑰孔血藍(lán)素)相連，例如通過交聯(lián)。本發(fā)明的多肽本身可用作載體或佐劑。較近開發(fā)的載體在免疫應(yīng)答中誘導(dǎo)T細(xì)胞的輔助，其包括乙型肝炎核心抗原(也被稱為核殼蛋白)、推測的T細(xì)胞表位，如Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys、β-半乳糖苷酶和白細(xì)胞介素-1的163-171位肽。后者的化合物可另外被視為載體或佐劑或這兩者。
另外，有幾個拷貝的相同或不同表位可以相互交聯(lián)，在這種情況下沒有分離的載體，而載體功能可由該交聯(lián)來提供。合適的交聯(lián)劑包括列于Sigma和Pierce目錄的那些，例如戊二醛、碳化二亞胺和琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己胺-1-羧酸酯，后一試劑利用C末端半胱氨酸殘基(如果存在)上的-SH基團(tuán)?？墒褂萌魏谓宦?lián)多肽的常規(guī)方法，如在O′Sullivan等，1979，Anal.Biochem.100100-108中有常規(guī)描述的那些。例如，第一部分可以富含硫醇基團(tuán)，而第二部分能與能與硫醇基團(tuán)反應(yīng)的雙功能試劑反應(yīng)，雙功能試劑例如碘乙酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸(SPDP)、在綴合的部分間整合了二硫橋接的雜雙功能交聯(lián)劑。酰胺和硫醚鍵(例如用m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯得到的)通常在體內(nèi)較二硫鍵更穩(wěn)定。
其它有用的交聯(lián)劑包括S-乙?；虼叶妓酦-羥基琥珀酰亞胺酯(SATA)，其是針對伯胺的硫醇化試劑，其在溫和條件下使巰基去保護(hù)(Julian等，1983，Anal.Biochem.13268))；二甲基軟木脂亞胺酯二鹽酸(dimethylsuberimidate dihydrochloride)和N，N′-鄰-亞苯基二馬來酰亞胺。
如果多肽通過合適的核苷酸序列在合適的宿主中表達(dá)來制備，則多肽作為與用作載體的肽序列的融合產(chǎn)物來表達(dá)是有益的。Kabigen的“Ecosec”系統(tǒng)就是這種排列的實例。
其它可用佐劑包括WO 02/053181中所述的佐劑，例如VSA3，其包括DDA(參見美國專利5,951,988)。
可用于制備合適重組多肽或多核苷酸的合適的載體或構(gòu)建體對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。能表達(dá)所需一種或多種多肽的多核苷酸可利用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)來制備。
希望多核苷酸能在接受者中表達(dá)一種或多種多肽，從而向人或動物給藥多核苷酸，導(dǎo)致在人或動物中表達(dá)抗原多肽(即源于血管生成抑制素結(jié)合蛋白并任選其它多肽的序列)。一種或多種多肽(例如p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白)可由任何下述合適的多核苷酸(遺傳構(gòu)建體)表達(dá)并遞送到接受者。通常，表達(dá)多肽的遺傳構(gòu)建體包含編碼所述多肽的多核苷酸序列，其可操作地連于能在接受者細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄的多核苷酸(如mRNA)分子的啟動子，其可以被翻譯以合成所述多肽。合適的啟動子對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，可包括針對普遍表達(dá)的基因(例如管家基因)或針對組織選擇性基因的啟動子，這取決于希望在哪里表達(dá)所述多肽(例如，在樹突細(xì)胞或其它抗原呈遞細(xì)胞或其前體中)。優(yōu)選地，使用樹突細(xì)胞或樹突前體細(xì)胞選擇性啟動子，但這不是必需的，特別是如果多核苷酸的遞送或攝取靶向于所選擇的細(xì)胞，如樹突細(xì)胞或前體。樹突細(xì)胞選擇性啟動子可包括CD83或CD36啟動子。
其它希望與本發(fā)明疫苗一起表達(dá)或組合的多肽/蛋白質(zhì)包括免疫刺激劑，如細(xì)胞因子或生長因子。實例包括GM-CSF、IL-2、IL12或IL-15。其它可表達(dá)或被包括入的免疫刺激劑是結(jié)合所謂Toll受體的因子，其包括小免疫刺激分子Imiquimod、微生物產(chǎn)物(如鞭毛蛋白)、或未甲基化的細(xì)菌CpG基序、或基于CpG基序的寡核苷酸。
能表達(dá)一種或多種多肽的多核苷酸序列優(yōu)選可操作地與表達(dá)所述序列所需的調(diào)節(jié)元件相連。
“可操作地相連”指鄰接從而能執(zhí)行成分的正常功能。因而，編碼序列“可操作地相連”于調(diào)節(jié)元件指其中編碼抗原(或免疫刺激分子)的核酸序列能在調(diào)節(jié)序列控制下表達(dá)的構(gòu)型。
“調(diào)節(jié)序列”指在特定宿主生物體中表達(dá)可操作相連的編碼序列所需的核酸序列。例如，適于真核細(xì)胞的調(diào)節(jié)序列有啟動子、聚腺苷化信號、和增強(qiáng)子。
“載體”指DNA分子，其包括單鏈、雙鏈、環(huán)或超螺旋DNA。合適的載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、痘病毒和細(xì)菌質(zhì)粒。反轉(zhuǎn)錄病毒載體是反轉(zhuǎn)錄病毒，其通過將它們的基因組隨機(jī)整合入宿主基因組而復(fù)制。合適的反轉(zhuǎn)錄病毒載體在WO 92/07573中有描述。
病毒載體應(yīng)當(dāng)不能使人生病或帶來任何疾病。這些病毒能在實驗室中通過基因工程制備，從而使它們在感染人細(xì)胞時，細(xì)胞將在其表面產(chǎn)生并展示所需的抗原。病毒應(yīng)僅能感染少量人細(xì)胞——足以引發(fā)免疫應(yīng)答，但不足以使人生病。
病毒也能通過基因工程來制備細(xì)胞因子或在它們的表面展示蛋白質(zhì)，幫助活化免疫細(xì)胞。這些能單獨(dú)或與疫苗一起給藥以輔助免疫應(yīng)答。
腺病毒包含線性雙鏈DNA基因組。合適的腺病毒載體在Rosenfeld 等，1991，Science，252432中有描述。
腺相關(guān)病毒(AAV)屬于細(xì)小病毒屬并包含約4-6KB的單鏈DNA基因組。
痘病毒載體是大的病毒并具有幾個可插入基因的位點(diǎn)。它們是熱穩(wěn)定的，可以在室溫下儲存。安全性研究表明痘病毒載體是復(fù)制缺陷的，并不能從宿主轉(zhuǎn)移到宿主或環(huán)境中去。
可將疫苗靶向特異細(xì)胞群(例如APC)，例如，通過注射位點(diǎn)，應(yīng)用靶向載體和遞送系統(tǒng)，或從接受者中選擇性純化該細(xì)胞群并先體外后體內(nèi)(ex vivo)給藥肽或核酸(例如樹突細(xì)胞可以如Zhou等，1995，Blood，863295-3301；Roth等，1996，Scand.J.Immunology 43，646-651所述進(jìn)行分選)。另外，靶向載體可包括組織或腫瘤選擇性啟動子，其指導(dǎo)抗原在合適的位置表達(dá)。
盡管包含本發(fā)明多核苷酸的遺傳構(gòu)建體可以是DNA或RNA，但優(yōu)選是DNA。優(yōu)選地，遺傳構(gòu)建體適于向人細(xì)胞進(jìn)行遞送。
將遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞或從動物體中去除的方式和方法是現(xiàn)有已知的。例如，本發(fā)明的構(gòu)建體可通過常規(guī)方法導(dǎo)入細(xì)胞，例如涉及反轉(zhuǎn)錄病毒的方法，從而使構(gòu)建體被插入(分裂)細(xì)胞的基因組中。被靶向的反轉(zhuǎn)錄病毒可用于本發(fā)明中；例如，提供特異結(jié)合親和力的序列可以通過基因工程導(dǎo)入預(yù)先存在的病毒env基因中(參見Miller & Vile，1995，F(xiàn)aseb J.9190-199對此和其它用于基因療法的靶向性載體的綜述)。
優(yōu)選的反轉(zhuǎn)錄病毒載體可以是慢病毒載體，如在Verma & Somia，1997，Nature，389239-242中所述的那些。
其它方法包括簡單地將構(gòu)建體遞送進(jìn)細(xì)胞中，用于在有限的時間內(nèi)表達(dá)，或者在整合入基因組中后，在較長時間內(nèi)表達(dá)。后者方法的例子包括脂質(zhì)體(Nssander等，1992，Cancer Res.52646-653)。其它遞送方法包括腺病毒，其通過抗體-聚賴氨酸橋帶有外源DNA，(參見Curiel Prog.Med.Virol.401-18)，和作為載體的鐵傳遞蛋白-聚陽離子綴合物(Wagner等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，873410-3414)。在這些方法中的第一個方法中，與本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或其它遺傳構(gòu)建體形成聚陽離子-抗體復(fù)合物，其中抗體特異針對野生型腺病毒或其中新的表位被導(dǎo)入以結(jié)合抗體的變體腺病毒。聚陽離子部分通過與磷酸骨架靜電相互作用來結(jié)合DNA。腺病毒，因為含不變的纖維和五鄰體蛋白質(zhì)，進(jìn)入細(xì)胞，并隨著它將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體帶入細(xì)胞。優(yōu)選聚陽離子是聚賴氨酸。
合適的細(xì)菌遞送方法描述于Dietrich，2000，Antisense Nucleic Acid DrugDelivery，10391-399。例如，減毒的細(xì)菌株通過粘膜表面給藥重組疫苗。盡管減毒細(xì)菌一般通過遺傳工程來表達(dá)異源抗原，其它方法使用細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌來遞送真核抗原表達(dá)載體(DNA疫苗)。該策略能通過細(xì)菌感染直接遞送DNA到專門的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DC)。用于DNA疫苗遞送的細(xì)菌在被APC吞噬后進(jìn)入宿主細(xì)胞胞質(zhì)，例如，志賀氏菌和李斯特氏桿菌，或它們?nèi)粤粼谕淌审w小室中，如沙門氏菌。細(xì)菌載體的這兩種細(xì)胞內(nèi)定位都適于成功遞送本發(fā)明的DNA疫苗載體。
表達(dá)本發(fā)明的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽可在誘導(dǎo)型細(xì)菌啟動子控制之下進(jìn)行，例如在細(xì)菌遭遇或進(jìn)入宿主生物體環(huán)境(例如宿主腸道)或結(jié)合或進(jìn)入宿主細(xì)胞時能誘導(dǎo)的啟動子。
本發(fā)明的多核苷酸可用“基因槍”皮內(nèi)免疫接種、肌肉內(nèi)注射、或皮內(nèi)或肌肉內(nèi)注射的質(zhì)粒DNA免疫接種來給藥，然后在注射位點(diǎn)進(jìn)行皮膚或肌肉內(nèi)“電穿孔”，以此增加免疫接種的功效。
例如如下所述，DNA也可通過腺病毒遞送，其中它存在于腺病毒顆粒內(nèi)。
可用高效核酸遞送系統(tǒng)，其利用了受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將DNA大分子帶入細(xì)胞。這通過綴合鐵傳輸?shù)鞍踪|(zhì)(鐵傳遞蛋白)與結(jié)合核酸的聚陽離子來進(jìn)行。人鐵傳遞蛋白、或雞同源物伴清蛋白、或其組合通過二硫連接共價連接于小DNA結(jié)合蛋白質(zhì)魚精蛋白或各種大小的聚賴氨酸。這些修飾的鐵傳遞蛋白分子保持了結(jié)合其同類受體和有效介導(dǎo)鐵轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的能力。鐵傳遞蛋白-聚陽離子分子與本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或其它遺傳構(gòu)建體形成了在電穿孔時穩(wěn)定的復(fù)合物，而無論核酸大小(可從短的寡核苷酸至21千堿基對的DNA)。當(dāng)鐵傳遞蛋白-聚陽離子和本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或其它遺傳構(gòu)建體的復(fù)合物用于靶細(xì)胞時，預(yù)計構(gòu)建體在細(xì)胞中高水平表達(dá)。
也可利用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或其它遺傳構(gòu)建體的高效受體介導(dǎo)的遞送，其利用由Cotten 等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，896094-6098的方法產(chǎn)生的有缺陷或化學(xué)失活的腺病毒顆粒的核內(nèi)體干擾活性。該方法似乎依賴以下事實，即腺病毒被修飾以從核內(nèi)體中釋放出它們的DNA而不經(jīng)過溶酶體，并且在存在諸如與本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或其它遺傳構(gòu)建體相連的鐵傳遞蛋白的情況下，該構(gòu)建體被細(xì)胞以與腺病毒顆粒相同的途徑攝入。
該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)，即無需利用復(fù)雜的反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體；不像反轉(zhuǎn)錄病毒感染那樣永久修飾基因組；和靶向的表達(dá)系統(tǒng)與靶向的遞送系統(tǒng)偶聯(lián)，因而減輕了對其它細(xì)胞類型的毒性。
“裸DNA”和與陽離子和中性脂復(fù)合的DNA也可用于將本發(fā)明的DNA導(dǎo)入接受者細(xì)胞中。非病毒方法進(jìn)行基因治療在Ledley，1995，Human GeneTherapy，61129-1144中有描述。其它靶向性遞送系統(tǒng)也是已知的，如WO 94/10323所述的修飾的腺病毒系統(tǒng)，其中通常DNA被攜帶在腺病毒、或腺病毒樣顆粒中。Michael等，1995，Gene Therapy，2660-668描述了修飾腺病毒從而將細(xì)胞選擇性部分加到纖維蛋白上。突變的腺病毒選擇性地在p53缺陷型人腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，如Bischoff等，1996，Science，274373-376所述的那些，其也可用于將本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體遞送到細(xì)胞中。其它合適的病毒或病毒樣顆粒包括HSV、AAV、痘苗病毒、慢病毒和細(xì)小病毒。
免疫脂質(zhì)體(導(dǎo)向抗體的脂質(zhì)體)尤其可用于靶向過表達(dá)細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的細(xì)胞類型，所述細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的抗體是可得到的，例如使用針對CD1、CD14或CD83(或其它樹突細(xì)胞或前體細(xì)胞表面分子)的抗體，就像在樹突細(xì)胞或前體中可能的那樣。為了制備免疫脂質(zhì)體，根據(jù)Martin&Papahadjopoulos，1982，J.Biol.Chem.257286-288的方法合成MPB-PE(N-[4-(對-馬來酰亞胺苯基)丁酰]-磷脂酰乙醇胺)。MPB-PE被整合入脂質(zhì)體雙層中從而能將抗體、或其片段和脂質(zhì)體表面共價偶聯(lián)。脂質(zhì)體方便地裝載有本發(fā)明的DNA或其它遺傳構(gòu)建體用以向靶細(xì)胞遞送，例如，可通過在DNA或其它遺傳構(gòu)建體溶液中形成所述脂質(zhì)體，然后接著在多至0.8MPa的氮?dú)鈮毫ο峦ㄟ^0.6μm和0.2μm孔徑的聚碳酸酯過濾膜順序擠出來進(jìn)行。擠出后，80000xg超離心45分鐘來將包裹的DNA構(gòu)建體從游離的DNA構(gòu)建體中分離出。新制備的溶于去氧緩沖液的MPB-PE-脂質(zhì)體與新制備的抗體(或其片段)混合并在4℃在氮?dú)庀潞愣ǚD(zhuǎn)過夜而來進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。80000xg超離心45分鐘來將免疫脂質(zhì)體從未綴合的抗體中分離出。例如可通過腹膜內(nèi)或例如可皮下直接導(dǎo)入存在靶細(xì)胞的位點(diǎn)來注射免疫脂質(zhì)體，。
將能理解的是，希望能暫時在細(xì)胞中調(diào)節(jié)一種或多種多肽(例如抗原多肽)的表達(dá)。因而，可能希望直接或間接在可調(diào)節(jié)啟動子控制下表達(dá)多肽，例如當(dāng)希望活化或減弱(取決于小分子是否活化或減弱所述啟動子)多肽表達(dá)時，可通過向接受者給藥的小分子的濃度來調(diào)節(jié)。將能理解的是，如果表達(dá)構(gòu)建體是穩(wěn)定的，即能在所述細(xì)胞中表達(dá)多肽(在存在任何必要調(diào)節(jié)分子的情況下)至少一周、一、二、三、四、五、六、八個月或一或多年，這是特別有益的。優(yōu)選表達(dá)構(gòu)建體在所述細(xì)胞中能表達(dá)多肽少于一月時間。本發(fā)明優(yōu)選的構(gòu)建體可包含可調(diào)節(jié)的啟動子。可調(diào)節(jié)的啟動子的例子包括以下論文提及的那些Rivera等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，968657-62(由雷帕霉素控制，其為口服的生物利用的藥物，其利用兩個分離的腺病毒或腺相關(guān)病毒(AAV)載體，一個編碼誘導(dǎo)型人生長激素(hGH)的靶基因，而另一個編碼雙向雷帕霉素調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子)；Magari等，1997，J.Clin.Invest.1002865-72(由雷帕霉素控制)；Bueler，1999，Biol.Chem.380613-22(腺相關(guān)病毒載體的綜述)；Bohl等，1998，Blood，921512-7(腺相關(guān)載體中由強(qiáng)力霉素控制)；Abruzzese等，1996，J.Mol.Med.74379-92(綜述，涉及誘導(dǎo)因子，如激素、生長因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞抑制素、放射性、熱休克和相關(guān)應(yīng)答元件)。也可用四環(huán)素誘導(dǎo)型載體。通過顯示能用于在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中調(diào)節(jié)表達(dá)的相對非毒性的抗生素可活化這些載體。而且，基于類固醇的誘導(dǎo)子尤其可用，這是因為類固醇受體復(fù)合物在轉(zhuǎn)錄前進(jìn)入DNA載體必須被隔離的核中。
通過在兩種水平上調(diào)節(jié)表達(dá)可進(jìn)一步改善該系統(tǒng)，例如通過利用組織選擇性啟動子和由外源誘導(dǎo)子/弱化子(例如上述和所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的小分子誘導(dǎo)子)控制的啟動子。因此，一種調(diào)節(jié)水平可包括將合適的編碼多肽的基因與誘導(dǎo)型啟動子連接，而另一種調(diào)節(jié)水平必須使用組織選擇性啟動子來驅(qū)動編碼所需誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子(其控制在誘導(dǎo)型啟動子下編碼多肽(例如抗原多肽)的基因表達(dá))的基因。通過細(xì)胞類型特異性靶向遺傳構(gòu)建體可進(jìn)一步改善控制。
利用現(xiàn)有公知的方法可制備本發(fā)明的構(gòu)建體。
治療劑或分子(疫苗)，例如抗原分子，例如本發(fā)明的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸和/或抗體或其制劑，可通過常規(guī)方法給藥，方法包括口服和非腸道(如，皮下或肌肉內(nèi))注射。優(yōu)選的途徑包括口服、鼻內(nèi)或肌肉內(nèi)注射。治療可由一段時期單劑或數(shù)劑組成。將會理解的是，優(yōu)選誘導(dǎo)子(例如上述小分子誘導(dǎo)子)可口服給藥。
向接收者細(xì)胞遞送包含編碼本發(fā)明的針對的多核苷酸(或反義多核苷酸)的遺傳構(gòu)建體(例如腺病毒載體構(gòu)建體)的方法對于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。尤其可用可采用的治療規(guī)程，更優(yōu)選可用基因槍來遞送構(gòu)建體至樹突細(xì)胞，例如在皮膚中。
可采用的治療規(guī)程描述于Nestle等，1998，Nature Med.4328-332和De Bruijn等，1998，Cancer Res.58724-731。
治療劑(疫苗)可向正在用某些其它方法治療疾病的受試者給藥。因而，盡管可單獨(dú)用治療方法，但希望用它作為輔助療法來治療，例如隨同常規(guī)預(yù)防性或治療性方法或靶向腫瘤抗原的免疫治療使用。例如，本發(fā)明的疫苗與基于腫瘤抗原的、以肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸或完整腫瘤細(xì)胞給藥的疫苗的組合可成為合適的組合療法。
盡管可能單獨(dú)給藥本文所述的治療分子，例如抗原分子或免疫刺激分子，優(yōu)選將其與一種或多種可接受的載體在一起作為藥物制劑。一種或多種載體必須是“可接受的”，其含義為與治療分子(其可以是核酸或多肽)相容，和不對其接受者有害。通常，載體將是無菌的和無熱源的水或鹽水。
藥物組合物可進(jìn)一步包含用于增加組合物抗原性和/或免疫原性的成分，例如上述佐劑和/或細(xì)胞因子?？捎枚鄡r抗原(抗原簇)。
商品型細(xì)胞因子已被用于非特異性免疫治療以全面增強(qiáng)免疫系統(tǒng)，并用于作為佐劑與諸如腫瘤疫苗的其它免疫治療劑一起給藥。正在測試GM-CSF用作抗癌的可非特異性免疫治療并用于作為與其它類型的免疫治療劑一起給藥的佐劑。
已知各種其它化合物能增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的活性，而且現(xiàn)在正在研究其能否用作佐劑，尤其用于疫苗療法。一些最常研究的佐劑如下列，但更多的在開發(fā)之中。
左咪唑，一種最先用于抗寄生蟲感染的藥物，最近被發(fā)現(xiàn)當(dāng)與一些化療藥物一起使用時能改善結(jié)腸直腸癌患者的存活率。它常用作免疫治療佐劑，因為它能活化T淋巴細(xì)胞。左咪唑現(xiàn)在常規(guī)用于患有某些階段的結(jié)腸直腸癌的人，并正在臨床試驗中測試能否用于治療其它類型的癌癥。
氫氧化鋁(明礬)是癌癥疫苗臨床試驗中最常用的佐劑之一。它已經(jīng)用于抗幾種傳染源、包括乙型肝炎病毒的疫苗中。
卡介苗(BCG)是細(xì)菌，其與造成肺結(jié)核的細(xì)菌相關(guān)。BCG感染對免疫系統(tǒng)的效應(yīng)使該細(xì)菌能用作抗癌免疫治療劑。BCG是最早用于抗癌的免疫治療劑之一。FDA批準(zhǔn)其用于常規(guī)治療表面膀胱癌。也正在測試它能否用于其它癌癥中作為非特異佐劑。研究人員正在關(guān)注在化療、放療或其他類型的免疫治療時注射BCG以增強(qiáng)免疫系統(tǒng)。
不完全福氏佐劑(IFA)與一些實驗性療法一起使用以幫助刺激免疫系統(tǒng)并增強(qiáng)對癌疫苗的免疫應(yīng)答，IFA是由溶于白色礦物油中的乳化劑組成的液體。
QS-21是相對較新的免疫刺激物，其由植物提取物制成，能增加對用于抗黑素瘤的疫苗的免疫應(yīng)答。
DETOX是另一種相對新的佐劑。它由細(xì)菌細(xì)胞壁的部分和一種脂肪制成。它與各種免疫療法一起使用以刺激免疫系統(tǒng)。
鑰孔血藍(lán)素(KLH)是另一種佐劑，用于提高癌疫苗療法的有效性。它提取自一類海洋軟體動物。
二硝基苯基(DNP)是半抗原/小分子，其能附著于腫瘤抗原并增強(qiáng)免疫應(yīng)答。在某些癌疫苗中，它被用于修飾腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的第八方面提供了本發(fā)明的抗體或片段檢測和/或測量測試樣品中血管生成和/或腫瘤形成的用途。例如，測試樣品(如血清、提取自腫瘤的腫瘤蛋白提取物或mRNA)可用于定量p80-和/或p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多核苷酸和/或多肽和/或抗p80-和/或p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的抗體的水平。許多公知的方法可用于該目的，包括ELISA和/或?qū)崟r聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測試。將能理解的是，利用由要分析的測試樣品決定的體外和/或體內(nèi)方法可檢測和/或測量血管生成和/或腫瘤形成。
本發(fā)明的第九方面提供了用于調(diào)節(jié)血管生成和/或腫瘤形成的藥物組合物，其包含有效量的本發(fā)明的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)和/或本發(fā)明的抗體或片段，和藥物賦形劑或稀釋劑。
對于“有效量”，我們包括足以調(diào)節(jié)血管生成和/或腫瘤形成的量。用于測量受試者(如人)中血管生成和/或腫瘤形成水平的方法對于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。
例如，腫瘤形成可在鼠腫瘤細(xì)胞系(如小鼠乳腺癌系D2F2、和淋巴瘤系EL-4)中評估。腫瘤體內(nèi)形成可在模型系統(tǒng)中測定，如小鼠轉(zhuǎn)基因乳腺癌模型BALB-neuT，其能由于在小鼠乳腺腫瘤病毒啟動子控制下過量表達(dá)轉(zhuǎn)化的大鼠Her.2/neu癌基因而自發(fā)發(fā)展出腫瘤(Boggio等，1998，J.Exp.Med.188589-96)。
這些模型中宿主免疫系統(tǒng)的狀態(tài)可利用已知的免疫學(xué)測試來評估，其測量CD8+和CD4+T細(xì)胞應(yīng)答(如ELISPOT測試)、細(xì)胞因子釋放測試和T細(xì)胞增殖測試以及測量抗體應(yīng)答的測試(如ELISA測試)和基于流式細(xì)胞儀的測試。腫瘤中的新血管化可通過各種已知的測試來評估，包括“基質(zhì)膠-拴”測試(描述于諸如，London等，2003，Cancer Gene Ther.10823-832)或基于成像的測試，如皮膚-皮片窗-室模型。
通過利用這種方法在受試者中確定用一定量的本發(fā)明的多肽和/或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)和/或抗體或片段治療之前和之后血管生成水平，可在體內(nèi)來確定有效量。另外，藥物的有效范圍可通過利用諸如實施例所述方法體外測試藥物來獲得。
優(yōu)選地，藥物組合物防止和/或減輕血管生成和/或腫瘤形成。
本發(fā)明的第十方面提供了用于調(diào)節(jié)血管生成和/或腫瘤形成的疫苗，其包含有效量的本發(fā)明的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)，和賦形劑或稀釋劑。
有一些動物研究證明了疫苗候選物可起預(yù)防性(即在用腫瘤細(xì)胞刺激過的動物中防止腫瘤)和治療性(即給藥疫苗可造成先前建立的腫瘤的消退)作用，例如Cavallo等，1993，Cancer Res.215067；Nanni等，2001，J.Exp.Med.1941195。
優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗或本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)一步包含至少一種添加劑，其用于輔助或增強(qiáng)多肽和/或多核苷酸(和/或反義多核苷酸)和/或其抗體或片段的作用。
更優(yōu)選地，至少一種添加劑是免疫刺激分子，常規(guī)的是，細(xì)胞因子或編碼細(xì)胞因子的多核苷酸(和/或反義多核苷酸)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗或本發(fā)明的藥物組合物包含細(xì)胞或細(xì)胞提取物，更優(yōu)選是APC，其負(fù)載有本發(fā)明的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽或用本發(fā)明的編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)轉(zhuǎn)染。
細(xì)胞通常是腫瘤細(xì)胞表達(dá)的血管生成抑制素結(jié)合蛋白或內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的血管生成抑制素結(jié)合蛋白。
本發(fā)明的第十一個方面提供了在哺乳動物中產(chǎn)生抗本發(fā)明的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括如下步驟 (iii)用本發(fā)明的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)先體外后體內(nèi)刺激從哺乳動物中收集的免疫細(xì)胞； (iv)將經(jīng)刺激的免疫細(xì)胞傳輸回哺乳動物，由此細(xì)胞傳輸回哺乳動物產(chǎn)生針對血管生成抑制素結(jié)合蛋白的免疫應(yīng)答。
優(yōu)選地，哺乳動物是人。
優(yōu)選地，免疫應(yīng)答起預(yù)防性或治療性作用以抑制血管生成相關(guān)疾病的發(fā)生或發(fā)展。
在本發(fā)明的該方面中，本發(fā)明的多肽先體外后體內(nèi)(即在受試者體外)刺激了受試者的免疫細(xì)胞。本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)染入抗原呈遞細(xì)胞(APC)后，該多肽可呈遞于患者的免疫細(xì)胞上，尤其是T細(xì)胞。抗原呈遞細(xì)胞也可預(yù)先用本發(fā)明的多肽或源于它的肽處理。任何能刺激淋巴細(xì)胞的細(xì)胞類型在本文行文中都被定義為抗原呈遞細(xì)胞；這些被認(rèn)為包括源于單核細(xì)胞或骨髓淋巴細(xì)胞的樹突細(xì)胞(DC)；和B細(xì)胞，其用分裂素刺激或用諸如Epstein Barr病毒(EBV)無限增殖。
可采用的將經(jīng)刺激的免疫細(xì)胞傳輸回患者的方法可造成通過被傳輸?shù)拿庖呒?xì)胞(主要是CD8+或CD4+型T細(xì)胞)識別在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的血管生成抑制素結(jié)合蛋白來抑制新血管生成，然后限制腫瘤發(fā)展或其它血管生成相關(guān)疾病?？刹捎玫膶⒔?jīng)刺激的免疫細(xì)胞傳輸回患者的方法也可造成通過將腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的血管生成抑制素結(jié)合蛋白被傳輸?shù)拿庖呒?xì)胞(主要是CD8+或CD4+型T細(xì)胞)識別為腫瘤抗原來限制腫瘤發(fā)展。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的用途、藥物組合物、疫苗或方法中，編碼多核苷酸包含 (i)SEQ ID NO2的多核苷酸(和/或反義多核苷酸)；或 (ii)多核苷酸(和/或反義多核苷酸)，其與SEQ ID NO2具有至少80％和/或至少90％和/或至少95％和/或至少98％同一性和/或在65℃、2xSSC的條件下能與SEQ ID NO2雜交，和/或其編碼功能性多肽；或 (iii)SEQ ID NO2的片段，其編碼功能性多肽片段。
而且其中，多核苷酸(和/或反義多核苷酸)不編碼p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白或p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的片段。
本發(fā)明的多核苷酸和/或反義多核苷酸不包括與編碼p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和其片段的多核苷酸一致的那些。
本發(fā)明的多核苷酸可進(jìn)一步包含上述調(diào)節(jié)序列和/或載體序列來使其在必要的宿主和/或靶細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)。
現(xiàn)有公知的是，那兩個編碼相同基因的核酸具有相似但不相同的核苷酸序列?；虻暮塑账嵝蛄兄械淖兓且环N變化，其(i)用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)或其片段，其隨后可用于制備特異于由所述基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體，或(ii)對應(yīng)于如上定義的(i)類基因或變體的反義序列。例如，可替換不同的密碼子，其與原密碼子編碼相同的氨基酸。另外，替換的密碼子可編碼不同的氨基酸，其將不影響蛋白質(zhì)的活性或免疫原性，或其可改善其活性或免疫原性。例如，定點(diǎn)突變或其它技術(shù)可用于產(chǎn)生單個或多個突變，如替代、插入、缺失、和轉(zhuǎn)座，如Botstein等，1985，Science，229193-1210所述，其內(nèi)容納入本文參考。由于這些修飾的基因可通過將已知的技術(shù)應(yīng)用于本文所包含的教導(dǎo)中來獲得，因此這些修飾的基因在要求保護(hù)的發(fā)明的范圍內(nèi)。
而且，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，本發(fā)明的基因序列(或其片段)可用于獲得其它在高度嚴(yán)緊條件下與它雜交的DNA序列。這些DNA包括任何基因組DNA。因此，本發(fā)明的基因包括DNA，其編碼本發(fā)明方法鑒定的基因推導(dǎo)的氨基酸序列有超過50％同一性的氨基酸序列，或包括DNA序列，其與本發(fā)明方法鑒定的基因有至少百分之55，優(yōu)選百分之60，和最優(yōu)選百分之70同源性，只要該同源DNA能用于本發(fā)明的方法中。本發(fā)明的基因還包括DNA，其編碼與血管生成抑制素結(jié)合蛋白的至少200個氨基酸的序列有超過20％同一性的氨基酸序列。
DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA雜交可在包含0.1XSSC至6XSSC的水溶液中在55℃至70℃的溫度下進(jìn)行。現(xiàn)有公知的是，溫度越高或SSC濃度越低，雜交條件越嚴(yán)緊。對于“高度嚴(yán)緊”，我們指2XSSC和65℃。1XSSC為0.15M NaCl/0.015M檸檬酸鈉。
基因的變化包括這樣的基因，其中相對短的一段序列(例如20至50個核苷酸)與本發(fā)明的基因的同等序列段具有高度同源性(至少50％和優(yōu)選至少90或95％)，然而兩個基因間的總體同源性可以低得多。這是因為即使當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的整體構(gòu)架不同時，重要的活性或結(jié)合位點(diǎn)可以是共有的。
雜交反應(yīng)的“嚴(yán)緊性”可由所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定，一般可根據(jù)探針長度、洗滌溫度、和鹽濃度來經(jīng)驗性地計算。一般而言，越長的探針需要越高的正確退火溫度，而較短的探針需要較低的溫度。當(dāng)互補(bǔ)鏈處于低于它們?nèi)劢鉁囟鹊沫h(huán)境時，雜交一般取決于變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列間所希望的同源性程度越高，則可用的相對溫度就越高。對于雜交反應(yīng)嚴(yán)緊性的其它詳情和解釋，參見Ausubel等，1995，CurrentProtocols in Molecular Biology(Wiley Interscience Publishers)或在線規(guī)程URLwww.protocol-online.net/molbio/index.htm)。
“嚴(yán)緊條件”或高度嚴(yán)緊可由如下那些確定(1)用低離子強(qiáng)度和高溫進(jìn)行洗滌，例如0.1XSSC，0.2％SDS@65-70℃。
“中度嚴(yán)緊條件”可由Sambrook等，2001，Molecular CloningALaboratory Manual(第3版)所述的來確定，并包括使用比上述的那些更不嚴(yán)緊的洗滌溶液和雜交條件(如溫度、離子強(qiáng)度、和％SDS)。中度嚴(yán)緊條件的例子是0.2XSSC，0.1％SDS@58-65℃。普通技術(shù)人員將能認(rèn)識到如何按需要調(diào)節(jié)溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)如探針長度、探針和靶位之間的同源性程度等。因此，除了感興趣的序列之外，還預(yù)計與感興趣的序列不同的其他或另外的探針序列也將能用于篩選感興趣的序列。
現(xiàn)在將參考以下附圖描述具體體現(xiàn)本發(fā)明某些方面的優(yōu)選、非限制性的實例

圖1鑒定p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白——血管生成抑制素結(jié)合蛋白的新剪接同工型。A針對血管生成抑制素結(jié)合蛋白的24個氨基酸的C末端的兔多克隆抗體識別293T細(xì)胞中的80kDa和130kDa的兩種蛋白質(zhì)。NIS＝非免疫血清。B對293T細(xì)胞進(jìn)行免疫沉淀，在SDS PAGE上分離并用銀染觀察蛋白質(zhì)。提取80kDa和130kDa的條帶，并用質(zhì)譜分析。紅色(粗體文本)表示p130同工型(isoform)所特有的蛋白水解片段的序列。藍(lán)色(下劃線的文本)序列(410-1084)對應(yīng)于也能在p80蛋白中找到的肽。當(dāng)鑒定出能分辨各肽片段的一致序列時，用斜體表示。C外顯子2和3間通過交互剪接產(chǎn)生了新的開放閱讀框，導(dǎo)致p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的N末端延伸。藍(lán)色(1)對應(yīng)于p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白中富含谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)域，紅色(2)對應(yīng)于卷曲-卷曲，黃色(3)對應(yīng)于血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而綠松石色(4)對應(yīng)于PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域。D如Western印跡所分析的，產(chǎn)生的抗p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白N末端中的266個氨基酸的兔多克隆抗體能特異檢測血管生成抑制素結(jié)合蛋白的130kDa同工型。PI＝免疫前血清，I＝免疫血清。
圖2在胚胎和成體小鼠組織中p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的表達(dá)。AWestern印跡分析胚胎期第5至19天時的小鼠胚胎中的血管生成抑制素結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)水平。在胚胎期第5至18天表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白(箭頭尖端)，而不能檢測到p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)。BWestern印跡分析小鼠胎盤溶解產(chǎn)物，顯示在胚胎期第11至19天表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白(箭頭尖端)。P130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白在胚胎期第13至16天表達(dá)(箭頭)。C分析小鼠成體組織，顯示在心、肺、肝、脾、卵巢、肝、胸腺、睪丸和胎盤中表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白(箭頭尖端)。P130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白僅僅在胸腺、睪丸和胎盤中被找到(箭頭尖端)。星號表示非特異性條帶。Lu，肺；Li，肝；Spl，脾，Ki，腎；St，胃；SI，小腸；SkM，骨骼肌；Ov，卵巢；Th，胸腺；Te，睪丸；Ut，子宮，P1，胎盤。DWestern印跡分析用載體、p-80血管生成抑制素結(jié)合蛋白和p-130血管生成抑制素結(jié)合蛋白逆轉(zhuǎn)染的MAE細(xì)胞和在293T細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)層、hTERT+-BCE細(xì)胞和BAE細(xì)胞中內(nèi)源表達(dá)的兩種同工型。箭頭表示p130和p80條帶的位置。
圖3血管生成抑制素結(jié)合蛋白與ZO-1共定位于原代牛毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞。A抗血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域抗體(綠)結(jié)合亞滿板牛毛細(xì)管內(nèi)皮(BCE)細(xì)胞細(xì)胞表面上的血管生成抑制素結(jié)合蛋白。抗陷窩蛋白(caveolin)細(xì)胞內(nèi)表位的抗體(紅)用作完整細(xì)胞膜的對照。當(dāng)細(xì)胞滿板時，細(xì)胞表面染色喪失了。B內(nèi)源血管生成抑制素結(jié)合蛋白與ZO-1共定位于滿板的BCE細(xì)胞。滿板的BCE細(xì)胞用Triton X-100進(jìn)行滲透并用抗血管生成抑制素結(jié)合蛋白C末端的抗體(綠)和抗ZO-1的抗體(紅)染色。顯示兩幅圖重疊(合并)，共定位情況顯示作黃色。C細(xì)胞密度調(diào)節(jié)血管生成抑制素結(jié)合蛋白p80和p130同工型的表達(dá)。細(xì)胞以所示密度鋪板，并通過Western印跡分析血管生成抑制素結(jié)合蛋白的表達(dá)?？潭缺硎?0μm。
圖4在出生后小鼠視網(wǎng)膜血管形成期間血管生成抑制素結(jié)合蛋白與ZO-1共定位于血管中。用抗ZO-1(紅)、抗CD31/PECAM(紅)的抗體和抗血管生成抑制素結(jié)合蛋白C末端的抗體(綠)通過整標(biāo)本(whole-mount)熒光顯微鏡分析出生后第5天的小鼠視網(wǎng)膜。顯示兩幅圖重疊(合并)，共定位情況顯示作黃色。A血管中表達(dá)血管生成抑制素結(jié)合蛋白，這通過內(nèi)皮標(biāo)記CD31/PECAM來顯示。B血管生成抑制素結(jié)合蛋白與ZO-1共定位于視網(wǎng)膜血管中細(xì)胞-細(xì)胞接觸面上。C放大血管的一部分，顯示出在細(xì)胞-細(xì)胞接觸面上共定位的血管生成抑制素結(jié)合蛋白和ZO-1?？潭缺硎?0μm。
圖5血管生成抑制素結(jié)合蛋白與ZO-1共定位于中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中。CHO細(xì)胞用pcDNA3轉(zhuǎn)染，所述pcDNA3含有p80-或p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的cDNA，并產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系。A利用抗血管生成抑制素結(jié)合蛋白C末端的抗體通過Western印跡分析CHO細(xì)胞系中血管生成抑制素結(jié)合蛋白的表達(dá)。Wt，野生型細(xì)胞，Vec，載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。B.用免疫熒光顯微鏡分析血管生成抑制素結(jié)合蛋白在CHO細(xì)胞中的定位。用抗血管生成抑制素結(jié)合蛋白C末端的抗體(綠)和抗ZO-1的抗體染色CHO細(xì)胞。顯示兩幅圖重疊(合并)，共定位情況顯示作黃色。如通過用毒傘素染色所確定的，P80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白位于細(xì)胞質(zhì)和緊密連接中，而p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白位于F-肌動蛋白纖維(箭頭)。ZO-1沿著應(yīng)力纖維被補(bǔ)充到p130陽性焦點(diǎn)上(箭頭尖端)?？潭缺硎?0μm。
圖6p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)應(yīng)力纖維形成。A-C用p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白逆轉(zhuǎn)染、并用血管生成抑制素結(jié)合蛋白兔多克隆抗體(綠)和得克薩斯紅綴合的毒傘素(紅)雙重染色的MAE細(xì)胞，顯示p80同工型位于遷移細(xì)胞的片狀偽足上。D-F同樣染色的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白逆轉(zhuǎn)染的MAE細(xì)胞產(chǎn)生了不同的亞細(xì)胞定位。以不時打斷的方式顯示P130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白定位于應(yīng)力纖維上。G-I用編碼p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白N末端結(jié)構(gòu)域的帶flag標(biāo)簽的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的MAE細(xì)胞用flag抗體和毒傘素染色。flag抗體染色顯示完全與F-肌動蛋白重合。J-L用血管生成抑制素結(jié)合蛋白多克隆抗體和毒傘素染色的MAE-載體細(xì)胞。Mp130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和毒傘素染色的三維圖像顯示p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和F-肌動蛋白聚集物共定位于應(yīng)力纖維上?？潭?0μm。
圖7p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白在應(yīng)力纖維破壞后仍與F-肌動蛋白相連。A-C用血管生成抑制素結(jié)合蛋白(綠)和F-肌動蛋白(毒傘素，紅)染色的MAE-p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞。D-F是用50μg/ml細(xì)胞松弛素B處理1小時后用同樣方法染色的MAE-p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞。p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的聚集結(jié)構(gòu)完全與被破壞的肌動蛋白纖維重疊。G-IMAE細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染有帶flag標(biāo)簽的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的N末端的，用flag抗體和毒傘素染色。J-L添加50μl/ml細(xì)胞松弛素B一小時后用同樣方法染色的N末端轉(zhuǎn)染的MAE細(xì)胞。N末端的聚集結(jié)構(gòu)完全與被破壞的肌動蛋白纖維重疊?？潭?0μm。
圖8血管生成抑制素結(jié)合細(xì)胞表面上的血管生成抑制素結(jié)合蛋白。
A穩(wěn)定表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的小鼠主動脈內(nèi)皮(MAE)細(xì)胞與硫代-NHS-LC-生物素一起孵育，并用針對血管生成抑制素結(jié)合蛋白的血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域或樁蛋白(paxillin)的抗體一起進(jìn)行免疫沉淀(IP)，然后用HRP-綴合的抗生物素蛋白進(jìn)行印跡。血管生成抑制素結(jié)合蛋白被生物素化，而細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)樁蛋白則沒有。輸入對照泳道代表用于免疫沉淀中的2％的量。B碘化的血管生成抑制素與穩(wěn)定表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的HeLa細(xì)胞的結(jié)合。結(jié)合是可飽和的，半最大濃度為11ng/ml、或0.3nM。
圖9血管生成抑制素結(jié)合蛋白的拓?fù)鋵W(xué)。Ap80-和p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。3種不同的抗血管生成抑制素結(jié)合蛋白的多克隆抗體被用于探查MAE細(xì)胞中血管生成抑制素結(jié)合蛋白的拓?fù)鋵W(xué)一種針對p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的C末端，一種針對其血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一種針對其N末端。表位在結(jié)構(gòu)域中用水平線顯示。這些抗體不與表達(dá)空載體的對照細(xì)胞反應(yīng)(未顯示)。另外，用myc抗體定位在N末端加標(biāo)簽的p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白。B抗血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域抗體(綠)結(jié)合細(xì)胞表面上的p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白。將抗陷窩蛋白細(xì)胞內(nèi)表位的抗體(紅)用作完整細(xì)胞膜的對照。相反，抗血管生成抑制素結(jié)合蛋白C末端的抗體(綠)僅在用去污劑首次處理細(xì)胞時才展示免疫反應(yīng)性。C抗血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域抗體(綠)結(jié)合帶有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞上的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白。這里，將毒傘素(紅)用作完整細(xì)胞膜的對照。抗p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白N末端的抗體因不能滲透而不能染色。載體細(xì)胞不能用抗體染色。D表達(dá)N末端帶有myc標(biāo)簽的p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的細(xì)胞僅染色被滲透的細(xì)胞?？潭缺硎?0μm.E對于p80-和p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白拓?fù)鋵W(xué)所建議的模型。
圖10p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域暴露于細(xì)胞表面。A-C在不滲透細(xì)胞膜的情況下用抗細(xì)胞外血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體染色的MAE-P130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞顯示對細(xì)胞表面上的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的染色。陽性細(xì)胞對于得克薩斯紅-綴合的毒傘素染色呈陰性，這顯示細(xì)胞膜是完整的。D-F用針對細(xì)胞內(nèi)C末端的多克隆抗體和用毒傘素染色未顯出對p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白或毒傘素有陽性染色結(jié)果?？潭?0μm。
圖11p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白與MAGI-1相互作用。A表達(dá)p80或p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和帶flag標(biāo)簽的MAGI-1B或MAGI-1C構(gòu)建體的CHO細(xì)胞的溶解產(chǎn)物用flag抗體或抗血管生成抑制素結(jié)合蛋白C末端的抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后用flag抗體或抗血管生成抑制素結(jié)合蛋白C末端的抗體進(jìn)行免疫印跡。通過對總?cè)芙猱a(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡來確認(rèn)蛋白質(zhì)表達(dá)。Bp130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白與MAGI-1B共定位于CHO細(xì)胞中。表達(dá)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和MAGI-1B的CHO細(xì)胞用flag抗體(紅)和抗血管生成抑制素結(jié)合蛋白C末端的抗體(綠)進(jìn)行免疫染色。顯示兩幅圖重疊(合并)，共定位情況顯示作黃色?？潭缺硎?0μm。
圖12血管生成抑制素結(jié)合蛋白控制滲透和遷移。分析穩(wěn)定表達(dá)p80-或p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的CHO細(xì)胞控制細(xì)胞層滲透和細(xì)胞遷移的能力。A以FITC-右旋糖酐隨時間沿細(xì)胞層的擴(kuò)散測量生長于滲透室中的CHO細(xì)胞單層的滲透。長斜方形，載體；正方形，p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白；十字形，p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白。顯示了一個有代表性的實驗從每個時間點(diǎn)開始的重復(fù)三次的平均數(shù)和平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差。當(dāng)匯聚了三次實驗的數(shù)據(jù)時，通過student’s t-測驗，對于載體-p80和載體-p130，p＜0.05。B血管生成抑制素不影響表達(dá)血管生成抑制素結(jié)合蛋白的CHO細(xì)胞的細(xì)胞滲透。1h后如A所述測量FITC-右旋糖酐的滲透。C血管生成抑制素抑制表達(dá)血管生成抑制素結(jié)合蛋白的CHO細(xì)胞的細(xì)胞遷移。在Boyden室中，細(xì)胞能自發(fā)或向0.05％血清處遷移。顯示了每個顯微鏡視野中遷移細(xì)胞平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差和平均數(shù)。
圖13p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白影響細(xì)胞形狀并介導(dǎo)血管生成抑制素對遷移的抑制.A對MAE-p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白、用N末端結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)染的MAE細(xì)胞、MAE-p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞和MAE-載體染色，如材料和方法所述的那樣評估細(xì)胞區(qū)域。表達(dá)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白或其N末端片段的細(xì)胞比p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和載體細(xì)胞大兩倍以上。三個星號表示p＜0.001。B表達(dá)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白、p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和載體的MAE細(xì)胞生長至滿板，并用吸液管刮擦來產(chǎn)生傷痕。在3和6小時后測量遷移率。P80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞的遷移幾乎是p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞和載體細(xì)胞的2倍。三個星號表示p＞0.001.CMAE-p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白、MAE-p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和MAE-載體細(xì)胞在遷移室測試中進(jìn)行測試。用或不用bFGF以及用或不用血管生成抑制素(5μg/ml)處理細(xì)胞。在存在bFGF的情況下刺激載體細(xì)胞遷移，但不被血管生成抑制素抑制。bFGF刺激的p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白遷移在存在血管生成抑制素的情況下被抑制了175％。bFGF刺激的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白遷移在存在血管生成抑制素的情況下被抑制了160％。D內(nèi)源表達(dá)p80和p130血管生成抑制素結(jié)合蛋白的hTERT+-BCE細(xì)胞在遷移室測試中分析。用bFGF刺激遷移，而在存在血管生成抑制素的情況下會被抑制85％。
圖14細(xì)胞滋養(yǎng)層表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白，并對血管生成抑制素應(yīng)答。A-F用針對血管生成抑制素結(jié)合蛋白C末端的多克隆抗體和檢測細(xì)胞角蛋白(細(xì)胞滋養(yǎng)層的標(biāo)記物)的單克隆抗體染色人胎盤切片(第二個三個月)，顯示細(xì)胞角蛋白和血管生成抑制素結(jié)合蛋白共定位于浮動的絨毛(FV)、錨定的絨毛(AV)和基板(BP)上。放大倍率＝400x。G血管生成抑制素處理(5μg/ml)極大抑制了細(xì)胞滋養(yǎng)層對基質(zhì)膠(matrigel)的體外侵入(p＜0.001)。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)顯著性通過Student’s t-測驗來分析。
圖15內(nèi)源p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白在牛毛細(xì)管內(nèi)皮(BCE)細(xì)胞中是生物素化的。在BCE細(xì)胞中進(jìn)行類似于圖8圖例中所述那些實驗以確定p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白是否有細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。
圖16p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白具有細(xì)胞外表位。表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的MAE細(xì)胞(“p80 Amot”)用胰蛋白酶處理5、10、20、40和80分鐘并用Western印跡分析細(xì)胞溶解產(chǎn)物。在80分鐘內(nèi)胰蛋白酶降解了大部分p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白，而細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白未被降解。
SEQ ID N01-p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的多肽序列。(與p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白序列沒有相似性的)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白N末端結(jié)構(gòu)域沒有加下劃線；與p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白有相似性的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白序列加了下劃線。
SEQ ID NO2-p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的多核苷酸序列。編碼p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白N末端結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列(其與p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白序列沒有相似性)沒有加下劃線；與p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白有相似性的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多核苷酸序列加了下劃線。
實施例1-實驗數(shù)據(jù) 材料和方法 細(xì)胞培養(yǎng) 穩(wěn)定表達(dá)p80-和p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的MAE細(xì)胞(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-1254)生長于Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)(Sigma)。中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞生長于含F(xiàn)-12 HAM的DMEM。穩(wěn)定表達(dá)p80或p130的CHO細(xì)胞通過利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胺2000(Gibco)用帶有p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白或p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白插入片段的pcDNA3轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并用0.4mg/ml的G418篩選克隆來產(chǎn)生。牛毛細(xì)管內(nèi)皮(BCE)細(xì)胞培養(yǎng)于添加了2ng/ml bFGF的DMEM。所有細(xì)胞培養(yǎng)基都添加了10％胎牛血清(Gibco)、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和2mM L-谷氨酰胺。
自發(fā)無限增殖的小鼠主動脈內(nèi)皮(MAE)細(xì)胞(Bastaki等，1997，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17454-464)和產(chǎn)生嗜親性反轉(zhuǎn)錄病毒的Phoenix eco細(xì)胞(由Dr G Nolan，Stanford University，Palo Alto，CA提供)生長于含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺和1％青霉素/鏈霉素的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)(Sigma)。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MAE細(xì)胞在存在5μg/ml嘌呤霉素(載體、p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白、和p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白)或800μg/ml G418(p130特異性N末端)的情況下生長。293T細(xì)胞生長于補(bǔ)充有10％供體牛血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基。M21細(xì)胞生長于含5-10％FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基。BAE細(xì)胞生長于含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺和1％青霉素/鏈霉素的DMEM。hTERT+-BCE細(xì)胞生長于含10％BCS、2ng/ml FGF-2、1％谷氨酰胺和1％青霉素/鏈霉素的DMEM。
質(zhì)粒的構(gòu)建 p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白cDNA亞克隆進(jìn)pENTR-2B載體(Gateway，Invitrogen)中，然后用LR重組反應(yīng)(Gateway，Invitrogen)重組進(jìn)轉(zhuǎn)變(convert)Gateway destination載體pcDNA3(Invitrogen)或pBABE(由H Land博士，LCRF，倫敦，英國提供)中。帶flag標(biāo)簽的MAGI-1b和MAGI-1c如(Dobrosotskaya等，2000，Biochem.Biophys.Res.Commun.270903-9)所述。N末端構(gòu)建體是A Shimono博士(發(fā)育生物學(xué)中心，Kobe，日本)的饋贈物。
抗體 使用三種不同的抗血管生成抑制素結(jié)合蛋白多克隆抗體一種抗p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(B3抗體)(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-54)，一種抗其C末端(TLE抗體)(Ernkvist等，2005，已提交)，和一種抗其N末端(Ernkvist等，2005，已提交)(圖9A)。使用以下小鼠單克隆抗體9E10抗myc標(biāo)簽(Santa Cruz)，M2抗flag標(biāo)簽(Sigma)，AC-15抗肌動蛋白(Sigma)，1A12抗ZO-1(ZymedLaboratories Inc.)，C060抗陷窩蛋白(Transduction Laboratories)，349抗樁蛋白(Transduction Laboratories)和大鼠單克隆Mec 13.3抗CD31/PECAM(BDPharmingen)。
產(chǎn)生了抗血管生成抑制素結(jié)合蛋白不同結(jié)構(gòu)域的兔多克隆抗體。用特異針對p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的266個氨基酸的片段產(chǎn)生N末端抗體。用血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生抗血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞外部分的抗體(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-54)。對應(yīng)于24個最C末端氨基酸的肽被用于產(chǎn)生C末端抗體。
免疫沉淀 細(xì)胞用裂解緩沖液(50mM，Tris-HCl pH7.4，0.2％諾乃洗滌劑(Nonidet)P40，150mM NaCl，1mM EDTA和蛋白酶抑制劑)提取。溶解產(chǎn)物于4℃用免疫前血清或免疫血清免疫沉淀1小時。沉淀用裂解緩沖液洗3次并重懸于1x上樣緩沖液中，用SDS-PAGE分析。為了在膠中消化和質(zhì)譜，5克293T細(xì)胞溶于50ml裂解緩沖液。17,000rpm離心20分鐘以使上清液澄清。500μl 50％免疫前或免疫抗孿蛋白抗體與瓊脂糖CL-4B偶聯(lián)的漿體用于在4℃免疫沉淀90分鐘。沉淀用RIPA緩沖液(50mM Tris pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1％NP40，1％脫氧膽酸，0.1％SDS和蛋白酶抑制劑)洗3次。樣品用100mM乙醇胺于室溫洗脫2分鐘，用Lamelli上樣緩沖液變性并在SDS-PAGE上分析。銀染后，切下條帶并進(jìn)行質(zhì)譜。
克隆 p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白 p130序列的蛋白酶水解片段的質(zhì)譜顯示來自p80的肽和來自被認(rèn)為是p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白5’“UTR”(圖1B中的黑體字)的肽和來自數(shù)據(jù)庫中的兩個EST(BI 058583和CK001189.1)的肽。延伸序列符合基因組DNA中的序列，其為p80 cDNA 5’末端上游的7千堿基，這暗示它來自于上游外顯子。因為我們不能獲得這些EST，因此我們使用了含基因組序列的PAC克隆(AC004827.1)；PCR擴(kuò)增出上游外顯子并將其連接于血管生成抑制素結(jié)合蛋白p80 cDNA的5’末端。產(chǎn)生的cDNA含EST BI058583和CK001189.1的公開序列以及p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的完整ORF。
Western印跡 蛋白質(zhì)在7.5％Criterion SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad)上分離，并通過半干印跡轉(zhuǎn)移至Protran硝化纖維素膜上。用5％PBD孵育和用一級抗體于+4℃孵育過夜封閉膜，然后與HRP-驢抗兔或HRP-綿羊抗小鼠(AmershamBiosciences)于室溫孵育1小時。用PBS+0.05％土溫洗滌過濾膜幾次，并用Western Blotting Luminol Reagent(Santa Cruz)使信號可見。
用SDS-PAGE分析細(xì)胞溶解產(chǎn)物并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝化纖維素膜上。用10％溶于含0.1％土溫的PBS(PBS-T)的奶粉封閉非特異結(jié)合1小時。過濾膜與針對血管生成抑制素結(jié)合蛋白C末端肽的多克隆抗體(1∶500)或針對血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體(1∶2000)一起于4℃在溶于PBS-T的5％奶粉中孵育過夜。二級抗體(抗兔-HRP)以1∶10000稀釋(Amersham)并于室溫孵育1h。然后，用Santa Cruz Biotechnology Inc的檢測系統(tǒng)在智能暗箱(Fujifilm)中用LAS1000程序(Fujifilm)使硝化纖維素膜可視化?？蓮纳虡I(yè)渠道購買的含小鼠成體組織、胚胎或胎盤的膜(RNWAYlaboratories)，其如上一樣孵育。
生物素化實驗 含有約1千萬個細(xì)胞的滿板10cm平板用PBS短暫洗2次，并與溶于PBS的NHS-硫代-LC-生物素(Pierce Inc.)(0.4mg/ml)或溶于DMSO的NHS-LC-生物素(0.4mg/ml)于室溫孵育30分鐘。然后用PBS洗平板。對照平板只與PBS一起孵育。加入1ml裂解緩沖液(20mM HEPES，140mMKCl，5mM MgCl2，10mM β-磷酸甘油，3％聚乙烯-9-月桂醇醚(Thesit)和蛋白酶抑制劑混合物，pH7.4)，用橡膠淀帚收獲細(xì)胞。以30000g離心25分鐘得到的溶解產(chǎn)物，通過將上清液與1μg B3血管生成抑制素結(jié)合蛋白抗體或1μg單克隆抗樁蛋白抗體和30μl蛋白質(zhì)G瓊脂糖漿體(Pierce Inc.)一起孵育進(jìn)行免疫沉淀。用裂解緩沖液洗珠1次并用含1％Thesit的裂解緩沖液洗3次。用30μl Laemli緩沖液洗脫蛋白質(zhì)并將一半材料上樣于10％預(yù)制Criterion凝膠(Bio-Rad)。生物素化的蛋白質(zhì)通過Western印跡來檢測，其中膜與HRP-綴合的鏈霉抗生物素蛋白(Pierce Inc.)在含5％脫脂牛奶的PBS中孵育過夜。
血管生成抑制素結(jié)合測試 人血管生成抑制素(kringle 1-4)根據(jù)廠商(Pierce Inc.)的規(guī)程通過Iodogen方法用碘125標(biāo)記。評估15000cpm/ng蛋白質(zhì)的比活。為進(jìn)行結(jié)合測試，使穩(wěn)定表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白或空載體的HeLa細(xì)胞在12孔板中生長至滿板。用含1mg/ml BSA的PBS洗細(xì)胞。細(xì)胞與10ng/ml放射性標(biāo)記的血管生成抑制素一起孵育2小時。然后用含1mg/ml BSA的PBS洗細(xì)胞5次并用含1％Triton X-100的PBS裂解，用γ射線計數(shù)儀測量放射性。
胰蛋白酶處理 滿板的生長在6厘米皮氏培養(yǎng)皿上的細(xì)胞用無鈣和鎂的PBS洗2次并與1ml 2μg/ml測序級胰蛋白酶(Sigma)或只與PBS于37℃孵育所示的一段時間。通過用PBS洗細(xì)胞1次并加入75μl Laemlli緩沖液來終止實驗。通過Western印跡來分析樣品。
生物信息學(xué)分析 穿膜螺旋用PredictProtein(http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html)(Rost等，1996，Protein Sci.51704-1718)和Tmpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED form.html)進(jìn)行預(yù)測。
免疫熒光 培養(yǎng)的細(xì)胞置于小室載玻片中并使之生長和粘附過夜。用4％PFA于室溫固定細(xì)胞10分鐘。需要時，細(xì)胞用0.1％triton X-100(Sigma)滲透1分鐘。通過與含5％馬血清的PBS孵育1h來封閉非特異反應(yīng)性，然后加入封閉緩沖液中的一級抗體孵育1小時。用熒光標(biāo)記的二級抗體(Dako and MolecularProbes)檢測抗體結(jié)合。用得克薩斯紅毒傘素(Molecular Probes)使F-肌動蛋白可視化。載玻片用Vector Laboratories的固定介質(zhì)固定，在Zeiss Axioplan 2顯微鏡下觀察，利用AxioCam HRm照相機(jī)和Axiovision 4.2軟件收集圖像。固定前，要用細(xì)胞松弛素B(Sigma)處理的細(xì)胞用50μg/ml細(xì)胞松弛素B處理1h。然后如上所述，對細(xì)胞染色。
胎盤切片的免疫染色利用前述方法(Fisher等，1989，J.Cell Biol.109891-902；Damsky等，1992，J.Clin.Invest.89210-222)，對胎盤切片進(jìn)行雙間接免疫定位。簡而言之，用冷的丙酮固定切片5分鐘，然后用PBS再洗5分鐘。通過在0.2％BSA/PBS中孵育30分鐘來封閉非特異反應(yīng)性，然后加入一級抗體混和物。使用以1∶50稀釋的大鼠抗人細(xì)胞角蛋白單克隆抗體7D3(Damsky等，1992，J.Clin.Invest.89210-222)。使用以1∶50稀釋的兔抗人血管生成抑制素結(jié)合蛋白。1h后，細(xì)胞用PBS洗并與綴合了若丹明或二氫熒光素的合適的物種特異性第二抗體(JacksonImmunoResearch Lab，Inc)一起孵育。用PBS再洗3次后，將蓋玻片裝在載玻片上并用Zeiss Axiophot落射熒光顯微鏡(Thornwood，NY)檢查。
培養(yǎng)的細(xì)胞的免疫熒光 在小室載片上的細(xì)胞板(Falcon)用PBS短暫洗滌，在4％多聚甲醛中固定10分鐘并(如果不另外說明)用0.05％Triton x-100處理30秒。然后細(xì)胞與5％馬血清孵育60分鐘，與用5％馬血清稀釋的一級抗體孵育1小時，用PBS洗4遍并與5％馬血清稀釋的德克薩斯紅馬抗小鼠(Vector LaboratoriesInc.)或FITC豬抗兔(DAKO)孵育1小時。用德克薩斯紅毒傘素(MolecularProbes)使F-肌動蛋白可視化。標(biāo)本用帶有DAPI的Vectashield固定介質(zhì)(Vector Laboratories Inc.)固定。用Ziess Axioplan 2顯微鏡捕獲圖像，并用Zeiss Axiovision軟件和Adobe Photoshop處理。
血管生成抑制素結(jié)合蛋白誘導(dǎo)測試 500000個BCE細(xì)胞以所示密度鋪板，24小時后用PBS洗細(xì)胞層2次，輕輕反轉(zhuǎn)到薄紙上，并加入100μl 2xSDS PAGE上樣緩沖液來裂解。利用TLE抗體通過Western印跡分析樣品。由于PBS殘留，樣品體積隨著平板尺寸增加而增加，因此，將10％體積的溶解產(chǎn)物上樣。通過用抗肌動蛋白抗體探測印跡來檢驗等量上樣。
小鼠視網(wǎng)膜的免疫熒光 處死的C57BL6小鼠的眼睛用4％多聚甲醛/PBS于4℃固定2-3小時并用PBS洗。視網(wǎng)膜如前述那樣切下(Chan-Ling等，1990，Curr.Eye Res.9459-478)并于室溫在滲透/封閉緩沖液PBB中孵育2小時，PBB為PBS，含1％BSA、0.5％Triton X-100和5％正常山羊血清。然后視網(wǎng)膜與用PBB緩沖液稀釋的一級抗體于4℃孵育過夜。用PBS于室溫洗6次后，視網(wǎng)膜于室溫在暗處與用PBS+0.5％BSA、0.25％Triton X-100和5％正常山羊血清稀釋的二級抗體孵育2小時。二級抗體是FITC-綴合的豬抗兔(Dako)Alexa Fluor 594-山羊抗小鼠(Molecular Probes)和RPE-山羊抗大鼠IgG小鼠(Southern Biotechnology Associates)。視網(wǎng)膜平置于Vectashield裝置(Vectorlabs)上。
用MAGI-1進(jìn)行免疫沉淀 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胺2000試劑(Life Technologies)轉(zhuǎn)染2μg每種質(zhì)粒DNA之前，2百萬個CHO細(xì)胞在6cm皮氏培養(yǎng)皿中鋪板一天。轉(zhuǎn)染后48小時將細(xì)胞收集在裂解緩沖液中150mM NaCl、50mM Tris-HCl pH7.4、0.5％Triton X-100和蛋白酶抑制劑。細(xì)胞溶解產(chǎn)物于4℃顛倒往復(fù)旋轉(zhuǎn)15分鐘，并于4℃以13000rpm離心5分鐘。收集上清液并用于通過Bradford法確定總蛋白質(zhì)。代表1.5mg總蛋白質(zhì)的溶解產(chǎn)物預(yù)先用20μl蛋白質(zhì)A珠澄清，然后在旋轉(zhuǎn)條件下于4℃用5μg抗血管生成抑制素結(jié)合蛋白或抗FLAG抗體孵育每種免疫前血清樣品6小時。然后，向每個免疫前血清樣品加入30μl蛋白質(zhì)A珠并于4℃旋轉(zhuǎn)過夜。孵育后，用裂解緩沖液洗珠2次，重懸于Lammeli上樣緩沖液中，煮沸并用7.5％Criterion預(yù)制凝膠(Bio-Rad)分辨。對于免疫熒光染色，40000個CHO細(xì)胞在小室載玻片中鋪板，并用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胺2000試劑轉(zhuǎn)染0.35μg的每種質(zhì)粒。
聚集測試 用不含鈣和鎂的PBS洗兩次并與0.02％EDTA(Sigma)孵育至解離來解離CHO細(xì)胞，重懸于不含鈣和鎂的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)(Sigma)，用HBSS洗1次并以100000個細(xì)胞/ml重懸于添加了2％FBS、且用不含鈣和鎂的PBS透析的HBSS中。在事先用1％BSA包被的24孔板中每孔加入50000個細(xì)胞。此時，絕大多數(shù)細(xì)胞是單個細(xì)胞。如所示加入CaCl2(2mM)和血管生成抑制素(5μg/ml)。讓細(xì)胞于37℃聚集60分鐘，其間在平臺旋轉(zhuǎn)器上以80rpm旋轉(zhuǎn)。加入戊二醛至5％的終濃度來終止實驗。以10x放大倍率為每個孔拍攝至少5個區(qū)域用于分析細(xì)胞聚集。計數(shù)細(xì)胞總數(shù)(N0)并計數(shù)60分鐘時細(xì)胞的聚集數(shù)(N60)。聚集指數(shù)如(Hirata等，2001，J.Biol.Chem.27616223-16231)所述，算作(N0-N60)/N0。每種情況評估約500個細(xì)胞。
滲透測試 根據(jù)廠商說明來使用Chemicon Inc.的體外血管滲透測試試劑盒，其基于FITC-標(biāo)記的右旋糖酐擴(kuò)散穿過生長于24孔型的膜上的細(xì)胞層。簡而言之，CHO細(xì)胞以每個膜插入物10000個細(xì)胞來接種并使之以5天形成單層。每種情況重復(fù)使用三個或四個插入物。如所示，向孔中加入血管生成抑制素(2μg/ml)，一小時后開始實驗。向上室加入FITC-右旋糖酐并在5、15、60和120分鐘時從下室取出100μl樣品。在Bio-Tek FL 600平板讀數(shù)儀上用激發(fā)波長485nm和發(fā)射波長530nm來測量熒光?？廴ゼ?xì)胞培養(yǎng)基的背景熒光。平行測量在無細(xì)胞情況下FITC-右旋糖酐擴(kuò)散穿過膜插入物以確證細(xì)胞單層的完整性。
定量細(xì)胞面積 用C末端血管生成抑制素結(jié)合蛋白多克隆抗體對細(xì)胞染色，檢測陽性細(xì)胞，然后用毒傘素染色使整個細(xì)胞可視化。用連在Zeiss Axioplan 2顯微鏡上的AxioCam HRm照相機(jī)拍照。用4.0.版Fujifilm image gauge來測量細(xì)胞面積。并用Statview 5.0.1繪框圖(box plot)和進(jìn)行統(tǒng)計計算。
傷口體外愈合 細(xì)胞于小室載玻片中鋪板并生長過夜。用200μl吸液管造傷。30分鐘(時間點(diǎn)0)、3.5小時(時間點(diǎn)3小時)和6.5小時(時間點(diǎn)6小時)后拍攝傷口照片。測量傷口邊緣細(xì)胞之間的距離。時間點(diǎn)3小時和6小時與時間點(diǎn)0作比較，以顯示傷口閉合率。用Statview 5.0.1進(jìn)行統(tǒng)計計算。
遷移測試 如(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-1254)所述進(jìn)行Boyden室遷移測試。簡而言之，無血清培養(yǎng)基中的30000個細(xì)胞上樣于每個孔中并使之向0.05％血清遷移4小時。去除未遷移的細(xì)胞并固定殘留的細(xì)胞并用Giemsa染料染色。用顯微鏡對每個孔的3個視野計數(shù)。
如早先所述的(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-1254)，利用48孔化學(xué)向性室(Neuroprobe Inc)在改良的Boyden室中進(jìn)行遷移測試。簡而言之，8微米Nucleopore無聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯過濾膜用100μg/ml1型膠原蛋白(Cohension，Palo Alta，USA)包被過夜。hTERT+-BCE細(xì)胞在0.2％FCS-DME培養(yǎng)基中饑餓16小時。為了測試血管生成抑制素的抑制活性，hTERT+-BCE、和載體以及血管生成抑制素結(jié)合蛋白MAE細(xì)胞預(yù)先與5μg/ml血管生成抑制素孵育1小時。細(xì)胞用胰蛋白酶消化，重懸于含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM中并向上室的每個孔中加入帶有或不帶有血管生成抑制素的30,000個細(xì)胞。將20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF；Peprotech EC Ltd.)用作下室中的化學(xué)引誘物?；瘜W(xué)向性室于37℃在10％CO2下孵育3-5小時，使細(xì)胞遷移通過膠原蛋白包被的聚碳酸酯過濾膜。去除濾膜上表面上的未遷移的細(xì)胞并用Giemsa染料(VWRInternational Ltd)對濾膜染色。每個視野中遷移細(xì)胞的總數(shù)以20x放大倍率計數(shù)；在三個獨(dú)立實驗中對每個樣品重復(fù)測試4次。
胎盤組織的收集 所有患者均知情同意，從其收集組織。在1小時的過程收集終止懷孕(6至22周)的胎盤組織，反復(fù)用含抗生素的PBS洗滌，并置于冰上。
分離細(xì)胞滋養(yǎng)層 通過公開方法(Fisher等，1989，J.Cell Biol.109891-902；Kliman等，1986，Endocrinology，1181567-1582)，從集中的第一個或第二個三月期的胎盤中分離細(xì)胞。簡而言之，胎盤進(jìn)行一系列酶消化，其使細(xì)胞滋養(yǎng)層先祖細(xì)胞與絨毛膜絨毛的基核分開。一旦分開，用Percoll梯度純化細(xì)胞并在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)于基質(zhì)膠包被的底物(協(xié)同生物醫(yī)藥產(chǎn)物)上15小時，所述無血清培養(yǎng)基DMEM，4.5g/L葡萄糖(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)，并含有2％Nutridoma(Boehringer Mannheim Biochemicals)，1％青霉素/鏈霉素，1％丙酮酸鈉，1％Hepes和1％慶大霉素(UCSF CellCulture Facility)。
侵入測試 如前述(Damsky等，1992，J.Clin.Invest.89210-222；Librach等，1991，J.Cell Biol.113437-449)進(jìn)行侵入測試。簡而言之，分離的細(xì)胞滋養(yǎng)層(0.25×106)在帶有用基質(zhì)膠包被的聚碳酸酯濾膜(孔大小為8μm)的Transwell插入物(6.5mm，Costar)上鋪板。實驗性培養(yǎng)物含血管生成抑制素，以5μg/ml加入到培養(yǎng)基中。48小時后，用特異與人細(xì)胞角蛋白反應(yīng)的7D3抗體染色培養(yǎng)物，從而能使細(xì)胞滋養(yǎng)層可視化。從支持物上切下濾膜并裝在載片上，其上表面朝下裝。計數(shù)濾膜下表面上的細(xì)胞角蛋白陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞突起。每個實驗條件重復(fù)測試3次并進(jìn)行完整的測試3次。數(shù)據(jù)表示成細(xì)胞滋養(yǎng)層總數(shù)和細(xì)胞滋養(yǎng)層突起。用Stufent’s t測驗分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計顯著性。
結(jié)果 血管生成抑制素結(jié)合蛋白新剪接同工型的鑒定 在為了其它目的而設(shè)計的免疫沉淀實驗過程中，我們在293T細(xì)胞中鑒定出了血管生成抑制素結(jié)合蛋白的新同工型。對293T細(xì)胞進(jìn)行免疫沉淀分析并通過SDS聚丙烯酰胺電泳(SDS PAGE)分離免疫沉淀并通過銀染檢測。切下對應(yīng)于80和130kDa的兩條條帶并用膠內(nèi)蛋白酶水解和質(zhì)譜來鑒定。對兩個蛋白質(zhì)的胰蛋白酶消化產(chǎn)物測序，鑒定出80kDa條帶和作為p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白同工型的130kDa蛋白質(zhì)條帶。用血管生成抑制素結(jié)合蛋白特異性抗體進(jìn)行Western印跡分析，確證了在293T細(xì)胞中有兩種血管生成抑制素結(jié)合蛋白的同工型(圖1A)。
在p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白中，氨基酸1-409位形成p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白特有的N末端部分，而氨基酸410-1084位對應(yīng)于p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白，并構(gòu)成了p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的C末端(圖1B)。P130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白通過外顯子2和3間的交互剪接方式來產(chǎn)生，其形成了這種帶有N末端延伸的同工型(圖1C)。然后我們產(chǎn)生了特異針對p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白N末端結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體。通過Western印跡分析，該抗體特異識別p130而不識別p80同工型(圖1D)。
血管生成抑制素結(jié)合蛋白的表達(dá) P130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白在胎盤中表達(dá)，但在懷孕期間在胚胎本身中不表達(dá)。
血管生成抑制素結(jié)合蛋白在胚胎發(fā)生期間起著重要的作用，因為血管生成抑制素結(jié)合蛋白敲除的小鼠顯示出在原腸胚形成期間有異常的內(nèi)臟內(nèi)胚層的細(xì)胞遷移，造成了70％小鼠胚胎死亡(Shimono和Behringer，2003，Current Biol.13613-7)。因此我們分析了在小鼠胚胎發(fā)生期間血管生成抑制素結(jié)合蛋白同工型的時間表達(dá)模式。小鼠胚胎在胚胎期(E)第5至19天的Western印跡顯示，在胎兒發(fā)育期間，從E6開始表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白，并增加了蛋白質(zhì)水平。沒有檢測到p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的表達(dá)(圖2A)。E15的胚胎溶解產(chǎn)物的過度曝光顯示p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白弱表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，我們推斷，p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白在胚胎發(fā)生期是占優(yōu)勢的表達(dá)形式。然后我們用Western印跡法分析了在外胚胎組織中血管生成抑制素結(jié)合蛋白的表達(dá)，其中使用了來自懷孕不同階段的胎盤樣品。除了從E11至懷孕終止都在表達(dá)的p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白，p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白表達(dá)僅僅在E13至E16的胎盤中被檢測到(圖2B)。分析血管生成抑制素結(jié)合蛋白在成體小鼠組織中的蛋白水平，顯示p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白表達(dá)僅限于胸腺和睪丸，而p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白則更豐富地在不同成體組織中表達(dá)(圖2C)。
為了確定p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白在細(xì)胞水平上的表達(dá)，我們檢測了來自293T細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)層、hTERT+-BCE細(xì)胞和牛主動脈內(nèi)皮(BAE)細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物。如圖2D所示，所有測試的細(xì)胞類型都產(chǎn)生了血管生成抑制素結(jié)合蛋白的這兩種同工型。
血管生成抑制素結(jié)合蛋白的定位 血管生成抑制素結(jié)合蛋白定位于原代內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接處并通過細(xì)胞密度控制 為了檢驗原代細(xì)胞中的細(xì)胞外染色模式。我們用以相似量表達(dá)p80-和p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白(Ernkvist等，2005，已提交)的BCE細(xì)胞進(jìn)行了相同的實驗。在不使用膜滲透的情況下，抗血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體能染色10％細(xì)胞，其模式與MAE細(xì)胞相似。用作陰性對照的抗GST的對照抗體不染色(數(shù)據(jù)未顯示)。我們隨后研究了血管生成抑制素結(jié)合蛋白在滿板的原代細(xì)胞中的定位情況。令人驚訝地，抗血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體在缺少去污劑的情況下無法顯示出對滿板的細(xì)胞有可檢測到的染色，這暗示當(dāng)細(xì)胞滿板時血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域被覆蓋了(圖3A)?？墒?，抗血管生成抑制素結(jié)合蛋白C末端的抗體在細(xì)胞-細(xì)胞接觸面上展示出強(qiáng)免疫反應(yīng)性。定位情況與ZO-1(緊密連接(TJ)的標(biāo)記)重疊。也能在似乎是細(xì)胞內(nèi)聚集物的地方檢測到血管生成抑制素結(jié)合蛋白，偶爾也呈ZO-1陽性。這與以下觀察結(jié)果在一起，即當(dāng)使用抗血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體時，僅有10％的亞滿板細(xì)胞顯示出表面免疫反應(yīng)性，而且完全滿板的細(xì)胞沒有展示出免疫反應(yīng)性，這暗示血管生成抑制素結(jié)合蛋白被補(bǔ)充在細(xì)胞表面上，在這些細(xì)胞的細(xì)胞-細(xì)胞接觸面上。用血管生成抑制素(5lμg/ml)處理滿板的細(xì)胞不改變血管生成抑制素結(jié)合蛋白的定位情況(數(shù)據(jù)未顯示)。
當(dāng)BCE細(xì)胞更滿板時，熒光染色顯示得更強(qiáng)。為了研究這一現(xiàn)象，我們以不同密度鋪板BCE細(xì)胞，并通過Western印跡分析血管生成抑制素結(jié)合蛋白表達(dá)。血管生成抑制素結(jié)合蛋白的p80-和p130-同工型的表達(dá)在25000個細(xì)胞/cm2時被強(qiáng)烈地誘導(dǎo)了，這時候細(xì)胞能與其它細(xì)胞相互形成接觸面(圖3C)。我們推斷，血管生成抑制素結(jié)合蛋白的表達(dá)由細(xì)胞-細(xì)胞接觸面的形成來調(diào)節(jié)。
血管生成抑制素結(jié)合蛋白體內(nèi)定位于內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞-細(xì)胞接觸面 我們隨后在體內(nèi)分析血管生成抑制素結(jié)合蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞中的位置。在小鼠視網(wǎng)膜中，出生后(P)第1至14天發(fā)生血管生成，血管從視神經(jīng)中的血管中向視網(wǎng)膜外周萌發(fā)，然后進(jìn)入較深層。我們對出生后P5天小鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜血管的整標(biāo)本染色，并通過免疫熒光分析血管生成抑制素結(jié)合蛋白的表達(dá)。血管生成抑制素結(jié)合蛋白與內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記——CD31/PECAM一起表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞中(圖4A)。這表明，血管生成抑制素結(jié)合蛋白的表達(dá)是視網(wǎng)膜中內(nèi)皮細(xì)胞特異性的。血管生成抑制素結(jié)合蛋白染色與ZO-1信號的重疊表明血管生成抑制素結(jié)合蛋白體內(nèi)定位于內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞-細(xì)胞接觸面上(圖4B和C)。
血管生成抑制素結(jié)合蛋白定位于CHO細(xì)胞中的緊密連接處并能使ZO-1補(bǔ)充 我們使用常用作細(xì)胞-細(xì)胞接觸面的模型系統(tǒng)的CHO細(xì)胞，從而研究緊密連接中的血管生成抑制素結(jié)合蛋白的功能。我們制造出表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白、p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白或空載體的穩(wěn)定CHO細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染導(dǎo)致Western印跡分析中出現(xiàn)預(yù)期分子量的條帶(圖5A)?？墒?，在p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，在120kDa和80kDa顯示出額外的條帶，表明如先前報道的(Ernkvist等，2005，已提交)，在p130 mRNA中額外的讀框內(nèi)ATG可用作轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)。CHO p130克隆表達(dá)蛋白質(zhì)的量有點(diǎn)低于p80克隆。野生型細(xì)胞和用空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞僅表達(dá)無法檢測到的蛋白量。
我們通過免疫熒光分析了血管生成抑制素結(jié)合蛋白在CHO細(xì)胞中的定位情況。P130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白定位于細(xì)胞-細(xì)胞上，而p80定位于細(xì)胞質(zhì)以及緊密連接上。在細(xì)胞-細(xì)胞接觸面中，血管生成抑制素結(jié)合蛋白染色與ZO-1重疊(圖5B)，表明血管生成抑制素結(jié)合蛋白與ZO-1共定位。偶爾，如從前報道的(17)，p130定位于沿著能用毒傘素來染色的F-肌動蛋白應(yīng)力纖維的焦點(diǎn)上。ZO-1能以對照細(xì)胞中不可見的方式被補(bǔ)充到這些焦點(diǎn)上(圖5B)，這表明血管生成抑制素結(jié)合蛋白能控制ZO-1定位。
p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域定位于肌動蛋白并穩(wěn)定應(yīng)力纖維。
如我們以前所報道的，p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白定位于片狀偽足(圖6A-C)(Troyanovsky等，2001，J.Cell.Biol.1521247-1254)。為了比較p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的亞細(xì)胞定位情況，用編碼各同工型的構(gòu)建體逆轉(zhuǎn)染小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(MAE)。多克隆陽性細(xì)胞用嘌呤霉素選擇并通過Western印跡分析檢測表達(dá)(圖2D)。用p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白逆轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示出130kDa條帶和80kDa處的微弱條帶，這表明p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白開放閱讀框(ORF)可產(chǎn)生這兩種同工型。用這些蛋白質(zhì)逆轉(zhuǎn)染的MAE細(xì)胞用C末端特異性抗體染色，并且p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白陽性細(xì)胞的染色顯示出非常有規(guī)律的小線性點(diǎn)的形式(圖6D)。這種染色形式不限于MAE細(xì)胞，因為M21黑素瘤和293T細(xì)胞當(dāng)轉(zhuǎn)染p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白時也顯示相似的結(jié)構(gòu)(數(shù)據(jù)未顯示)。p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的絲狀表達(dá)模式暗示p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白可能定位于F-肌動蛋白。為了評估潛在的肌動蛋白連接，表達(dá)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的MAE細(xì)胞用得克薩斯紅綴合的毒傘素對F-肌動蛋白以及p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白染色。截短的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白染色表明在大多數(shù)位置上能直接與F-肌動蛋白重合(圖6D-F)。染色的有趣觀察結(jié)果是，載體細(xì)胞(圖6J-L)和p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞不具有與p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白相同的肌動蛋白纖維模式。P130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白誘導(dǎo)應(yīng)力纖維，而表達(dá)載體和p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的細(xì)胞只有較少肌動蛋白纖維。這表明，p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白能穩(wěn)定應(yīng)力纖維。
為了進(jìn)一步分析p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和F-肌動蛋白的共定位情況，我們使用了計算機(jī)化的去卷積以及3D成像軟件來確定p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和F-肌動蛋白的重疊。圖3M顯示血管生成抑制素結(jié)合蛋白和肌動蛋白共定位于一個單個應(yīng)力纖維中。
接下來，我們研究了p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白特異性N末端部分是否介導(dǎo)與肌動蛋白的連接。為此，MAE細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染該p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白特異性N末端結(jié)構(gòu)域。N末端片段的免疫熒光染色顯示出能與應(yīng)力纖維完美的共定位，但缺少全長p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白特有的不時打斷的模式(圖6G-I)。相似的染色模式也在用N末端結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)染的HeLa和M21細(xì)胞中被觀察到(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果顯示p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白N末端409個氨基酸與應(yīng)力纖維相連。
與用p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相似，用N末端轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比載體和p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞有更多的應(yīng)力纖維，這表明p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白N末端能誘導(dǎo)更多的應(yīng)力纖維樣模式。
為了研究p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白是否與F-肌動蛋白相連，我們用肌動蛋白解聚劑——細(xì)胞松弛素B處理細(xì)胞。如圖7D所示，p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的不時打斷的染色模式在用細(xì)胞松弛素B處理的細(xì)胞中被破壞。被破壞的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白染色完全與肌動蛋白聚集結(jié)構(gòu)的毒傘素染色相重合(圖7D-F)。接著，我們將p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)染進(jìn)MAE細(xì)胞(圖7G-I)并用細(xì)胞松弛素B處理這些細(xì)胞。再一次，N末端染色完全與肌動蛋白聚集結(jié)構(gòu)相重合(圖7J-L)。為了確保染色不是由于細(xì)胞崩潰造成的，我們還對微管蛋白和細(xì)胞色素C進(jìn)行染色。微管蛋白和細(xì)胞色素C的染色都不受細(xì)胞松弛素B處理影響(數(shù)據(jù)未顯示)。我們還用細(xì)胞松弛素B處理轉(zhuǎn)染了p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的MAE細(xì)胞。p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的片狀偽足染色被破壞，但不影響所有p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白陽性細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)染色情況(數(shù)據(jù)未顯示)。
血管生成抑制素結(jié)合蛋白的拓?fù)鋵W(xué) 血管生成抑制素結(jié)合細(xì)胞表面上的血管生成抑制素結(jié)合蛋白 我們先前報道，用p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)染的小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(MAE細(xì)胞)將通過阻斷遷移和管的體外形成來應(yīng)答血管生成抑制素。這暗示p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白是血管生成抑制素的受體。可是，如序列分析所判定的，血管生成抑制素結(jié)合蛋白不具有明顯的能介導(dǎo)蛋白質(zhì)插入膜中的信號肽。為了研究p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白是否有細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，我們將MAE細(xì)胞與硫代-NHS-LC-生物素(帶有能綴合生物素與蛋白質(zhì)的反應(yīng)基團(tuán)的生物素衍生物)一起孵育。硫代-NHS-LC-生物素是水溶性的并不會穿透完整的細(xì)胞膜。用硫代-NHS-LC-生物素孵育后，我們對細(xì)胞溶解物進(jìn)行針對血管生成抑制素結(jié)合蛋白、或作為陰性對照針對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)樁蛋白的免疫沉淀。用HRP-綴合的抗生物素蛋白進(jìn)行Western印跡來分析免疫沉淀。如圖8A所見，p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白是生物素化的，而樁蛋白不是。可是，樁蛋白能用疏水、膜滲透的類似物——NHS-LC-生物素進(jìn)行生物素化(數(shù)據(jù)未顯示)。用牛毛細(xì)管內(nèi)皮(BCE)細(xì)胞進(jìn)行相似的實驗(圖15)時，內(nèi)源p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白也可以在原代細(xì)胞中生物素化。這是令人感興趣的，因為血管生成抑制素最初通過其抑制這些細(xì)胞增殖的能力而被鑒定出來(O’Reilly等，1994，Cell，79315-328)。為了驗證血管生成抑制素結(jié)合蛋白具有細(xì)胞外表位，我們用胰蛋白酶處理MAE細(xì)胞幾次并通過Western印跡分析細(xì)胞溶解產(chǎn)物。胰蛋白酶在80分鐘內(nèi)降解了大部分p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白，而不降解細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白(圖16)。
以前我們表明，轉(zhuǎn)染了血管生成抑制素結(jié)合蛋白的HeLa細(xì)胞能結(jié)合并內(nèi)在化FITC-標(biāo)記的血管生成抑制素(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-54)。為了驗證血管生成抑制素與表達(dá)血管生成抑制素結(jié)合蛋白的細(xì)胞結(jié)合，穩(wěn)定表達(dá)血管生成抑制素結(jié)合蛋白的HeLa細(xì)胞與碘化的血管生成抑制素以不同濃度孵育，并測量閃爍值(圖8B)。血管生成抑制素以可飽和的方式結(jié)合這些細(xì)胞，半最大濃度11ng/ml、或0.3nM，其被認(rèn)為近似于Kd。血管生成抑制素不以任何大的程度結(jié)合對照細(xì)胞。100倍濃度的冷的血管生成抑制素能競爭結(jié)合標(biāo)記的血管生成抑制素?？墒牵酝耆钄鄻?biāo)記的血管生成抑制素的結(jié)合的量加入血管生成抑制素是不可行的，因為這需要1000倍濃度。結(jié)果，我們的數(shù)據(jù)表明血管生成抑制素結(jié)合蛋白位于細(xì)胞表面上，在那兒它結(jié)合血管生成抑制素。
血管生成抑制素結(jié)合蛋白的拓?fù)鋵W(xué) 接著，我們研究血管生成抑制素結(jié)合蛋白的拓?fù)鋵W(xué)。通過序列分析，p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白含3種不同的結(jié)構(gòu)域.N末端的一半預(yù)計形成卷曲-卷曲(coiled-coil)(Bratt等，2002，Gene，29869-77)，而C末端具有推測的PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其對控制細(xì)胞運(yùn)動力起重要作用(Levchenko等，2003，J.CELL Sci.1163803-3810)。酵母雙雜交篩選中鑒定到的血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是135個殘基的部分疏水的結(jié)構(gòu)域(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-54)，其位于多肽的中心區(qū)域(圖9A)。p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白含延伸的N末端結(jié)構(gòu)域，其帶有保守的富含谷氨酰胺的基序。生物信息學(xué)分析暗示，血管生成抑制素結(jié)合蛋白在血管生成抑制素結(jié)合區(qū)疏水部分中含多至3個推測的穿膜螺旋(數(shù)據(jù)未顯示)。我們推測血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是在細(xì)胞外的，而且N末端卷曲-卷曲以及PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域是在細(xì)胞內(nèi)的。
一般而言，細(xì)胞膜必須是抗體可滲透的才能在免疫熒光研究中對細(xì)胞內(nèi)表位染色。為了研究血管生成抑制素結(jié)合蛋白的穿膜拓?fù)鋵W(xué)，在預(yù)先進(jìn)行或不進(jìn)行去污劑Triton X-100處理的情況下，用針對血管生成抑制素結(jié)合蛋白不同結(jié)構(gòu)域的抗體免疫熒光染色亞滿板的細(xì)胞。我們使用了3種不同的多克隆兔抗體一種針對血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-54)，一種針對最C末端的24個殘基，和一個針對p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的N末端(圖9A)。在不先提取膜的情況下，針對血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體能進(jìn)行染色，這暗示該結(jié)構(gòu)域具有細(xì)胞外表位(圖9B)。作為完整細(xì)胞膜的對照，我們對細(xì)胞內(nèi)陷窩蛋白N末端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行染色，其僅僅染色用Triton X-100處理過的細(xì)胞。相反，針對血管生成抑制素結(jié)合蛋白C末端的抗體為了染色需要滲透(圖9B)。當(dāng)使用Triton X-100時，該抗體以與抗血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域抗體相似的染色模式對細(xì)胞染色。這表明C末端是在細(xì)胞內(nèi)的，然而不能正式排除該表位是在細(xì)胞外的、并在用去污劑去除結(jié)合c末端的覆蓋蛋白質(zhì)之后變得可為抗體所用。可是，該表位含PDZ結(jié)合結(jié)構(gòu)域和該結(jié)構(gòu)域據(jù)目前所知總是在細(xì)胞內(nèi)的事實，支持前一結(jié)論。通過相同的方法，抗p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白N末端的抗體也僅在首次滲透細(xì)胞時才展示免疫反應(yīng)性，這表明該結(jié)構(gòu)域是在細(xì)胞內(nèi)的(圖9C)。最后，為了以相同方式分析p80血管生成抑制素結(jié)合蛋白N末端，我們用N末端上帶有myc標(biāo)簽的血管生成抑制素結(jié)合蛋白的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染MAE細(xì)胞。我們用綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染標(biāo)記來共轉(zhuǎn)染。對N末端myc標(biāo)簽的染色需要滲透(圖9E)，這表明血管生成抑制素結(jié)合蛋白N末端是在細(xì)胞內(nèi)的。結(jié)果，這些數(shù)據(jù)表明血管生成抑制素結(jié)合蛋白N末端和C末端是細(xì)胞內(nèi)的，在血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域側(cè)翼的疏水區(qū)能形成兩個穿膜螺旋，使血管生成抑制素中心部分在細(xì)胞外空間中結(jié)合。
p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的血管生成抑制素結(jié)合基序暴露在細(xì)胞表面 如上和在前研究(Troyanovsky等，2001，J.Cell.Biol.1521247-1254；Bratt等，2005，已提交)所示，p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白含有細(xì)胞外血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。因此，我們分析血管生成抑制素結(jié)合基序在表達(dá)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的細(xì)胞中是否暴露于細(xì)胞表面。表達(dá)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的非滲透的MAE細(xì)胞用針對細(xì)胞外血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體染色。細(xì)胞也與毒傘素一起孵育以驗證細(xì)胞外膜是完整的。p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的同樣的不時打斷的模式能在毒傘素染色陰性的非滲透細(xì)胞中被觀察到(圖10A-C)。在用針對血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞內(nèi)C末端結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體染色的細(xì)胞中沒有檢測到p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的染色(圖10D-F)。這些結(jié)果表明，p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白像p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白那樣也包含細(xì)胞外血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
血管生成抑制素結(jié)合蛋白的功能 血管生成抑制素結(jié)合蛋白與MAGI-1相互作用 血管生成抑制素結(jié)合蛋白與ZO-1的共定位提示我們嘗試免疫共沉淀血管生成抑制素結(jié)合蛋白和ZO-1。可是，沒有能發(fā)現(xiàn)這樣的相互作用。也沒有能確定閉合蛋白(occludin)和血管生成抑制素結(jié)合蛋白間的相互作用。然后，我們將注意力轉(zhuǎn)向MAGI-1——與ZO-1相關(guān)的膜相關(guān)鳥嘌呤核苷激酶(MAGUK)，據(jù)報道其結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮細(xì)胞選擇性粘附分子(ESAM)的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(Wegmann等，2004，Exp.Cell Res.300121-133)。在瞬時表達(dá)p80或p130血管生成抑制素結(jié)合蛋白和帶flag標(biāo)簽的MAGI-1同工型MAGI-1b和MAGI-1c的CHO細(xì)胞中，MAGI-1b、而不是MAGI-1c能與p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白免疫沉淀，但不與p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白沉淀。而且，p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白、而不是p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白也能用flag抗體免疫沉淀(圖11A)。免疫熒光研究揭示了在CHO細(xì)胞中表達(dá)時，p130和MAGI-1b共定位(圖11B)。因而，p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域能與MAGI-1b或與同MAGI-1b相互作用的蛋白質(zhì)相連。
血管生成抑制素結(jié)合蛋白控制細(xì)胞遷移和滲透 為了分析細(xì)胞-細(xì)胞接觸面中的血管生成抑制素結(jié)合蛋白功能，我們進(jìn)行細(xì)胞聚集測試。這些表明，血管生成抑制素結(jié)合蛋白在短期聚集測試中在缺失或存在鈣的情況下不介導(dǎo)細(xì)胞聚集，而且血管生成抑制素不對轉(zhuǎn)染了血管生成抑制素結(jié)合蛋白的細(xì)胞聚集產(chǎn)生影響(數(shù)據(jù)未顯示)。我們隨后研究血管生成抑制素結(jié)合蛋白在控制緊密連接滲透中的作用。為此，我們使用體外滲透測試，其中測量FITC-標(biāo)記的右旋糖酐擴(kuò)散穿過生長于滲透膜上的細(xì)胞層。熒光以時間依賴性方式增長，但在表達(dá)血管生成抑制素結(jié)合蛋白的細(xì)胞中顯著慢于對照細(xì)胞。1小時后，表達(dá)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的細(xì)胞展示出比對照細(xì)胞的滲透低88％，而p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞展示出滲透低70％(圖12A)。這顯示，血管生成抑制素結(jié)合蛋白不僅定位于緊密連接，而且其本身能影響緊密連接功能?？墒?，血管生成抑制素不能影響p80-或p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞中的滲透(圖12B)。在Boyden室測試中，穩(wěn)定表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的MAE細(xì)胞通過減少遷移來應(yīng)答血管生成抑制素，而MAE對照細(xì)胞不應(yīng)答(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-54)。為了研究CHO細(xì)胞是否以相似的方式反應(yīng)，我們用表達(dá)p80-或p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的CHO細(xì)胞進(jìn)行Boyden室實驗。這些結(jié)果如圖12C所示。表達(dá)p80-或p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的CHO細(xì)胞應(yīng)答血管生成抑制素，其運(yùn)動性減少50％。因而，血管生成抑制素的效應(yīng)局限于抑制細(xì)胞遷移，而血管生成抑制素不影響血管生成抑制素結(jié)合蛋白介導(dǎo)的對緊密連接的控制。
P130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白影響細(xì)胞形態(tài) 與表達(dá)載體和p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的細(xì)胞相比，p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白逆轉(zhuǎn)染的MAE細(xì)胞含更多應(yīng)力纖維并展現(xiàn)出扁平的形態(tài)。針對血管生成抑制素結(jié)合蛋白表達(dá)對細(xì)胞進(jìn)行染色，并用毒傘素，以使細(xì)胞輪廓可見。對血管生成抑制素結(jié)合蛋白染色陽性的細(xì)胞被拍照，并如材料和方法中所述的測量細(xì)胞面積。如圖13A中框圖所示，表達(dá)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白或N末端結(jié)構(gòu)域的MAE細(xì)胞的中值面積比p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白或載體細(xì)胞大2倍以上。這些結(jié)果顯示，p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞形態(tài)，而且蛋白質(zhì)的N末端部分介導(dǎo)這些效應(yīng)。
P130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白被血管生成抑制素抑制 我們以前的研究顯示，血管生成抑制素結(jié)合蛋白促進(jìn)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞遷移。因此，我們使用體外傷口愈合測試來研究p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白表達(dá)對MAE細(xì)胞遷移率的影響。在該測試中，用p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白、p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白或載體轉(zhuǎn)染的MAE細(xì)胞生長至滿板，然后通過用吸液管刮擦來造傷。通過分析從傷口邊緣到遷移細(xì)胞的最前端邊緣的距離來評估遷移率。傷口愈合的結(jié)果證明了，p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的表達(dá)刺激向傷口遷移幾乎2倍，而載體細(xì)胞和p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞具有相似的遷移率(圖13B)。接著，我們分析了表達(dá)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的MAE細(xì)胞是否應(yīng)答血管生成抑制素。首先，我們檢驗了血管生成抑制素是否能影響p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白陽性細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞與5μg/ml血管生成抑制素孵育過夜，第二天固定并進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，血管生成抑制素的處理不顯著影響p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞的細(xì)胞面積(數(shù)據(jù)未顯示)。
我們以前顯示，在Boyden室測試中，表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的MAE細(xì)胞的遷移被血管生成抑制素抑制了(Troyanovsky等，2001，J.Cell.Biol.1521247-1254)。因此我們比較了p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白、p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白、和載體細(xì)胞在存在或缺失血管生成抑制素的情況下的遷移。轉(zhuǎn)染了載體的細(xì)胞的遷移在存在bFGF的情況下被刺激，但在存在血管生成抑制素的情況下不被抑制。在存在血管生成抑制素的情況下，bFGF刺激的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的遷移分別被抑制百分之160和175，其低于在缺失bFGF的情況下的遷移水平(圖13C)。
因為hTERT+-BCE細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白，所以我們在遷移室測試中測試它們。hTERT+-BCE細(xì)胞的遷移在bFGF存在的條件下被刺激了，并在用血管生成抑制素處理時被抑制了85％(圖13D)。我的結(jié)果與以前的報道一致，表明血管生成抑制素抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移(Claesson-Welsh等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，955579-5583)。
血管生成抑制素抑制細(xì)胞滋養(yǎng)層侵入 細(xì)胞滋養(yǎng)層是人胎盤的專門化的內(nèi)皮細(xì)胞，其分化以獲得腫瘤樣性質(zhì)，其能使它們侵入子宮，在那兒它們產(chǎn)生內(nèi)皮樣特征(在Red-Horse等，2004，J.Clin.Invest.114744-754中有綜述)。它們表達(dá)PECAM、VE-鈣粘蛋白、VCAM-1、αv和αvβ3整合素也表明了這個事實。以前我們僅僅在內(nèi)皮細(xì)胞中檢測血管生成抑制素結(jié)合蛋白的表達(dá)。可是，由于人細(xì)胞滋養(yǎng)層也表達(dá)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白同工型(圖2D)，因此我們對胎盤切片染色。如圖14所示，染色顯示，細(xì)胞角蛋白和血管生成抑制素結(jié)合蛋白共定位于浮動的絨毛、錨定的絨毛和基板中，這表明p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白在所有細(xì)胞滋養(yǎng)層群體(如先祖、侵入的細(xì)胞)中表達(dá)，并不在分化的合胞滋養(yǎng)層中表達(dá)(圖14A-F)。
接著，我們測試了細(xì)胞滋養(yǎng)層(其表達(dá)大量內(nèi)源p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白)的侵入是否受血管生成抑制素處理影響。侵入測試在存在或缺失血管生成抑制素的情況下進(jìn)行。48小時后，侵入的細(xì)胞用細(xì)胞角蛋白單克隆抗體染色，并如材料和方法所述對實驗評分。結(jié)果顯示，在加入血管生成抑制素的實驗中，細(xì)胞滋養(yǎng)層侵入與對照相比下調(diào)了幾乎3倍(圖14G)。
討論 我們鑒定出了血管生成抑制素結(jié)合蛋白的新剪接同工型，其調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)并介導(dǎo)血管生成抑制素抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移。p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白包含延伸的氨基末端結(jié)構(gòu)域，但其它部分與其較短的80kDa同工型一樣。N末端結(jié)構(gòu)域最先的243個氨基酸顯示出與Amotl-1和Amotl-2有58％同源性。在這些243個氨基酸中有5個由在3個蛋白質(zhì)之間100％保守的約8-10個氨基酸組成的、富含谷氨酰胺的保守區(qū)島。關(guān)于Amotl-2的細(xì)胞位置和功能知道得很少，但顯示Amotl-1(JEAP)特異表達(dá)于外分泌細(xì)胞中并體外和體內(nèi)定位于緊密連接處中的ZO-1處(Nishimura等，2002，J.Biol.Chem.2775583-7)。p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的亞細(xì)胞位置不同于MAE細(xì)胞中的p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白。與用p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白觀察到的片狀偽足染色情況相反，p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白以有規(guī)律的不時打斷的模式表達(dá)，與F-肌動蛋白重疊。該染色模式不與纖維狀粘附(fibrillar adhesion)中發(fā)現(xiàn)的張力蛋白(Zamir等，1999，J.CELL Sci.1121655-1669)或α-輔肌動蛋白(肌動蛋白結(jié)合蛋白質(zhì))(Belkin和Koteliansky，1987，F(xiàn)EBS Letts，220291-4；Otey等，1990，J.Cell Biol.111721-9)的模式重疊(數(shù)據(jù)未顯示)。
與表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的細(xì)胞相比，表達(dá)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的細(xì)胞包含更多應(yīng)力纖維，這造成了細(xì)胞形態(tài)的改變以及細(xì)胞面積增加約2倍。這依賴于Rho活化的激酶活性，因為加入ROCK抑制劑Y27632能防止應(yīng)力纖維形成(Worthylake和Burridge，2003，J.Biol.Chem.27813578-13584；Nobes和Hall，1999，J.Cell Biol.1441235-1244)(數(shù)據(jù)未顯示)。對用p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白N末端結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)染的MAE細(xì)胞進(jìn)行染色表明，與用p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)染的細(xì)胞所觀察到的不時打斷的模式相反，它與F-肌動蛋白始終如一地共定位。N末端片段的表達(dá)造成相似的應(yīng)力纖維積聚，其造成細(xì)胞形狀如用p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白所見的那樣增大。這表明，N末端結(jié)構(gòu)域包含靶向肌動蛋白的序列，所述序列介導(dǎo)應(yīng)力纖維在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中穩(wěn)定。用細(xì)胞松弛素D——肌動蛋白解聚劑處理后，對p130和N末端片段染色都保持了與毒傘素染料的連接，這進(jìn)一步表明N末端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白靶向于肌動蛋白。p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的不時打斷的膜位置證實了，對應(yīng)于p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的C末端區(qū)域在沿著應(yīng)力纖維的隔腔中將p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白組織起來。另外，C末端將p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白集中到細(xì)胞中心部分，而只表達(dá)N末端會定位于整個細(xì)胞。
p80和p130在小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中不同的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)模式也支持同工型有不同的細(xì)胞功能。我們以前顯示，過表達(dá)p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的MAE細(xì)胞響應(yīng)化學(xué)趨化因子遷移率提高100％(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-1254)。另外，p80的表達(dá)促進(jìn)腫瘤體內(nèi)生長并侵入周圍肌肉組織(Levchenko等，2004，Oncogene，231469-1473)。血管生成抑制素結(jié)合蛋白在細(xì)胞遷移中的作用進(jìn)一步由以下發(fā)現(xiàn)所強(qiáng)化血管生成抑制素結(jié)合蛋白缺陷型小鼠在胚胎期第7-8天死在子宮內(nèi)，這是因為在前內(nèi)臟內(nèi)皮層中的遷移缺陷造成的(Shimono和Behringer，2003，Curr.Biol.13613-7)?？墒?，如在Boyden室或傷口愈合測試中分析的，p130血管生成抑制素結(jié)合蛋白在MAE細(xì)胞中的表達(dá)并不顯著影響遷移率。p130-和p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白同工型包含血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其不存在于血管生成抑制素結(jié)合蛋白蛋白家族的其它兩個成員中(Bratt等，2002，Gene，29869-77)。我們在本文中顯示，p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域與p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域相似，暴露于細(xì)胞表面。將血管生成抑制素加入到用p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)染的MAE細(xì)胞中會以與表達(dá)p80的細(xì)胞相似的效率抑制細(xì)胞遷移?？墒?，血管生成抑制素不影響表達(dá)p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的細(xì)胞的應(yīng)力纖維形成或細(xì)胞形狀。這些數(shù)據(jù)表明，血管生成抑制素主要干擾p80結(jié)構(gòu)域引起的潛在的信號傳遞途徑。
p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白在胚胎發(fā)生期和在成體組織中的分布提示其表達(dá)是被緊密調(diào)節(jié)的；p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白僅在胸腺、睪丸和胎盤中被發(fā)現(xiàn)，而其較短的同工型分布更廣。在胎盤中，血管生成抑制素結(jié)合蛋白由內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)層表達(dá)。后者的細(xì)胞的特征在于其能侵入蛻膜并替代子宮細(xì)動脈內(nèi)皮壁，并在較少程度上替代靜脈。該重要的過程建立了子宮胎盤循環(huán)(綜述于Bratt等，2002，Gene，29869-77)。有趣的是，侵入的細(xì)胞滋養(yǎng)層獲得內(nèi)皮特性并表達(dá)特異于內(nèi)皮的基因(如PECAME和VE-鈣粘蛋白)。內(nèi)皮細(xì)胞和人細(xì)胞滋養(yǎng)層是至今僅有的顯示表達(dá)血管生成抑制素結(jié)合蛋白這兩種同工型的原代細(xì)胞。結(jié)果，這兩種細(xì)胞類型也通過抑制遷移或侵入來應(yīng)答血管生成抑制素。
血管的管的形成包括來自周圍組織的誘導(dǎo)性信號傳遞，其誘導(dǎo)細(xì)胞定向遷移(綜述于(Carmeliet，2000，Nature Med.6389-395)。頂端細(xì)胞通過絲足的伸展來感應(yīng)化學(xué)趨向梯度(Gerhardt等，2003，J.Cell Biol.1611163-1177)。管的形成還涉及重塑細(xì)胞的細(xì)胞骨架以形成封閉的單層，其圍繞充滿液體的中空內(nèi)腔。細(xì)胞連接處的形成封住了內(nèi)皮層，從而防止側(cè)面細(xì)胞滲漏并標(biāo)記了頂端和基底膜部分的邊界(綜述于Bazzoni和Dejana，2004，Physiol.Rev.84869-901)。我們在本文中顯示，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管生成抑制素結(jié)合蛋白的兩種同工型——p80和p130。我們推測這些同工型在血管生成期間起不同作用，其中p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白促進(jìn)細(xì)胞遷移，而p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白涉及在管形成期間改變內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)。
我們提供了證據(jù)，即p80-和p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白都是整合型膜蛋白質(zhì)。我們進(jìn)一步顯示，這兩種同工型與ZO-1在體外和體內(nèi)共定位于內(nèi)皮細(xì)胞中。數(shù)據(jù)表明，血管生成抑制素結(jié)合蛋白是內(nèi)皮緊密連接蛋白質(zhì)復(fù)合物的新成分，并可在內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞連接中起功能性作用。
我們提供了以下血管生成抑制素結(jié)合蛋白作為膜整合型蛋白質(zhì)模型的證據(jù) 1.血管生成抑制素結(jié)合蛋白通過對完整的轉(zhuǎn)染的以及原代內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記而生物素化。
2.血管生成抑制素結(jié)合蛋白表位對胰蛋白酶降解敏感。
3.血管生成抑制素特異結(jié)合血管生成抑制素結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的表面。
4.針對血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體與轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的細(xì)胞表面上的血管生成抑制素結(jié)合蛋白結(jié)合。我們推斷，血管生成抑制素結(jié)合蛋白位于細(xì)胞表面上，其中它可用作血管生成抑制素的受體?？贵w圖譜提示了血管生成抑制素結(jié)合蛋白的穿膜模型，其中在血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域側(cè)翼的疏水區(qū)可形成兩個穿膜螺旋，使血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的中心部分暴露于細(xì)胞表面上。
如序列分析所判定的，血管生成抑制素結(jié)合蛋白缺少信號肽，其表明它不通過經(jīng)典的分泌途徑到達(dá)膜，經(jīng)典的分泌途徑通過在蛋白質(zhì)合成過程中將肽整合進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜中而開始(Keenan等，2001，Ann.Rev.Biochem.70755-775)?？墒牵鞍踪|(zhì)可通過其他機(jī)制插入膜，或可被分泌(Nickel，2003，Eur.J.Biochem.2702109-2119)。因而，蛋白質(zhì)可通過通常被稱為非經(jīng)典分泌來分泌。這些蛋白質(zhì)的例子有bFGF(Prudovsky等，2002，J.CellBiol.158201-8)、硫氧還蛋白(Tanudji等，2003，Am.J.Physiol.Cell Physiol.284C1272-1279)、和TSAP6(Amzallag等，2004，J.Biol.Chem.27946104-46112)。還有缺少信號肽、因此在蛋白質(zhì)合成期間不能被插入ER的膜蛋白質(zhì)的例子。一組膜蛋白質(zhì)(其通常被稱為尾部錨定的蛋白質(zhì)，例如突觸短桿素)翻譯后插入膜(Whitley等，1996，J.Biol.Chem.2717583-7586)。可是，我們提供的血管生成抑制素結(jié)合蛋白模型不支持抗血管生成抑制素結(jié)合蛋白屬于該類膜蛋白質(zhì)。而且，真核細(xì)胞中寄生蟲利什曼蟲表達(dá)的蛋白質(zhì)HASPB也可從細(xì)胞質(zhì)位置插入質(zhì)膜內(nèi)小葉，然后穿過膜(Denny等，2000，J.Biol.Chem.27511017-11025)。膜聯(lián)蛋白(有趣的是，它也結(jié)合血管生成抑制素(Tuszynski等，2002，Microvasc.Res.64448-462))是膜結(jié)合蛋白質(zhì)，其能被插入膜并通過包括從膜結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)換成跨膜狀態(tài)的機(jī)理獲得跨膜構(gòu)型(Langen等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9514060-14065)。我們的數(shù)據(jù)提示，血管生成抑制素結(jié)合蛋白與膜聯(lián)蛋白和HASPB具有相似的性質(zhì)，因為盡管缺少信號肽，但仍能通過將在血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域側(cè)翼的疏水螺旋插入膜來獲得跨膜構(gòu)型。
以前的數(shù)據(jù)顯示，血管生成抑制素結(jié)合蛋白表達(dá)與細(xì)胞運(yùn)動性增加相關(guān)，而且該效應(yīng)被血管生成抑制素所阻斷，這暗示血管生成抑制素通過阻斷血管生成抑制素結(jié)合蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動性來抑制血管生成(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-1254；Levchenko等，2003，J.CELL Sci.1163803-3810；Levchenko等，2004，Oncogene，231469-1473；Shimono和Behringer，2003，Curr.Biol.13613-7)。該研究表明，血管生成抑制素結(jié)合蛋白除了控制細(xì)胞運(yùn)動性之外(Folkman，1995，NatureMed.127-31)，還在體內(nèi)和體外定位于細(xì)胞-細(xì)胞接觸面，而且當(dāng)轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO細(xì)胞時(Hanahan和Folkman，1996，Cell，86353-364)，能與緊密連接蛋白質(zhì)ZO-1共定位(O’Reilly等，1994，Cell，79315-328)，將ZO-1補(bǔ)充到應(yīng)力纖維(Ji等，1998，F(xiàn)aseb J.121731-8)，控制滲透(Claesson-Welsh等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，955579-5583)并結(jié)合緊密連接蛋白質(zhì)MAGI-1和與其共定位。我們推斷，血管生成抑制素結(jié)合蛋白是緊密連接蛋白質(zhì)。以前，我們報道過，在胚胎期第9.5天檢測的在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)顯性陰性血管生成抑制素結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠展示出滲漏的血管，這造成腦中嚴(yán)重的出血(Levchenko等，2003，J.Cell Sci.1163803-3810)，該發(fā)現(xiàn)與血管生成抑制素結(jié)合蛋白減少緊密連接滲透的作用一致。
在血管生成期間，細(xì)胞遷移到新血管的位點(diǎn)上，然后成熟成帶有成熟的緊密連接和粘附連接的功能性血管。在血管生成期間，遷移和成熟是關(guān)鍵的步驟，而且我們的數(shù)據(jù)與以前的發(fā)現(xiàn)暗示，血管生成抑制素結(jié)合蛋白能控制這兩者。JAM-1(一種穿膜緊密連接蛋白質(zhì))以相似的方式減少側(cè)面細(xì)胞滲透(Tanudji等，2003，Am.J.Physiol.Cell Physiol.284C1272-9)，而且還為bFGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動性所需(Amzallag等，2004，J.Biol.Chem.27946104-46112；Whitley等，1996，J.Biol.Chem.2717583-7586)。在該研究中，血管生成抑制素特異性影響血管生成抑制素結(jié)合蛋白誘導(dǎo)的運(yùn)動性，但不影響血管生成抑制素結(jié)合蛋白控制的滲透。這提示，血管生成抑制素專門影響參與血管生成的運(yùn)動的內(nèi)皮細(xì)胞，而不影響已建立的血管中的內(nèi)皮細(xì)胞。另外，未見臨床試驗報道血管生成抑制素能增加血管滲透(Denny等，2000，J.Biol.Chem.27511017-11025)。
血管生成抑制素結(jié)合蛋白如何控制滲透？血管生成抑制素結(jié)合蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域能參與同型結(jié)合并用于封閉緊密連接，很像閉合蛋白或密蛋白。另一種可能性是血管生成抑制素結(jié)合蛋白的效應(yīng)是次級的，而且是信號傳遞和/或其它蛋白質(zhì)補(bǔ)充至緊密連接的結(jié)果。血管生成抑制素結(jié)合蛋白樣蛋白1/JEAP也被報道位于緊密連接上(Dejana，2004，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.5261-270)，但由于該蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)家族成員血管生成抑制素結(jié)合蛋白樣蛋白2缺少血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Bratt等，2002，Gene，29869-77)，因此我們預(yù)測血管生成抑制素結(jié)合蛋白是專門的血管生成抑制素效應(yīng)介導(dǎo)劑。
我們顯示過，p130-而不是p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白與緊密連接蛋白質(zhì)MAGI-1b相互作用，這表明p130血管生成抑制素結(jié)合蛋白409個殘基的N末端延伸結(jié)構(gòu)域是該相互作用所必需的。盡管我們沒有顯示p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白和MAGI-1間直接的相互作用，但是有趣的是，注意到p130的N末端包含幾種富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域，包括PpxY基序，其能用作MAGI-1的WW結(jié)構(gòu)域的結(jié)合基序(Dobrosotskaya和James，2000，Biochem.Biophys.Res.Comm.270903-9；Kay等，2000，F(xiàn)aseb J.14231-241)?？墒?，與MAGI-1的相互作用并不是將血管生成抑制素結(jié)合蛋白靶向緊密連接所必需的，因為血管生成抑制素結(jié)合蛋白本身定位于細(xì)胞-細(xì)胞接觸面并控制滲透。
肌動蛋白細(xì)胞骨架和GTP酶的Rho家族都能緊密調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動性和緊密連接。例如，盡管Rho和Rac都被識別為細(xì)胞運(yùn)動性的兩種最重要調(diào)節(jié)劑(Burridge和Wennerberg，2004，Cell，116167-179)，這兩者都分別在調(diào)節(jié)Par-3和Par-6下游的緊密連接形成中起關(guān)鍵作用(Chen和Macara，2005，Nat.Cell Biol.7262-9；Ozdamar等，2005，Science，3071603-1609；Patrie等，2002，J.Biol.Chem.27730183-30190)。可能的是，血管生成抑制素結(jié)合蛋白通過影響肌動蛋白細(xì)胞骨架來調(diào)節(jié)滲透和運(yùn)動性。實際上，有證據(jù)表明血管生成抑制素和血管生成抑制素結(jié)合蛋白與Rho信號傳遞相聯(lián)系(Ernkvist等，2005，已提交；Gupta 等，2001，EMBO Rep.2536-540)(Bratt和Holmgren)，而且試圖推測肌動蛋白細(xì)胞骨架的控制是血管生成抑制素結(jié)合蛋白兩種性質(zhì)的核心。根據(jù)此，MAGI-1結(jié)合肌動蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)α-輔肌動蛋白4和突觸足蛋白(Patrie等，2002，J.Biol.Chem.27730183-30190)。
用VEGF抗體bevacizumab獲得的令人激動的結(jié)果(Hurwitz等，2004，N.Engl.J.Med.3502335-42)顯示，我們正進(jìn)入抗血管生成療法的紀(jì)元，而且表明需要另外的血管生成抑制劑。我們的結(jié)果提供了設(shè)計結(jié)合血管生成抑制素結(jié)合蛋白的血管生成抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體的基本原理。已經(jīng)顯示，通過阻斷VE-鈣粘蛋白來影響細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的抗血管生成抗體可以設(shè)計成不導(dǎo)致成熟血管的滲透，而僅阻斷新血管化(Corada等，2002，Blood，100905-11)。該研究提示，血管生成抑制素模擬抗體可通過專門控制細(xì)胞遷移、而不影響成熟血管中的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞-細(xì)胞接觸面來阻斷血管生成。
實施例2-優(yōu)選的藥物制劑和給藥模式和劑量。
本發(fā)明的多肽、多核苷酸和抗體可利用可注射的持續(xù)釋放藥物遞送系統(tǒng)而遞送。這些被特別設(shè)計以減少注射頻率。該系統(tǒng)的例子是NutropinDepot，其用可生物降解的微球?qū)⒅亟M人生長激素(rhGH)包裹成膠囊，一旦注射，就可在一段持續(xù)的時期緩慢釋放rhGH。
本發(fā)明的多肽、多核苷酸和抗體可通過外科手術(shù)植入設(shè)備給藥，其直接將藥物釋放到所需的位置。例如，Vitrasert將更昔洛韋直接釋放到眼睛中以治療CMV視網(wǎng)膜炎。該有毒性的試劑向疾病位點(diǎn)的直接應(yīng)用得到了有效的治療效果，而沒有藥物的顯著全身性副作用。
電穿孔治療(EPT)系統(tǒng)也可用于給藥。向細(xì)胞遞送脈沖電場的設(shè)備能增加藥物向細(xì)胞膜的滲透，使得顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)藥物遞送。
本發(fā)明的多肽、多核苷酸和抗體也可通過電摻入(EI)來遞送。EI發(fā)生在皮膚表面上大至30微米直徑的小顆粒受到與電穿孔中所用的那些一樣或相似的電脈沖的時候。在EI中，這些顆粒被驅(qū)動穿過角質(zhì)層表皮并進(jìn)入皮膚的更深層。顆?？裳b載或包被有藥物或基因，或能簡單地用作“子彈”在皮膚上產(chǎn)生孔，讓藥物能進(jìn)入。
可選的給藥方法是熱敏的ReGel注射系統(tǒng)。低于體溫時，ReGel是可注射的液體，而在體溫時，它立刻形成凝膠體緩慢腐蝕并溶解成已知安全的、可生物降解的聚合物?；钚运幬镫S著生物聚合物溶解而隨時間被遞送。
本發(fā)明的多肽、多核苷酸和抗體可通過“木馬肽(Trojan peptide)”而導(dǎo)入細(xì)胞中。這些是被稱為penetratin的多肽類型，其具有易位性質(zhì)并能攜帶親水化合物穿過質(zhì)膜。該系統(tǒng)將寡肽定向靶向于細(xì)胞質(zhì)和核，并可以是非細(xì)胞類型特異性的并有高功效(Derossi等，1998，TrendsCell Biol.8，84-87)。
本發(fā)明的藥物制劑優(yōu)選是單位劑型，其含每日劑量或單位、每日亞劑量或其合適分?jǐn)?shù)的活性成分。
本發(fā)明的多肽、多核苷酸和抗體可通過任何非腸道途徑給藥，其藥學(xué)上可接受的劑型的藥物制劑的形式包括活性成分，任選形式是非毒性的有機(jī)、或無機(jī)酸、或堿、加成鹽的形式。根據(jù)要治療的疾病和患者以及給藥途徑，組合物可以各種劑量給藥。
在治療人時，本發(fā)明的多肽、多核苷酸和抗體可單獨(dú)給藥，但通常將與根據(jù)所希望的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物實踐而選擇的合適的藥物賦形劑、稀釋劑或載體混合給藥。
本發(fā)明的多肽、多核苷酸和抗體也可非腸道給藥，例如，靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)、顱內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下給藥，或它們可通過融合技術(shù)給藥。它們最好以無菌水溶液形式使用，其可含其它物質(zhì)，例如，足夠的鹽或葡萄糖以制備與血液等滲的溶液。如果需要，水溶液應(yīng)當(dāng)是合適的緩沖液(優(yōu)選pH為3至9)。通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)藥物技術(shù)，能容易完成在無菌條件下制備合適的非腸道制劑。
適于非腸道給藥的制劑包括水溶性和非水溶性無菌注射溶液，其可包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和能使制劑與所希望的接受者血液等滲的溶質(zhì)；和水溶性和非水溶性無菌混懸液，其可包括混懸劑和增稠劑。制劑可以提供在單位劑量或多劑量容器中，例如在密封的安瓿和小瓶中，并可以儲存在冷凍干燥(凍干)的條件下，其僅需要在使用前立即加入無菌液體載體，例如注射用水。臨時注射溶液和混懸液可以由前述類型的無菌粉末、顆粒和片劑制備。
一般而言，在人中，口服或非腸道給藥本發(fā)明的多肽、多核苷酸和抗體是優(yōu)選的途徑，是最方便的。
對于獸醫(yī)應(yīng)用，本發(fā)明的多肽、多核苷酸和抗體根據(jù)正常獸醫(yī)實踐作為合適的可接受的劑型給藥，而且獸醫(yī)醫(yī)生將能確定最適于特定動物的劑量方案和給藥途徑。
本發(fā)明藥物組合物的制劑可方便地以單位劑量形式提供，并可以通過任何現(xiàn)有公知的制藥方法來制備。該方法包括將活性成分與由一種或多種輔助成分構(gòu)成的載體組合起來。一般而言，通過將活性成分與液體載體或細(xì)密分割的固體載體或這兩者均一、精密地組合起來，然后如果需要，對產(chǎn)品塑形，由此制備制劑。
優(yōu)選的單位劑量制劑是含每日劑量或單位、每日亞劑量或其合適分?jǐn)?shù)的活性成分。
本發(fā)明優(yōu)選的遞送系統(tǒng)可包含注滿本發(fā)明的多肽、多核苷酸和抗體的水凝膠，其優(yōu)選攜帶在棉塞上，其能被塞入子宮頸，并一旦產(chǎn)生合適的子宮頸成熟或其他對女性生殖系統(tǒng)所需的影響，就能收回。
應(yīng)當(dāng)能理解的是，除了上述特別提到的成分，根據(jù)所需要的制劑類型，本發(fā)明的制劑可包括其他現(xiàn)有常規(guī)的試劑。
實施例3-示例性的藥物制劑 盡管本發(fā)明的多肽、多核苷酸和抗體可以單獨(dú)給藥，優(yōu)選將其與一種或多種可接受的載體配制成藥物制劑。一種或多種載體必須是“可接受的”，其含義與本發(fā)明的化合物相容，對其接受者無毒。載體通常是無菌和無熱原的水或鹽液。
以下例子示例了本發(fā)明所述的藥物制劑，其中活性成分是本發(fā)明的多肽、多核苷酸和/或抗體。
實施例3A眼科溶液 活性成分 0.5g 氯化鈉(分析級)0.9g 硫柳汞0.001g 加純水至 100ml pH調(diào)節(jié)至 7.5 實施例3B膠囊劑 制劑A 膠囊制劑通過混合以上實施例C中的制劑D的成份并裝填入兩部分硬明膠膠囊中來制備。制劑B(見下)以相似的方式制備。
制劑B mg/膠囊 活性成分 250 乳糖B.P. 143 葡糖酸淀粉鈉 25 硬脂酸鎂 2 420 制劑C mg/膠囊 活性成分 250 聚乙二醇4000 BP350 600 膠囊的制備是熔化聚乙二醇4000BP，使活性成分分散于熔化物中并將熔化物裝填入兩部分硬明膠膠囊中。
制劑D mg/膠囊 活性成分 250 卵磷脂 100 花生油 100 450 膠囊的制備是使活性成分分散于卵磷脂和花生油中并將分散物裝填入軟的有彈性的明膠膠囊中。
制劑E(控釋膠囊) 以下控釋膠囊制劑的制備是用擠壓機(jī)擠壓出成份a、b、和c，然后使擠壓物呈球形并干燥。然后，干燥的小團(tuán)用控釋膜(d)包被并裝填入兩片硬明膠膠囊中。
mg/膠囊 活性成分 250 微晶纖維素 125 乳糖BP 125 乙基纖維素 13 513 實施例3C 注射劑 活性成分 0.200g 加無菌、無熱源磷酸緩沖液(pH7.0)至10ml 活性成分溶于大部分磷酸緩沖液(35-40℃)中，然后補(bǔ)充至體積并通過無菌微孔過濾膜過濾進(jìn)無菌的10ml琥珀色玻璃瓶(1型)中，并用無菌塞子密封并打上封印。
實施例3D肌肉內(nèi)注射劑 活性成分0.20g 苯甲醇 0.10g 四氫呋喃聚乙二醇醚(Glucofurol)751.45g 加注射用水適量至3.00ml 活性成分溶于四氫呋喃聚乙二醇醚中。然后加入苯甲醇并溶解，加水至3ml。然后將混合物通過無菌微孔膜過濾并密封于無菌的3ml瓶(1型)中。
實施例3E糖漿混懸劑 活性成分 0.2500g 山梨醇溶液1.5000g 甘油 2.0000g 可分散的纖維素0.0750g 安息香酸鈉0.0050g 桃味調(diào)味劑17.42.3169 0.0125ml 加純水適量至 5.0000ml 安息香酸鈉溶于部分純水中并加入山梨醇溶液。加入活性成分并分散。
在甘油中分散有增稠劑(可分散的纖維素)。混合兩種分散物并用純水加到所需的體積。如需要，通過額外攪拌混懸液來進(jìn)一步增稠。
實施例3F栓劑 mg/栓劑 活性成分(63μm)* 250 固體脂肪BP(Witepsol H15-Dynamit Nobel)1770 2020 *活性成分被用作粉末，其中至少90％的顆粒是63μm直徑的或更小。
將五分之一的Witepsol H15在蒸汽套盤中以最大45℃熔解。活性成分篩過200μm篩子并加到熔化的基質(zhì)同時混合，用裝有切割頭的silverson攪拌直至得到平滑的分散物。于45℃保存混合物，將剩下的Witepsol H15加入到混懸液中并攪拌以確保均勻混合。將全部混懸液通過250μm不銹鋼屏，期間不斷攪拌，使之冷卻至40℃。于溫度38℃至40℃，將2.02g混合物裝填入合適的塑料模具中。將栓劑冷卻至室溫。
實施例3G陰道栓劑 mg/陰道栓劑 活性成分250 無水葡萄糖 380 土豆淀粉363 硬脂酸鎂7 1000 以上成份直接混合，通過直接壓縮得到的混合物來制備陰道栓劑。
實施例3H乳劑和藥膏 描述于Remington，The Science and Practise of Pharmacy，第19版，ThePhiladelphia College of Pharmacy and Science，ISBN 0-912734-04-3。
實施例3I微球劑型 本發(fā)明的化合物也可利用微球劑型來遞送，如描述于Cleland(1997，Pharm.Biotechnol.101-43；和2001，J.Control.Release 7213-24)中的那些。
權(quán)利要求
1.用于調(diào)節(jié)血管生成和/或腫瘤形成的分離或重組的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽是分離或重組的哺乳動物p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白。
3.權(quán)利要求2的多肽，其中所述多肽是分離或重組的人p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白。
4.權(quán)利要求1至3之任一的多肽，其中所述多肽包含
(i)序列SEQ ID NO1；或
(ii)與SEQ ID NO1具有至少80％和/或至少90％和/或至少95％和/或至少98％同一性、并提供功能性多肽的序列；或
(iii)SEQ ID NO1或(ii)的序列的功能性片段。
而且其中所述多肽不是p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白或p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的片段。
5.權(quán)利要求4的多肽，其中SEQ ID NO1的功能性片段由SEQ ID NO1的氨基酸殘基1至409組成。
6.抗體或其片段，其能結(jié)合如權(quán)利要求1至5之任一所限定的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽。
7.權(quán)利要求6的抗體或片段，其能結(jié)合由SEQ ID NO1的殘基1至殘基409所限定的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽的區(qū)域，但不能結(jié)合p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽。
8.權(quán)利要求6的抗體或片段，其能結(jié)合由SEQ ID NO1的殘基410至殘基1084所限定的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽的區(qū)域，但不能結(jié)合p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽。
9.權(quán)利要求6的抗體或片段，其能結(jié)合由SEQ ID NO1的殘基871至殘基1013所限定的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽的區(qū)域，但不能結(jié)合p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽。
10.如權(quán)利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)用于產(chǎn)生能結(jié)合如權(quán)利要求1至5之任一所限定的p130-血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽的抗體的用途。
11.用作藥物的如權(quán)利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)和/或如權(quán)利要求6至9之任一所限定的抗體或片段。
12.如權(quán)利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)和/或如權(quán)利要求6至9之任一所限定的抗體或片段用于制備調(diào)節(jié)血管生成和/或腫瘤形成的藥物的用途。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述藥物防止和/或減輕血管生成和/或腫瘤形成。
14.如權(quán)利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)和/或如權(quán)利要求6至9之任一所限定的抗體或片段用于制備治療患有血管生成相關(guān)疾病或病癥的受試者的藥物的用途。
15.如權(quán)利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)和/或如權(quán)利要求6至9之任一所限定的抗體或片段用于制備免疫接種患有血管生成和/或腫瘤形成和/或血管生成相關(guān)疾病或病癥或處于所述疾病或病癥風(fēng)險的受試者的疫苗的用途。
16.權(quán)利要求14或15的用途，其中血管生成相關(guān)疾病或病癥是癌、實體腫瘤、血管瘤、眼新血管形成、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、黃斑變性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性病況、牛皮癬、慢性腸炎、哮喘或子宮內(nèi)膜異位癥。
17.如權(quán)利要求6至9之任一所限定的抗體或片段在檢測和/或測量測試樣品中血管生成和/或腫瘤形成中的用途。
18.用于調(diào)節(jié)血管生成和/或腫瘤形成的藥物組合物，其包含有效量的如權(quán)利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)和/或如權(quán)利要求6至9之任一所限定的抗體或片段，和藥物賦形劑或稀釋劑。
19.權(quán)利要求18的藥物組合物，其防止和/或減輕血管生成和/或腫瘤形成。
20.用于調(diào)節(jié)血管生成和/或腫瘤形成的疫苗，其包含有效量的如權(quán)利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽和/或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)，和賦形劑或稀釋劑。
21.權(quán)利要求20的疫苗或權(quán)利要求18或19的藥物組合物，其進(jìn)一步包含至少一種用于輔助或增大多肽和/或多核苷酸(和/或反義多核苷酸)和/或其抗體或片段的作用的添加劑。
22.權(quán)利要求21的疫苗或權(quán)利要求21的藥物組合物，其中至少一種添加劑是免疫刺激分子。
23.權(quán)利要求22的疫苗或權(quán)利要求22的藥物組合物，其中免疫刺激分子是細(xì)胞因子或編碼細(xì)胞因子的多核苷酸(和/或反義多核苷酸)。
24.權(quán)利要求20至23之任一的疫苗，其中所述疫苗包含細(xì)胞或細(xì)胞提取物。
25.權(quán)利要求24的疫苗，其中細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞，所述抗原呈遞細(xì)胞負(fù)載有血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽、或被編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)所轉(zhuǎn)染。
26.權(quán)利要求25的疫苗，其中細(xì)胞是表達(dá)血管生成抑制素結(jié)合蛋白的腫瘤細(xì)胞或表達(dá)血管生成抑制素結(jié)合蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞。
27.在哺乳動物中產(chǎn)生針對血管生成抑制素結(jié)合蛋白的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括以下步驟
(i)用如權(quán)利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素結(jié)合蛋白多肽或其編碼多核苷酸(和/或反義多核苷酸)先體外后體內(nèi)刺激收集自哺乳動物的免疫細(xì)胞；
(ii)將受刺激的免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移回哺乳動物，由此將細(xì)胞轉(zhuǎn)移回哺乳動物產(chǎn)生針對血管生成抑制素結(jié)合蛋白的免疫應(yīng)答。
28.權(quán)利要求27的方法，其中哺乳動物是人。
29.權(quán)利要求27或28的方法，其中免疫應(yīng)答起預(yù)防性或治療性作用，以抑制血管生成相關(guān)疾病的發(fā)生或進(jìn)展。
30.權(quán)利要求10至17之任一的用途或權(quán)利要求18、19或21之任一的藥物組合物或權(quán)利要求20至26之任一的疫苗或權(quán)利要求27至29之任一的方法，其中編碼多核苷酸包含
(i)SEQ ID NO2的多核苷酸(和/或反義多核苷酸)；或
(ii)多核苷酸(和/或反義多核苷酸)，其與SEQ ID NO2有至少80％和/或至少90％和/或至少95％和/或至少98％同一性，和/或能與SEQ IDNO2在65℃、2xSSC的條件下雜交，和/或其編碼功能性多肽；或
(iii)SEQ ID NO2的片段，其編碼功能性多肽
而且其中多核苷酸(和/或反義多核苷酸)不編碼p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白或p80-血管生成抑制素結(jié)合蛋白的片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防性或治療性治療，以阻止血管形成(例如，血管生成)，例如阻止腫瘤生長。本發(fā)明尤其涉及疫苗或藥物，其包含完整的血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子或其片段，其可用于產(chǎn)生針對血管生成抑制素結(jié)合蛋白的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供了特異針對完整血管生成抑制素結(jié)合蛋白分子或其片段的抗體，用于預(yù)防性或治療性治療。
文檔編號C07K14/435GK101213210SQ200680024095
公開日2008年7月2日 申請日期2006年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月29日
發(fā)明者拉斯·霍姆格倫 申請人:生物發(fā)明國際公司